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CN1890260A - 蛋白质nmb1125及其在药物制剂中的用途 - Google Patents

蛋白质nmb1125及其在药物制剂中的用途 Download PDF

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CN1890260A
CN1890260A CNA2004800358779A CN200480035877A CN1890260A CN 1890260 A CN1890260 A CN 1890260A CN A2004800358779 A CNA2004800358779 A CN A2004800358779A CN 200480035877 A CN200480035877 A CN 200480035877A CN 1890260 A CN1890260 A CN 1890260A
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G·E·古伊伦尼尔托
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L·H·贝坦科特纽涅兹
L·R·卡斯特拉诺斯萨拉
Y·佩雷拉尼格林
D·加西亚迪亚兹
O·尼布拉佩雷斯
E·卡巴雷罗米南德斯
S·冈萨雷斯布兰克
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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗细菌、病毒、癌性的或其他来源的疾病的新疫苗抗原的用途。本发明的技术目的是开发能够增加现有疫苗的保护谱的制剂并扩展该疫苗抵抗不同的病原体。为此分离了蛋白质NMB1125，并鉴定为脑膜炎奈瑟氏球菌外膜制剂的组分，其能诱导杀菌活性。另外，克隆和表达了编码蛋白质NMB1125的基因，纯化所述的蛋白质，并随后在动物生物模型中测定了其免疫原性。同源基因序列的高度保守水平表明当以不同方式被呈递时其作为诱导交叉免疫应答的抗原的高度价值。所得的制剂适于用于制药业作为用于人类的疫苗制剂。

Description

蛋白质NMB1125及其在药物制剂中的用途
本发明涉及医学领域，具体地涉及开发预防性或治疗性应用的新疫苗制剂，其可以提高抗不同来源的疾病抗原的免疫应答的质量。
唯一已知宿主是人的革兰氏阴性双球菌脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是脑膜炎球菌性脑膜炎的致病因子。通常在正常人群的无症状携带者(是其微生物分离的最常见的来源的生态位)中发现这种细菌。
就全世界而言，2岁以下的儿童是接触性脑膜炎球菌性脑膜炎的最易感人群，但是年轻的成年人以及正常的成年人群体也可能被感染。
未治疗的脑膜炎球菌病对大多数被感染的个体具有致死过程，免疫接种通过早在细菌的定殖阶段停止所述事件而可能预防这种情形。
已经发展了几种策略旨在获得能够满足在普通人群中诱导抗这种疾病的保护性所需的条件的疫苗。为此，已经考虑了荚膜抗原，因为它们的免疫特异性能将这种微生物分类为血清群。这些血清群中的5种被确定为导致了全世界的大多数的脑膜炎球菌病的临床病例。血清群A是在亚撒哈拉非洲中流行病的主要原因。在大多数情况下血清群B和C与发达国家中的发病有关。血清群Y和W135在大多数的该疾病的复发病例中常见，并且它们在美国的一些地区中比较普遍，在最近几年中有明显的增加。从这些数据来看，将荚膜多糖作为疫苗候选物进行使用、研究和评估是显而易见的。一种基于荚膜多糖的抗血清群A、C、Y和W-135的四价疫苗在美国已经获得许可。免疫接种后产生的抗体是血清群特异的(Rosenstein N.等人，2001.Meningococcaldisease.N.Engl.J.Med，344，1378-1388)。
血清群B与其他血清群不同，也是地方性和流行性脑膜炎球菌病的主要病因，这主要是因为根本没有对其的有效疫苗。已经注意到荚膜多糖B是弱免疫原性的，加之因为该化合物在结构上类似于人神经系统胎儿结构存在的寡糖链，因而存在基于该化合物的疫苗有诱导免疫耐受和自身免疫的理论危险。(Finne J.等人，1987.An IgGmonoclonal antibody to group B meningococci cross-reacts withdevelopmentally regulated polysialic acid units ofglycoproteins in neural and extraneural tisues.J.Immunol，138：4402-4407)。因此，针对血清群B的疫苗的开发集中于使用亚荚膜(sub-capsular)抗原。
外膜蛋白和泡囊(vesicle)疫苗
在70年代，基于外膜蛋白制备疫苗的最初尝试基于通过去污剂去除LPS的外膜蛋白制剂(Frasch CE和Robbins JD.1978.Protectionagainst group B meningococcal disease.III.Immunogenicity ofserotype 2 vaccines and specificity of protection in a guineapig model.J Exp Med 147(3)：629-44)。然后沉淀外膜蛋白OMP以制备悬浮于氯化钠中的聚集体。尽管在动物研究中获得了有希望的结果，但是这些疫苗不能在成人和儿童中诱导杀菌性抗体(Zollinger WD等，1978.Safety and immunogenicity of a Neisseria meningitidistype 2 protein vaccine in animals and humans.J.Infect.Dis.137(6)：728-39)，这些疫苗较差的表现主要是由于沉淀导致的四级结构的丧失。因此，下一个合理的步骤是制备具有呈现天然构象的外膜蛋白泡囊形式的蛋白的疫苗(Zollinger WD等，1979.complex ofmeningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membraneprotein immunogenic in man.J.Clin.Invest.63(5)：836-48，WangLY和Frasch CE.1984.Development of a Neisseria meningitidisgroup B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mousemodel.Infect Immun.46(2)：408-14136)。
这些外膜泡囊疫苗的免疫原性明显比OMP聚集体的免疫原性高，并且该免疫原性通过吸附氢氧化铝佐剂而进一步加强(Wang LY和Frasch CE.1984.Neisseria meningitidis group B serotype 2bprotein vaccine and evaluation in a mouse model.Infect Immun.46(2)：408-14136)。
