Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN1732184A - 抗脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的单克隆抗体、用于免疫色谱以检测脱唾液酸α1 －酸性糖蛋白的诊断条和使用其诊断肝病的方法 - Google Patents

抗脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的单克隆抗体、用于免疫色谱以检测脱唾液酸α1 －酸性糖蛋白的诊断条和使用其诊断肝病的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1732184A
CN1732184A CNA2003801077250A CN200380107725A CN1732184A CN 1732184 A CN1732184 A CN 1732184A CN A2003801077250 A CNA2003801077250 A CN A2003801077250A CN 200380107725 A CN200380107725 A CN 200380107725A CN 1732184 A CN1732184 A CN 1732184A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
sialic acid
acid glycoprotein
acid
diagnosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2003801077250A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100384876C (zh
Inventor
郑兑和
宋银永
姜智显
金京儿
李银荣
催龙卿
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Neobiodigm Co Ltd
Original Assignee
Neobiodigm Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Neobiodigm Co Ltd filed Critical Neobiodigm Co Ltd
Publication of CN1732184A publication Critical patent/CN1732184A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100384876C publication Critical patent/CN100384876C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及在早期快速诊断肝病的方法。更具体地，本发明涉及抗脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的单克隆抗体；诊断肝病的方法，其使用所述的单克隆抗体评价试样中的脱唾液酸α1－酸性糖蛋白；和用于免疫色谱的诊断条，其由所述的抗脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的单克隆抗体和蓖麻凝集素(RCA)组成。本发明的诊断装置可以方便地测量脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的浓度，并快速诊断肝病。

Description

抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体、用于免疫色谱以检测脱唾液酸 α1-酸性糖蛋白的诊断条和使用其诊断肝病的方法
技术领域
本发明涉及在早期快速诊断肝病的方法。更具体地，本发明涉及抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体；诊断肝病的方法，其使用所述的单克隆抗体评价试样中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白；和用于免疫色谱的诊断条，其由所述的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体和蓖麻凝集素(RCA)组成。本发明的诊断装置可以方便地测量脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，并快速诊断肝病。
背景技术
肝病包括肝炎、肝硬化和肝癌，是韩国、日本、台湾、中国和其它东南亚国家最流行的疾病。目前，通过评价患者尿中的胆红素或尿胆素原的含量，通过测量谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶、全胆红素、白蛋白、乳酸脱氢酶等的含量来分析血液中的生化组分的变化，和通过检测来自乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)的抗原或抗这些病毒的抗体，已经可以诊断肝病。另外，通过甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)实验，可以诊断肝硬化。但是，肝脏是一个复杂的器官，因为它有多种功能，且不能从外表上非常特异性地揭示异常状态。而且，尚未建立早期诊断方法，因而肝病经常难以治疗，因为它是在严重恶化以后才被确诊。
本发明的发明人已经开发出了一种标记，其可以在临床上早期诊断肝病，且能准确地反映出患者的严重性，从而生产出了一种诊断试剂盒。本专利申请和论文已经揭示，该标记是诊断肝病的显著试剂。
准确地说，本发明的发明人已经证实了韩国专利申请PCT/KR00/00840(2000年8月1日)，美国专利申请09/662,363(2000年9月13日)和韩国专利申请10-2000-0040609(2000年7月14日)中的诊断方法和诊断试剂盒，其通过使用特异性抗体和凝集素来利用夹心ELISA方法，并测量血液中的脱唾液酸糖蛋白。证实该技术是可再现的和准确的，因而可以用于诊断肝功能和治疗肝病。
