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CN1791393A - 用于抑制或预防骨密度减少的组合物、食品和饮料 - Google Patents

用于抑制或预防骨密度减少的组合物、食品和饮料 Download PDF

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CN1791393A CNA2004800137846A CN200480013784A CN1791393A CN 1791393 A CN1791393 A CN 1791393A CN A2004800137846 A CNA2004800137846 A CN A2004800137846A CN 200480013784 A CN200480013784 A CN 200480013784A CN 1791393 A CN1791393 A CN 1791393A
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Kirin Brewery Co Ltd
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Abstract

一种用于抑制或预防骨密度减少的组合物，包含异黄腐酚或异构化啤酒花提取物作为活性成分；或用于这种用途的食品和饮料。使用这种组合物或食品和饮料，可以在抑制或预防骨密度减少的同时，避免在使用雌激素制剂时可能产生的副作用问题。

Description

用于抑制或预防骨密度减少的组合物、食品和饮料
技术领域
本发明涉及用于抑制或预防骨密度减少的组合物、食品和饮料。更具体地，本发明涉及一种用于预防、治疗或改善骨质疏松症的组合物，和用于预防、治疗或改善骨质疏松症的食品和饮料。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨量降低和骨组织细微结构障碍为特征的疾病，并会导致骨脆度和骨折几率的增加。骨质疏松症正在变成一种世界性的严重健康问题，三分之一的更年期妇女和大多数的老年人(包括男人和女人)都遭受到骨质疏松症的困扰。比如在日本，与骨质疏松症有关的骨折是产生“卧床不起者”的排在第三位的原因，也是导致医疗费用膨胀的原因之一。另外据认为，老年社会的发展也产生了数量更加庞大的骨质疏松症患者。因此，研制用于预防、治疗或改善骨质疏松症的药物可以说是非常重要的。
据认为，骨量减少在40岁以后逐渐发展的一个因素，是由于年龄增长而导致肠道的钙吸收减少或由于体内维生素D3量降低而使得保持钙稳态的甲状旁腺素分泌增加。其中，对于妇女，在许多情况下，是由于具有促进骨生成和抑制骨吸收功能的雌性激素在更年期减少，导致骨量迅速减少。
到现在为止，已经在临床应用的骨质疏松治疗剂包括，例如，维生素D类制剂、降钙素类制剂、雌激素类制剂、异丙氧黄酮类制剂、维生素K2制剂、促蛋白合成甾类制剂，以及双磷酸盐类制剂。其中，已知雌激素类制剂对于预防或治疗绝经后骨质疏松症是有效的，但另一方面，也已知它们会产生副作用，例如子宫出血、及增加发生乳腺癌或子宫癌的几率。
骨质疏松症的医学治疗在多数情况下都应当持续一段较长的时间，这样，就无法忽视各种问题，例如由于长时间施用药物而导致副作用的发生。因此，直到现在，骨质疏松症的医学治疗都不是针对病因的治疗，而只是对症治疗，例如抑制疾病的发展。
此外，对于骨质疏松，采取预防措施也被认为是非常重要的。然而，通过施用药物进行日常的预防由于费用和安全方面的原因而无法实现。
因此，迫切需要一种高安全性和日常可以使用的骨质疏松症预防剂或治疗剂，而且从安全的观点考虑，从食用的食物中找到骨质疏松症的预防剂或治疗剂是非常有利的。
另一方面，为了使用与药物治疗不同的方法预防骨质疏松，推荐适量摄入包括钙在内的各种营养物，同时改善生活习惯例如限制过量饮酒、戒烟及进行锻炼。既然药物对生物体来说只是一种外源物质而且必须注意治疗产生的副作用，那么，非药物治疗也是有效的。尤其是，据认为通过日常饮食进行治疗也是非常重要的，这样迫切需要发展对于预防、治疗或改善骨质疏松症有效的优良食品。
啤酒花植物是产于欧洲的桑科(Moraceae)多年生草本植物(分类命名为：Humulus luplus)，其球果(由雌花发育而成)叫做啤酒花。啤酒花由于用作啤酒的苦味和调味成分而闻名，人们已经摄取了很多年。啤酒的苦味和味道来源于啤酒花的苦味素部分(球果内苞片根部形成的黄色颗粒)。啤酒花也用作民间药物并且已知其具有例如镇静、入睡和静态睡眠、刺激食欲、健胃和利尿作用等生理学效果。
酒花酮和黄腐酚作为啤酒花的成分在体外实验中已被证明具有抑制骨吸收的作用(日本专利公开号330594/1995和285856/1995，及Biosci Biotech Biochem 61(1)，158-159(1997))。也有报道说，饮用啤酒能够抑制骨矿物质密度减少，并且该活性来自于啤酒花(MikioKatayama等，“Kotsu Soshosho Moderu Ratto Niokeru Biru No KotsuMitsudo Gensho Yokusei Koka(啤酒在骨质疏松症模型大鼠中对于骨矿物质密度减少的抑制作用)”，Proceedings of the 56th Conference andScientific Meeting of The Japanese Society of Nutrition and FoodScience(发表于2002年6月20日的The Japanese Society of Nutritionand Food Science，326p，31-10p)。
迄今为止，也已知啤酒花具有雌激素活性(例如，Munch.Med.Wschr.95，845(1953))。在1999年，作为一种具有雌性激素活性的物质，从啤酒花中分离出了8-异戊二烯柚皮素(J.ClinicalEndocrinology & Metabolism 83(6)，2249-2252(1999))。因此，基于这种活性，人们认为使用8-异戊二烯柚皮素浓度显著提高的啤酒花浓缩物用于预防、或治疗绝经后骨质疏松症是有效的。然而，尽管如此，和雌激素类制剂一样，人们还是担心其会导致副作用。
啤酒花组分的异构体产物，包括，例如异酒花酮(异-α酸)和异黄腐酚。这些物质是在啤酒生产过程中(在麦芽汁煮沸工序中)添加的啤酒花组分经异构化作用而在啤酒中产生的。顺便提一句，据报道在啤酒中异黄腐酚的含量为0.04至3.4mg/L(J.Chromatogr.A832(1999)p97-107)。同样，在可能是异酒花酮含量最高型的啤酒(Foreign Extra Stout：Guinness Malaysisa Berhad生产：源自Brauindustrie)中，异酒花酮的含量为大约60mg/L。
WO01/76614公开了包含植物来源的生长因子产生增强物质的食品、饮料等等，异黄腐酚作为一种生长因子产生增强物质也被提及。此外该专利还公开了该生长因子产生增强物质显示增强肝细胞生长因子(HGF)和神经生长因子(NGF)产生作用并可以用于治疗疾病，例如，肝病、胃肠损伤、肺炎和糖尿病。
然而，据本发明人所知，异黄腐酚可以改善骨质疏松症的活性还是未知的。日本专利公开文本330594/1995号描述的是异酒花酮与酒花酮一起作为活性成分。然而在该文中，并没有关于异酒花酮对于骨吸收具有抑制活性的明确证据。
发明概述
本发明人已经发现，在啤酒等中包含的异构化啤酒花衍生组分对抑制或预防骨矿物质密度减少是非常有效的。并认为这种效果可以用于预防、治疗或改善骨质疏松症。此外，本发明人已经发现，这种效果是以异黄腐酚为基础的，并且异黄腐酚的效果要好于其类似物—黄腐酚的效果。本发明正是基于上述发现基础上的。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于预防、治疗或改善骨质疏松症的组合物、食品和饮料，其具有高度的安全性和有效性。