使用可溶性外膜泡囊疫苗的不同制剂进行了许多功效实验。分别应对在古巴(Sierra GV等人，1991.Vaccine against group BNeisseria meningitidis：protection trial and mass vaccinationresults in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)：195-210)和挪威(Bjune G等人，1991.Effect of outer membrane vesicle vaccine againstgroup B meningococcal disease in Norway.Lancet.338(8775)：1093-6)的疾病爆发，在20世纪80年代开发了两种最广泛研究的疫苗。由古巴Finlay学院制备的OMV疫苗(商业名为VA-MENGOC-BC)是由具有血清群C多糖的株系B：4：P1.19，15和高分子量OMP制剂制备的，并吸附氢氧化铝(Sierra GV等人，1991.Vaccineagainst group B Neisseria meningitidis：protection trial andmass vaccination results in Cuba.NIPH Ann Dis.14(2)：195-210)。该疫苗导致古巴流行病的快速下降(Rodriguez AP等人，Theepidemiological impact of antimeningococcal B vaccination inCuba.1999.Mem Inst Oswaldo Cruz.94(4)：433-40)。
由Norwegian National Institute for Public Health(NIPH)制备的疫苗同样最初想在另一种来自ET-5克隆(B：15：P1.7，16)的生物体引起的高度地方性疾病期间使用。其也是一种单价疫苗，由吸附于氢氧化铝的纯化的外膜泡囊制备(Bjune G等，1991.Effect ofouter membrane vesicle vaccine against group B meningococcaldisease in Norway.Lancet.338(8775)：1093-6)。
外膜泡囊疫苗有效地使外膜蛋白呈现充分天然的构象以允许功能性杀菌抗体的产生，至少在十几岁的青少年和成人中。也已经显示产生的抗体应答增加了脑膜炎球菌的调理吞噬作用。疫苗的精确配方(即OMP含量、LPS含量和佐剂的存在与否)对免疫原性具有明显的影响(Lehmann AK等，1991.Immunization against serogroup Bmeningococci.Opsonin response in vaccinees as measured bychemiluminescence.APMIS.99(8)：769-72，Gomez JA等，1998.Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activityof antibodies against the transferrin-binding proteins ofNeisseria meningitidis.Vaccine.16(17)：1633-9，Steeghs L等，1999.Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in aLipopolysaccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis：Influence of Adjuvants on the Immune Response.Infect Immun.67(10)：4988-93)。
疾病分离物的抗原性特性谱也变化很快，因此只作用有限数量的选择株系的疫苗在几年以后就可能变得无效，除非根据地方流行病学改变疫苗的组成。
目前，OMV疫苗比其他任何血清群B的疫苗的应用都广泛，并且在单一PorA型导致的疾病的爆发中非常有用。
在株系间产生交叉反应性的免疫原仍需充分地说明。来自Finlay学院和NIPH疫苗实验的接种后血清研究表明针对PorA(P1，1类血清亚型蛋白)和OpcA(另一种主要OMP，以前称为Opc)二者的抗体(WedegeE，等人，1998.Immune Responses against Major Outer MembraneAntigens of Neisseria meningitidis in Vaccinees and ControlsWho Contracted Meningococcal Disease during the NorwegianSerogroup B Protection Trial.Infect Immun.66(7)：3223-31)对介导血清杀菌活性都非常重要(PorA免疫原性最大)，两种抗原都显示显著的株系与株系的差异性。
PorA蛋白的显著性和该蛋白的显著水平的差异性在疾病爆发间期和期间其表位都持续发生变异(Jelfs J等人，2000.SequenceVariation in the porA Gene of a Clone of Neisseria meningitidisduring Epidemic Spread.Clin Diagn Lab Immunol.7(3)：390-5)(其中接种后(疾病后)的大多数杀菌活性都是针对所述表位的)，这增加了基于单一菌株(单价)OMV的疫苗可能是血清亚型限制性的(即依赖PorA型)的担心。
为了克服这些潜在的问题，在荷兰的RIVM开发了一种OMV疫苗，其含有来自六种不同流行的病原性分离株的PorA蛋白(van Der Ley P和Poolman JT.1992.Construction of a multivalentmeningococcal vaccine strain based on the class 1 outer membraneprotein.Infect Immun.60(8)：3156-61，Claassen I等，1996.Production，characterization and control of a Neisseriameningitidis hexavalent class 1 outer membrane proteincontaining vesicle vaccine.Vaccine.14(10)：1001-8)。在该情形中，从两种很好表征的H44/76株系的变体中分离了疫苗泡囊，所述的H44/76株系已经遗传改造以表达三种单独的PorA蛋白。
通用抗原的研究