据报道，脱唾液酸糖蛋白作为血清中的标记代表着肝病的预后状态(T.Sawamura等，Gastroenterology 1981，81：527～533；T.Sawamura等，Gastroenterology 1984，87：1217～1221)。另外，阐明了脱唾液酸糖蛋白有助于检测肝癌的状况，因为其浓度与肝癌的严重性成比例(T.Sawamura等，Gastrologia Japonica 1985，20：201～208)。
常规地，从人或其它动物(例如兔子和小鼠)分离出针对脱唾液酸糖蛋白的受体，纯化后用作捕获蛋白，以测量脱唾液酸糖蛋白的浓度。将其标记上放射活性的底物后，进行竞争性放射性测定和电免疫扩散(J.S.Marshall等，J.Lab.Clin.Med.1978，92：30～37；N.Serbource-Goguel等，Hepatology 1983，3：356～359)。
不幸的是，存在一些问题。首先，难以大规模地得到针对脱唾液酸糖蛋白的受体，但是检测试剂盒需要大量的脱唾液酸糖蛋白。在竞争性放射受体测定中，使用放射性物质是危险的，且难以制备用于处理废弃物等的特殊设备。在电免疫扩散中，定量分析数据非常困难。特别地，竞争性测定不适用于一般的诊断试剂盒，因为其缺少准确性和再现性。
附图简述
从下面的详述中，结合附图，可以更清楚地理解本发明的上述的和其它的目的、特征和其它优点，其中：
图1显示了通过进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)从血浆中纯化出的α1-酸性糖蛋白(AGP)和去唾液酸化的α1-酸性糖蛋白。
图2显示了通过进行蛋白印迹从本发明的杂交瘤细胞系生产出的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体。
图3显示了在本发明中通过实施ELISA方法制备出的单克隆抗体，其仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白反应，且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白。
图4a显示了在本发明中制备的用于免疫色谱的诊断条的平面图。
图4b显示了在本发明中制备的用于免疫色谱的诊断条的正视图。
图5显示了使用在本发明中制备的用于免疫色谱的盒式诊断条测量的结果，以浓度依赖方式显示了脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。
发明内容
为了解决上述的技术问题，且通过检测脱唾液酸糖蛋白来快速、容易地诊断肝病，本发明人已经尝试开发了对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)特异性的单克隆抗体、使用所述的单克隆抗体诊断肝病的方法和用于该方法的免疫色谱的诊断条。
本发明的目的是提供容易地检测肝病的装置和方法。
为了实现所述的目的，本发明提供了仅结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体也不与脱唾液酸肝球蛋白和脱唾液酸α2-巨球蛋白作用。优选地，本发明的单克隆抗体是亚类IgG1。
通过现有技术公开的方法(Davidson R.L.和P.S.Gerald 1976，Improved techniques for the induction of mammalian cell hybridization bypolyethylene glycol，Somatic Cell Genet.，2：165～176；Knott C.L.，Kuus-Reichel K.，Liu R.和Wolfert R.L.1997，Development of antibodies fordiagnostic assays，In Price C.和Newman D.(eds.)，Principles and Practice ofImmunoassay，2nd ed.New York，Stockton Press，36～64；Gillete R.W.1987，Alternatives to pristine priming for ascitic fluid and monoclonal antibodyproduction，J.Immunol.Meth.99，21～23；Norwood T.H.，C.J.Zeigler和G.M.Martin 1976，Dimethyl sulphoxide enhances polyethylene glycol-mediatedsomatic cell fusion，Somatic cell Genet.，2：263～270)，可以制备出单克隆抗体。更准确地，通过包含下述步骤的方法生产：(1)分离脱唾液酸α1-酸性糖蛋白，和(2)免疫小鼠。
首先，为了大规模地生产上面得到的单克隆抗体，通过常规方法制备出了杂交瘤细胞，经分离、筛选后，腹膜注射进小鼠中，然后从腹膜液中收集。
具体地，通过专利申请[PCT申请PCT/KR00/00840(2000年8月1日)，美国专利申请09/662,363(2000年9月13日)，韩国专利申请10-2000-0040609(2000年7月14日)]所述的方法，从血液中纯化脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。将脱唾液酸α1-酸性糖蛋白悬浮到磷酸盐缓冲液中，通过Titer-MAX混合，并用于免疫小鼠。从免疫的实验小鼠中分离出脾细胞和骨髓瘤细胞，融合后，通过ELISA方法筛选对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的杂交瘤细胞系。为了从上面的杂交瘤细胞大规模生产对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体，将生产抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞注射进实验小鼠中，收集含有高水平的杂交瘤细胞的小鼠腹膜液，分离对本发明的单克隆抗体特异性的细胞。
另外，本发明还提供了杂交瘤细胞系，其可以大规模地生产仅结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体。