根据本发明，提供一种抑制或预防骨矿物质密度减少的组合物，包含异黄腐酚作为活性成分。根据本发明的用于抑制或预防骨矿物质密度减少的组合物可以包含含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物作为活性成分。
此外，根据本发明，提供一种预防、治疗或改善骨质疏松症的组合物，包含异黄腐酚作为活性成分。
此外，根据本发明，提供一种预防、治疗或改善骨质疏松症的组合物，包含含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物作为活性成分。
此外，根据本发明，提供用于抑制或预防骨矿物质密度减少的食品和饮料，包含异黄腐酚或包含含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物。
此外，根据本发明，提供非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其包含活性成分异黄腐酚的量使得每个成人每天摄取的异黄腐酚为0.003至0.5mg/kg体重。
在本发明的另一个实施方案中，提供非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其包含活性成分异黄腐酚的量使得每次摄取的异黄腐酚为0.2至30mg。
根据本发明的组合物或食品和饮料中的活性成分对于抑制或预防骨矿物质密度减少非常有效，此外也预期其具有增加骨矿物质密度的作用。该活性成分包含在啤酒等之中，其作为食品和饮料中的饮料已经饮用多年。这样，根据本发明的组合物或食品和饮料，当患者或想预防骨质疏松症的人摄取或食用较长时间时也基本上不会显示出副作用，因此是高安全性的。此外，需要注意的是，根据本发明的组合物或食品和饮料当使用的剂量大于可获得预想效果的剂量至少1000倍时，在未成年大鼠中依然观测不到任何雌激素作用。因此，根据本发明，在获得预防、治疗或改善骨质疏松症的优良效果的同时，还能避免如使用雌激素类制剂时由于雌激素作用而产生的副作用，例如，避免发生子宫出血、乳腺癌或子宫癌的危险增加。
附图简述
图1显示实施例中实验2的结果，其显示的是用MCF-7细胞生长作为指标时异黄腐酚和8-异戊二烯柚皮素的雌激素活性，其中IXH代表异黄腐酚，8PN代表8-异戊二烯柚皮素，E2代表17β-雌二醇；
图2显示实施例中实验3-a的结果，其显示的是对于未成年大鼠，异黄腐酚和8-异戊二烯柚皮素的体内雌激素活性，其中IXH代表异黄腐酚，8PN代表8-异戊二烯柚皮素，E2代表17β-雌二醇，*表示P＜0.05，***表示P＜0.001。
图3显示实施例中实验3-b的结果，其显示的是对于切除卵巢的大鼠，异黄腐酚、8-异戊二烯柚皮素和啤酒的体内雌激素活性，其中IXH代表异黄腐酚，8PN代表8-异戊二烯柚皮素，***表示P＜0.001；
图4显示实施例中实验3-b的结果，其显示的是对于切除卵巢的大鼠，异黄腐酚和啤酒的体内雌激素活性，其中IXH代表异黄腐酚，E2代表17β-雌二醇，***表示P＜0.001；
图5显示实施例中实验4的结果，其显示的是对于切除卵巢的大鼠，异黄腐酚、8-异戊二烯柚皮素和啤酒的抑制骨矿物质密度减少的活性，其中IXH代表异黄腐酚，8PN代表8-异戊二烯柚皮素，*表示P＜0.05，***表示P＜0.001；
图6显示实施例中实验4的结果，其显示的是对于切除卵巢的大鼠，异黄腐酚、黄腐酚、异-α酸和啤酒的抑制骨矿物质密度减少的活性，其中IXH代表异黄腐酚，XNT代表黄腐酚，α代表包含异-α酸的啤酒花提取物，E2代表17β-雌二醇，*表示P＜0.05，***表示P＜0.001；
图7显示实施例中实验5的结果，其显示的是对于切除卵巢的大鼠，加入异黄腐酚的大麦茶的抑制骨矿物质密度减少的活性，其中，0mg/L代表在大麦茶中不加入异黄腐酚，2mg/L，10mg/L和50mg/L各自代表在加入异黄腐酚的大麦茶中异黄腐酚的浓度，E2代表17β-雌二醇，相对于施用水的对照组，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，而相对于不加入异黄腐酚的大麦茶组，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；及
图8显示实施例中实验5的结果，其显示的是对于切除卵巢的大鼠，加入异黄腐酚的绿茶的抑制骨矿物质密度减少的活性，其中，0mg/L代表在绿茶中不加入异黄腐酚，10mg/L代表在加入异黄腐酚的绿茶中异黄腐酚的浓度为10mg/L，E2代表17β-雌二醇，相对于施用水的对照组，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，而相对于不加入异黄腐酚的绿茶组，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01。
发明详述
异黄腐酚
如上所述，根据本发明的组合物、食品和饮料，包含作为活性成分的异黄腐酚或包含含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物。
异黄腐酚可以是通过对可购得的黄腐酚(例如购自ApinChemical)进行异构化或对从啤酒花提纯的高纯度异黄腐酚进行异构化而制备的。
黄腐酚可以从啤酒花中提纯，例如，采用下列的方法。用乙醇提取干燥啤酒花，过滤提取物，然后减压浓缩过滤液。然后，用己烷和85％乙醇的水溶液对浓缩物进行液-液分配，以分离乙醇水溶液相，然后进行减压浓缩。将浓缩物溶解于氯仿：己烷(5∶2)中，再将溶液通过硅胶柱，从所获得的级分中分离出被洗脱的黄腐酚级分。将分离出来的级分的洗脱液进行减压浓缩，再用己烷和醋酸乙酯反复重结晶以获得纯化的黄腐酚。
可以通过在碱或者氧化镁存在的条件下加热黄腐酚或其他常规的方法来进行黄腐酚的异构化。
下面描述的是异构化的一个具体实例。将黄腐酚溶解于醇溶剂例如乙醇中。向该溶液中加入弱碱性水。在弱碱性水存在条件下回流加热(例如，约92到93℃)该混合物以进行黄腐酚的热异构化，从而获得异黄腐酚。如果需要，通过异构化生产的异黄腐酚可以用常规方法进行浓缩或纯化，例如，过滤、减压浓缩，或冻干。
异构化啤酒花提取物
在本发明中，异构化啤酒花提取物是指通过对例如从啤酒花中提取的含有异黄腐酚的啤酒花提取物进行异构化而生产的啤酒花提取物。特别地，异构化啤酒花提取物主要是通过获得来源于啤酒花的苦味素部分的提取物(啤酒花提取物)并对该提取物进行异构化来生产的。
例如，啤酒花提取物可以通过对啤酒花球果或其压缩物或在磨碎后进行提取操作来制备。
提取操作的一个例子是采用乙醇溶剂的提取方法，该方法也作为啤酒酿造中啤酒花提取物的制备方法。可选择地，其他常用的啤酒花提取方法也可以用于提取操作，这些方法的例子包括(1)将啤酒花球果、其粉碎物等等浸入溶剂中，进行例如浸渍或消化的方法；(2)通过加热和搅拌进行提取，过滤获得提取物的方法；或(3)渗滤法。
通过上述提取操作获得的粗提物，如果需要，可以通过过滤或离心法除去固体物质。这样获得的液体可以作为啤酒花提取物使用。可选择地，在作为啤酒花提取物使用前，可以蒸发除去液体中的溶剂而部分浓缩或干燥该液体。浓缩或干燥后的提取物可以进一步用不溶性溶剂洗涤纯化。然后可进一步溶解或悬浮于适当的溶剂中。此外，在本发明中，在使用前，啤酒花提取物(液体)可以用常规方法例如减压干燥或冻干处理以获得啤酒花提取物的干燥产品。
提取可用的溶剂包括：水；及常规的有机溶剂，例如具有1到4个碳原子的低级醇，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇；低级烷基酯，如醋酸乙酯；二醇，如乙二醇、丁二醇、丙二醇及丙三醇；极性溶剂，如乙醚、丙酮及醋酸；烃类如苯及己烷；和非极性溶剂，例如醚类，如乙醚及石油醚。这些溶剂也可以两种或多种组合使用。
在本发明一个优选的实施方案中，黄腐酚含量较高的啤酒花提取物可以通过下述步骤获得：使用例如乙醇或水的溶剂来制备包含黄腐酚的提取物，再将提取物进行超临界二氧化碳提取以除去其中所含的α酸和β酸的部分。在此情况下，如果需要，可以过滤以从啤酒花提取物中除去不溶性部分，或也可选择通过将提取物减压浓缩等方法除去溶剂以使啤酒花提取物蒸发至干燥。