显然，外膜蛋白(OMP)能够诱导抗血清群B疾病的功能性免疫应答，但是至今没有开发出一种疫苗可以具有通用的保护性，因为外膜蛋白的表面暴露区域具有很大的异质性。外膜泡囊(OMV)疫苗诱导的适度的交叉免疫刺激了对外膜抗原(或抗原组)的研究，所述的外膜抗原诱导功能性抗体并存在于所有的脑膜炎球菌株系上。这些抗原，如果它们存在于无论什么血清群的所有株系上，则可能形成真正通用的脑膜炎球菌疫苗的基础，这可能会消除多糖接种后病原性株系上荚膜转变的潜在问题。
一旦该免疫显性PorA蛋白的变异性限制其作为通用疫苗的应用变得明显，则可以考虑许多其他主要的外膜蛋白的疫苗潜力，并且其中的几种正在进一步的开发中。那些已经被考虑的外膜蛋白包括第5类蛋白(OpcA)，NspA和铁调节的蛋白(TbpA和B，FbpA，FetA)。TbpB与TbpA形成转铁蛋白结合复合物的一部分。最近的工作表明TbpA不但在铁结合中具有重要作用(Pintor M等人，1998.Analysis of TbpAand TbpB functionality in defective mutants of Neisseriameningitidis.J Med Microbiol 47(9)：757-60，而且是比TbpB更有效的免疫原。
已经使用来自不同脑膜炎球菌株系的外膜蛋白制剂的组合免疫小鼠通过新技术发现了一种高度保守的小的外膜蛋白(Martin D等人，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface ProteinConfers Protection against Experimental Infection.J Exp Med185(7)：1173-83)。使用来自小鼠的B细胞产生杂交瘤，然后筛选其针对多脑膜炎球菌株系的交叉反应性。发现一种高度交叉反应性的单克隆抗体结合22kDa的外膜蛋白，其被称为NspA。用重组NspA蛋白的免疫显示在小鼠中诱导了针对来自血清群A-C的株系的交叉反应性杀菌应答。疫苗接种也保护了小鼠抗致死性脑膜炎球菌感染(Martin D等，1997.Highly Conserved Neisseria meningitidisSurface Protein  Confers Protection against ExperimentalInfection.J Exp Med 185(7)：1173-83)。在遗传不同的脑膜炎球菌株系间的NspA序列的比较表明该蛋白是高度保守的(97％的同源性)(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-ProtectiveActivities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseriameningitidis NspA Outer Membrane Protein.Infect Immun 67(9)：4955-9)。
使用抗NspA的单克隆抗体通过ELISA在99.2％的来自血清群A-C的测试株系上检测到NspA的存在(Martin D等人，1997.HighlyConserved Neisseria meningitidis Surface Protein ConfersProtection against Experimental Infection.J Exp Med 185(7)：1173-83)。这些单克隆抗体显示对许多脑膜炎球菌株系具有杀菌活性，并且能够降低小鼠模型中的脑膜炎球菌菌血症(Cadieux N等人，1999.Bactericidal and Cross-Protective Activities of a MonoclonalAntibody Directed against Neisseria meningitidis NspA OuterMembrane Protein.Infect Immun 67(9)：4955-9)。尽管该数据表明NspA是一种有希望的能够在跨血清群界限进行保护的疫苗候选物，但是来自小鼠的多克隆抗重组NspA血清不结合大约35％的病原性血清群B脑膜炎球菌株系的表面，尽管在这些生物体中存在nspA基因(Moe GR等，1999.Differences in Surface Expression ofNspA among Neisseria meningitidis Group B Strains.Infect Immun67(11)：5664-75)。
抗原呈递和疫苗制剂
早前的工作表明抗原呈递的形式可能比较关键。膜结合蛋白上的表位通常依赖于正确的三级结构的维持，这反过来又经常依赖疏水性膜结合结构域。已经显示外膜蛋白制剂只有呈现泡囊形式时才在人体中引发免疫性(Zollinger WD等人，1979.complex of meningococcalgroup B polysaccharide and type 2 outer membrane proteinimmunogenic in man.J Clin Invest 63(5)：836-48，Zollinger WD等人，1978.Safety and immunogenicity of a Neisseriameningitidis type 2 protein vaccine in animals and humans.JInfect Dis 137(6)：728-39)。
单蛋白疫苗已经在本领域中使用了几十年，并通常表现较好的稳定性。如果需要以泡囊的形式呈现，以使抗原保持膜结合，稳定性和再现性可能难保证。外膜泡囊的免疫原性和反应原性可能随着蛋白量以及纯化过程中LPS的去除的变化而变化。但是在OMV疫苗制备中产生了泡囊制备的实际经验，对目前制备的疫苗进行质量控制。构建完全合成的脂质体泡囊可允许进一步优化和标准化这些疫苗(Christodoulides M等人，1998.Immunization with recombinantclass 1 outer-membrane protein from Neisseria meningitidis：influence of liposomes and adjuvants on antibody avidity，recognition of native protein and the induction of abactericidal immune response against meningococci.Microbiology 144(Pt 11)：3027-37)。换句话讲，外膜蛋白已经以泡囊和纯的表达蛋白呈现，并且抗体应答的产生是适度的。至今主要努力集中在脑膜炎球菌疫苗的肌内注射，导致产生全身IgG。但是，在脑膜炎球菌疾病中，如果宿主的侵入是通过鼻上皮，那么分泌性IgA的产生可能也是重要的。
脑膜炎奈瑟氏球菌的基因组序列