为了研究从杂交瘤细胞得到的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白是否是特异性的，首先通过进行电泳和蛋白印迹分析了脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。通过如实施例2所述的ELISA方法等，进一步研究了本发明的单克隆抗体是否仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用、且排斥其它的糖蛋白。
优选地，本发明提供了生产对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的亚型IgG1单克隆抗体的杂交瘤细胞系，根据布达佩斯条约，其于2004年5月24日保藏在韩国生命科学与生物技术研究所基因库中(保藏号KCTC10261 BP)。
另外，本发明提供了检测肝病的方法，其包括下述步骤：(1)使得仅结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体；作为特异性地识别脱唾液酸糖蛋白的凝集素的蓖麻凝集素(在下文中称作“RCA”)；和试样反应；和(2)测量脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)。
在本发明的检测肝病的方法中，通过夹心(sandwich)酶免疫测定法(在用于免疫色谱的诊断条上的酶免疫测定法)和不同类型的酶免疫测定法，可以在微量培养板上分析试样。更特别地，在用于免疫色谱的诊断条上的酶免疫测定法是这些方法中最方便的。
优选地，在本发明的诊断方法中使用的单克隆抗体是如上所述的亚型IgG1。更优选地，从以保藏号为KCTC 10261 BP保藏的本发明的小鼠杂交瘤细胞系生产单克隆抗体。此外，优选地使用识别脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的RCA作为凝集素。
本发明提供了用于免疫色谱的诊断条，其含有仅结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体，和识别脱唾液酸糖蛋白的凝集素RCA；其可以用于测量试样中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，和快速地、容易地诊断肝病。
优选地，本发明提供了用于免疫色谱的诊断条，其包含保藏号为KCTC 10261 BP的单克隆抗体AS 16.89和作为凝集素的RCA。本发明的用于免疫色谱的诊断条包含：包被了微粒(例如与单克隆抗体偶联的金胶体)的玻璃纤维(GF)膜；硝化纤维膜(NC)，RCA带在其中排列作为诊断线；和作为标准线的单克隆抗体带；吸收试样溶液的样品垫；排出非反应性物质的吸收垫；和用于固定上述元件的粘合塑料底座。
本发明的用于免疫色谱的诊断条以适当的次序固定，优选地，NC膜、GF膜、样品垫和吸收垫部分地重叠在粘合塑料底座上，以通过毛细管作用平稳地转移物质。
可以通过常规方法制备用于免疫色谱的诊断条。优选地，本发明的诊断条可以生产成盒式或杆式。
此外，试样优选地是用洗脱缓冲液稀释10倍的血液或血清，且洗脱缓冲液优选地为50mM硼酸盐缓冲液，其含有5％蔗糖、1％牛血清白蛋白或1％Triton X-100。
本发明的用于免疫色谱的诊断条可以用于如下检测肝病：当稀释试样且滴到样品垫上时，3～5分钟后，标准线和诊断线都在带上着色，根据颜色可以判断样品是否是肝病阳性的。准确地说，如果抗体-金偶联物形成为微粒，包含脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的阳性样品会在测试后在标准线和基准线上都显示红色，而包含正常水平的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的阴性样品(非肝病患者)仅在标准线上显示红色。
如上所述，本发明的用于免疫色谱的诊断条可以检测直到边界值(约1.50μg/ml)的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白，其可以早期诊断肝病，如果继续评价肝硬化和肝癌患者中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的水平，还可以监视其预后和治疗。
另外如上所述，仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体和使用它的用于免疫色谱的诊断条，可以迅速、方便地获悉实验结果，使得肝病可以容易地确诊。因此，期望其有助于预防和治疗肝病。
实施例
如下面的实施例所示，解释了实用的和目前优选的本发明的实施方案。
但是，本领域的技术人员应当理解，参考本说明书，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
<实施例1>脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)的分离和纯化
如下，从人血浆中含有的脱唾液酸糖蛋白分离和纯化出α1-酸性糖蛋白(AGP)。
将2个NIH单位的凝血酶加入200ml人血浆中，在37℃储存2小时，在4℃储存过夜，离心去除血块。使用0.05M醋酸钠缓冲液(pH4.3)透析上面制备的血清，装载到预先用相同缓冲液平衡的DEAE柱上，混合0.05M醋酸钠缓冲液(pH4.3)和0.1M醋酸钠缓冲液(pH4.3)后，然后通过线性浓度梯度洗脱。随后，在280nm检测光密度(OD)，数据如图1所示。收集含有AGP和其它蛋白的级分，与硫酸铵混合至0.5g/ml，离心以沉淀蛋白。再次将得到的上清液与硫酸铵混合至0.18g/ml，以沉淀蛋白，将沉淀溶解到少量蒸馏水(D.W.)中，使用D.W.充分透析，然后冻干。
使用6ml 0.1N硫酸盐溶液，将40mg上面分离的AGP在80℃水解2小时，使用1N氢氧化钠中和，然后使用0.01N磷酸盐缓冲液(pH7.4)透析。将在上面方法中制备的去唾液酸化的α1-酸性糖蛋白(AsAGP)装载到Sephadex G-200柱上，使用0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.4)过滤，通过280nm的OD值计算，最终收集包含蛋白的级分。结果如图1所示：泳道1是蛋白分子量的标准标记；泳道2是α1-酸性糖蛋白；泳道3和4是脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)。