这样获得的啤酒花提取物至少包含黄腐酚。啤酒花提取物除了黄腐酚以外，有时也包含很少量的异构化产物异黄腐酚。在这种情况下，在本发明中，这种啤酒花提取物(非异构化啤酒花提取物)同样也可以使用。然而，一般地，将这种啤酒花提取物进一步异构化以获得用于本发明的异构化啤酒花提取物。
啤酒花提取物可以通过在碱或氧化镁存在下加热，或使用其它常规的方法进行异构化。这样，包含在啤酒花提取物中的黄腐酚就转变成为异黄腐酚。
下面描述的是一个具体的异构化的例子。将含有黄腐酚的啤酒花提取物溶解于醇溶剂例如乙醇中。向该溶液中加入弱碱性水。在弱碱性水存在条件下将混合物回流加热(例如，约92到93℃)以进行啤酒花提取物的热异构化，从而获得含有异黄腐酚的啤酒花提取物。如果需要，异构化啤酒花提取物可以用常规方法进行浓缩或纯化，例如，过滤、减压浓缩，或冻干。出于安全性的考虑，在异构化处理中优选使用的弱碱性(例如，pH8.5到9.5)水是商业购得的水，例如可饮用的离子化碱性水，如瓶装水。由于具有良好的饮用经验，商业购得的可饮用水是高度安全的。此外，由于上述的异构化与在啤酒酿造中麦芽汁煮沸过程中发生热异构化的反应类型是基本相同的，因此从提供食品和饮料的方面来考虑，安全性也是非常高的。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，异构化啤酒花提取物是通过异构化由乙醇溶剂提取获得的含有黄腐酚的啤酒花提取物来制备的。在这种情况下，更优选的，异构化是通过在碱性水中回流加热啤酒花提取物而完成的。这里的乙醇溶剂是指，例如，主要含有乙醇的溶剂或由乙醇和水组成的溶剂。
在本发明中，异构化处理获得的异构化啤酒花提取物可以直接用于组合物或食品和饮料的生产。然而，优选地，获得和使用的是包含较高浓度活性成分的分馏产品。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，在本发明的组合物或食品和饮料中作为活性成分的异构化啤酒花提取物与仅通过啤酒花提取物异构化作用获得的产物相比，异黄腐酚的含量更高。
在本发明中，也可使用经过各种方法提取的商业购得的啤酒花提取物，并在使用前异构化以获得异构化啤酒花提取物。可选择地，也可以使用商业购得的异构化啤酒花提取物。
具有较高浓度异黄腐酚的异构化啤酒花提取物可以采用下列方法容易地制得，包括：异构化提取自啤酒花的啤酒花提取物而获得常规的异构化啤酒花提取物，然后用常规方法处理异构化啤酒花提取物，例如浓缩、添加异黄腐酚、或者除去异黄腐酚以外的组分。
商业购得的啤酒花提取物的例子包括用如下方法制备的啤酒花提取物：用乙醇提取啤酒花球果的粉碎物，然后用超临界二氧化碳提取法分馏该提取物以提高黄腐酚的含量(例如购自Hopsteiner的Xanthohumol-enriched Hop product(商品名)和包含大约80％黄腐酚的产品(购自Hopsteiner的Xantho-pure(商品名))。它们可以通过异构化而获得异黄腐酚含量较高的异构化啤酒花提取物。
更不必说可以用包括上述方法在内的方法通过浓缩由这些提取物制备活性成分含量较高的分馏产品。
在本发明的一个更优选的实施方案中，在根据本发明的组合物或食品和饮料中作为活性成分的异构化啤酒花提取物中包含的异黄腐酚为0.005至90％重量，更优选8至90％重量。
此外，在食品和饮料中，当在食品和饮料的生产过程中包括黄腐酚的异构化步骤，例如加热的步骤时，可以在食品和饮料加热步骤前加入上述的啤酒花提取物，优选与常规的啤酒花提取物相比，黄腐酚含量更高的啤酒花提取物，以使得最终的产品中包含异黄腐酚。上述食品和饮料具有代表性的例子包括啤酒和低麦芽啤酒。在啤酒和低麦芽啤酒中，可以在麦芽汁煮沸的步骤中加入上述的啤酒花提取物，以使得最终的产品中包含异黄腐酚。当上述的方法使用富含黄腐酚的啤酒花提取物时，不需要把在啤酒中作为苦味组分的异酒花酮的浓度增加到超过必要的水平(即是说，不需要使苦味达到过度的水平)就能够生产异黄腐酚含量较高的产品。关于这一方面，需要注意的是，异构化步骤并不排除上述实施方案，上述方案中包括：在生产过程中或向最终产品中加入纯化的异黄腐酚，异黄腐酚含量较高的异构化啤酒花提取物，该提取物是通过异构化例如黄腐酚含量较高的啤酒花提取物(例如，购自Hopsteiner的Xanthohumol-enriched hop product(商品名))，或包含大约80％黄腐酚的产品(购自Hopsteiner的Xantho-pure(商品名))而获得的。
用途
在切除卵巢的动物和人中，可以观察到破骨细胞激活作用和骨吸收增强。然而一般地，当加入雌性激素后，破骨细胞激活作用和骨吸收增强导致的骨量减少的现象会消失。但是，迄今并未阐明这种作用是如何发生的。然而，据认为，例如与骨吸收有关的细胞因子IL1、细胞因子IL6、TGFβ、前列腺素E等等以一种复杂的方式参与了这种作用。除了由于缺乏雌性激素而导致骨吸收增强外，肠道钙吸收的抑制也被认为是骨量减少的原因之一。
雌性激素与核受体相结合发挥了这种作用。近年来，发现存在着两种类型的受体：α和β。此外，近年来，发展了(SERMs)类药物，其对某些器官具有雌性激素的作用，但是对另外的组织却具有相反的作用。预期这些药物可以作为不具有显著副作用的药物。一种试图对这种现象进行的解释是，通过两种受体类型，该类药物对某些器官的作用机理与对其他器官的作用机理是不同的。
绝经后骨质疏松症的发病机理是复杂和多样的，其中很大一部分尚未阐明。因此，预防或治疗绝经后骨质疏松症的效果并不能够仅仅通过雌激素激动剂活性得到令人满意的解释。实际上，例如在日本，由于副作用的原因，在临床主要使用的是不具有雌激素激动剂活性的制剂。
正如在下面将要描述的实施例的实验4中所示，其利用的是切除卵巢的大鼠，异黄腐酚显著地改善了由于卵巢中雌激素的分泌被阻断而导致的骨矿物质密度减少。基于这个事实，可以认定是异黄腐酚直接或间接作用于破骨细胞而抑制了骨吸收作用。另一方面，实施例的实验2显示了，在体外实验中异黄腐酚具有雌激素活性。在此情况下，即使剂量比在切除卵巢的大鼠中出现改善骨矿物质密度减少作用的剂量大至少1000倍，在未成年大鼠中也不会观测到子宫肥大的作用(见下面将要描述的实施例的实验3)。基于此，可以认定，异黄腐酚对于骨组织具有比对于子宫更高的选择性，尽管它与雌性激素的一种——17β-雌二醇具有不同的机理，也就是说，其与雌激素受体具有相互作用。
因此，使用常规雌激素制剂的药物疗法会让人担心其产生的副作用，例如子宫出血及增加发生乳腺癌和子宫癌的几率，而根据本发明的活性成分能够预防、治疗或改善骨质疏松症，同时可以避免产生上述的副作用。
因此，根据本发明的组合物或食品和饮料能够用于抑制、改善或预防骨矿物质密度减少。如有可能，根据本发明的组合物或食品和饮料也可以用于增加骨矿物质密度。因此，根据本发明的组合物或食品和饮料能够用于预防、治疗或改善骨质疏松症。
这里的术语“骨矿物质密度”是指在目标哺乳动物的骨中，每给定体积内矿物质如钙的量，可以通过常规方法测定骨矿物质密度。常规方法的例子包括X射线法(例如，DXA，MD和pQCT法)和超声波法(例如，QUS法)。在本发明中，骨矿物质密度可以用例如下面将要描述的实施例的实验4所述的方法来进行测定。
根据本发明，提供一种抑制或预防哺乳动物骨矿物质密度减少的方法，所述方法包括下列的步骤：将有效量的异黄腐酚或含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物施用于哺乳动物，或允许哺乳动物摄取有效量的异黄腐酚或含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物。此外，本发明提供一种预防、治疗或改善骨质疏松症的方法，所述方法包括下列步骤：将预防、治疗或改善有效量的异黄腐酚或含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物施用于哺乳动物，或允许哺乳动物摄取预防、治疗或改善有效量的异黄腐酚或含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物。这里的“有效量”可以根据下面所述的异黄腐酚的剂量进行选择。
