CN1764375A - 使用包括热休克蛋白或α－2－巨球蛋白的组合物治疗癌症和传染病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及预防和治疗传染病与癌症的方法和组合物。本发明的方法包括给予(a)一种组合物，包括衍生自抗原细胞或病毒颗粒的抗原蛋白或抗原肽和一种或多种不同的热休克蛋白的复合物组；和(b)基于非热休克蛋白和非α－2－巨球蛋白的治疗方式。用于产生抗原肽的种群或蛋白制品包括至少50％的不同蛋白或至少50种不同的抗原细胞或病毒颗粒的蛋白。制备抗原肽的方法，包括用一或多种蛋白酶消化抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品，或将蛋白制剂暴露于ATP、盐酸胍(guanidium hydrochloride)和/或酸性条件中。

Description

使用包括热休克蛋白或α-2-巨球蛋白的 组合物治疗癌症和传染病的方法

本发明是在政府支持下在国立卫生研究所(the NationalInstitutes of Health)颁发的许可号CA/A184479下作出的。美国政府在本发明中享有某些权利。

1.前言

本发明涉及预防和治疗传染病，以及原发性和转移性肿瘤疾病的方法和组合物。在预防和治疗传染病和癌症的实践中，将包括抗原细胞和/或其消化产物的胞液和膜-衍生蛋白的组合物，与热休克蛋白和/或α-2-巨球蛋白复合，以扩大对肿瘤以及传染物的免疫反应。还包括这样的组合物在与其它的治疗方式联用中的用途。

2.发明背景

2.1.热休克蛋白

热休克蛋白(HSPs)，也称为应激反应蛋白，是首先被识别为细胞在热休克应答中合成的蛋白。基于分子量，HSPs已经被分为五个家族，HSP100，HSP90，HSP70，HSP60和smHSP。其后发现了这些家族的许多成员是响应于其它应力刺激而诱发的，包括营养剥夺，代谢性中断，氧自由基，和胞内病原体感染(见Welch，1993年5月，Scientific American 56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.8：401-420；Craig，1993，Science 260：1902-1903；Gething等人，1992，Nature 355：33-45；和Lindquist等人，1988，Annu.Rev.Genetics 22：631-677)。

对热休克及其它生理应激反应的细胞应答进行研究，显示HSPs不仅参与这些不利条件下的细胞保护，而且参与未应激细胞中的基本生化和免疫过程。HSPs可以完成各种不同的伴侣功能。例如，定位于细胞胞浆、细胞核、线粒体或内质网的HSP70家族成员(Lindquist等人，1988，Ann.Rev.Genetics 22：631-677)，参与抗原向免疫系统细胞的递呈，还参与正常细胞的蛋白转换、折叠和装配。HSPs能够与蛋白或肽结合，并在三磷酸腺苷(ATP)存在或酸性条件下释放所结合的蛋白或肽(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.178：1391-1396)。

Srivastava等人说明了针对甲基胆蒽所诱导的近亲繁殖小鼠肉瘤的免疫应答(1988，Immunol.Today 9：78-83)。在这些研究中，发现负责对这些肿瘤分别产生独特免疫原性的分子是96kDa的糖蛋白(gp96)和84至86kDa的细胞内蛋白(Srivastava等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：3407-3411；Ullrich等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：3121-3125)。用从特定肿瘤分离的gp96或84/86接种小鼠可使小鼠对这种肿瘤产生免疫力，但对抗原性截然不同的肿瘤则无免疫力。对编码gp96和p84/86的基因进行分离和特性鉴定，发现它们之间有着显著的同源性，显示gp96和p84/86分别是同一热休克蛋白的内质网和胞液的对应物(Srivastava等人，1988，Immunogenetics 28：205-207；Srivastava等人，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol.167：109-123)。此外，发现HSP70可激发对其分离起源肿瘤的免疫应答，对抗原性截然不同的肿瘤则不能激发免疫应答，但和肽脱离的HSP70丧失了其免疫原活性(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.178：1391-1396)。这些观察结果表明热休克蛋白本身不具备免疫原性，但可与抗原肽形成非共价复合物，该复合物可以引起对抗原肽的特异性免疫(Srivastava，1993，Adv.Cancer Res.62：153-177；Udono等人，1994，J.Immunol.，152：5398-5403；Suto等人，1995，Science 269：1585-1588)。

从癌细胞提纯的HSPs和肽的非共价复合物可用于治疗和预防癌症，其见于1996年4月11日提交的WO 96/10411号PCT出版物和1997年3月20日提交的WO 97/10001号PCT出版物(分别为于1998年5月12日公布的No.5,750,119号美国专利和于1998年11月17日公布的No.5,837,251号美国专利，将其全部引入本文中作为参考)。HSP-肽复合物的分离和纯化已有描述，例如从病原体感染细胞分离和纯化，并用于诸如病毒、包括细菌、原生动物、真菌和寄生虫在内的其它细胞内病原体等所致感染的治疗和预防(见，例如，1995年9月21日提交的WO 95/24923号PCT出版物)。还可以用应激蛋白和抗原肽的体外复合来制备免疫原性应激蛋白-抗原复合物，1997年3月20日提交的WO 97/10000号PCT出版物(2000年2月29日公布的No.6,030,618号美国专利)描述了该类复合物在癌症和传染病的治疗和预防中的应用。1997年3月20日提交的WO 97/10002号PCT出版物(参见1999年11月16日公布的No.5,985,270号美国专利)描述了使用应激蛋白-抗原复合物在体外致敏用于过继性免疫疗法的抗原呈递细胞。

2.2.α2-巨球蛋白

α-巨球蛋白是包含C3、C4和C5补体组分的结构相关蛋白的蛋白超家族成员。人类血浆蛋白α-2-巨球蛋白(α2M)是720kDa同源四聚体蛋白，起初认为其是蛋白酶抑制因子及血浆和炎性流体蛋白水解酶清道夫分子(综述见Chu和Pizzo，1994，Lab.Invest.71：792)。α2M是以具有1474个氨基酸残基的前体物形式合成的。前23个氨基酸起信号序列的作用，将其切去后获得带有1451个氨基酸残基的成熟蛋白(Kan等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：2282-2286).

α2M以共价方式与含亲核氨基酸侧链的蛋白和肽混杂地结合(Chu等人，1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.737：291-307)，并将它们靶向表达α2M受体(α2MR)的细胞(Chu和Pizzo，1993，J.Immunol.150：48)。α2M与α2M受体的结合由α2M的羧基末端介导(Holtet等人，1994，FEBS Lett.344：242-246)，关键的残基已得以鉴定(Nielsen等人，1996，J.Biol.Chem.271：12909-12912)。

通常认为α2M具有抑制蛋白酶的活性，其通过多重结合位点与各种蛋白酶结合(见例如，Hall等人，1981，Biochem.Biophys.Res.Commun.100(1)：8-16)。蛋白酶与α2M的相互作用导致复杂的、称为转化的结构重排，这是蛋白酶被硫酯“俘获”之后在α2M的“bait(诱饵)”区内断裂的结果。构型变化使受体结合所需要的残基暴露出来，使α2M蛋白酶复合物与α2MR结合。甲胺可以诱导类似于由蛋白酶诱导的构型变化和切割。不能被受体辨别的α2M的未断裂形态，常常称其为“慢”形态(s-α2M)。断裂形态被称为“快”形态(f-α2M)(综述见Chu等人，1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.737：291-307)。最近还发现α2MR可以与诸如gp96、hsp90、hsp70和钙网蛋白等HSPs结合(Basu等人，2001，Immunity 14(3)：303-13)。

研究表明，除抑制蛋白酶功能之外，α2M与抗原复合时，可以使抗原递呈细胞如巨噬细胞摄取抗原、递呈给体外T淋巴细胞杂交瘤的能力增加高达两个数量级(Chu和Pizzo，1994，Lab.Invest.71：792)，并可诱导T细胞增殖(Osada等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.146：26-31)。进一步的证据显示，抗原与α2M形成复合物可促进体外未成熟的脾细胞产生抗体(Osada等人，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.150：883)，在实验兔(Chu等人，1994，J.Immunol.152：1538-1545)和小鼠(Mitsuda等人，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.101：1326-1331)中引起体内抗体反应。α2m-抗原肽复合物还显示其可诱导体内细胞毒性T细胞应答(Binder等人，2001，J.Immunol.166：4698-49720)。

3.发明概述

本发明包括用于预防和治疗癌症和传染病的抗原蛋白和肽和热休克蛋白(HSP)或α2-巨球蛋白(α2M)的复合物的制备与使用。基于治疗方式，优选，复合物是在与至少一种非热休克蛋白和非α2-巨球蛋白的联用中使用。

在一个实施方案中，本发明使用了由以下方法制备的HSPs与一组抗原细胞或病毒颗粒的抗原蛋白的复合物，该方法包括将一组衍生自抗原细胞或病毒颗粒的抗原蛋白与一或多种不同的热休克蛋白在体外形成复合物，其中该组抗原蛋白包括存在于抗原细胞或病毒颗粒或抗原细胞的细胞组分中不同蛋白的至少50％或至少50种不同的蛋白。

在另一个实施方案中，复合物是由以下方法制备的，该方法包括将蛋白制品与一或多种不同的热休克蛋白在一定条件下体外接触，使得蛋白制品中的蛋白与热休克蛋白形成复合物。

在又一个实施方案中，本发明提供了包括HSPs和抗原细胞或病毒颗粒的一组抗原肽的复合物的用途，其中分别使用一或多种不同的蛋白酶消化抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品而生成该组抗原肽。还可以将抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品暴露于ATP、盐酸胍(guanidium hydrochloride)和/或酸性条件中，使得足以从存在于蛋白制品中的蛋白复合物中洗脱抗原肽，从而产生该组抗原肽。使用任意一种或使用两种方法产生的抗原肽在体外与一种或多种不同的HSPs形成复合物。