在2000年描述和公开了MC58(血清群B脑膜炎球菌)的基因组序列(Tettelin H等人，2000.complete Genome Sequence ofNeisseria meningitidis Serogroup B Strain MC58.Science 287(5459)：1809-15172)以及Z2491(血清群A菌株)的基因组序列(Parkhill J等人，2000.complete DNA sequence of a serogroup Astrain of Neisseria meningitidis Z2491.Nature 404(6777)：502-6173)。所述基因序列的获得对脑膜炎球菌疫苗的研究产生了重大的影响。而MC58基因组测序取得了进展，Pizza等人开始签定了被描述编码膜结合蛋白、表面暴露蛋白和输出蛋白的开放阅读框。他们鉴定了570种这样的ORF，通过聚合酶链反应对他们进行了扩增，并将他们克隆进大肠杆菌中以允许编码的蛋白以带His标签或谷胱苷肽S转移酶融合蛋白形式表达(Pizza M等人，2000.Identificationof Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus byWhole-Genome Sequencing.Science 287(5459)：1816-20)。61％(350)的所选择的ORF被成功表达，那些不能表达的ORF通常含有一个以上疏水跨膜结构域(可能排除了大量外膜结合蛋白)。纯化了重组蛋白并用于接种小鼠。通过酶联免疫吸附(ELISA)测定和流式细胞术测定了免疫血清对多种脑膜炎球菌株系的表面结合，使用血清杀菌测定评价了免疫血清的对两种株系的杀菌活性。基于在所有三种测定中的阳性应答最后选择了7种蛋白用于进一步研究。使用多种这些蛋白的实验疫苗制剂组合佐剂显示诱导了明显的针对小鼠中同源脑膜炎球菌株系(MC58)的杀菌滴度，但是没有一种蛋白诱导SBA的滴度和MC 58外膜泡囊疫苗一样高(Giuliani MM等人，2000.Proceedings12th IPNC.p.22)。另一方面，有一些证据表明这些蛋白的组合可能在小鼠显示高于单一蛋白的免疫原性(Santini L等人，2000.Proceedings 12th IPNC.p.25)。在该研究中排除的大量开放阅读框(可能通过不能蛋白质表达或他们的免疫学特性的修饰)可能也具有疫苗潜力并需要进一步研究。
一旦了解了各个抗原对脑膜炎奈瑟氏球菌的发病机理的作用，就可能比较有效地选择疫苗组分。抗原本身可以称为有效的疫苗候选物，或者减毒的突变体可能作为疫苗成分。
在这一指导下，使用在几种病原性微生物中序列高度保守的疫苗候选物可能提供对它们引起的多种疾病的解决方案，如果这些候选物通过免疫系统作用诱导方便的应答。
本发明的技术目的是开发能够增强和/或扩宽针对不同病原体或广泛的各个病原体变体的免疫应答的疫苗制剂，所述的病原体为癌症、细菌、病毒或任何其他来源的。
发明描述
在本发明的工作目的中，首次报道了使用NMB 1125蛋白作为疫苗制剂的组分，所述的疫苗制剂具有抗脑膜炎球菌疾病或任何由奈瑟氏菌属的成员引起的任何感染的治疗或预防特性。
本发明的新特征在于以前未曾报道的NMB1125蛋白在具有新特性的制剂中的应用，所述的制剂能够诱导广谱保护作用的全身或粘膜免疫应答，这是由于该蛋白在脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的不同分离株中的保守特性。
附图简述
图1.在克隆和表达蛋白NMB1125中使用的克隆载体pM100。pTrip，色氨酸启动子；N-term P64k，P-64k N末端片段；T4终止子，T4噬菌体转录终止子。
图2.在pM100载体中的基因NMB1125的核苷酸序列的最终结构。
图3.细胞破碎获得的部分的SDS-PAGE分析。泳道1：总细胞；泳道2：细胞沉淀；泳道3：上清。
图4.来自破碎的上清的NMB1125纯化过程的SDS-PAGE分析。泳道1：所得的蛋白；泳道2：发现于不同层析级分中的低分子量污染蛋白；泳道3：应用前的样品。
图5.获自通过鼻内或腹膜内途径免疫的小鼠的针对重组蛋白NMB1125的抗体水平(IgG)。显示了ELISA结果，其被表示为使免疫前血清的值加倍的最高稀释度的倒数。
图6.使用用重组蛋白免疫的小鼠的血清对存在于脑膜炎奈瑟氏球菌OMV中的NMB1125的Western印迹。免疫鉴定的NMB1125比较显著。
图7.在通过鼻内途径免疫的小鼠中在粘膜水平的针对重组蛋白NMB1125的IgA抗体应答。结果表示为使免疫前血清的值加倍的最高稀释度的倒数。(A)唾液中的IgA抗体应答。(B)肺冲洗物中的IgA抗体应答。
图8.使用BLAST对NMB1125蛋白(查询)和来自不同血清群脑膜炎奈瑟氏球菌(“Sbjct”)的基因组的该序列之间的同源性探查的结果。
图9.通过针对重组抗原引发的血清对不同脑膜炎奈瑟氏球菌株系中的NMB1125的识别。图中只显示了用半纯化的蛋白的腹膜内途径获得的结果，但是在其他情况中观察到类似的特性。结果表示为使免疫前血清的值加倍的最高稀释度的倒数。
图10.在幼年大鼠模型的针对脑膜炎球菌感染的被动保护实验中通过腹膜内途径给药用两种方法获得的蛋白免疫引发的血清的比较。
图11：通过产生的mAb(mAb H8/92，3H2764和7D2/15)对NMB1125蛋白和一组非相关抗原的识别。P1，脑膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.15的1类蛋白；P64k，来自脑膜炎奈瑟氏球菌的丙酮酸脱氢酶的E3亚基；T.T，破伤风类毒素；HBsAg，乙型肝炎病毒表面抗原。
图12.来自脑膜炎球菌病存活者的人恢复期血清对NMB1125的识别。使用健康供者血清作为阴性对照。结果显示为在ELISA类型测定中的吸光度(492nm)。
图13.来自用游离肽(JY1)、重组蛋白(NMB1125)或缀合物JY1-NMB1125免疫的动物的血清的JY1抗肽滴度。
实施例
此处通过实施例描述本发明，所述的实施例对本发明本身提供了信息，但决不是对所述发明的限制。
实施例1：在血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌外膜泡囊制剂中NMB1125蛋白的检测
为了研究存在于血清群B脑膜炎奈瑟氏球菌(株系B:4:P1.19，15)外膜泡囊中的蛋白质，根据别处描述的方法进行了二维电泳(Grg A等人，1985.Electrophoresis 6：599-604)。然后使用胰蛋白酶(Promega，Madison，WI，U.S.)对凝胶提取的蛋白质进行了酶消化。消化后产生的肽通过微型柱(ZipTips，Millipore，MA，U.S.)提取入溶液。为了质谱法分析，用60％乙腈、1％甲酸从微型柱中洗脱肽，然后立即应用于nanotips(Protana，Denmark)。
在配备有电离源(nanoESI)具有cuadrupole和飞行时间的杂合质谱仪(QTof-2TM，Manchester，United Kingdom)中进行测量。400-2000范围的w/z在0.98秒内并使用0.02秒的扫描间隔获得质谱测定数据。使用MassLynx程序(versión 3.5，Micromass)进行数据的获得和数据处理。