根据本发明的另一方面，提供异黄腐酚或异构化啤酒花提取物在制造用于抑制或预防骨矿物质密度减少的组合物中的用途。此外，根据本发明的另一方面，提供异黄腐酚或异构化啤酒花提取物在制造用于预防、治疗或改善骨质疏松症的组合物中的用途。
组合物、食品和饮料
根据本发明的组合物包含作为活性成分的异黄腐酚或异构化啤酒花提取物。
这里，“包含作为活性成分”是指可以根据所需要的制剂加入药学可接受的载体，另外，也可以加入其它可与本发明的组合物联合使用的药物。
根据本发明的组合物可以通过口腔或胃肠外给药。特别地，口服制剂包括颗粒、粉剂、片剂(包括糖包衣片)、丸剂、胶囊、糖浆剂、乳剂和悬浮剂。胃肠外制剂包括注射剂(例如皮下注射、静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射)、滴剂、外用制剂(例如，经鼻制剂、经皮制剂、及软膏)，及栓剂(例如，直肠栓剂和阴道栓剂)。可以使用本领域常用的方法，加入药学可接受的载体来制备上述的制剂。
药学可接受的载体包括赋形剂、粘合剂、稀释剂、添加剂、芳香剂、缓冲剂、增稠剂、着色剂、稳定剂、乳化剂、分散剂、悬浮剂和防腐剂。可以使用下列的载体，例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂。
可以和根据本发明的活性成分合用的其它药物包括，例如，氨基酸、抗生素、维生素D类制剂、降钙素类制剂、雌激素类制剂、异丙氧黄酮类制剂、维生素K2制剂、促蛋白合成甾类制剂，以及双磷酸盐类制剂。
所述制剂可以通过例如下面的方法进行生产。
生产口服制剂时，例如，可以向活性成分加入赋形剂(如乳糖、蔗糖、淀粉和甘露醇)、崩解剂(如碳酸钙、羧甲基纤维素钙)、粘合剂(如凝胶化淀粉、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素)，或润滑剂(如，滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇6000)，对该混合物进行压片，任选地用已知的方法对该压片产品包衣，以达到掩味、利于肠溶或具有持久性的目的。可用的包衣材料包括，例如乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚氧乙二醇、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、及Eudragit(由德国Roehm Pharma生产；甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)、明胶和支链淀粉。
生产注射剂时，例如，在例如水溶剂(例如，蒸馏水、盐水、林格液等)或油溶剂(例如，植物油如橄榄油、芝麻油、棉花籽油和玉米油、丙二醇)中溶解、悬浮或乳化活性成分的同时，加入分散剂(例如，Tween 80(由Atlas Powder Co.，(US)生产)，HCO60(由Nikko Chenicals Co.，Ltd.生产)，聚乙二醇、羧甲基纤维素、藻酸钠等)，防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇、三氯叔丁醇、和苯酚)，张度调节剂(例如，氯化钠、甘油、山梨醇、葡萄糖、和转化糖)等等。在此情况下，如果需要，可以加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠和醋酸钠)，稳定剂(例如，人血清白蛋白)，无痛剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因)。
生产外用制剂可将活性成分加入到固体、半固体或液体组合物中。例如固体组合物的制备可以是将活性成分加入到粉剂中，或在活性成分中加入和混入赋形剂(例如乳糖、甘露醇、淀粉、微晶纤维素和蔗糖)，增稠剂(例如，天然胶质、纤维素衍生物和丙烯酸聚合物)等，再将该组合物加入到粉剂中。液体组合物的制备方法与注射液基本相同。半固体组合物可以是水或油性胶凝剂或软骨质的形式。此外，这些组合物都可以进一步加入pH调节剂(例如，碳酸、磷酸、柠檬酸、盐酸、或氢氧化钠)，防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯，三氯叔丁醇、苯扎氯胺)等。
生产栓剂可将活性成分加入到油性或水性固体、半固体或液体组合物中。组合物中可用的油性基质包括，高级脂肪酸的甘油酯(例如，可可脂和Wittep sol(由Dynamit Nobel生产))，中级脂肪酸的甘油酯(例如，由Dynamit Nobel生产的Miglyol)，或植物油(例如，芝麻油、大豆油和棉花籽油)。水性基质包括聚乙二醇和丙二醇。水性凝胶基质包括天然胶质、纤维素衍生物、乙烯基聚合物和丙烯酸聚合物。
根据本发明的食品和饮料包含有效量的根据本发明的活性成分。
这里，“包含有效量的活性成分”是指所包含的活性成分的量，使得分别以通常的量摄取食品和饮料后，所摄取的活性成分的量在下面所述的范围内。根据本发明的活性成分可以以上面的组合物形式加入到本发明的食品和饮料中。更特别地，根据本发明的食品和饮料可以是用如下方法制备的：将根据本发明的活性成分或上述啤酒花粉碎物或提取物等或将其异构化后加入到食品和饮料中，也可进一步在食品和饮料中加入各种蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素等，或将本发明的食品或饮料加入到常规的食品和饮料中。
在本发明中，“食品和饮料”没有特别的限制，只要它们不是药物并可被哺乳动物摄取，食品和饮料的形式可以任意是液体、半固体或固体。因此，食品和饮料包括，例如饮料的形式。此外，食品和饮料包括健康食品、功能性食品、特定保健用食品和供患者使用的食品。此外，“食品和饮料”用于人类以外的哺乳动物时，还包括饲料。
本发明的活性成分对于骨量减少具有抑制或预防的功能。因此，在日常摄取的食品和健康食品和作为补充食品摄取的功能性食品中，适当地在包含一种或多种矿物质例如钙和镁，及维生素例如维生素K的食品和饮料中，加入本发明的活性成分，能够获得具有预防骨质疏松症发病、治疗和改善骨质疏松症的内在功能，并且具有防止初期病症发展成骨质疏松症的功能的食品和饮料。
这样，根据本发明的食品和饮料可以是适合于想要增加骨矿物质密度或预防骨矿物质密度减少的消费者使用的食品和饮料，或者是适合于担心骨健康的消费者使用的食品和饮料，也就是说，是所谓的特定保健用食品。
这里所说的特定保健用食品是指在用于抑制或预防骨矿物质密度减少目的而生产或出售等时，出于健康的观点而在某些国家的法律中具有一定限制的食品和饮料。
食品和饮料的具体的例子包括包含碳水化合物的食品和饮料，例如稻米、面条、面包、面团(pasta)；各种糕饼包括西式糕饼例如饼干和蛋糕，日式糕饼例如蒸的豆-果酱小面包(bean-iam bun)和豆类甜果冻，糖果、口香糖、冷点心例如酸乳酪和布丁、冰点心等等；各种饮料，包括果汁、软饮料、乳类饮料、茶类饮料、功能性饮料、补充营养性饮料、不含酒精的啤酒等等；酒精饮料例如啤酒和低麦芽啤酒；利用鸡蛋的加工食品或利用海产(墨鱼、章鱼、贝壳类动物、鳗鱼等)或动物肉(包括各种肉例如肝脏)的加工食品。
食品和饮料优选是非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料。这里，“非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料”是指一类不包含至少使用一种啤酒花和谷类作为原料发酵产生的发酵成分(例如，啤酒和低麦芽啤酒)的食品和饮料。也就是说，非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料所指的食品和饮料不同于包含啤酒花作为原料的发酵型饮料，例如啤酒和低麦芽啤酒。通过提供非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，和在食品和饮料中加入有效量的异黄腐酚，可以实现骨健康的恢复、保持或发展。