在又一个实施方案中，本发明提供了α2M与一组抗原细胞的抗原蛋白的复合物的用途。该复合物是由以下方法制备的，该方法包括将一组衍生自抗原细胞或病毒颗粒的抗原蛋白，与α2M在体外形成复合物，其中该组抗原蛋白包括存在于抗原细胞或病毒颗粒、或存在于抗原细胞组分中的至少50％不同蛋白或至少50种不同蛋白。在另一个实施方案中，该方法包括将蛋白制品与α2M在一定条件下体外接触，使得蛋白制品中的蛋白与α2M形成复合物。

在又一个实施方案中，本发明提供了包括α2M和抗原细胞或病毒颗粒的一组抗原肽的复合物的用途，其中该组抗原肽是由以下方法产生的，该方法包括分别使用一种或多种不同的蛋白酶消化抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品。还可以由以下方法产生该组抗原肽，该方法包括将抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品暴露于ATP、盐酸胍(guanidium hydrochloride)和/或酸性条件中。使用任意一种或使用两种方法产生的抗原肽在体外与α2M形成复合物。

在各种实施方案中，抗原细胞可以是癌细胞、或受病原体或传染物感染的细胞，优选人类细胞。抗原细胞还可以是病原体或传染物的细胞，或其变体。抗原蛋白/肽可以由癌细胞或与癌症或传染病抗原有关的病原体感染的细胞来制备。包括病毒颗粒的病原体或传染物，也可以用于制备抗原肽。抗原细胞的蛋白制品可以仅仅包含胞液蛋白、仅包含膜来源蛋白或同时包含胞液和膜来源蛋白。蛋白制品可以是粗制的、未分级分离的细胞裂解液。在一具体实施方案中，可以利用本领域已知的方法裂解抗原细胞、除去细胞碎片和非蛋白质物质、并任选地纯化蛋白，从而制备蛋白制品。在某些实施方案中，没有使用从抗原细胞中的其它蛋白中选择性地除去或保留一或多种特定蛋白的制备方法来制备蛋白制品。

在某些实施方案中，抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品可以在适合酶反应的条件下，用各种蛋白酶消化，蛋白酶可以是但不局限于胰蛋白酶，葡萄球菌肽酶I(又名蛋白酶V8)，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，组织蛋白酶G，嗜热菌蛋白酶，弹性蛋白酶和木瓜蛋白酶。可以取样并利用已知的技术进行分析，以测定肽链的长度，从而监测消化程度。优选，消化步骤是在一定条件下进行的，这样可以使所得到的包含抗原肽的一组肽的平均长度从约7个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。利用不同蛋白酶消化蛋白制品的等分试样，从蛋白制品产生不同组的肽也是合乎需要的。在与HSP或α2M形成复合物之前，可以对用不同消化手段得到的肽进行组合。在包含抗原肽的该组肽与HSP或α2M形成复合物之前，将蛋白酶灭活或从该组肽中分离，及任选地纯化该组肽是合乎需要的。

在某些实施方案中，将抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品与三磷酸腺苷(ATP)、盐酸胍(guanidium hydrochloride)和/或酸性条件接触，使得可以洗脱抗原肽，而不需要先分离HSP复合物或α2M复合物。用此方法洗脱的抗原肽包含与HSPs、α2M及I类和II类MHC分子内源性相关的肽。

在本发明的各种实施方案中，根据该组抗原肽与HSP或α2M在体外形成复合物的方法，反应可以产生以共价键或非共价键与HSP或α2M形成复合物的抗原肽。预期用于形成复合物的热休克蛋白包括但不局限于HSP60，HSP70，HSP90，gp96、钙网蛋白、grp78(或BiP)，蛋白质二硫键异构酶(PDI)，HSP110和grp170。通常优选人类的HSPs和人类的α2M。HSP或α2M与抗原肽在体外形成的复合物可以在用于或用作治疗剂或预防组合物之前进一步纯化。这样的组合物可以进一步包含助剂。也提供了包含HSP和/或α2M、抗原细胞、蛋白制品和/或蛋白酶和补充治疗方式的联合治疗的试剂盒。

在另一个方面，提供了治疗或预防一种癌症或传染病的方法，包含给予需要这种治疗或预防的对象(i)包含对于所述治疗或预防有效量的HSP和/或α2M与一组抗原肽的复合物；和与(ii)基于非HSP和非α2M治疗方式的另外治疗方式的联用。优选的补充治疗方式是非疫苗治疗方式。治疗方式的例子包括但不局限于抗生素，抗病毒素，抗真菌化合物，抗原生动物化合物，驱虫化合物，抗癌症治疗剂例如化疗剂，抗血管生成化合物，激素和放射，以及生物学治疗剂和免疫治疗剂。

在另一个实施方案中，提供了治疗或预防一种癌症或传染病的方法，包括给予需要这种治疗或预防的对象抗原递呈细胞，该抗原递呈细胞已经用HSP和/或α2M与一组抗原蛋白/肽的复合物致敏。除了给予患者激活的抗原递呈细胞之外，还可以给予患者HSP和/或α2M与一组抗原肽的复合物、和/或非HSP和非α2M的治疗。

本发明也提供了用于提高非HSP和非α2M治疗方式的治疗效果的方法，包括和给予的治疗方式一起给予HSP复合物或α2M复合物，优选纯化复合物。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种在患者中诱导针对第一抗原细胞或病毒颗粒的免疫应答的方法，其中所述患者接受了非HSP和非α2M治疗方式，所述方法包括将包含免疫原性量的、与一组抗原蛋白/肽形成复合物的HSP和/或α2M的组合物给予个体，其中该组抗原蛋白/肽由第二抗原细胞或病毒颗粒制备。抗原肽可以用蛋白酶消化抗原细胞或病毒颗粒的蛋白制品、或将蛋白制品暴露于ATP、盐酸胍(guanidium hydrochloride)和/或酸性条件中来获得。第一和第二抗原细胞或病毒颗粒表达至少一种共同的抗原决定簇。

在另一个实施方案中，本发明也提供了一种在接受了HSP复合物或α2M复合物患者中改善治疗效果的方法，该方法在给予HSP复合物或α2M复合物之前、同时或之后给予患者另一种治疗方式。HSP复合物或α2M复合物可以在非疫苗治疗方式的治疗方案之前、重叠和/或之后的时期内给予。

可以在相同部位周期性地，例如每隔一星期，重复给予患者HSP复合物或α2M复合物。组合物可以通过许多途径给予，例如皮内或皮下。

在又一个实施方案中，本发明包括能够提供比单独给予治疗方式或HSP复合物更好的治疗特性的治疗方法。在另一个实施方案中，本发明包括能够提供比单独给予治疗方式或α2M复合物更好的治疗特性的治疗方法。本发明包括的是其中给予HSP复合物或α2M复合物的治疗方式具有附加的效能或附加的治疗效果的方法。本发明也包括治疗效能大于附加效能的协同效果。优选地，这种使用HSP复合物或α2M复合物的治疗方式的给予，还降低或避免了不需要的或不利影响。

在某些实施方案中，为了增加患者依从性、提高治疗效果和/或降低不需要的或不利影响，本发明给予的非疫苗治疗方式的剂量可以降低或给予频率减少。在一个具体实施方案中，给予较少或更少的频繁化疗或放射治疗剂量，以降低或避免不需要的结果。或者，如果给予一种治疗方式，可以给予更少剂量或更少频次的HSP复合物和α2M复合物。在某些实施方案中，在没有给予治疗方式的情况下给予HSP/α2M复合物、或在没有给予HSP/α2M复合物的情况下给予治疗方式，都没有治疗效果。在一个具体实施方案中，HSP/α2M复合物或治疗方式的量，是以不足以单独产生治疗效果的量给予的。在交替的实施方案中，当单独给予时，HSP/α2M复合物或治疗方式中的两种或至少一种具有治疗效果。

4.发明的详细说明：

本发明提供了包含用于预防和治疗癌症和传染病的热休克蛋白(HSP)或α2-巨球蛋白(α2M)的组合物的制备和使用方法。本发明的方法包括体外制备HSP或α2M与抗原细胞的抗原蛋白和肽的复合物，和在与另一个治疗方式的联用中使用它。在一个实施方案中，该方法包括制备含一组抗原蛋白的抗原细胞的蛋白制品；和该组抗原蛋白与HSP或α2M在体外形成复合物。在另一个实施方案中，该方法进一步包括用至少一种蛋白酶消化抗原细胞的蛋白制品，以便在该组抗原肽与HSP或α2M体外形成复合物之前产生一组抗原肽。本发明利用抗原细胞的全部抗原潜能，产生基于HSP和/或α2M的疫苗。

本发明的治疗和预防方法基于在需要治疗或预防传染病或癌症的患者中、和已经接受或将会接受另一个治疗方式的患者中引起免疫应答。免疫应答直接特异性地针对癌细胞的抗原决定簇、导致传染病的传染物感染的细胞的抗原决定簇或传染物的抗原决定簇。将包含HSPs与抗原细胞的蛋白/肽的复合物、或一组包含α2M与抗原细胞的蛋白肽的分子复合物的组合物给予个体后，组合物中的分子复合物可以刺激免疫应答，例如个体中的细胞毒性T细胞应答。抗原细胞可以是癌细胞或受感染细胞，或是与癌或受感染细胞有共同抗原决定簇或显示相似抗原性的细胞。免疫应答的结果是，个体的各种免疫效应机制作用于癌或受感染细胞，其本身或与其它治疗方式联用导致这种疾病的治疗或预防。