<实施例2>制备抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体
(1)小鼠的免疫
为了得到用于制备生产抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的免疫的小鼠，使用Titer-MAX充分地悬浮作为抗原的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白，调节到50μg/50ml的浓度，然后注射进6～8周龄的Balb/c小鼠的腹腔中。2周后，将相同量的在首次注射中提到的抗原与Titer-MAX混合，并重复注射到相同位点。通过相同的方法，7天后再次注射抗原，3周后重复注射。随后，从小鼠的尾巴收集少量血液，检测，评价滴度。
(2)细胞融合
为了进行制备杂交瘤细胞系的细胞融合，用上述的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白抗原免疫小鼠，并从小鼠收集脾细胞和骨髓瘤细胞。然后，充分洗涤108个脾细胞和107个骨髓瘤细胞(SP2/0)，混合到一起，经约1分钟倒入1ml PEG 1500，轻轻搅拌约1分钟。随后，经约3分钟加入9ml RPMI培养基，缓慢搅拌达到50ml的终体积。离心细胞悬浮液，收集细胞沉淀，再使用HAT培养基悬浮到1～2×105细胞/ml，以0.2ml体积/孔倒入96-孔微量培养板中，然后在CO2培养箱中在37℃孵育。
(3)筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞
为了筛选对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的杂交瘤细胞，使用包被了脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的微量培养板，如下进行了ELISA方法。准确地说，以100μl(1μg/ml)/孔将脱唾液酸α1-酸性糖蛋白抗原置于微量培养板中，以包被表面，洗去未反应的抗原。向每个孔中加入100μl杂交瘤细胞的培养基，反应2小时，使用Tween 20磷酸盐缓冲液(PBST)洗掉未反应的培养基。随后，加入山羊抗小鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)，在室温反应1小时，使用PBST溶液洗掉。然后，使用邻苯二胺(OPD)作为过氧化物酶的底物，反应后，用ELISA读数仪，在490nm检测OD值。
结果，首先筛选到了分泌出高度结合脱唾液酸α1-酸性糖蛋白抗原的抗体的细胞系，并重复选择以分离分泌对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白抗原特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过有限稀释处理得到的细胞，形成单克隆，再筛分能生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系。随后，收集了2个具有最高滴度的克隆，例如脱唾液酸α1-酸性糖蛋白1和脱唾液酸α1-酸性糖蛋白2，通过ELISA方法检测培养基上清液的滴度，然后通过双免疫扩散分析了单克隆抗体的亚基类型。结果，将本发明的克隆分泌的抗体分别鉴别为IgG1和IgM。
已经将分泌IgG1的细胞系命名为AS 16.89，并于2004年5月24日保藏在韩国生命科学与生物技术研究所基因库中(保藏号KCTC 10261BP)。
(4)大规模生产和纯化单克隆抗体
为了从杂交瘤细胞大规模地生产单克隆抗体，将0.5ml姥鲛烷注射进Balb/c小鼠的腹腔中。1周后，将在上面步骤(3)得到的每个细胞系以5×106个细胞/小鼠注射进实验小鼠中，然后如果膨胀从腹腔收集腹膜液。在12,000rpm离心腹膜液，收集细胞，通过蛋白G柱过滤得到的上清液，分离和纯化抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体，储存在-20℃，用于下一个实验。
(5)通过蛋白印迹鉴别单克隆抗体的特异性
为了阐明对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体的性质，通过进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白印迹，鉴别了通过上述步骤(4)纯化出的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体(见图2)。通过现有技术的典型方法，进行了蛋白印迹。在图2中，泳道1是蛋白分子量的标准标记；泳道2是α1-酸性糖蛋白；泳道3是脱唾液酸α1-酸性糖蛋白；泳道4是α2-巨球蛋白；泳道5是肝球蛋白。
(6)通过酶免疫化学测定鉴定单克隆抗体的特异性
将脱唾液酸α1-酸性糖蛋白、肝球蛋白、α2-巨球蛋白抗原分别以100μl(1μg/ml)/孔加到96-孔微量培养板中，结合到表面上，与加入的100μl抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体反应2小时，使用磷酸盐缓冲液-Tween 20(PBST)洗掉未反应的培养基。而且，加入山羊抗小鼠IgG-HRP，在室温反应1小时，使用PBST溶液充分洗涤。然后，加入邻苯二胺(OPD)作为过氧化物酶的底物，反应后，用ELISA读数仪，在490nm检测OD值。结果，证实了上面纯化的抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的单克隆抗体是对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体(见图3)。在图3中，AGP显示了α1-酸性糖蛋白和AsAGP，本发明的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。
<实施例3>通过用于免疫色谱的诊断试剂盒检测肝病