在本发明的一个更优选的实施方案中，食品和饮料包括茶类饮料、乳类饮料，和酸乳酪。在本发明的另一个优选的实施方案中，食品和饮料是一种饮料。
茶类饮料是指这样一种饮料，例如，其煮泡茶树(一种茶科(Theaceae)的常绿树)的叶子(茶叶)，或茶树以外的植物的叶子或谷物，用于饮用。茶类饮料包括所有的发酵茶、半发酵茶和非发酵茶。茶类饮料的具体例子包括日本茶(例如绿茶或大麦茶)、红茶、草药茶(例如，茉莉花茶)、中国茶(例如，中国绿茶、乌龙茶)、或焙炒过的茶。
乳类饮料是指生奶、牛奶等等，或用它们作为原料制备食品，再将该食品作为一种主要原料制备的饮料。乳类饮料包括用牛奶等作为原料的饮料，此外，还包括例如用加工牛奶如营养强化型牛奶、加味牛奶及加糖分解牛奶作为原料的饮料。
酸乳酪包括任何硬型、软型、和饮料型的制品，此外还包括用酸乳酪作为原料制备的加工的酸乳酪制品。
当把通过异构化本发明的活性成分获得的产品，或啤酒花的粉碎物或提取物加入到常规食品的原料中制备食品时，如下所述，优选活性成分或粉碎物或提取物的用量，使活性成分或啤酒花的苦味不会影响食品和饮料的味道，或者采用技术掩盖苦味。
一般地，啤酒花派生的食品和饮料例如啤酒、不含酒精的啤酒、和低麦芽啤酒有时也包含给定量或较大量的根据本发明的活性成分。也就是说，这些常规的包含异黄腐酚的食品和饮料不是仅仅加入啤酒花组分的食品和饮料，而是对啤酒花组分异构化而制备的食品和饮料。这些上述的食品和饮料，也同样被用作根据本发明的食品和饮料。然而，在这些食品和饮料中加入异黄腐酚或含有异黄腐酚的提取物或异构化啤酒花提取物可以进一步增强所希望的效果或者可以减少有效的摄取量。
常规的包含异黄腐酚的食品和饮料的例子包括啤酒。如上所述，啤酒中异黄腐酚的含量是，例如，0.04至3.4mg/L。然而，啤酒中也包含作为苦味组分的异酒花酮和具有雌激素活性的8-异戊二烯柚皮素。例如，已知啤酒中8-异戊二烯柚皮素的含量落在一个较宽的范围内，为异黄腐酚含量的1/6至1/133(J.Chromatogr.A 832，97-1071999)。
在根据本发明的食品和饮料中，从成本的观点来看，使用啤酒花提取物的异构化产物比使用纯化的异黄腐酚更有利。
在食品和饮料中使用异构化啤酒花提取物时，优选也需要考虑到由异酒花酮等产生的苦味所引起的感觉方面。在此情况下，优选通过使用富含黄腐酚的啤酒花提取物或富含异黄腐酚的异构化啤酒花提取物，使得与食品和饮料中异黄腐酚的含量相比，异酒花酮的含量相对较低。可选择地，可以采用对苦味组分进行掩味的方法，此外，可以增加啤酒花、啤酒花提取物、或者异构化啤酒花提取物的量。
在食品和饮料中，当基本上不存在费用的问题时，可以在制备食品的过程中或向最终产品中加入纯化的异黄腐酚。可选择地，当制备过程包含异构化反应的步骤时，可以在该步骤之前加入纯化的异黄腐酚。
根据本发明的组合物或食品和饮料使用的是人们已经作为食品和饮料摄取了多年的啤酒花提取物组分或其衍生物，因此其毒性是较低的。这样，它们可以安全地用于哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、和猴子)。
当根据本发明的组合物施用于哺乳动物以增加哺乳动物的骨矿物质密度时，或施用于哺乳动物以抑制、改善、或预防哺乳动物的骨矿物质密度减少(优选当希望预防、治疗、或改善骨质疏松症时)时，剂量的确定需要考虑，例如，受者、受者的年龄和体重、症状、给药周期、剂型、给药方法和药物的联合。例如，当根据本发明的活性成分作为一种药物进行给药时，口服剂量为0.01至100mg/kg-成人体重，优选0.02至50mg/kg-成人体重，胃肠外给药剂量为0.005至10mg/kg-体重，优选0.01至10mg/kg-体重。上述剂量可以是一天一次施用，或者一天多次分开施用。
当使用异构化啤酒花提取物作为活性成分时，可以根据异黄腐酚的量施用，使每个成年人的摄取量不超过5mg/kg-重量·天(摄取量：每个成年人每天不超过300mg)，优选不超过1mg/kg-体重·天。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明的组合物包含异黄腐酚的量，使得每个成年人每天异黄腐酚的摄取量为0.003至5mg/kg-体重·天(60kg体重的成年人每天异黄腐酚的摄取量为0.2至300mg)。更优选地，每个成年人异黄腐酚摄取量的下限是不少于0.013mg/kg-体重·天(60kg体重的成年人每天摄取不少于0.8mg)，更优选地，不少于0.02mg/kg-体重·天(60kg体重的成年人每天摄取不少于1.2mg)。
在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明的食品和饮料包含异黄腐酚的量，使得每个成年人每天异黄腐酚的摄取量为0.003至0.5mg/kg-体重·天(60kg体重的成年人每天异黄腐酚的摄取量为0.2至30mg)。更优选地，每个成年人的异黄腐酚摄取量的下限是不少于0.013mg/kg-体重·天(60kg体重的成年人每天摄取量不少于0.8mg)，更优选不少于0.02mg/kg-体重·天(60kg体重的成年人每天摄取不少于1.2mg)。
异黄腐酚摄取量的下限，即0.003mg/kg-成人体重·天(60kg体重的成年人每天摄取0.2mg)相当于施用异黄腐酚浓度为2mg/L的受试试剂，在后面将要描述的实施例的实验4和实验5中已经证实，后者在10mg/kg的剂量时是有效的。更特别地，该剂量下限是根据大鼠的体表面积和人的体表面积的比例而进行剂量转化得出的值。由大鼠每千克体重的剂量转化值得到的每个成年人的摄取量是0.02mg/kg-体重·天(60kg体重的成年人每天摄取1.2mg)。
对于食品和饮料，异黄腐酚的摄取量的上限，即0.5mg/kg-成人体重·天，或60kg体重的成人每天摄取30mg，是考虑到异黄腐酚的溶解性和饮食的经验而确定的。即使当异黄腐酚的摄取量大于上述上限值时，其抑制骨矿物质密度减少的功能也不会消失。因此，如果可能，食品和饮料中可以包含超过上述上限值量的异黄腐酚。
在本发明一个优选的实施方案中，食品和饮料中包含异黄腐酚的量，使得每次异黄腐酚的摄取量为0.2至30mg，更优选0.8至30mg，更优选1.2至30mg。
这里所说的“每次异黄腐酚的摄取量”是指人每次进食活动摄取的食品和饮料中包含的异黄腐酚的量。因此，对于基于该产品将由人一次进食活动所摄取的假设制备而成的食品和饮料，“每次异黄腐酚的摄取量”相当于在这些食品和饮料中包含的异黄腐酚的量。
基于该产品将由人一次进食活动所摄取的假设制备而成的食品和饮料，其形式的确定可以适当地考虑物理因素，例如想要摄取食品和饮料的客体的年龄、性别、体力、和健康状况，及摄取食品和饮料时的环境、气候等。例如，这些食品和饮料的形式是以范围为100至500ml(优选100至350ml)的含量单位装在容器内的饮料。
当基于该产品将由一次进食活动所摄取的假设制备而成的食品和饮料的形式是100ml的瓶装饮料时，100ml饮料包含的异黄腐酚量相当于上述的异黄腐酚摄取量(0.2至30mg)。这样，在该饮料中异黄腐酚的浓度为2至300mg/L。同样地，当基于该产品将由一次进食活动所摄取的假设制备而成的食品和饮料的形式是350ml的瓶装饮料时，350ml饮料包含的异黄腐酚量相当于上述的异黄腐酚摄取量(0.2至30mg)。这样，在该饮料中异黄腐酚的浓度为0.57至85.7mg/L。
此外，下面描述一个具体的例子。在上述食品和饮料的形式中，在瓶装饮料(容量单位：100ml、200ml、和350ml)中异黄腐酚的浓度如下表A中所示。
表A
  每次异黄腐酚的摄取量   异黄腐酚浓度，mg/L
  100ml饮料   200ml饮料   350ml饮料