需要治疗或预防传染病或癌症的个体或患者是动物，优选哺乳动物、非人类的灵长类，最优选人类。本文中使用的术语“动物”包括但不局限于陪伴动物，例如猫和狗；动物园动物；野生动物，包括鹿、狐狸和浣熊；农场动物，家畜和家禽，包括马、牛、羊、猪、火鸡、鸭和小鸡，以及任何啮齿动物。

本发明的组合物和方法是对其它使用天然存在的HSP-抗原肽复合物来治疗或预防癌症或传染病的组合物和方法的改进。在这样的其它方法中，从癌或受感染细胞分离出特异性的HSP和其与抗原肽的复合物，然后将它们给予患者以在体内诱导针对所述癌或受感染细胞的免疫应答(见例如，美国专利Nos.5,750,119和5,961,979)。依据所需的HSP类型而确定的方法分离天然存在的复合物。因此，天然存在的一类HSP和抗原肽的复合物仅仅包含与该类HSP共同定位于抗原细胞的某一区室中的那些抗原肽。某些类型的HSPs仅在一种细胞区室中发现，而一些抗原肽仅仅在抗原细胞的某些区室中被发现。例如，HSP90和HSP70仅在胞液中发现。由此，它们仅与位于胞液中的抗原肽形成复合物，而不与位于其它地方例如内质网中的抗原肽形成复合物。也就是说，仅有一部分抗原细胞的抗原肽的亚型可以与每一特定的HSP结合。由此，为了激发癌或受感染细胞中的最大量抗原决定簇的免疫应答，必须利用它们的相应分离方法从癌或受感染细胞分离出各种HSPs和它们的肽复合物，然后给予患者。这种方法非常费力，并且可能需要大量抗原细胞，而这些抗原细胞在某种情况下无法大量获得。本发明的方法通过在体外生成实质上代表抗原细胞的所有抗原的肽，然后将这些肽与一或多种不同的HSP和/或α2M形成复合物，所形成的复合物可用于在患者中激发免疫应答，从而解决了这个问题。利用本发明方法，即使不是共同定位于抗原细胞的相同区室内的抗原肽和HSPs，也可以形成复合物。本发明的方法使得特定类型的HSP与抗原细胞中的大部分或甚至每一抗原肽形成复合物成为可能。相应地，利用本发明的方法制备的组合物可以更有效地诱导针对抗原细胞的免疫应答。此外，本方法不需要预先将HSP复合物与相关肽分离，由此可以使用很少量的、供应常常受限制的起始原料。

此外，癌细胞、受感染细胞或病原体的抗原特性经过一段时间后如在疗程期间可能会改变。许多病原体经过突变与合成不能被免疫细胞和抗体辨别的突变株蛋白而避开宿主的免疫系统。已知癌细胞可以经过突变而合成突变蛋白，其中一些不能为免疫系统所识别，从而对某些药物产生抗药性。利用本发明的一个实施方案的优势之一是对源于癌细胞、受感染细胞或病原体的胞液和/或膜蛋白进行消化，可以使更大范围的抗原蛋白及因此更具多样性的抗原肽与HSPs和/或α2M形成复合物。结果，免疫应答受抗原细胞上更大量的抗原决定簇引导，从而使抗原细胞例如癌细胞或受感染细胞更难避开免疫系统的识别和作用。

在另一个具体的实施方案中，本发明的方法产生非天然存在的α2M-肽复合物。已知α2M是一种可与各种细胞外蛋白尤其是蛋白酶结合的细胞外蛋白，将其灭活，然后将它们带至细胞内环境。通常α2M不能接触抗原细胞的全部抗原肽，因此不能与所有的抗原肽形成复合物。本发明的方法使α2M可以与范围更大的胞液或膜来源、或抗原细胞的胞液和膜来源蛋白在体外消化而产生的肽形成复合物。

在4.1部分中描述的是抗原细胞的来源，蛋白制品可由这些抗原细胞制备。在4.2部分中，提供了制备抗原细胞的不同类型蛋白制品的方法和消化蛋白制品的方法。4.3部分分别描述了用于与抗原肽形成复合物的HSP或α2M的分离或产生。在4.4部分中，描述了HSP与抗原肽的体外复合物。在4.5部分中所描述的是使用复合物预防和治疗癌和感染性病原的方法，和所治疗的癌症和传染病的类型。在4.6部分中描述了本发明方法制备的组合物在继承性免疫中的应用。第5部分提供了本发明的复合物在预防性保护动物免于癌细胞生长中所显示的效果的试验数据。

4.1.抗原细胞的来源

本发明的抗原细胞包含患者免疫应答所需要的抗原决定簇。

为了治疗或预防癌症或传染病，本发明的方法提供了HSPs和α2M与抗原蛋白和肽复合的组合物，其中抗原蛋白/肽源自于癌细胞，优选人类的癌细胞，例如肿瘤特异抗原片段和肿瘤相关抗原片段。将来源于癌细胞、或与癌细胞共享抗原决定簇的细胞、或与癌细胞显示相似抗原性的细胞的蛋白(例如，胞液和/或膜来源蛋白)进行蛋白质水解消化，从而产生肽。还可以将蛋白暴露于ATP、盐酸胍(guanidiumhydrochloride)和/或酸性条件中而产生抗原肽。本文中使用的术语“同种癌的细胞或组织”是指相同组织类型的癌细胞或组织，或由相同组织类型的癌转移的细胞或组织。

为了治疗或预防传染病，本发明的方法提供了HSPs和α2M与抗原肽复合的组合物，其中抗原肽来源于受病原体或可导致传染病的感染性病原，或来源于包括但不局限于病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫等病原体。优选感染人类的病原体。将来源于受感染细胞、与受感染细胞共享抗原决定簇的抗原细胞、或与受感染细胞显示相似抗原性的抗原细胞、或包括病毒颗粒的病原体的蛋白(例如，胞液和/或膜来源蛋白)进行蛋白质水解消化，从而产生抗原肽。还可以将蛋白暴露于ATP、盐酸胍(guanidium hydrochloride)和/或酸中而产生抗原肽。抗原肽还可以由显示传染病致病原(病原体)、或这种病原的变异体的抗原性的抗原细胞产生。

由于在本方法中使用全部癌细胞、受感染细胞或其它抗原细胞，在使用本方法之前没有必要将抗原肽分离或鉴定其特性、或甚至了解其特性。根据疾病与何种抗原相关的性质来选择抗原细胞的来源。在本发明的一个实施方案中，任何组织或从包括已转移至多个部位的肿瘤的任何肿瘤分离的细胞，均可用作本方法的抗原细胞。例如，血液循环中的白血病细胞、淋巴液或其它体液也可以使用，也可以使用实体瘤组织(例如，活检的原发组织)。本文中使用的术语癌细胞也包括肿瘤前的细胞，这种细胞是由正常细胞转化成肿瘤形式的过渡形态。从非肿瘤细胞生长过渡到肿瘤形成通常包括增生、化生和发育异常(这种异常生长病症的综述见Robbins和Angell，1976，BasicPathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79).在下面的4.5.1部分中提供了可用于本文中的非限制性癌症及其细胞的列表。

在本发明的另一个实施方案中，任何被病原体或传染物感染的细胞，即受感染细胞，可用作制备抗原肽的抗原细胞。尤其优选被例如病毒、细菌、真菌、寄生虫或原生动物等细胞内病原体感染的细胞。在4.5.2部分提供了可以感染用于本文中细胞的示范性的感染性病原菌列表。

在又一个实施方案中，任何可以导致传染病的病原体或感染性病原，可用作制备抗原肽的抗原细胞。病原体或感染性病原的变体，例如但局限于缺乏复制能力的变体、非病原性的或减毒变体、非感染性的变体，也可以用作此目的的抗原细胞。例如，许多可以体外培养或从感染物质分离的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物，可以充当抗原细胞的来源。可使用本领域中用于繁殖这种包括病毒颗粒的病原体的已知方法。在4.5.2部分提供了可用作抗原细胞的病原体或感染性病原的示范性的列表。

来源于癌组织、癌细胞或受感染细胞的细胞系也可以用作抗原细胞。优选人类的癌或感染组织、细胞或细胞系。可以通过任何本领域已知的方法识别和分离癌细胞、受感染细胞或抗原细胞。例如，可以用形态学、酶检方法、增殖试验或在病原体或致癌病毒存在的条件下对癌细胞或受感染细胞进行鉴定。如果使人感兴趣的抗原的特征是已知的，也可以用本领域已知的任何生化或免疫学方法对抗原细胞鉴定或分离。例如，可以用外科手术、内窥镜检查、其它活检技术、从体液(例如血液)分离、亲和层析和荧光活化细胞分选(例如用针对细胞所表达抗原的荧光标记抗体)，对癌细胞或受感染细胞进行分离。显示相似抗原性的抗原细胞具有一或多种共同的抗原决定簇，在患者中针对这些抗原决定簇的免疫应答是所需要的(例如，为了治疗或预防目的)。

如果从患者处获得的抗原细胞的数目不足，可以在使用本方法前用标准方法进行体外培养，以增加其数量。抗原细胞不需要是单克隆或同源或纯化的细胞。可使用细胞的混合物，条件是混合物中有足够数量的细胞包含使人感兴趣的抗原决定簇或抗原。在一个具体实施方案中，抗原细胞和/或免疫细胞是经过纯化的。