使用ProFound程序(Zhang W和Chait BT.2000.ProFound：anexpert system for protein identification using massspectrometric peptide mapping information.Anal Chem72：2482-2489. http：//prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)进行基于质谱数据的蛋白质鉴定。对包含于SwissProt数据库( http：//www.ebi.ac.uk/swissprot/)和NCBI( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因和衍生的蛋白质序列进行检索，考虑甲硫氨酸的氧化、半胱氨酸的脱酰胺基作用和羧基酰胺甲基化作用作为可能遇到的修饰。
利用MASCOT程序(Perkins DN等，1999.Probability-basedprotein identification by searching sequence databases usingmass spectrometry data.Electrophoresis 20：3551-3567.http：//www.matrixscience.com/)进行基于质谱的蛋白质鉴定。检索参数包括半胱氨酸修饰以及氧化作用和脱酰胺作用。
从存在于外膜泡囊制剂中的蛋白质的鉴定获得的结果的分析，选择NM1125蛋白用于作为可能的疫苗候选物进行评价，由此通过质谱鉴定一种肽。
实施例2：NMB1125蛋白与可用的数据库中的报告的基因产物的同源性分析
为了分析NM1125蛋白与其他基因产物的同源性，使用BLAST程序(Altschul SF等，1990.Basic local alignment search tool.J MolBiol 215：403-410， http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)在NCBI数据库中进行了基于同源性的检索。该方法获得的结果标记为同源的，除了在公开的奈瑟氏菌属基因组中报告的蛋白质外，识别了来自不同生物如Ralstonia，耶尔森氏菌属(Yersinia)和假单孢菌属(Pseudomonas)种的几种标记为假定的蛋白质的基因产物。
这些蛋白质在这些基因组中的高度保守性已经产生了具有在NCBI数据库中报告的保守结构域的直向同源进化组[( gnl|CDD|13507，COG4259，在细菌中保守的未表征的蛋白质[功能未知)]，表明存在可能的系统发生关联和他们存在共同的祖先。
使用MBGD数据库(Uchiyama，I.2003.MBGD：microbial genomedatabase for comparative analysis.Nucleic Acids Res.31，58-62.)进行对编码NM1125的基因的基因组环境的分析，并揭示了在前面提到的微生物中这些基因的保守的基因组织，结合以前的数据，这促使我们得出这样的结论，即这些基因在他们各自的基因组中是显著同源的。
实施例3：在大肠杆菌中克隆和表达编码脑膜炎奈瑟氏球菌的NMB1125蛋白的NMB1125基因。
为了克隆和表达NM 1125基因，使用了pM-100克隆载体。该载体允许使用不同的限制酶进行克隆，并且在大肠杆菌中产生高表达水平的包函体形式的异源蛋白。
该pM-100载体(图1)具有下列元件：色氨酸启动子、编码来自脑膜炎奈瑟氏球菌株系B:4:P1.19，15的P64kDa的Nt片段的47个氨基酸稳定序列的基因片段、T4噬菌体转录终止子序列和赋予氨苄青霉素抗性的作为选择标志的基因的序列。
从编码NMB1125蛋白的核苷酸序列(实施例1)设计了两个引物(7738和7739)来从B:4:P1.19，15基因组DNA扩增该基因片段，没有编码预测的信号肽的序列。
                   BglII
7738：5＇TTAGATCTCTATCCCGATACCGTCTATGAAGG＇3
(Seq.ID.No.1)
7739：5＇AAG CTCGAGTCGTTTGCCTCCTTTACC 3＇
                   Xhol
(Seq.ID.No.2)
使用SignalP World Wide Web server( http：//www.cbs.dtu.dk/services/Signa1P-2.0)进行信号肽的预测。使用引物7738和7739 PCR扩增NMB1125基因之后(Randall K等人，1988.Science 42394：487-491)，使用BglII和XhoI限制酶消化该PCR产物，并克隆进预先消化的pM-100克隆载体中。最后的构建体示于图2中，NMB1125蛋白表达为与P64kDa蛋白的Nt片段的融合蛋白。使用ALFexpress II自动测序仪(Termo SequenaseTM CyTM 5DyeTerminador Kit，Amersham Biosciences)和分别结合P64稳定剂以及T4转录终止子的序列的寡核苷酸1573(Seq.ID.No.8)和6795(Seq.ID.No.9)对克隆的基因NMB1125进行测序。此处产生的质粒在其以后的应用中称为pM-238。
为了表达NMB1125基因，使用pM-238质粒(图2)通过化学方法转化GC366大肠杆菌。在补充1％甘油、1％酪蛋白水解物、0.1mM CaCl2，1mM MgSO4和50ug/mL氨苄青霉素的基本培养基(M9)(Miller JH.1972.Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，NEW York，USA)中进行表达实验。细菌培养物在37℃和250rpm下孵育12小时。离心生长培养物，并超声破碎细胞沉淀(IKA LABORTECHNIK)。通过SDS-PAGE(Laemmli UK.1970.Cleavage of structural proteins during the assembly of the headof bacteriophage T4.Nature 277：680)和考马斯亮蓝R-250染色分析沉淀和上清级分。通过凝胶密度测定法(LKB Bromma 2202 Ultrascanlaser densitometer；Amersham Pharmacia Biotech，United Kingdom)测定表达百分比。从上清级分中获得NMB1125蛋白，大约是该级分总蛋白含量的60％(图3)。含有蛋白的部分用缓冲液A(25mM的Tris-羟甲基氨基甲烷)进行透析，并通过使用monoQ 5/5柱(AmershamBiosciences)以及在1小时内的0-100％NaCl梯度[缓冲液A作为平衡缓冲液，缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)]的离子交换层析从中纯化NMB1125蛋白，获得80％纯的蛋白，如图4所示。