  0.2至30mg   2至300   1至150   0.57至85.7
  1.2至30mg   12至300   6至150   3.43至85.7
制备将被一次进食活动所摄取的需要的容量单位的饮料，可以利用上述表格，或对上述表格中的值进行转化来设定饮料中异黄腐酚的浓度。
实施例
下面的实施例是对本发明进一步的阐释，而不是对本发明的范围进行限定。
制备实施例
实施例A：异黄腐酚的纯化
下面描述的例子是在啤酒(KIRIN LAGER BEER(商品名)，由Kirin Brewery Co.，LTD.(日本)生产)(下文简称为“啤酒”)，和黄腐酚含量较高的粉末状啤酒花提取物(Xanthohumol Enriched Product(商品名)和Xantho-pure(商品名)，都由Hopsteiner生产)中进行的异黄腐酚的纯化。
从啤酒中纯化
将啤酒(1000ml)除气，用1000ml的二乙醚提取其中的800ml部分。二乙醚相用无水硫酸钠脱水，并减压浓缩。然后，加入20ml乙酸乙酯，再将混合物用无水硫酸钠脱水，并减压浓缩至大约1ml。浓缩物通过柱色谱法在硅胶(Kieselgel 60，10g)上分级。用30％乙酸乙酯/正己烷洗柱，然后用60％乙酸乙酯/正己烷洗脱。洗脱级分减压蒸发至干燥，然后溶解于3ml甲醇中。此外，在溶液中加入3ml蒸馏水，然后用HPLC对混合物进一步纯化。HPLC的条件如下。
流动相：45％乙腈和55％蒸馏水
柱：YMC-ODS-AQ 25×250mm(由YMC Co.，Ltd.生产)
保护柱：YMC-ODS-AQ 25×50mm(由YMC Co.，Ltd.生产)
流速：10ml/min，注入量3ml
检测波长：UV 290nm
纯化后异黄腐酚的纯度可以由HPLC分析法和核磁共振(NMR)波谱测量法测定。进行纯度测定的HPLC的条件如下所示。
流动相：液体A(乙腈)，液体B(蒸馏水)，用液体A梯度洗脱(20％到100％)
柱：YMC-hydrosphere C18 4.6×250mm(由YMC Co.，Ltd.生产)
流速：1ml/min，注入量5μl
检测波长：UV 290nm
HPLC分析的结果是，发现异黄腐酚的纯度不低于98％。
将纯化后的异黄腐酚(1mg)溶解于800ml甲醇-d4，利用核磁共振(NMR)波谱器(JNM-A400(由Japan Electric Optical Laboratory生产))用1H-NMR测量法对溶液进行分析。
NMR测定的结果是，发现分离后和纯化的异黄腐酚的化学位移与文献值一致，证明异黄腐酚具有单一的组分。
从啤酒花提取物中纯化(1)
将啤酒花提取物(Xanthohumol Enriched Product(商品名))(1g)加入1L水中，将混合物在高压锅中100℃下煮沸120分钟进行异构化。冷却异构化产物至室温，然后用滤纸过滤上清液以获得滤液。接着，将800ml的滤液用1000ml二乙醚进行提取。二乙醚相用无水硫酸钠脱水，并减压浓缩。然后，加入20ml乙酸乙酯，再将混合物用无水硫酸钠脱水，并减压浓缩至大约1ml。浓缩物通过柱色谱法在硅胶(Kieselgel 60，10g)上分级。用30％乙酸乙酯/正己烷洗柱，然后用60％乙酸乙酯/正己烷洗脱。洗脱级分减压蒸发至干燥，然后溶解于3ml甲醇中。此外，在溶液中加入3ml蒸馏水，然后用HPLC对混合物进一步纯化。HPLC的条件如下。
流动相：45％乙腈和55％蒸馏水
柱：YMC-ODS-AQ 25×250mm
保护柱：YMC-ODS-AQ 50×25mm
流速：10ml/min，注入量3ml
检测波长：UV 290nm
纯化后异黄腐酚的纯度可以由HPLC分析法和核磁共振(NMR)波谱测量法，采用与从啤酒中纯化相同的方法进行测定。
HPLC分析的结果是，发现异黄腐酚的纯度不低于98％。
NMR测定的结果是，发现分离后和纯化的异黄腐酚的化学位移与文献值一致，证明异黄腐酚具有单一的组分。
从啤酒花提取物中纯化(2)
将啤酒花提取物(Xantho-pure(商品名))(2.5g)溶解于50ml乙醇中。向溶液中加入10N的氢氧化钠水溶液(50ml)和蒸馏水至体积为500ml。混合物在沸水浴中煮沸一小时进行异构化，然后冷却至室温。向其中加入12N盐酸(45ml)。接着，冷却所得液并用玻璃棉过滤器抽滤。向所收集的产物中加入乙醚(1.2L)和0.8ml蒸馏水，用液-液分配法提取两次。将乙醚相减压蒸发至干燥。加入少量乙酸乙酯和己烷，反复重结晶得到纯度不低于98％的异黄腐酚。
实施例B：啤酒花提取物的异构化
将商业购得的黄腐酚含量为大约80％的啤酒花提取物(Xantho-pure(商品名))(18g)溶解于2L乙醇中。向溶液中加入弱碱性(pH8.5至9.5)瓶装水(Arukari lon no Mizu(离子化碱性水)(商品名)，由KIRIN BEVERAGE生产)(18L)。混合物在92℃-93℃下回流加热2小时进行热异构化。接着，用滤纸滤去不溶物。然后减压浓缩过滤物，并冻干浓缩物。冻干获得大约18g粉末状的异构化啤酒花提取物。粉末状的异构化啤酒花提取物中异黄腐酚的含量大约是70％。
用与实施例A“从啤酒花提取物中纯化(2)”相同的方法纯化，可以提供纯度不低于98％的异黄腐酚。
实施例C：药物制剂的制备
将下面的组分磨成细粉。它们经过充分搅拌制备成均匀的混合物。然后将混合物按照每胶囊0.2g的量装入支链淀粉胶囊或明胶胶囊中，制备成为胶囊制剂。
由实施例B制备的异构化啤酒花提取物    20g
玉米淀粉                             1880g
氢化菜籽油                           100g
实施例D：食品和饮料的制备(包含异黄腐酚的饮料的制备)
将沸水(2L)加进40g商业购得的大麦茶用大麦中，混合物煮沸5分钟以提取大麦茶。向提取物中加入异黄腐酚使得其浓度为2mg/L、10mg/L、和50mg/L，以制得包含异黄腐酚的大麦茶饮料。这里所用的异黄腐酚是在实施例A的“从啤酒花提取物中纯化(2)”中制备的。
同样地，将2L沸水加进50g商业可购的绿茶叶中，混合物煮沸5分钟以提取绿茶。向绿茶中加入异黄腐酚使其浓度为10mg/L，以制得包含异黄腐酚的绿茶饮料。
评价试验
实验1：啤酒中雌激素活性成分的鉴别
            1-a)测定雌激素活性的方法
用雌激素反应性的人乳腺癌衍生的MCF-7细胞的细胞生长作为指标，测定受试化合物的雌激素活性。所用的细胞株能表达雌激素受体，并在类雌激素物质存在时增强细胞生长。因此，可以使用细胞计数试剂盒(由DOJINDO LABORATORIES生产)测定细胞株的细胞生长来测定雌激素活性。
用细胞计数试剂盒测定MCF-7细胞的细胞生长，可以使用微量培养板读数器(SOFTmax(由Molecular Devices Corporation生产))测定由加入到细胞中的WST-1试剂(2-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑，一钠盐)产生的甲月替在450nm处的吸光度而完成。
更具体地，MCF-7细胞在包含10％的胎牛血清的DMEM培养基(由Gibco生产)中预培养3天，该培养基已经过葡聚糖包被的活性炭(由Sigma生产)的处理，吸收和除去了内源性甾体，此外还包含青霉素和链霉素(各10000单位，1mg/ml，由Gibco生产)，0.1mM非必需氨基酸(由Gibco生产)，1mM丙酮酸钠(由Gibco生产)及1μg/ml胰岛素(人重组体27.5USP单位/mg：(由Sigma生产))。制备MCF-7细胞浓度为8×104细胞/ml的细胞悬浮液，并将悬浮液以100μl/孔的量接种在96孔板上。培养开始一天后，用含有溶解于二甲亚砜的受试化合物(0.1％(v/v))的培养基代替孔中的培养基，并继续培养。在培养的第四天，再用含有受试化合物的新鲜培养基代替孔中的培养基。在培养的第七天，用细胞计数试剂盒测定细胞生长。
使用最为有效的内源性雌激素——17β-雌二醇(由Sigma生产)的二甲亚砜溶液，作为阳性对照物。