为了制备病原体感染的细胞，在体外对易被致病病原体或传染物感染的细胞类型的未感染细胞进行感染。根据病原体或传染源的传播方式和生物学性质，可用标准技术促进病原体或感染性病原的感染及受感染细胞的繁殖。例如，可以使用流感病毒感染正常的人纤维母细胞；可以使用分枝杆菌感染正常的人施旺细胞。在各种实施方案中，感染性病原的变体例如复制缺陷性病毒、非病原性或减毒突变体、或温度敏感突变体，也可以用于感染或转化细胞，以产生用于制备抗原肽的抗原细胞。如果需要用大量的病原体感染细胞、或如果病原体直接用作抗原细胞，可使用本领域任何已知的方法进行繁殖和培育病原体。这种方法将取决于病原体，并且不涉及感染宿主。例如，本领域许多培育处于培养中的致病细菌、真菌及其它非病毒微生物的技术、包括大规模的发酵是已知的。

或者，如果编码肿瘤抗原(例如，肿瘤特异抗原和肿瘤相关抗原)或病原体抗原的基因可以获得，可以用包含编码这种抗原的核酸分子的表达构建体在体外转化或转染来源于预计接受者的合适类型的正常细胞，以便抗原在接受者的细胞中得以表达。在一个实施方案中，肿瘤相关抗原是在肿瘤细胞中以相对于正常细胞高水平表达的抗原；肿瘤特异抗原是在肿瘤细胞中表达、正常细胞不表达的抗原。用这种方式，多于一种这样的抗原可以任选地在接受者的细胞中表达，本领域技术人员能理解这一点，可使用例如在Ausubel等人(1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，WileyInterscience)描述的任何已知的技术，进行抗原基因的转化或转染及随后在接受者细胞中的重组表达。

可以在这种细胞中表达的合适的蛋白和肽包括但不局限于那些显示癌细胞抗原性的蛋白和肽。例如，这种肿瘤特异的或肿瘤相关抗原包括但不局限于KS 1/4泛癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142：3662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)：407-415)；卵巢的癌抗原(CA125)(Yu，等人，1991，Cancer Res.51(2)：468-475)；前列腺的酸式磷酸盐(Tailer，等人，1990，Nucl.Acids Res.18(16)：4928)；前列腺特异性抗原(HenttuandVihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)：903-910；Israeli，等人，1993，Cancer Res.53：227-230)；黑素瘤-相关抗原p97(Estin，等人，1989，J.Natl.CancerInst.81(6)：445-446)；黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl，等人，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)；高分子量黑色素瘤抗原(Natali，等人，1987，Cancer 59：55-63)，前列腺特异性膜抗原，酪氨酸酶，gp100，黑素A和粘蛋白。其它可以与HSPs/α2M复合的外源性抗原包括部分或在癌细胞中以高频率突变的蛋白，例如癌基因(例如，ras，尤其是带活化突变的突变体，其仅仅在四个氨基酸残基发生突变(12，13，59或61)(Gedde-Dahl等人，1994，Eur.J.Immunol.24(2)：410-414))和抑癌基因(例如，p53，能够激发细胞毒性T细胞应答的各种突变体或多形态的p53肽抗原已经为其作出了鉴定(Gnjatic等人，1995，Eur.J.Immunol.25(6)：1638-1642).

优选地，在希望治疗或预防病毒性疾病的情况下，包含已知病毒的抗原表位的合适蛋白和肽可以在合适的细胞中表达。例如，这种源自于病毒的抗原性的抗原表位包括但不限于，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，流行性感冒，水痘，腺病毒，I型单纯疱疹(HSV-I)，II型单纯疱疹(HSV-II)，牛疫，鼻病毒，艾柯病毒，轮状病毒，呼吸道合胞体病毒，乳头状瘤病毒，乳多泡病毒，巨细胞病毒，泡沫病毒(echinovirus)，虫媒病毒，huntavirus，柯萨奇病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，天花病毒，风疹病毒，脊髓灰质炎病毒，I型人类免疫缺陷性病毒(HIV-I)和II型人类免疫缺陷性病毒(HIV-II)。

优选地，在希望治疗或预防细菌感染的情况下，可以在合适的细胞中表达包含已知细菌的抗原表位的合适蛋白和肽。例如，这种细菌抗原决定基可以来源于各种细菌，这些细菌包括但不限于，革兰氏阳性杆菌(例如，李司特氏菌属，杆菌例如炭疽杆菌，丹毒丝菌属种)，革兰氏阴性杆菌(例如，巴尔通氏体属，布鲁氏菌属，弯曲杆菌属，肠杆菌属，埃希氏杆菌属，弗朗西斯氏菌属，嗜血杆菌，克雷伯氏杆菌属，摩根氏菌属(morganella)，变形杆菌，普罗威登斯菌属(providencia)，假单胞菌属，沙门菌属，沙雷氏菌属，志贺氏菌属，弧菌，和耶尔森氏菌属种)，螺旋细菌(例如，疏螺旋体物种包括导致莱姆病的博氏疏螺旋体，和钩端螺旋体属)，厌氧菌(例如，放线菌属和梭状芽孢杆菌种包括破伤风梭菌(C.Tetani)，C.botulinutn，产气荚膜梭状芽孢杆菌(C.Perfringens))，革兰氏阳性和阴性球菌，链球菌种，肺炎球菌种，葡萄球菌属种(例如，金黄色葡萄球菌和肺炎葡萄球菌(S.Aureus)和S.肺炎)，奈瑟氏球菌属种(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitides))。

优选地，在希望治疗或预防真菌的感染的情况下，可以在合适的细胞中表达包含已知真菌的抗原表位的合适蛋白和肽。例如，这种抗原表位可以来源于各种真菌，包括，曲霉菌(例如，烟曲霉)，隐球菌(例如，新型隐球菌)，Sporotrix，球孢子菌属，副球孢子菌属，组织胞浆菌属，芽生菌，念珠菌属(例如，白色念珠菌)，酒曲菌属，根毛霉属(Rhizomucor)，犁头霉属，和蛙粪霉属种(Basidiobolusspecies)。

优选地，在希望治疗或预防寄生虫的感染的情况下，可以在合适的细胞中表达包含已知原生动物的抗原表位的合适蛋白和肽。例如，这种抗原表位可以来源于各种原生动物，包括但不限于，Entoamoeba，疟原虫属，利什曼虫属，艾美虫属，隐孢子虫属(Cryptosporidium)，贾第鞭毛虫病，弓型体属，和锥虫属物种。

4.2.抗原蛋白和肽的制备

按照本发明，本发明的组合物包含与HSPs形成复合物的抗原蛋白，其中抗原蛋白来自于感兴趣的抗原细胞的蛋白制品。本发明的组合物也包含与α2M形成复合物的抗原蛋白，其中抗原蛋白来自于感兴趣的抗原细胞的蛋白制品。本发明的组合物也包含HSPs与抗原肽的复合物、或α2M与抗原肽的复合物，其是首先由感兴趣的抗原细胞的蛋白制品产生一组肽、然后肽与HSPs或α2M形成复合物来制备的。

在各种实施方案中，为保留抗原蛋白和肽的多样性并使之最大化，用于制备抗原细胞的蛋白制品的方法不能从抗原细胞中的的其它蛋白和肽中选择性地除去或保留任何特定的蛋白或肽。即使在某些实施方案中，当使用胞液蛋白或膜来源蛋白时，用于制备制品的方法不能选择性的除去或保留任何特定的胞液蛋白或膜蛋白。因此，存在于胞液或膜中的大部分蛋白也存在于相应的抗原细胞的抗原蛋白和肽的制品中。在优选实施方案中，基本上抗原细胞的全部抗原蛋白和肽和基本上胞液或膜内的所有抗原蛋白和肽，均参与复合反应并与HSPs和/或α2M形成复合物。

4.2.1抗原细胞的蛋白制品

在本发明的一个实施方案中，提供了源自于癌细胞、受感染细胞或病原体的蛋白制品。例如，为了治疗癌症，由癌症患者手术后获得的肿瘤细胞制备蛋白制品。在本发明的另一个实施方案中，感兴趣的一或多种抗原蛋白在引入编码这种抗原的重组表达系统的改造细胞系中合成，并且这种细胞用于制备蛋白。蛋白可以从一种或多种细胞组分获得，例如抗原细胞的胞液，或可以从抗原细胞的膜或细胞壁提取或溶解而获得。可使用本领域任何已知的细胞溶解、细胞内容物的分馏和蛋白富集或分离技术。参见例如Current Protocols inImmunology，2卷，8章，Coligan等人(主编)，John Wiley & Sons，Inc.；Pathogenic and Clinical Microbiology：Rowland等人的A Laboratory Manual，Little Brown & Co.，June 1994；将每篇以整体引入到本文中。根据分离细胞内容物的技术，细胞组分包含至少20，50，100，500，1,000，5,000，10,000或20,000种不同的蛋白。

本文中使用的术语“蛋白制品”是指从抗原细胞、抗原细胞的细胞组分或病毒颗粒获得的蛋白混合物。蛋白可以从细胞组分例如胞液获得。蛋白还可以是非胞液的蛋白(例如，源于细胞壁、细胞膜或细胞器的蛋白)，或具有这两种蛋白。细胞组分可以包括但不局限于胞液组分、膜组分及例如源于细胞核、线粒体、溶媒体和内质网的细胞器组分。蛋白制品可以从非重组细胞或重组细胞获得。本文中使用的术语“抗原蛋白”也包括可能存在于制品中的抗原多肽和抗原肽。从抗原细胞或其细胞组分或病毒颗粒处获得的蛋白制品，可以用本领域已知的技术任选地从其它非蛋白物质纯化至各种程度。蛋白制品可以包含至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％ 97％，98％，99％的存在于抗原细胞或病毒颗粒或抗原细胞组分中的不同蛋白和肽。