实施例4：用NMB1125蛋白通过腹膜内和鼻内途径免疫诱导的免疫应答的评价
为了评价NMB1125蛋白的免疫原性，在小鼠中设计和进行了免疫实验，其中给药了通过两种不同的方法获得的相同的蛋白。第一个由从聚丙烯酰胺凝胶的带中的提取物组成(Castellanos L等，1996.Aprocedure for protein elution from reverse-stainedpolyacrylamide gels applicable at the low picomole level：Analternative route to the preparation of low a bundance proteinsfor microanalysis.Electroforesis 17：1564-1572)，而第二个是实施例3中所涉及的，所述的产物称为半纯化的蛋白。
用这些制剂免疫雌性Balb/C小鼠(8-10周龄)，所述的小鼠分成4组，每组8只。通过鼻内或腹膜内途径进行三次免疫，两次间隔15天。通过腹膜内途径给药的蛋白用弗氏佐剂乳化。表1中描述了该免疫原的组成：
                表1：用于免疫的Balb/C小鼠的组别
  组别   从凝胶提取的蛋白   半纯化的蛋白   途径
  1   50μg   --   i.n
  2   --   50μg   i.n
  3   10μg   --   i.p
4 -- 10μg i.p
在取自第三次接种后的血清样品中针对重组蛋白和存在于细菌中的同源蛋白的抗体滴度(IgG)通过ELISA测定。在图5中显示了各个动物的针对重组蛋白的抗体滴度。在第二次接种后确定抗体水平，尽管他们在第三次接种后更高。另外，通过Western印迹进行了免疫鉴定，其中识别了每个蛋白带。通过腹膜内途径免疫的组的滴度显著高于通过鼻内途径引发的。为了进行结果的统计学分析，根据Bartlett’s检验使用了Kruskal-Wallis的无参数方差分析，因为组中的非方差齐性。使用Dunn的多重比较检验比较了每个处理的平均值。
用重组蛋白免疫后获得的血清识别存在于株系CU385的外膜蛋白(OMP)制剂中天然蛋白。这些结果示于图6中。为了分析粘膜应答评价了唾液样品和肺洗液。图7只显示了通过鼻内途径免疫的组。在接受半纯化的蛋白的组中观察到IgA滴度的增加。
实施例5：在不同脑膜炎奈瑟氏球菌株系中编码蛋白NMB1125的基因序列的表征
为了分析在不同脑膜炎奈瑟氏球菌株系中编码蛋白NMB1125蛋白的基因序列的保守性，使用程序BLAST(Altschul SF等人，1990.Basiclocal alignment search tool.J Mol Biol 215：403-410.http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)对在NCBI数据库( NC_003116.1， NC_003112.1， NC_003221，SANGER_135720|Contigl)中标注的脑膜炎奈瑟氏球菌(血清群A、B和C)基因组进行了类似的研究。图8显示了这些序列的序列比较结果，其在每个分析的基因组中产生明显的比对。组A和组B中的序列与编码蛋白NMB1125的基因的序列(Seq.ID.No.3)具有100％的序列相同性，血清群C的序列具有99％的相同性。另外，对3个古巴分离株确定了所述基因的序列(Seq.ID.No.5-7)，他们属于血清群B(B:4:P1.19，15)，并使用ClustalX程序( http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/)进行了序列比对。比对的结果显示在被分析的株系中基因NMB1125的核苷酸序列具有很大的保守性。
考虑到存在于前述序列中的高度相似性，使用蛋白NMB1125作为疫苗候选物，将可以产生有效的免疫应答，对脑膜炎球菌疾病具有广谱的保护作用(由于交叉反应性)。
实施例6：用蛋白NMB1125免疫Balb/C小鼠诱导的广谱作用的免疫应答的表征。
为了评价用蛋白NMB1125的免疫是否诱导了与其他奈瑟氏菌属株系广泛的交叉反应性应答，进行了ELISA。用7种奈瑟氏菌属株系的全细胞包被聚苯乙烯平板，所述的株系属于不同的血清型和血清亚型。所述的平板与通过两种途径免疫(如实施例4所述)获得的针对蛋白NMB1125的混合血清温育。
图9显示了用针对通过腹膜内途径给药的半纯化的蛋白引发的血清获得的结果。如所观察到的结果，免疫血清识别存在于不同株系中的所述蛋白，其水平类似于在株系CU385中发现的水平。其他的血清在该测定中具有相当的表现。
实施例7：在幼年大鼠模型中对蛋白NMB1125特异的鼠血清诱导的抗同源和异源株系的保护作用
为了测定获得的抗血清的功能活性，在幼年大鼠模型中进行了对于脑膜炎球菌感染的保护作用测定。将24只大鼠(5-6天龄)分组，每组6只。
测定通过腹膜内途径给药的血清是否保护大鼠免受一小时后通过相同途径接种的细菌(株系CU385)引起的感染。混合每组的血清并1/10(在灭菌PBS中)稀释，然后将他们接种幼年大鼠。4小时后，对动物取样，并计数他们血液中的活菌。
为了解释该结果，进行了方差(Anova)分析，然后进行了Dunnet’s多重比较测试，其中测试组与阴性对照组比较。如在图10中所观察到的，接受抗蛋白NMB1125的抗血清的组显示与阴性对照统计学上显著的差异，因此他们被认为在该模型中是保护性的。
用分离于古巴病人的株系H44/48和120/90(其血清学分类与株系CU385同源)感染幼年大鼠进行了类似的测定。另外，用血清群C的株系233(C:2a:P1.5)和血清群B的株系H44/76(B:15:P1.7，16)进行了攻击实验。在所有情况中，抗血清保护幼年大鼠抵抗脑膜炎球菌感染。
实施例8：能够介导抗脑膜炎奈瑟氏球菌的杀菌活性的针对蛋白NMB1125的单克隆抗体的产生
为了产生特异针对蛋白NMB1125的单克隆抗体(mAb)，并研究介导抗同源和异源抗脑膜炎奈瑟氏球菌株系的杀菌活性的功能性，用纯度高于80％的蛋白NMB1125制剂(实施例3)进行了免疫程序。在Balb/C(H-2d，雌性，5-6周龄)中进行免疫，并应用如下的四个剂量：在第0、15和30天常规免疫，每只小鼠通过皮下途径给药用弗氏佐剂乳化的10μg抗原NMB1125(总体积100μl)；在第50天通过腹膜内途径给药每只小鼠在磷酸缓冲盐水(140mM NaCl，270mM KCl，1.5mM KH2PO4，6.5mM Na2HPO4 x 2H2O，pH 7.2)中的10μg抗原。在第0天和第45天进行血液提取。
通过使用蛋白NMB1125作为包被抗原(实施例3)的间接ELISA测量的具有最高滴度的动物的脾细胞与X63 Ag8 653小鼠骨髓瘤细胞融合。根据标准方法(Gavilondo JV.1995.AnticuerposMonoclonales：Teoría  y Práctica，Elfos Scientiae，La Habana，Cuba)分离和筛选所得到的杂交瘤。