         1-b)寻找啤酒中的雌激素活性成分
啤酒除气后，装入ENVI-18柱(10g，60ml，由Supelco生产)，依次用l80ml的20％甲醇的水溶液、180ml的50％甲醇的水溶液、180ml的80％甲醇的水溶液、180ml甲醇洗脱。
用上述方法测定每一级分的雌激素活性。结果，在80％甲醇和甲醇的洗脱级分都观测到了雌激素活性。
将80％甲醇的洗脱级分和甲醇的洗脱级分合并，合并后的级分在减压下蒸发至干燥，然后用硅胶(Kieselgel 60，10g，由Merck生产)进行柱层析，其中用正己烷、含有乙酸乙酯∶正己烷＝1∶7的混合溶剂、含有乙酸乙酯∶正己烷＝1∶4的混合溶剂、和乙酸乙酯分步洗脱。
测定用上述方法获得的各级分的雌激素活性。结果，乙酸乙酯∶正己烷＝1∶7的级分和乙酸乙酯∶正己烷＝1∶4的级分观测到雌激素活性。
将观测到活性的级分减压蒸发至干燥，再溶解到甲醇中。溶液在下述条件下通过HPLC分级。
流动相：液体A(乙腈)，液体B(蒸馏水)，用液体A线性梯度洗脱(40％到100％)
柱：YMC-hydrosphere C18 10×250mm(由YMC Co.，Ltd.生产)
保护柱：YMC-hydrosphere C18 10×30mm(由YMC Co.，Ltd.生产)
流速：2.5ml/min，注入量80μl
检测波长：UV 290nm
以2分钟的间隔收集HPLC级分。用上述方法测定各级分的雌激素活性。
结果如下。
结果，发现在保留时间14分钟和保留时间16分钟之间收集的级分(Fr8)和在保留时间18分钟和保留时间20分钟之间收集的级分(Fr10)具有雌激素活性。
利用质谱仪(DX303，由Japan Electric Optical Laboratory生产)用EI-MS法对包含在Fr8中的物质进行质(MS)谱测定。结果，在m/z 354处观测到一个离子。这与异黄腐酚的标准光谱特性一致。此外，将5mg Fr8溶解于600μl重二甲亚砜中。溶液用核磁共振(NMR)光谱分析仪(UNITY plus type-500，由Varian，Inc.生产)进行1H-NMR、13C-NMR和NOESY-1D测定。结果，证实了Fr8的活性成分是异黄腐酚。
对Fr10进行HPLC质谱(MS)分析。
分析仪器包括与HPLC(HP 1100(由Agilent生产)连接的三级型质谱仪(MS/MS)(Quattro Ultima(由Micromass生产))。HPLC的条件如下。
流动相：液体A(乙腈)，液体B(蒸馏水)，用液体A线性梯度洗脱(55％到90％)
柱：Capcell Pack C18 2.0×150mm(由Shiseido Co.，Ltd.生产)
流速：0.2ml/min，注入量5μl
质谱分析仪的操作条件是，用电喷射离子化系统进行离子化(ESI-)，母离子338.3，子离子218.8，椎体(cone)电压80V，碰撞能20eV。
测定的结果，证实Fr10中8-异戊二烯柚皮素的含量较高。
    1-c)分析啤酒中的异黄腐酚和8-异戊二烯柚皮素
用5ml二乙醚提取啤酒(1ml)两次，在氮气中蒸发至干燥。然后溶解于包含40ppb 2，4-双氢查耳酮作为内标物的50％甲醇的水溶液中，制备成分析物。
分析仪器包括与HPLC(HP 1100(由Agilent生产)连接的三级型质谱仪(MS/MS)(Quattro Ultima(由Micromass生产))。HPLC的条件如下。
流动相：液体A(乙腈)，液体B(蒸馏水)，用液体A线性梯度洗脱(55％到90％)
柱：Capcell Pack C18 2.0×150mm
流速：0.2ml/min，注入量5μl
质谱分析仪的操作条件是，用电喷射离子化系统进行离子化(ESI-)，二种化合物同时用MRM模式进行定量。对于异黄腐酚，测定的离子和离子化条件是母离子352.8，子离子232.8，椎体(cone)电压80V，和碰撞能18eV。对于8-异戊二烯柚皮素，测定的离子和离子化条件是母离子338.3，子离子218.8，椎体(cone)电压80V，和碰撞能20eV。
结果，该实验使用的啤酒中异黄腐酚的浓度为2.1mg/L，8-异戊二烯柚皮素的浓度为43μg/L。
实验2：体外雌激素活性的评价
对于纯化后的异黄腐酚和化学合成的8-异戊二烯柚皮素，可以用与实验1同样的方法测定其雌激素活性，不同之处是培养MCF-7细胞的培养基中受试化合物的浓度设置如下。
加入异黄腐酚，使得培养基中异黄腐酚的浓度为1.0×10-5、1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8、1.0×10-9、及1.0×10-10mol/L。
加入8-异戊二烯柚皮素，使得培养基中8-异戊二烯柚皮素的浓度为1.0×10-7、1.0×10-8、1.0×10-9、1.0×10-10、1.0×10-11、及1.0×10-12mol/L。
加入作为阳性对照的17β-雌二醇，使得培养基中17β-雌二醇的浓度为6.3×10-11、1.6×10-11、3.9×10-12、1.0×10-12、1.0×10-13、及1.0×10-14mol/L。
结果如图1所示。
异黄腐酚和8-异戊二烯柚皮素都具有雌激素活性。将它们的活性与雌二醇的活性进行比较。结果，异黄腐酚的活性是雌二醇的约10-5倍，8-异戊二烯柚皮素的活性是雌二醇的10-2倍。
实验3：体内雌激素活性的评价
           3-a)在未成年大鼠中的评价
用幼小的Wistar雌性大鼠进行体内雌激素活性的评价。
所使用的大鼠是由如下方法提供的。开始时，选择20天大的Wistar雌性大鼠(购自Charles River Japan，Inc)以使动物之间的体重差异在平均体重的±10％内。然后，将动物随机分组，每组6只动物。通过自由获取水和AIN-76A(由CLEA JAPAN INC.生产)对动物进行喂养。
在预先喂养一天后，按照1、5或25mg/kg/天(液体量10ml/kg)的剂量用胃管强制口饲异黄腐酚或8-异戊二烯柚皮素到胃里，每天1次，共3天。对于对照组，按上述相同的方法口饲溶剂(花生油)，而对于阳性对照组，提供的是17β-雌二醇，并按400μg/kg/天的剂量用上述相同的方法口饲。在最后一次给药大约24小时后，取出大鼠的子宫，测量子宫的重量以测定体内雌激素活性。
结果如图2所示。
可以发现，与雌二醇或8-异戊二烯柚皮素不同，对于未成年大鼠，异黄腐酚不具有体内雌激素活性，或者仅具有非常低水平的活性。
        3-b)在切除卵巢的大鼠中的评价
将9周大的雌性SD大鼠(购自Charles River Japan，Inc)两侧的卵巢去除，将大鼠随机分组，每组6只。通过自由获取水和AIN-76A(由CLEA JAPAN INC.生产)对动物进行喂养。从手术后第二天开始，用胃管(液体量10ml/kg)强制口饲受试化合物到胃里，每天1次，共28天。
将异黄腐酚溶解于0.8％乙醇的水溶液中，以使得与啤酒中包含的异黄腐酚的浓度相比，所得溶液中异黄腐酚浓度为其1倍、5倍和20倍。对于对照组和假手术组，按照与施用受试化合物的组相同的方法口饲0.8％乙醇的水溶液。在阳性对照组中提供的是17β-雌二醇，并以2μg/kg/天的剂量皮下给药。
结果如图3和4所示。
切除卵巢组(OVX)的子宫重量显著低于假手术组，甚至在施用异黄腐酚的组，也没有观测到子宫的重量显著恢复。
实验4：去除卵巢后在骨质疏松症中的改善骨矿物质密度减少的效果
将9周大的雌性SD大鼠两侧的卵巢去除，从去除卵巢后第二天开始，用胃管(液体量10ml/kg)口饲受试化合物到胃里，每天1次，共28天。
对于对照组和假手术组，按照与施用受试化合物的组相同的方法口饲0.8％乙醇的水溶液。在阳性对照组中提供的是17β-雌二醇，并以4μg/kg/天的剂量皮下给药。
啤酒(国内产的皮尔逊型啤酒)中包含2.1mg/L异黄腐酚和43μg/L 8-异戊二烯柚皮素。将该啤酒冷冻，然后溶解于水中以去除乙醇，即得到下面实验中将要用的受试化合物。