如下，生产了本发明的用于免疫色谱的诊断试剂盒，其可以通过上面生产的对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体As 16.89和血液中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白之间的免疫反应，测量试样中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，并用于临床领域。
(1)用于免疫色谱的诊断试剂盒的制备
用于检测血液中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的诊断试剂盒由如下所述的组分组成。
A.固定在固体载体(例如微量培养板)上的对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体(As16.89)
B.抗脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的凝集素(RCA)-辣根过氧化物酶(HRP)
C.样品稀释缓冲液(1％BSA/PBST)
D.酶底物溶液(OPD)
E.洗涤缓冲液(PBST)
F.脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的标准溶液
G.终止缓冲液
(2)测量
a.将100μl脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的标准溶液(1μg/ml)分别加入固定有单克隆抗体As 16.89的微量培养板上。从St.Mary Hospital，Catholic Medical School得到了实验样品，其中包括40个正常人、155个没有肝病的患者、36个急性肝炎的患者、272个慢性肝炎(CH)的患者、230个肝硬化的患者、72个从肝硬化发展成的肝癌(HCC)的患者。使用稀释缓冲液，以1∶10的比例稀释血液样品，以100μl分配到微量培养板的每个孔上，在室温温育120分钟。
b.反应后，向每个孔加入100μl洗涤缓冲液，重复洗涤3次。
c.将通过制备方法稀释的凝集素(RCA)-HRP分配到微量培养板的每个孔上，在室温反应60分钟。
d.重复步骤b。
e.将酶底物溶液(OPD)分配到上面微量培养板的每个孔中。
f.向每个孔中加入100μl终止缓冲液，终止酶反应。
g.使用ELISA读数仪，在490nm测量OD值。
结果，通过上述方法评价了血液中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，如表1所示。
<表1>
血液AsAGP的测量
(边界值：1.50μg/ml)
 类别   总和   平均值±标准偏差μg/ml*   AsAGP＞1.50μg/ml   AsAGP＞1.50μg/ml
  样品数   ％   样品数   ％
 标准组   总和   196   0.89±0.46   19   10.0   177   90
  正常   41   0.84±0.41   2   5   39   95
  无肝病   155   0.90±0.48   17   11   138   89
 肝病组1   急性肝炎   36   1.3±0.77   9   25   27   75
 肝病组2   总和   574   2.48±0.89   323   56   251   44
  慢性肝炎(CH)   272   1.63±0.45   99   36   173   64
  肝硬化(LC)   230   3.12±0.42   165   72   65   28
  肝硬化(LC)后的肝癌(HCC)   72   3.64±0.1   59   82   13   18
结果，证实了正常人和无肝病的患者的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)的浓度平均水平低于1.00μg/ml，AsAGP的浓度超过1.50μg/ml的样品数目是约10％。在急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和具有肝硬化的肝癌的患者组中，测得AsAGP的平均血液水平分别为1.33μg/ml、1.63μg/ml、3.12μg/ml和3.64μg/ml。这些浓度与标准组的浓度明显不同，即使AsAGP超过1.5μg/ml的样品的比例分别为25％、36％、72％和82％。因此，证实了该实验能有效地诊断肝病。
因而，根据上述数据，当本发明的单克隆抗体As 16.89用于酶免疫测定法时，确定诊断肝病的边界值是1.50μg/ml。
<实施例4>制备用于免疫色谱的诊断条
(1)制备单克隆抗体-金偶联物
向金颗粒的胶体溶液中，加入15μg/ml在本发明中选择的对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体，在室温反应2小时，并旋转。然后，以1/10体积混合10％BSA，形成1％的浓度，再次反应1小时，制备抗体-金偶联物。随后，将得到的产物在12,000rpm离心40分钟，抛弃上清液，加入2mM硼酸盐缓冲液，洗掉抗体-金偶联物。重复洗涤产物3次，最后将含有1％BSA的2mM硼酸盐缓冲液加入约1/10体积的金溶液中，并悬浮。用紫外分光计检测后，通过稀释将530nm的OD值调节到3.00。
(2)样品垫
样品垫是能吸收试样的膜，且由用于该目的的纤维素材料制成。
(3)玻璃纤维(GF)膜
玻璃纤维是试样中的AsAGP和通过本发明的方法制备出的单克隆抗体于其上反应的组件。GF膜在表面上包被有金胶体颗粒-As 16.89，且如下制备。
如步骤(1)所述，使从本发明的杂交瘤细胞系As 16.89生产的单克隆抗体偶联到膜上。
使用20mM硼酸钠缓冲液浸泡购自Millipore Co.Ltd的GF膜(1.0cm×0.7cm)，将金胶体颗粒-As 16.89均匀地喷雾到表面上，在37℃干燥，从而制备出用于免疫色谱的GF膜垫(即偶联垫)，其上面固定有与着色颗粒偶联的单克隆抗体。
(4)硝化纤维(NC)膜和排列
将购自Millipore Co.Ltd的硝化纤维膜切成合适的大小(0.7cm×5cm)，排在离塑料底座的底部约3.4cm的位点，山羊抗小鼠IgG作为标准线，在2.7cm的位点作为基准线，用于通过使用购自EY Lab的RCA检测脱唾液酸α1-酸性糖蛋白，然后干燥，完成NC膜。