杂交瘤分泌的抗体针对蛋白NMB1125的反应性以及他们与无关抗原的交叉反应性通过使用5μg/ml的每种抗原的间接ELISA进行测试，测定相同浓度的每种mAb。图11显示了该实验获得的结果，共获得3个阳性克隆(mAb H8/92，3H2/64和7D2/15)，其特异识别蛋白NMB1125，并既不与相应于P64K的N末端的氨基酸序列反应，也不与测定的其他无关抗原反应。
为了测定针对蛋白NMB1125产生的mAb介导抗脑膜炎奈瑟氏球菌的同源和异源株系的杀菌应答的能力，进行了杀菌测试。杀菌抗体的滴度表示为测试的抗体能够杀死50％或更多的细菌的最高稀释度的倒数，所产生的抗体中两种(3H2/64和7D2/15)具有高于1∶128的抗同源株系B:4:P1.19，15的杀菌滴度，一种mAb(H8/92)具有高于1∶80的滴度。另外，他们具有高于1∶64的抗异源株系B:15:P1.7，16和C:2a:P1.5的滴度。
实施例9：鼠科动物针对蛋白NMB1125的免疫应答的靶区域的表征
为了鉴定该蛋白的通常被针对重组抗原产生的鼠科动物抗血清识别的区域，进行了SPOTScan测定。在纤维素膜上合成了一套跨度所述蛋白序列的重叠肽，所述的肽与1∶100稀释的混合血清温育。通过与缀合抗鼠免疫球蛋白G-碱性磷酸酶温育并随后加入含有底物溴-氯-碘基磷酸的溶液来检测抗原抗体反应。
无论用于免疫所使用的制剂，在蛋白中观察到几个共同的抗原性区域。但是，在用弗氏佐剂佐化的蛋白免疫的组中有比较广的形式的识别。
实施例10：人血清对NMB1125蛋白的识别
在本研究中使用来自康复期个体的人血清收集物，通过ELISA进行该研究。用获自制备性电泳的蛋白NMB1125(5μg/ml)包被平板。用含有Tween-20的3％脱脂奶粉PBS溶液封闭平板后，用相同溶液1∶50稀释血清，并于平板中温育。如已经广泛报道的进行免疫测定。健康供体血清用作阴性对照。另外，来自用重组的针对乙型肝炎的疫苗免疫的个体的混合血清作为无关对照(数据未显示)。
图12显示了该测定中用5个康复期血清获得的结果。可以看到人血清识别该蛋白，这表明其在脑膜炎球菌感染阶段表达并是免疫原性的。
实施例11：蛋白NMB1125作为肽载体
为了证明重组蛋白NMB1125的载体能力，将其缀合至15聚体(15mer)的合成肽，所述的合成肽来自HIV-1分离株JY1的gp120蛋白的V3区。通过戊二醛方法进行所述的缀合。将游离JY1肽、重组蛋白NMB1125和缀合物JY1-NMB1125以三剂量方案给药成年小鼠，其中免疫原用弗氏佐剂乳化。第三次剂量后两周，从免疫的动物获取血清样品，并通过ELISA分析该样品以确定抗肽抗体滴度。为此，用游离肽(20μg/ml)包被平板，如以前所述进行免疫测定。实验的结果(图13)显示了NMB1125的载体能力，即缀合后其能明显地加强针对肽JY1的抗体应答。
序列表
<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology
<120>NMB1125蛋白及其在药物制剂中的用途
<140>CU 2003/0285
<141>2003-12-02
<150>CU 2003/0285
<151>2003-12-02
<160>9
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ttagatctct atcccgatac cgtctatgaa gg                                    32
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸7739
<400>2
aagctcgagt cgtttgcctc ctttacc                                          27
<210>3
<211>262
<212>DNA
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
<400>3
ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac      60
cgaaaagatg gaaaaatact ttgtggaagc cggcaacaaa aaaatgaatg ccgccccggg 120
tgcgcacgcc atctgggact gctgctttcc gttcgggaga caaagagggc cgttccgcca 180
gtttgaagaa gagaaaaggc tgtttcccga atcgggcgta tttatggact tcctgatgaa 240
aaccggtaaa ggaggcaaac ga                                          262
<210>4
<211>97
<212>PRT
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>4
Gln Lys Ser Leu Tyr Tyr Tyr Gly Gly Tyr Pro Asp Thr Val Tyr Glu
  1               5                  10                  15
Gly Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ser Leu Gly Lys Gln Thr Glu Lys Met
             20                  25                  30
Glu Lys Tyr Phe Val Glu Ala Gly Asn Lys Lys Met Asn Ala Ala Pro
         35                  40                  45
Gly Ala His Ala His Leu Gly Leu Leu Leu Ser Arg Ser Gly Asp Lys
     50                  55                  60
Glu Gly Ala Phe Arg Gln Phe Glu Glu Glu Lys Arg Leu Phe Pro Glu
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Phe Met Asp Phe Leu Met Lys Thr Gly Lys Gly Gly Lys
                 85                  90                  95
Arg
<210>5
<211>260
<212>DNA
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>5
ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60
gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120
gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180
cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240
aaaaccggta aaggaggcaa                                                 260
<210>6
<211>260
<212>DNA
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>6
ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60
gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120
gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180
cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240
aaaaccggta aaggaggcaa                                             260
<210>7
<211>260
<212>DNA
<213>脑膜炎奈瑟氏球菌
<400>7
ctatcccgat accgtctatg aaggtttgaa aaacgacgac acttcgttgg gcaagcagac 60
gaaaagatgg aaaaatactt tgtggaagcc ggcaacaaaa aaatgaatgc cgccccgggt 120
gcgcacgccc atctgggact gctgctttcc cgttcgggag acaaagaggg cgcgttccgc 180
cagtttgaag aagagaaaag gctgtttccc gaatcgggcg tatttatgga cttcctgatg 240
aaaaccggta aaggaggcaa                                             260
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸1573
<400>8
ttccatggta gataaaagaa tggctttag                                   29
<210>9
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成寡核苷酸6795
<400>9
aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg                                          27

Claims (31)

1.脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的蛋白质NMB1125，特征在于其是能够在受体生物中产生针对由奈瑟氏菌属的细菌引起的感染的保护性应答的抗原，并具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的蛋白质NMB1125，其特征在于由序列表中SEQ IDNO：3所示的基因NMB1125编码。
3.权利要求2的基因NMB1125，其特征在于具有序列表中SEQ IDNO：3所示的碱基序列并编码权利要求1的蛋白质。
4.通过重组技术或化学合成获得的蛋白质或肽，特征在于蛋白质NMB1125的序列并能在受体生物中产生抗由权利要求1的奈瑟氏菌属细菌引起的感染的保护性应答。
5.药物制剂，特征在于含有权利要求1、2和4的蛋白质或肽或根据权利要求1、2和4，通过天然方法制备的权利要求1的蛋白质。
6.权利要求5的药物制剂，特征在于是能够在受体生物中产生抗奈瑟氏菌属细菌引起的感染的保护性应答的疫苗。
7.权利要求5和6的药物制剂，特征在于是能够在受体生物中产生抗脑膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的保护性应答的疫苗。
8.权利要求5和6的药物制剂，特征在于是能够在受体生物中产生抗淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的感染的保护性应答的疫苗。
9.权利要求5、6、7和8的药物制剂，特征在于是预防性或治疗性制剂。
10.权利要求5、6、7和8的药物制剂，特征在于是含有一种或几种通过重组方式、合成方式获得的或通过天然途径制备的不同抗原性质的抗原的组合制剂。
11.权利要求5、6、7和8的药物制剂，特征在于含有多糖抗原。
12.权利要求5、6、7和8的药物制剂，特征在于制剂的组分之一是脑膜炎奈瑟氏球菌的荚膜多糖。
13.权利要求9的药物制剂，特征在于含有一种多糖-蛋白质缀合物，所述的多糖部分对应于细菌多糖。
14.权利要求5、6、7和8的药物制剂，特征在于含有一种或几种灭活的微生物。
15.权利要求5、6、7和8的药物制剂，特征在于含有肽抗原。
16.权利要求5和6的药物制剂，特征在于含有激素。
17.权利要求5和6的药物制剂，特征在于含有生长因子。
18.权利要求5-17的药物制剂，特征在于是通过肠胃外途径给药的制剂。
19.权利要求5-17的药物制剂，特征在于是通过粘膜途径给药的制剂。
20.权利要求5-17的药物制剂，特征在于是经口途径给药的制剂。
21.权利要求5-20的药物制剂，特征在于是免疫刺激剂或免疫增强剂制剂。
22.权利要求5-21的药物制剂，特征在于含有NMB1125抗原的肽或片段。
23.权利要求5-21的药物制剂，特征在于含有NMB1125抗原的模拟表位。
24.基因修饰的生物，特征在于含有权利要求3的基因或其部分，单独或包括于另一基因序列中。
25.权利要求24的药物制剂，特征在于含有基因修饰的生物，活的、减毒的或其制备物。
26.药物制剂，特征在于含有权利要求24中的生物表达的蛋白质，并且能在受体生物中产生针对由奈瑟氏菌属的细菌引起的感染的保护性应答。
27.药物制剂，特征在于含有权利要求1、2和4的蛋白质或肽，作为不同性质的抗原的载体。
28.药物组分，特征在于含有权利要求1和2的蛋白质NMB1125或其片段，并能够单独或在其他组分存在下检测人体中的脑膜炎球菌病。
29.药物组分，特征在于含有权利要求3的基因或其片段，并能够单独或在其他组分存在下检测人体中的脑膜炎球菌病。
30.根据权利要求1和2的蛋白质NMB1125或其片段在生物传感器或其他制药学或生物技术学应用中的用途。
31.根据权利要求3的基因NMB1125或其片段在生物传感器或其他制药学或生物技术学应用中的用途。
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