在一个具体的实施方案中，对蛋白制品没有使用任何制备方法来选择性的除去或保留抗原细胞中一种或多种特定蛋白。

在一具体实施方案中，蛋白制品是未分离和/或纯化的全部细胞裂解液，并且可能包含细胞的其它非蛋白物质。

在另一个具体实施方案中，蛋白制品是细胞组分中的全部蛋白，该组分没有经过进一步分离或纯化，可能包含细胞的其它非蛋白物质。

在又一个的实施方案中，蛋白制品是病毒颗粒制品中的全部蛋白。

在具体实施方案中，蛋白制品包含抗原细胞的全部细胞蛋白、全部胞液蛋白或全部膜结合蛋白。

在各种实施方案中，蛋白制品包含至少20，50，100，500，1,000，5,000，10,000或20,000种不同的蛋白。许多不同的抗原蛋白存在于抗原细胞的蛋白制品中。而且，蛋白制品中的蛋白在体外与HSPs或α2M形成复合物之前可以进行蛋白酶消化步骤。或者，蛋白制品中的蛋白在体外与HSPs或α2M形成复合物之前可以不进行蛋白酶消化步骤。

为制备抗原细胞或病毒颗粒的蛋白制品，可以使用本领域已知的标准方法进行抗原细胞的裂解或细胞壁、细胞膜或病毒颗粒结构的离解。在各种实施方案中，抗原细胞可以用例如机械剪切、超声处理、冻融、调节细胞周围介质的渗透性或这些技术的联用等方法进行裂解。在较不优选的实施方案中，可以用例如去污剂的化学试剂来裂解抗原细胞。

一旦细胞被裂解，最好除去细胞碎屑、非蛋白物质或不包含胞液和/或膜来源蛋白(包括细胞器膜中的蛋白)的物质。可以用例如低速离心分离或过滤的技术除去这些组分。细胞碎屑和完整细胞除去之后，可使用高速离心步骤，将上清液中的胞液蛋白和聚集在沉淀中的膜来源蛋白分离。可用本领域通常已知的标准方法将膜来源蛋白从沉淀中进一步分离。可使用本领域通常已知的标准技术从病毒颗粒中提取病毒蛋白。这些分离方法基于通常的和总体的尺寸、密度、和/或存在于抗原细胞、胞液或膜中的分子的电荷而起作用。这些分离方法不会或没有设计成能够选择性的从其它蛋白中除去或保留任何一或多种特定的蛋白。

在各种实施方案中，源于抗原细胞的蛋白可以通过它们通常的生化和/或生物物理学性质例如尺寸、密度、电荷、细胞定位或其组合而任选地分离。可使用许多本领域已知的技术进行分离。所选择的、包含至少20，50，100，500，1,000，5,000，10,000或20,000种不同蛋白或包含至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％ 97％，98％，99％的存在于抗原细胞或其细胞组分或病毒颗粒中的不同蛋白的蛋白/肽组分，可用于形成与HSP或α2M的复合物。相应地，源于抗原细胞的蛋白可以通过下列方法制备：按照它们的尺寸、电荷、细胞定位或其组合分离分子，而且不能从存在于抗原细胞、胞液或膜中的其它蛋白中选择性的除去或保留任何一或多种特定蛋白。

一种用于制备包含胞液蛋白的蛋白制品的示范性的、而不是限制性的方法如下：

将细胞悬浮在3倍体积的1X裂解缓冲液中，在冰上培育20分钟，其中裂解缓冲液中包含pH7.5的30mM碳酸氢钠和1mM的PMSF，细胞可以是来源于患者的活检肿瘤细胞或在体外培养的肿瘤细胞、或病原体感染的细胞，然后在杜恩斯匀浆器中将低-肿胀的细胞均化，直至超过95％的细胞裂解。作为剪切的替代方案，可以在冰上将细胞超声处理，直至镜检确定超过99％的细胞裂解。使用超声处理时，超声处理之前将细胞悬浮在缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，其中缓冲液包含1mM的PMSF。

将裂解液以1,000xg离心10分钟，以除去完整细胞、细胞核及其它细胞碎屑。将得到的上清液以100,000xg再次离心约一小时，重新获得上清液。可以将100,000xg的上清液在4℃用PBS或其它合适的缓冲液透析36小时(三次，每次100倍体积)，以提供本发明的可溶胞液蛋白。如果需要的话，可以通过过滤或低速离心分离除去制品中的不溶性物质。

一种用于制备包含膜来源蛋白的蛋白制品的示范性的、而不是限制性的方法如下：

将细胞悬浮在3倍体积的1X裂解缓冲液中，在冰上培育20分钟，其中裂解缓冲液中包含pH7.5的30mM碳酸氢钠和1mM的PMSF，细胞可以是来源于患者的活检肿瘤细胞或在体外培养的肿瘤细胞或病原体感染的细胞，然后在杜恩斯匀浆器中将低渗-肿胀的细胞均化，直至超过95％的细胞裂解。作为剪切的替代方案，可以在冰上将细胞超声处理，直至镜检确定超过99％的细胞裂解。使用超声处理时，超声处理之前将细胞悬浮在缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，其中缓冲液包含1mM的PMSF。

然后将裂解液于100,000xg离心10分钟以收集细胞膜。通过将沉淀再悬浮于包含1％脱氧胆酸钠(不含Ca²⁺和Mg²⁺)的5倍体积的PBS中、并在冰上培育1小时，使得膜来源蛋白从双层脂质脱离并得以从100,000g沉淀(膜来源蛋白所位于的地方)中分离。将得到的悬浮液于20,000g离心30分钟，收集所得上清液并更换数次PBS(不含Ca²⁺和Mg²⁺)透析以除去去污剂。将得到的渗析液于100,000g离心90分钟，上清液进一步纯化。然后将钙和镁都加入到上清液中，至终浓度为2mM。如果需要的话，可以通过过滤或低速离心分离除去制品中的不溶性物质。

在一个具体的实施方案中，从抗原细胞获得的一组胞液和/或膜来源蛋白可以直接与HSP或α2M形成复合物而不需要蛋白酶处理或任何进一步的提取或筛选过程。作为替代选择，蛋白在形成复合物之前可以进行蛋白酶处理。

4.2.2来源于抗原细胞的肽

按照本发明，可将从抗原细胞处获得的胞液和膜来源蛋白任选地进行消化以产生抗原肽。在一个实施方案中，将胞液蛋白或膜来源蛋白进行消化。在另一个实施方案中，在消化反应中将胞液和膜来源蛋白混合，以产生抗原肽。在优选实施方案中，用于蛋白酶消化的蛋白制品没有经过任何从抗原细胞、或抗原细胞的胞液或膜中的其它蛋白中选择性的除去或保留一或多种特定蛋白的方法处理。

本发明中可使用各种蛋白酶或蛋白水解酶，由抗原细胞的蛋白制品产生一组包含抗原肽的肽。酶消化可以单独进行，或与本领域众所周知的任何蛋白水解酶的合适组合来进行，蛋白水解酶包括但不限于，胰蛋白酶，葡萄球菌肽酶I(又名蛋白酶V8)，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，组织蛋白酶G，嗜热菌蛋白酶，弹性蛋白酶，和木瓜蛋白酶。胰蛋白酶是一种断裂赖氨酸和精氨酸羧基末端的高度特异丝氨酸蛋白酶。由于受到断裂位点的数量限制，预计会保留许多完好的MHC结合表位。葡萄球菌肽酶I是一种丝氨酸蛋白酶，可特异性地在谷胺酸和天冬氨酸残基之后断裂。可以用单一蛋白酶或蛋白酶的混合物进行消化。使用的蛋白酶或蛋白水解酶是在适合于特定酶的条件下培育的。优选纯化的酶。还可以使用非酶方法，例如溴化氰断裂产生肽。要消化的蛋白制品可以等分成多份反应液，每一反应液使用一种不同的酶，得到的肽可以任选地合在一起使用。在酶反应中，完全消化蛋白是不必要的。这些反应的结果是每一种存在于蛋白制品中的蛋白产生了一组多样的和不同的肽。不同肽组的产生使得当这些肽与HSP或α2M形成复合物时，产生能够诱导针对蛋白制品中抗原的免疫应答的抗原肽更为可能。在一个优选实施方案中，将被消化的蛋白制品等分成两份单独的反应液，并用两种不同的蛋白水解酶，由存在于蛋白制品中的蛋白制备两组不同的肽。根据蛋白、酶和反应条件，反应液中可能仍然保留未消化的蛋白。在一个优选实施方案中，分别使用胰蛋白酶和葡萄球菌肽酶I消化蛋白制品。

在另一个优选实施方案中，本发明使用的蛋白水解酶呈现出与蛋白酶体中发现的蛋白水解活性相似的活性。蛋白酶体负责将细胞中错误折叠或损伤的胞液蛋白和核蛋白进行溶媒体外的内催化降解。蛋白酶体可以将蛋白完全降解为单一氨基酸，可以产生最佳的I类主要组织相容复合物(MHC I)结合表位，并可以产生更长肽前体物，该前体物可能在细胞的其它地方潜在地进行进一步修剪成细胞毒性T细胞表位。蛋白酶体偏向于断裂碱性、酸性和疏水性氨基酸的羧基(COOH)端。存在于蛋白酶体中的已知三种蛋白水解酶活性相似于糜蛋白酶活性、胰蛋白酶活性和肽-谷氨酰胺-肽水解活性(Uebel和Tampe，1999，Curr.Opin.Immunol.11：2 203-208)。这样，具有这种活性和特异性的酶可单独或联合使用来消化蛋白制品。在一个优选实施方案中，使用了胰蛋白酶、糜蛋白酶和/或肽-谷氨酰胺-肽-水解酶。