将异黄腐酚溶解于0.8％乙醇的水溶液中，以使得与啤酒中包含的异黄腐酚的浓度相比，所得溶液中异黄腐酚浓度为其1倍、5倍和20倍。
此外，为了鉴别啤酒中对骨质疏松症的预防活性有贡献的主要成分，制备如下的受试液体并用于下面的实验中：
.一种液体，其制备方法包括：用0.8％的乙醇的水溶液稀释包含30％异-α酸的啤酒花提取物(Iso-Extract，(由Hopsteiner生产)，调节稀释后的液体，使得其中异-α酸的浓度与啤酒中的异-α酸浓度(30mg/L)相同；
.一种液体，其制备方法包括：用水稀释8-异戊二烯柚皮素，使得其中8-异戊二烯柚皮素的浓度与啤酒中8-异戊二烯柚皮素的浓度相同；及
.一种液体，其制备方法包括：用水稀释异黄腐酚的异构体—黄腐酚(由Apin chemical生产)，使得其中黄腐酚的浓度与啤酒中异黄腐酚的浓度(2.1mg/L)相同。
解剖大鼠的股骨测定骨矿物质密度，用pQCT(外周定量计算断层分析Peripheral Quantitative computed tomography)骨矿物质密度测定仪(XCT-960A，由Norland Stratec生产)测定远侧干骺端骨端部的松质骨矿物质密度。
结果如图5和6所示。
对于去除卵巢的组(OVX)，股骨的松质骨矿物质密度减少。但是，施用啤酒和异黄腐酚显著地改善了骨矿物质密度减少。据认为，8-异戊二烯柚皮素在啤酒中的雌激素活性贡献率是最高的，但是上述改善作用并没有在8-异戊二烯柚皮素中观测到。已经有报道在凹陷形成(pit formation)试验中，包含黄腐酚和异酒花酮的异-α酸具有抑制骨吸收作用的活性。对于这些异-α酸，也观测不到任何和异黄腐酚一样的活性。
如在实验3中所显示的，对于切除卵巢的大鼠，当异黄腐酚以显示抑制骨矿物质密度减少活性的剂量，甚至该剂量的20倍施用时，也不会显示出增加子宫重量的活性。此外，对于未成年大鼠，当异黄腐酚以可观测到抑制骨矿物质密度减少活性的剂量的1250倍施用时，也不会显示增加子宫重量的活性。
实验5：包含异黄腐酚的饮料对骨矿物质密度减少的改善效果
将9周大的雌性SD大鼠两侧的卵巢去除，从去除卵巢后第二天开始，用胃管(液体量10ml/kg)口饲受试溶液到胃里，每天1次，共28天。
对于对照组和假手术组，按照与施用受试溶液组相同的方法口饲水。在阳性对照组中提供的是溶解于花生油中的17β-雌二醇，并以10μg/kg/天的剂量皮下给药。
根据实施例D提供下述受试溶液。
.大麦茶，用与实施例D相同的方法提取并不含异黄腐酚；
.大麦茶，包含2mg/L、10mg/L、和50mg/L的异黄腐酚；
.绿茶，用与实施例D相同的方法提取并不含异黄腐酚；
.绿茶，异黄腐酚含量为10mg/L。
用与实验4相同的方法测定骨矿物质密度。
结果如图7和8所示。
去除卵巢组(OVX)与假手术组相比，股骨的松质骨矿物质密度减少。然而，施用包含异黄腐酚的饮料的组的骨矿物质密度，显著高于施用水的对照组，显示包含异黄腐酚的饮料具有改善骨矿物质密度减少的作用。另一方面，不含异黄腐酚的饮料不具有改善骨矿物质密度减少的作用。
一般认为，绿茶含有大量茶叶儿茶素，已知儿茶素能够抑制与骨吸收作用有关的破骨细胞活性(Biochem Biophys Res Commun292(1)，94-101，(2002))。然而，对于不含异黄腐酚的绿茶，在切除卵巢的大鼠中没有观测到任何抑制骨矿物质密度减少的活性。同样对于绿茶，改善骨矿物质密度减少的作用只能是通过加入异黄腐酚获得的(图8)。

Claims (30)

1.一种用于抑制或预防骨矿物质密度减少的组合物，包含异黄腐酚作为活性成分。
2.一种用于抑制或预防骨矿物质密度减少的组合物，包含含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物作为活性成分。
3.根据权利要求2的组合物，其中所述的异构化啤酒花提取物是对乙醇溶剂提取获得的含有黄腐酚的啤酒花提取物进行异构化而制备的。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述的异构化是在碱性水中回流加热啤酒花提取物完成的。
5.根据权利要求1到4任一项的组合物，其为一种药物组合物。
6.根据权利要求1到5任一项的组合物，用于预防、治疗或改善骨质疏松症。
7.一种用于抑制或预防骨矿物质密度减少的食品和饮料，包含异黄腐酚作为活性成分。
8.一种用于抑制或预防骨矿物质密度减少的食品和饮料，包含含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物作为活性成分。
9.根据权利要求8的组合物，其中所述的异构化啤酒花提取物是对乙醇溶剂提取获得的含有黄腐酚的啤酒花提取物进行异构化而制备的。
10.根据权利要求9的食品和饮料，其中所述的异构化是在碱性水中回流加热啤酒花提取物完成的。
11.根据权利要求7到10任一项的食品和饮料，其为健康食品、功能性食品、特定保健用食品或供患者使用的食品。
12.根据权利要求7到11任一项的食品和饮料，用于预防、治疗或改善骨质疏松症。
13.根据权利要求7到12任一项的食品和饮料，其为饮料的形式。
14.根据权利要求13的食品和饮料，其为非啤酒花类饮料。
15.根据权利要求14的食品和饮料，其为茶类饮料。
16.根据权利要求14的食品和饮料，其为乳类饮料。
17.根据权利要求7到12任一项的食品和饮料，其为酸乳酪。
18.根据权利要求7到17任一项的食品和饮料，其包含异黄腐酚的量，使得每个成年人每天的异黄腐酚摄取量为0.003至0.5mg/kg-体重。
19.根据权利要求7到17任一项的食品和饮料，其包含异黄腐酚的量，使得每次摄取的异黄腐酚为0.2至30mg。
20.一种非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其包含作为活性成分的异黄腐酚的量，使得每个成年人每天的异黄腐酚摄取量为0.003至0.5mg/kg-体重。
21.一种非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其包含作为活性成分的异黄腐酚的量，使得每次异黄腐酚的摄取量为0.2至30mg。
22.一种非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其包含作为活性成分的含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物的量，使得每个成年人每天的异黄腐酚摄取量为0.003至0.5mg/kg-体重。
23.一种非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其包含作为活性成分的含有异黄腐酚的异构化啤酒花提取物的量，使得每次异黄腐酚的摄取量为0.2至30mg。
24.根据权利要求20到23任一项的非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其为茶类饮料。
25.根据权利要求20到23任一项的非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其为乳类饮料。
26.根据权利要求20到23任一项的非谷物-啤酒花发酵型食品和饮料，其为酸乳酪。
27.一种抑制或预防哺乳动物骨矿物质密度减少的方法，包含下列步骤：将有效量的权利要求1到4任一项的活性成分施用于哺乳动物，或允许哺乳动物摄取有效量的权利要求1到4任一项的活性成分。
28.一种预防、治疗或改善骨质疏松症的方法，包含下列步骤：将有效量的权利要求1到4任一项的活性成分施用于该哺乳动物，或允许哺乳动物摄取有效量的权利要求1到4任一项的活性成分。
29.权利要求1到4任一项定义的活性成分在制备用于抑制或预防骨矿物质密度减少的组合物中的用途。
30.权利要求1到4任一项定义的活性成分在制备用于预防、治疗或改善骨质疏松症的组合物中的用途。
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