(5)吸收垫
纤维素膜用于吸收免疫反应后试样中的未反应的物质，并通过毛细管作用转移样品溶液。
(6)制备用于免疫色谱的诊断条
如图4a和图4b所示，将上述的膜固定到粘合塑料底座上。准确地说，将NC膜、GF膜、样品垫和吸收垫以适当的次序排列，均匀地重叠约0.1cm部分，通过粘合剂固定，以通过毛细管作用平稳地转移物质。
<实施例5>使用用于免疫色谱的诊断条分析脱唾液酸α1-酸性糖蛋白
使用洗脱缓冲液(例如含有5％蔗糖、1％牛血清白蛋白或1％TritonX-100的50mM硼酸盐缓冲液)，以1∶10的比例稀释血清样品，并以60～70μl的体积加在实施例4中制备的用于免疫色谱的诊断条的样品垫上，在3～5分钟后，检测标准线和基准线是否着色。
图5显示了从用于免疫色谱的盒式条得到的结果。编号1是α1-酸性糖蛋白(AGP)、肝球蛋白和α2-巨球蛋白的混合物的标准滴加；编号2是正常人的血清的诊断条；编号3～编号6分别是1.5μg/ml、2.0μg/ml、3.0μg/ml和4.0μg/ml脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的带。如图5所示，在编号3中，该线是模糊的；在编号4～编号6中，标准线(上)和基准线(下)的红色都是清楚的。
观察了本发明的用于免疫色谱的诊断条，在低于边界值1.50μg/ml脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的正常人的试样(阴性的)中，仅仅标准线变成红色，因为没有形成抗原-抗体-酶偶联复合物。另一方面，当由于肝病使脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的水平增加到超过1.50μg/ml时，2条线都变红，其中脱唾液酸α1-酸性糖蛋白吸附在样品垫上，与GF膜上的金颗粒-单克隆抗体As 16.89偶联物反应，形成免疫复合物，通过毛细管作用转移到NC膜上，并与NC膜上的基准线中的RCA偶联，形成金沉淀。而且，根据脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，可以改变基准线的厚度和颜色密度。因此，通过试样中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白的浓度，可以预测肝病的严重性。
工业实用性
如上所述，本发明的对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的单克隆抗体和诊断条和使用它们用于免疫色谱的诊断试剂盒，可以用于快速、容易地评价血液样品中的脱唾液酸α1-酸性糖蛋白。因此，本发明的单克隆抗体和诊断装置可以有效地检测肝病的严重性、治疗和预后肝病。
本领域的技术人员应当明白，可以容易地使用前面说明书中公开的概念和具体实施方案作为改进或设计用于实现本发明的相同目的的其它实施方案的基础。
本领域的技术人员还应当明白，这些等同的实施方案没有背离所附权利要求书所述的本发明的精神和范围。

Claims (20)

1.一种单克隆抗体，其仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用，且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白。
2.根据权利要求1的单克隆抗体，其是亚型IgG1。
3.一种细胞系，其大规模生产仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体。
4.根据权利要求3的细胞系，其通过融合从脱唾液酸α1-酸性糖蛋白免疫的小鼠提取出的脾细胞和骨髓瘤细胞来制备。
5.根据权利要求4的细胞系，其生产对脱唾液酸α1-酸性糖蛋白特异性的亚型IgG1单克隆抗体，且根据布达佩斯条约于2004年5月24日保藏在韩国生命科学与生物技术研究所基因库中(保藏号KCTC 10349 BP)。
6.一种诊断肝病的方法，其中使仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体和识别脱唾液酸糖蛋白的凝集素RCA(蓖麻凝集素)与试样反应，以测量脱唾液酸α1-酸性糖蛋白(AsAGP)的量。
7.根据权利要求6的诊断肝病的方法，其中所述的单克隆抗体是从保藏号为KCTC 10261 BP的小鼠细胞系生产的亚类IgG1。
8.根据权利要求6的诊断肝病的方法，其中所述的试样是血液或血清。
9.用于免疫色谱的诊断条，其包含：仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体；和作为凝集素的识别脱唾液酸糖蛋白的RCA；和在超过1.50μg/ml脱唾液酸α1-酸性糖蛋白下使试样反应，以检测肝病。
10.根据权利要求9的用于免疫色谱的诊断条，其中所述的单克隆抗体是保藏号为KCTC 10261 BP的As 16.89。
11.根据权利要求9的用于免疫色谱的诊断条，其中所述的单克隆抗体与微粒如胶体类型的金颗粒偶联。
12.根据权利要求11的用于免疫色谱的诊断条，其包含：(1)包被了与单克隆抗体偶联的微粒的玻璃纤维(GF)；(2)硝化纤维膜(NC)，其包括用于检测糖蛋白的标准线和诊断线；(3)试样的样品垫；(4)非反应性物质的吸收垫；和(4)用于固定上述元件的粘合塑料底座。
13.根据权利要求12的用于免疫色谱的诊断条，其中NC膜、GF膜、样品垫和吸收垫以合适的次序部分地重叠在所述的粘合塑料底座上，以通过毛细管作用转移物质，且以一定的间隔分开作为诊断线的RCA带和作为标准线的抗体带。
14.根据权利要求9的用于免疫色谱的诊断条，其中所述的试样是用洗脱缓冲液稀释10倍的血液或血清。
15.根据权利要求14的用于免疫色谱的诊断条，其中所述的洗脱缓冲液是50mM硼酸盐缓冲液，其含有5％蔗糖、1％牛血清白蛋白或1％Triton X-100。
16.根据权利要求9的用于免疫色谱的诊断条，其中标准线和诊断线在所述条上着色，以指示肝病阳性。
17.根据权利要求9的用于免疫色谱的诊断条，它是盒式。
18.根据权利要求9的用于免疫色谱的诊断条，它是杆式。