得到的肽消化液包含抗原肽、非抗原肽和单一氨基酸残基。反应液也可能包含未消化或不完全消化的抗原蛋白。对本发明的蛋白水解酶的消化液进行监测以便产生长度在理想范围内的肽。在一个优选实施方案中，产生的肽约为7至约20个氨基酸残基。大部分被I类和II类MHC呈递至T细胞的抗原肽在此范围内。在各种实施方案中，该组肽包含长度在6至21，8至19，10至20，或至少7，8，9，10，11，12，15，20，25，30，40，45或50个氨基酸残基的肽。在优选实施方案中，抗原肽具有7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个氨基酸残基。为了监测蛋白消化的进度，可进行试验反应，即从反应液中取出小等分蛋白消化液，并通过三(羟甲基)甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(“tricine-PAGE”)、高效液相色谱(“HPLC”)或质谱、或任何其它本领域已知的方法测定肽链长度来监测消化进度。使用这样的试验反应，可以确定在特定酶浓度下，何时产生特定长度范围的肽片段。其它可以控制的反应变量包括反应液中蛋白的量、温度、孵育持续时间、辅助因子存在与否等等。

一旦从一种抗原细胞生成特定长度范围的肽片段的适当条件得以建立，可以复制酶反应条件以产生可汇合的抗原肽。优选在肽与HSPs或α2M形成复合物之前终止酶消化反应。在本发明的一个实施方案中，可使用抑制剂终止酶消化。根据用于蛋白消化的酶，可用于本发明的酶抑制剂包括但不局限于PMSF、苯丁抑制素、氨肽酶抑制剂、亮肽素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂。大部分的蛋白酶抑制剂在本领域为大家所熟知。另外，另一种终止酶消化的方法是用物理方法将酶从反应液中除去。可使所选的酶附到固相上，例如树脂或易于通过众所周知的方法例如离心分离或过滤除去的物质，达到除去该酶的目的。蛋白制品可与固相接触或流过固相一段时间。这种固相酶可通过商业途径购买，或利用本领域众所周知的固定酶的方法制备。

消化反应结束时，可以任选地将肽从制品中的低分子量物质例如二肽或单一氨基酸残基中分离出来。例如，可以通过离心使肽通过一种膜例如Centriprep-3而将肽分离出来。任选地，利用其生化和/或生物物理学性质，例如尺寸、电荷或其组合来分离肽。可用本领域已知的任何技术进行分离，从而产生包含至少50，100，500，1,000，5,000，10,000，20,000，50,000或100,000种不同肽的消化了的蛋白制品。

在本发明的另一个实施方案中，存在于抗原细胞中的内源性肽可单独用于本发明中，或与胞液蛋白和膜来源蛋白水解消化后产生的肽联合使用。存在于抗原细胞中的内源性肽包括在体内与HSP和/或I类和II类MHC分子形成复合物的肽。按照本发明，从抗原细胞的蛋白制品中直接分离出的肽可与HSPs和/或α2M形成复合物。

在具体的实施方案中，分离过程中使用胞液蛋白或膜来源蛋白。在另一个具体的实施方案中，分离过程中联合使用胞液蛋白和膜来源蛋白。在优选实施方案中，用于分离的蛋白制品没有从抗原细胞、或抗原细胞的胞液或膜中的其它蛋白中经过任何选择性的除去或保留一或多种特定蛋白的方法处理。抗原肽可以直接从细胞的蛋白制品中分离，而不预先将抗原肽和HSP、α2M或主要组织相容性复合体(MHC)分子的复合物分离出来。优选的蛋白制品包括包含至少20，50，100，500，1,000，5,000，10,000，或20,000种不同蛋白或包含至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％ 97％，98％，99％的存在于抗原细胞或其细胞组分或病毒颗粒中的不同蛋白。

在各种实施方案中，该方法包括将蛋白制品用ATP、盐酸胍处理，和/或将蛋白制品暴露于酸性条件下，以便可以将蛋白制品中与蛋白例如HSPs、α2M和I类MHC分子相关的抗原肽洗脱出来。优选，在用ATP、盐酸胍或酸性条件之前，分离过程不包括将蛋白制品的HSP复合物、α2M复合物或MHC复合物纯化。可使用许多不同的酸，包括但不局限于三氟乙酸。从HSP-肽复合物中分离肽的方法在本领域是已知的，例如Menoret等人，1999，Biochem.Biophys.Res.Commun.262(3)：813-8，将其整体引入到本文中作为参考。还可以使用本领域已知的方法例如在Marston和Hartley(1990，Meth.Enzymol.182：264-276)描述的方法来解离蛋白质聚集体。

具体地说，分离过程包括将抗原细胞的蛋白制品暴露于ATP中，例如在室温下暴露一小时，和/或用浓度在含0.05％至1％TFA内的三氟乙酸(TFA)处理抗原细胞的蛋白制品。处理优选包括在0.1％ TFA存在下的超声处理。在一个最优选实施方案中，蛋白制品首先暴露于ATP中，接着在0.1％ TFA中超声处理。本发明可在细胞裂解和分离过程之前使用各种蛋白酶抑制剂，以防止或减少可能产生与HSPs或α2M无内源性相关的肽的细胞蛋白断裂。例如，可使用14种蛋白酶抑制剂的混合物：2mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)，1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)，1mM的乙二醇双(P-氨乙基醚)N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)，均购自Sigma，St.Louis，MO)，和20mg/ml的抗蛋白酶，5mg/ml的苯丁抑制素，20ptg/ml的Chemostatin，20Jig/ml的E64，1ttg/ml的亮抑酶肽，1gg/ml的胃蛋白酶抑制素，40Ag/ml的Pefabloc和10tkg/ml的脱辅基蛋白(以上均购自Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。源于蛋白制品的肽包括各种长度的、范围从至少7，8，9，10，11，12，15，20，25，30，40，45或50个氨基酸残基的抗原肽和非抗原肽。处理结束时，优选在与HSP或α2M形成复合物之前将肽与制品中的蛋白分开而复原。例如，肽的复原方法包括通过离心使肽通过一种膜例如Centriprep-3、真空干燥、或反相层析例如在BioCad20微分HPLC Poros RH2柱(PerseptiveBiosystems，Cambridge，MA)进行分离、在水中用0.1％TFA平衡及用乙腈洗脱。相应地，内源性存在于抗原细胞中及直接从蛋白制品中分离的抗原肽可以与HSPs和/或α2M形成复合物。另外，包含内源性存在于抗原细胞中的肽及源于消化胞液和膜来源蛋白所得肽的一组混合肽，可以与HSPs和/或α2M形成复合物。

4.3.HSPs和α2M的制备

按照本发明，来源于抗原细胞的抗原肽与HSPs和/或α2M形成复合物。本文中描述了可用于分离和制备本发明使用的HSPs与α2M的示范性方法。

在本发明的实践中使用的热休克蛋白，本文中也指的是应激蛋白，可以选自满足下列标准的任何细胞蛋白。当细胞暴露于应激性刺激时，蛋白在细胞内的浓度提高，其能够与其它蛋白或肽结合，在三磷酸腺苷(ATP)的存在下或在酸性条件下，它能够释放所结合的蛋白或肽；并且其是一种与具有上述性质的任何细胞蛋白的同源性至少为35％的蛋白。

最先得以鉴定的应激蛋白是热休克蛋白(HSP)。正如它们的名称所示，HSPs是由对于热休克应答的细胞所合成。基于家族成员的分子量，至今已经鉴定出五个主要类别的HSPs。这些类别被称为sHSPs(小热休克蛋白)、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100，其中数字反映了HSPs近似的千道尔顿分子量。除了主要的HSP家族之外，一种内质网驻留蛋白，称为钙网蛋白，也已经被确定为另一种热休克蛋白，当其复合至抗原分子时，用于引起免疫应答(Basu和Srivastava，1999，J.Exp.Med.189：797-202)。其它可用于本发明的应激蛋白包括但不局限于grp78(或BiP)，蛋白二硫化物异构酶(PDI)，HSP110和grp170(Lin等人，1993，Mol.Biol.Cell，4：1109-1119；Wang等人，2001，J.Immunol.，165：490-497)。随后发现这些家族的许多成员经诱导可对其它应激性激发剂产生应答，这些应激性激发剂包括但不限于营养剥夺、代谢失调、氧自由基、缺氧和细胞内病原体感染。(参见Welch，May 1993，Scientific American 56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.8：401-420；Craig，1993，Science260：1902-1903；Gething，等人，1992，Nature 355：33-45；和Lindquist，等人，1988，Annu.Rev.Genetics 22：631-677)，将其公开内容引入本文中作为参考。可以预期属于这些家族的所有HSPs/应激蛋白可在本发明的实践中使用。

主要HSPs在应激细胞内可以积聚很高的水平，但它们在非应激细胞内以低至中等水平出现。例如，正常温度下高度可诱导的哺乳动物HSP70几乎检测不出，但热休克时成为细胞中最活跃的合成蛋白之一(Welch，等人，1985，J.Cell.Biol.101：1198-1211)相比之下，正常温度下在大部分但不是所有的哺乳动物细胞中存在丰富的HSP90和HSP60，并且可以进一步热诱导(Lai，等人，1984，Mol.Cell.Biol.4：2802-10；van Bergen en Henegouwen，等人，1987，GenesDev.1：525-31)。

热休克蛋白属于现有最高度保守的蛋白。例如，DnaK为来自大肠杆菌的HSP70，其氨基酸序列约50％与来自脱皮的(excoriates)HSP70蛋白相同(Bardwell，等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.81：848-852)。HSP60和HSP90家族也显示类似的家族内高度保守性。(Hickey，等人，1989，Mol.Cell.Biol.9：2615-2626；Jindal，1989，Mol.Cell.Biol.9：2279-2283)。另外，已经发现HSP60、HSP70和HSP90家族由与应激蛋白序列相关但表达水平不因应激而改变的蛋白组成，例如其氨基酸有35％以上是相同的。因此，本文中预期的热休克蛋白或应激蛋白的定义，正如本文中使用的，包括氨基酸至少有35％至55％与三个家族中的成员相同、细胞内表达水平在对应激性应答时升高的其它蛋白、突变蛋白、类似物和其变体，优选有55％至75％氨基酸相同，最优选75％至85％氨基酸相同。

在一个实施方案中，HSP抗原肽复合物中的HSP部分需要从细胞纯化，下文4.3.1-4.3.3部分所描述的示范性纯化方法可用于纯化HSP-肽复合物，而后在ATP的存在或在酸性条件下，使HSPs从内原性HSP-肽复合物中分离，随后在体外与一组抗原肽形成复合物。参见Peng，等人，1997，J.Immunol.Methods，204：13-21；Li和Srivastava，1993，EMBO J.12：3143-3151，将每篇引入到本文中作为参考。尽管所描述的是用于肿瘤细胞，下文所描述的方案可用于将HSPs从任何受感染细胞和任何真核细胞中分离出来，例如细胞内病原体感染的组织、分离细胞或永生真核生物细胞系，及肿瘤细胞或肿瘤细胞系。

4.3.1.HSP70-肽复合物的制备和纯化

HSP70-肽复合物的纯化先前已有描述，参见，例如Udono等人，1993，J.Exp.Med.178：1391-1396.下文以实施例的方式描述了一种可以使用的方法，但不限制于此。

开始，将肿瘤细胞悬浮在3倍体积的1X裂解缓冲液中，其中缓冲液包括pH值7.5的30mM碳酸氢钠、1mM PMSF。然后将沉淀在冰上超声处理，直至镜检测定超过99％的细胞裂解为止。作为超声处理的替代方案，可以在杜恩斯匀浆器中用机械剪切的方法均化细胞将细胞裂解，直至超过95％的细胞裂解为止。

然后将裂解液以1,000g离心10分钟，以除去未裂解的细胞、细胞核及其它细胞碎屑。将得到的上清液以100,000g再次离心90分钟，采集上清液，然后与已用包含2mM Ca²⁺和2mM Mg²⁺的磷酸盐缓冲盐水(PBS)平衡的Con A琼脂糖凝胶混合。当细胞以机械剪切方式裂解时，在与Con A琼脂糖凝胶混合之前，用等体积的2X裂解缓冲液稀释上清液。然后将上清液在4℃与Con A琼脂糖凝胶结合2-3小时。采集未能结合的物质，在pH值7.5的10mM三-乙酸酯(Tris-Acetute)、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mM PMSF中透析36小时(三次，每次100倍体积)。然后渗析液以17,000rpm(Sorvall SS34转子)的速度离心20分钟。然后采集得到的上清液，将其加到已在pH为7.5、含20mM三乙酸酯、20mM NaCl、0.1mM EDTA和15mM 2-巯基乙醇中平衡的MonoQ FPLC柱上。然后将该柱以20mM至500mM的NaCl梯度进行洗脱，洗脱的组分通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，使用合适的抗HSP70抗体(例如来源于克隆N27F3-4的抗体，来自StressGen)、通过免疫印迹法进行鉴定。

汇集对于抗HSP70抗体具有强烈免疫活性的组分，并用硫酸铵沉淀HSP70-肽复合物；具体地用50％-70％的硫酸铵。然后以17,000rpm(SS34 Sorvall转子)离心，收集沉淀并用70％硫酸铵洗涤。然后将洗过的沉淀溶解，通过在Sephadex^R G25柱(Pharmacia)上凝胶过滤，除去任何剩余的硫酸铵。如果需要的话，由此获得的HSP70制品可以通过如上所述的Mono Q FPLC柱重提纯。

使用该方法，HSP70-肽复合物可以纯化至明显的均质性。典型地说，1g的细胞/组织可以纯化出1mg的HSP70-肽复合物。

改进的HSP70纯化方法包括将细胞蛋白与附于固体底物的ATP或ATP的不可水解的类似物接触，以便裂解液中的HSP70可以与ATP不可水解的ATP类似物结合，并洗脱出结合的HSP70。优选的方法使用附于固体基质(例如ATP-琼脂糖)的ATP的柱层析。得到的HSP70制品纯度更高，不含污染肽。HSP70的收率也显著提高，约大于10倍。

另外，可以用ADP的不可水解类似物代替ATP的层析法来纯化HSP70-肽复合物。举例来说，但不限于此，通过ATP-琼脂糖层析法纯化不含肽的HSP70，可以按如下方法进行：

Meth A肉瘤细胞(500百万个细胞)在低渗缓冲液中均化，裂解液在4℃于100,000g离心90分钟。将上清液加到ATP-琼脂糖柱上。将柱在缓冲液中洗涤，并用5倍于柱体积的3mM ATP洗脱。在总数为15级分的洗脱液中，HSP70在第2至第10级分中得以洗脱。洗脱的组分通过SDS-PAGE分析。使用该方法，HSP70可以纯化至明显的均质性。

4.3.2.HSP90-肽复合物的制备和纯化

下文以实施例的方式描述了一种可以使用的方法，但不限制于此。

首先将肿瘤细胞悬浮在3倍体积的1X裂解缓冲液中，其中缓冲液包括30mM碳酸氢钠和1mM PMSF，pH值7.5。然后将沉淀在冰上超声处理，直至镜检测定超过99％的细胞裂解为止。作为超声处理的替代方案，可以在杜恩斯匀浆器中用机械剪切的方法均化细胞将细胞裂解，直至超过95％的细胞裂解为止。

然后将裂解液以1,000g离心10分钟，以除去未裂解细胞、细胞核及其它细胞碎屑。将得到的上清液以100,000g再次离心90分钟，采集上清液，然后与已用包含2mM Ca²⁺和2mM Mg²⁺的PBS平衡的Con A琼脂糖凝胶混合。当细胞以机械剪切方式裂解时，在与Con A琼脂糖凝胶混合之前，用等体积的2X裂解缓冲液稀释上清液。然后将上清液在4℃与Con A琼脂糖凝胶结合2-3小时。采集未能结合的物质，在pH值7.4的20mM磷酸钠、1mM EDTA、250mMNaCl中透析36小时(三次，每次100倍体积)。然后渗析液以17,000rpm(Sorvall SS34转子)的速度离心20分钟。然后收集得到的上清液，并加到已用透析缓冲液平衡的Mono Q FPLC柱上。然后将蛋白用200mM至600mM NaCl的盐梯度洗脱。

洗脱的组分用SDS-PAGE分离，并且将包含HSP90-肽复合物的组分通过使用抗HSP90抗体例如3G3(Affinity Bioreagents)的免疫印迹法鉴定。使用该方法，HSP90-肽复合物可以纯化至明显的均质性。典型地，1g细胞/组织可以纯化出150-200μg的HSP90-肽复合物。

4.3.3.GP96-肽复合物的制备和纯化

下文以实施例的方式描述了一种可以使用的方法，但不限制于此。

将肿瘤块再悬浮于3倍体积的缓冲液中，缓冲液包括30mM碳酸氢钠缓冲液(pH值7.5)和1mM PMSF，并使细胞在冰上溶胀20分钟。然后在冰上将细胞块在杜恩斯匀浆器(按照各个细胞类型，均化器的合适廓清率将会改变)中均化，直至超过95％的细胞裂解。

然后将裂解液以1,000g离心10分钟，以除去未裂解细胞、细胞核及其它碎片。然后将源于离心步骤的上清液于100,000g再次离心90分钟。gp96-肽复合物可以从100,000g离心后的沉淀中纯化，也可从上清液中纯化。

当从上清液纯化时，用等体积的2X裂解缓冲液稀释上清液，并将上清液在4℃与已用包含2mM Ca²⁺和2mM Mg²⁺的PBS平衡过的Con A琼脂糖凝胶混合2-3小时。然后，将浆液加到柱中，并用1X裂解缓冲液洗涤，直至OD₂₈₀降至基线。然后，用1/3柱床体积的、溶于包含2mMCa²⁺和2mM Mg²⁺的PBS中的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗涤，将柱用一块石蜡膜密封，在37℃培育15分钟。然后将柱冷却到室温，从柱底部除去石蜡膜。将五倍柱体积的α-MM缓冲液加到柱中，通过SDS-PAGE分析洗脱液。典型地，得到的物质的纯度大约60-95％，然而这取决于细胞类型和所用组织与溶解缓冲液的比例。然后将样品加到已用含5mM磷酸钠、pH7的缓冲液平衡的Mono Q FPLC柱(Pharmacia)中。然后用0-1M NaCl的梯度将蛋白从柱中洗脱出来，gp96级分于NaCl浓度为400mM和550mM之间洗脱出来。

然而可以通过两个额外的步骤对该方法加以改进，可单独使用任意一步或两步联合使用，以便始终产生明显均一的gp96-肽复合物。一个任选的步骤包括在Con A纯化步骤之前进行硫酸铵沉淀，另一个任选的步骤包括在Con A纯化步骤之后、Mono Q FPLC步骤之前进行DEAE-琼脂糖凝胶纯化。

如下文以实施例方式所述的第一步任选步骤中，往100,000g离心步骤所获得的上清液中加入硫酸铵至硫酸铵最后浓度为50％。缓慢加入硫酸铵，同时轻轻搅拌置于冰水槽中的烧杯中的溶液。将溶液在4℃搅拌约0.5-12小时，然后以6,000rpm(Sorvall SS34转子)离心得到的溶液。将此步骤中得到的上清液除去，通过加入硫酸铵溶液使硫酸铵饱和度达到70％，并以6,000rpm(Sorvall SS34转子)离心。收集此步骤中得到的沉淀，为了冲洗沉淀，将其悬浮在包含70％硫酸铵的PBS中。以6,000rpm(Sorvall SS34转子)离心混合物，并将沉淀溶于包含2mM Ca²⁺和Mg²⁺的PBS中。以15,000rpm(Sorvall SS34转子)稍微离心除去未溶解的物质。然后，将溶液与Con A琼脂糖凝胶混合，以下步骤与前面相同。