19.一种用于免疫色谱的诊断试剂盒，其包含：仅与脱唾液酸α1-酸性糖蛋白作用、且排斥肝球蛋白和α2-巨球蛋白的单克隆抗体；作为凝集素的识别脱唾液酸糖蛋白的RCA(蓖麻凝集素)；和在超过1.50μg/ml脱唾液酸α1-酸性糖蛋白下使试样反应，以检测肝病。
20.根据权利要求19的用于免疫色谱的诊断试剂盒，其中单克隆抗体是保藏号为KCTC 10261 BP的As 16.89。
CNB2003801077250A 2002-12-27 2003-12-27 抗脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的单克隆抗体、用于免疫色谱以检测脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的诊断条和使用其诊断肝病的方法 Expired - Fee Related CN100384876C (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2002-0084834A KR100499989B1 (ko) 2002-12-27 2002-12-27 아사이알로 α1-산 당단백질에 대한 단일클론 항체, 이 항체를 포함하는 아사이알로 α1-산 당단백질에 대한 단일클론 항체, 이 항체를 포함하는 면역크로마토그래피 스트립 및 이 스트립를 이용한 아사이알로 α1-산 당단백질 측정방법
KR1020020084834 2002-12-27
PCT/KR2003/002860 WO2004058823A1 (en) 2002-12-27 2003-12-27 Monoclonal antibody against asialo alpha 1-acid glycoprotein, immunochromatographic strip comprising the monoclonal antibody, and method for diagnosing liver diseases using the immunochromatographic strip

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1732184A true CN1732184A (zh) 2006-02-08
CN100384876C CN100384876C (zh) 2008-04-30

Family

ID=36780434

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2003801077250A Expired - Fee Related CN100384876C (zh) 2002-12-27 2003-12-27 抗脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的单克隆抗体、用于免疫色谱以检测脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的诊断条和使用其诊断肝病的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7575938B2 (zh)
EP (1) EP1576012A4 (zh)
JP (1) JP2006522736A (zh)
KR (1) KR100499989B1 (zh)
CN (1) CN100384876C (zh)
AU (1) AU2003285814A1 (zh)
WO (1) WO2004058823A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439443A (zh) * 2009-03-06 2012-05-02 儿童医院医疗中心 快速横向流动的聚糖检测装置
CN101921336B (zh) * 2009-06-11 2013-02-27 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种抗人α1酸性糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法
CN103102411A (zh) * 2009-06-11 2013-05-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法
CN104374919A (zh) * 2009-07-14 2015-02-25 独立行政法人产业技术综合研究所 糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物
CN105561294A (zh) * 2015-05-07 2016-05-11 中国人民解放军第二军医大学 α1-酸性糖蛋白在制备减肥药物中的应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100724597B1 (ko) * 2005-11-04 2007-06-04 한국생명공학연구원 간질환 진단용 면역스트립 판독기
KR20150091545A (ko) 2006-06-08 2015-08-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 염증성 질환의 예방 또는 치료제
KR100834932B1 (ko) * 2006-11-28 2008-06-03 한국생명공학연구원 알파1산 당단백질과 아사이알로 알파1산 당단백질의 비율을 이용한 간질환 진단킷트
CA2708532C (en) 2007-12-05 2018-06-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-il31ra antibody and use thereof
KR101250464B1 (ko) * 2010-05-06 2013-04-15 대한민국 혈장 내 ｐｇｃｐ 농도 측정을 통한 치매 진단 방법
MX2013009859A (es) 2011-03-01 2014-02-28 Novo Nordisk As Ligandos dr3 antagonicos.
US10544227B2 (en) 2015-04-14 2020-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition for prevention and/or treatment of atopic dermatitis comprising IL-31 antagonist as active ingredient
KR101863508B1 (ko) * 2017-08-03 2018-06-01 주식회사 디아젠 알파-1산 당단백질에 대한 단일항체 agp501 및 rcaⅱ-hrp 접합체를 포함하는 간경변 또는 간암 특이적 진단용 키트 및 이의 용도
KR102269748B1 (ko) * 2019-10-31 2021-06-29 주식회사 에이스바이오메드 간세포 손상 표지자 아시알로 알파-1산 당단백질 측정을 통한 진행성 만성간염 및 간섬유화 정도 추적 진단용 키트 및 이의 용도
WO2021100794A1 (ja) 2019-11-20 2021-05-27 中外製薬株式会社 抗体含有製剤

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4894442A (en) 1985-04-12 1990-01-16 Kuraray Co., Ltd. Monoclonal antibodies that bind to alpha-acid glycoprotein
WO1998022824A1 (en) * 1996-11-18 1998-05-28 Avraham Zer Immunochromatography test strips
KR100292182B1 (ko) * 1997-09-18 2001-11-26 모리시타 요이찌 면역크로마토그라피장치
KR100394940B1 (ko) * 1999-11-10 2003-08-19 주식회사 코비아스 간 질환 진단을 위한 혈중 아사이알로당단백질양의측정방법 및 측정용 킷트

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102439443A (zh) * 2009-03-06 2012-05-02 儿童医院医疗中心 快速横向流动的聚糖检测装置
CN101921336B (zh) * 2009-06-11 2013-02-27 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种抗人α1酸性糖蛋白的单克隆抗体及其制备方法
CN103102411A (zh) * 2009-06-11 2013-05-15 北京华大蛋白质研发中心有限公司 一种制备针对糖基化修饰蛋白质的单克隆抗体杂交瘤的方法
CN104374919A (zh) * 2009-07-14 2015-02-25 独立行政法人产业技术综合研究所 糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物
CN104374919B (zh) * 2009-07-14 2017-01-18 独立行政法人产业技术综合研究所 糖蛋白的测定方法、试剂及糖链标记物
CN105561294A (zh) * 2015-05-07 2016-05-11 中国人民解放军第二军医大学 α1-酸性糖蛋白在制备减肥药物中的应用
CN105561294B (zh) * 2015-05-07 2019-11-01 中国人民解放军第二军医大学 α1-酸性糖蛋白在制备减肥药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20040058551A (ko) 2004-07-05
JP2006522736A (ja) 2006-10-05
EP1576012A4 (en) 2006-05-31
US20060177876A1 (en) 2006-08-10
US7575938B2 (en) 2009-08-18
EP1576012A1 (en) 2005-09-21
CN100384876C (zh) 2008-04-30
KR100499989B1 (ko) 2005-07-07
WO2004058823A1 (en) 2004-07-15
AU2003285814A1 (en) 2004-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1732184A (zh) 抗脱唾液酸α1－酸性糖蛋白的单克隆抗体、用于免疫色谱以检测脱唾液酸α1 －酸性糖蛋白的诊断条和使用其诊断肝病的方法
KR100303525B1 (ko) 면역화학적간이반정량방법및장치
EP0158973B1 (en) Multisite immunometric assay
US4894347A (en) Erythrocyte agglutination assay
JPS59180362A (ja) 免疫定量法における抗イデイオタイプ抗体の使用
WO2004011607A2 (en) Reagent and method for determination of a substance using an immunoaggregator
US20130224884A1 (en) Device and method for immunoassays
JP7013051B2 (ja) 牛妊娠関連グリコタンパク質１に特異的に結合する抗体及びその用途
US5583003A (en) Agglutination assay
EP1568995B1 (en) New probe plate based on antigen-antibody reaction and reagent kit and method using the probe plate
AP156A (en) Agglutination assay.
CN1065729A (zh) 单克隆抗体
EP0308242B1 (en) Agglutination assay
EP3306319B1 (en) Test object detection method, and immunoassay instrument and monoclonal antibody for same
CN107860911A (zh) 一种致病性沙门氏菌测试条的制备方法
CN1237346C (zh) 人髓质素的免疫测定方法以及用该方法诊断多发性硬化
WO2006132809A2 (en) Monoclonal antibody reagents
US20050153382A1 (en) Biochip kit comprising biochip based on antigen-antibody reactions, and its usage
JP2001133460A (ja) Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の高感度免疫測定試薬
CN209356509U (zh) 一种快速定量检测抗ccp抗体的免疫荧光层析试剂盒
AP81A (en) Agglutination assay
CN1252473C (zh) 肝细胞生长因子激活剂的抑制剂－1的抗体和其用途
KR101878209B1 (ko) 항-b형 간염 바이러스 항체 융합체를 포함하는 면역크로마토그래피용 테스트 스트립 및 이를 포함하는 진단용 키트
JP2023518742A (ja) 抗インターフェロンγ抗体を検出するための免疫クロマトグラフィーによる方法及びキット
JPH08226919A (ja) Ｎ−ペプチドのサンドイッチ免疫学的測定法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080430

Termination date: 20100127