如下文以实施例方式描述的第二步任选的步骤中，将从Con A柱中洗脱出来的级分中含有gp96的级分汇集，将该缓冲液用透析方法与pH为7、含5mM的磷酸钠缓冲液和300mM NaCl的缓冲液交换，优选在Sephadex G25柱上进行缓冲液交换。缓冲液交换之后，将溶液与预先用pH为7的、5mM磷酸钠缓冲液、300mM NaCI平衡的DEAE-琼脂糖凝胶混合。将蛋白溶液和磁珠轻柔地混合1小时，装入柱中。然后，用pH为7的5mM磷酸钠缓冲液、300mM NaCl洗涤柱，直至280nm处的吸光度降到基线为止。然后用五倍体积的pH为7的5mM磷酸钠缓冲液、700mM NaCI将所结合的蛋白洗脱出来。汇集含有蛋白的级分并用pH为7的、5mM磷酸钠缓冲液稀释，使盐浓度下降至175mM。然后将得到的物质加到用pH为7的、5mM磷酸钠缓冲液平衡的Mono Q FPLC柱(Pharmacia)中，用前述方法将结合至Mono Q FPLC柱(Pharmacia)的蛋白洗脱下来。

然而，本领域技术人员可能用常规实验来评估将第二个任选步骤引入纯化方案的益处，这是可以理解的。另外，加入每一个任选步骤的益处取决于起始材料的来源，这也是可以理解的。

gp96组分从100,000g沉淀中分离时，将沉淀悬浮在含1％去氧胆酸钠或1％oxtyl吡喃葡萄糖苷(不含Mg²⁺和Ca²⁺)的5倍体积的PBS中，在冰上培育1小时。将悬浮液于20,000g离心30分钟，所得上清液并用若干不同的PBS(不含Ca²⁺和Mg²⁺)透析以除去净化剂。将渗析液于100,000g离心90分钟，收集上清液，将钙和镁分别加入到上清液中，使其最后浓度为2mM。然后按照从100,000g上清液中分离gp96-肽复合物的未改进或改进方法来纯化样品，参见上面。

使用该方法，gp96-肽复合物可以纯化至明显的均质性。1g细胞/组织可以分离出约10～20μg gp96。

4.3.4.α2M的制备和纯化

α-2-巨球蛋白可以通过商业途径购买或由人类血液纯化提纯来制备。

通常，α2-巨球蛋白可以通过已知的方法、从哺乳动物血清中回收和提纯，方法包括硫酸铵沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱层析，磷酸纤维素层析，免疫亲和层析，羟磷灰石层析和凝集素层析法。

在一个实施方案中，α2M是使用亲和纯化技术从血清中提纯的。蛋白的层析分离方法，例如亲和层析，在本领域为大家所熟知。简要地说，亲和层析使用固定的结合配偶体，以特异性地捕获结合反应中的蛋白。亲合性捕捉试验的结合配偶分子可以包括例如α2M或其它配体的抗体，例如特异性结合α2M的α2M受体结合区域。另外，过滤结合试验使用一种器械例如固相表面例如过滤机或柱，基于复合物和未结合的反应物之间的一些物理或化学差别，非特异性保留蛋白或蛋白复合物。亲和层析和/或过滤结合分离技术可用于从血清或其它体液中分离α2M，如本文所述。

在本发明的一个具体实施方案中，按如下方法从血清中分离α2M：血清与含有α2M结合配偶体即α2M的束缚分子的固相例如琼脂糖柱接触。使血清在固相上培育一段时间，这段时间应足够α2M与固相结合。然后从固相除去没有结合的物质；并从固相将所结合的α2M洗脱下来。

α2M的结合配偶体可以是特异性地与α2M结合的任何分子。在一个优选实施方案中，α2M结合分子是特异性针对α2M的抗体。优选α2M-特异性抗体是单克隆抗体。在另一个优选实施方案中，α2M结合分子是α2M受体的配体结合片段。

固相可以是任何表面或基质，例如，但不局限于聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，玻璃，硝化纤维，右旋糖酐，尼龙，聚丙烯酰胺和琼脂糖。支持构型可以包括磁珠、膜、微粒、反应容器的内表面例如微量滴定板、试验管或其它反应容器。

在一个优选实施方案中，通过用0.04M Tris pH值7.6、0.15MNaCl稀释血清，将α2M从小鼠血清中分离出来。然后将混合物施加到用相同的缓冲液平衡和洗脱的65ml Sephacryl S 300R(Sigma)柱上。通过斑点印迹膜测定α2M阳性组分，并使用PD-10柱将缓冲液转换为0.01M磷酸钠缓冲液、pH值7.5。另外0.04M Tris pH值7.6、0.15M NaCl缓冲液可用作ht e 65ml柱的缓冲液，以省去交换缓冲液的步骤。将含有复合物的组分施加到刀豆素A琼脂糖凝胶柱上。将结合的复合物用0.2M甲基甘露糖吡喃糖苷或5％甲基甘露糖吡喃糖苷洗脱，并加到用0.05M乙酸钠缓冲液平衡过的DEAE柱上。A2M是以纯净的形式洗脱出来的，用0.13M乙酸钠缓冲液，通过SDS-PAGE和免疫印迹法分析。

在又一个实施方案中，α2M可以从血液中分离，可以实施例的形式使用下列非限制性方案：从主体采集血液并使其凝结。然后以14,000xg将其离心30分钟，获得血清，然后将其加到用0.04M pH为7.6的0.04M Tris缓冲液及0.3M NaCl平衡过的凝胶过滤柱(SephacrylS-300R)中。血清约为10ml时，使用65ml柱。收集三毫升为一级分，对各个级分用α2M特异性抗体通过斑点印迹检验α2M是否存在。汇集α2M的阳性级分，并将其加到PD10柱中，以便将缓冲液与含PMSF的、pH为7.5的0.01M磷酸钠缓冲液交换。然后将汇集的级分加到用磷酸盐缓冲液平衡的Con A柱(10mol)上。洗柱，并用5％甲基甘露糖吡喃糖苷洗脱蛋白。洗脱液流过PD10柱以便将缓冲液改变为乙酸钠缓冲液(0.05M；pH6.0)。然后将DEAE柱用乙酸酯缓冲液平衡，并将样品加到DEAE柱中。洗柱，并用0.13m乙酸钠洗脱蛋白。然后汇集含α2M的组分。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳试验表明，使用该方法可将α2M纯化至明显的均质性。

还可以使用本领域已知的其它分离α2M的方法(Dubin等人，1984，Immunotherapy 8(4)：589-596，；Okubo等人，1981，Bio.Chem.Biophys.688：257-267；Nieuwenhuizen等人，1979，Biochem.Et Biophy.580：129-139)。

4.3.5.非共价细胞产生的HSP110-肽复合物的制备和纯化

通过Wang等人在2001，J.Immunol.166(1)：490-7中所描述的可使用的方法，通过实施例而非限制性的方式描述如下：

将细胞或组织例如肿瘤细胞组织的小块(40-60ml)，利用Dounce匀浆器，在5倍体积的低渗缓冲液(30mN碳酸氢钠，pH7.2，和蛋白酶抑制剂)中匀浆。将裂解液于4,500xg离心，然后于100,000xg离心2小时。如果是肝脏的细胞或组织，首先将得到的上清液加到蓝色Sepha-rose柱(Pharmacia)上除去白蛋白。另外，将得到的上清液加到已用结合缓冲液(20mMTris-HCl，pH值7.5；100mM NaCl；1mMMgCl₂；1mM CaCl₂；1mM MnCl₂；和15mM 2-ME)预先平衡过的Con A-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。将结合的蛋白用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷的结合缓冲液洗脱。(Sigma，St.Louis，MO).

首先用20mM Tris-HCl、pH7.5；100mM NaCl；和15mM 2-ME的溶液透析Con A-琼脂糖凝胶未结合的物质，然后加到DEAE-琼脂糖凝胶柱上，并用从100至500mM NaCl的盐梯度洗脱。收集含有hsp 110的组分，透析，并装载到已用20mM Tris-HCl、pH7.5、200mM NaCl和15mM 2-ME平衡过的Mono Q(Pharmacia)10/10柱上。用200-500mM NaCI的梯度洗脱所结合的蛋白。用SDS-PAGE和免疫印迹法分析组分中是否存在hsp110，如Wang等人在1999，J.Immunol.162：3378中所描述的。汇集含有hsp 110的组分并用Centriplus(Amicon，Beverly，MA)浓缩，加到Superose 12柱(Pharmacia)中。用40mMTris-HCl、pH8.0；150mM NaCl；和15mM 2-ME洗脱蛋白，流速0.2ml/min。

4.3.6.非共价细胞产生的GRP170-肽复合物的制备和纯化

通过Wang等人在2001，J.Immunol.166(1)：490-7中所描述的可使用的方法，通过实施例而非限制性的方式描述如下：

将细胞或组织例如肿瘤细胞组织的小块(40-60ml)，利用Dounce匀浆器，在5倍体积的低渗缓冲液(30mN碳酸氢钠，pH7.2，和蛋白酶抑制剂)中匀浆。将裂解液于4,500xg离心，然后于100,000xg离心2小时。如果是肝脏的细胞或组织，首先将得到的上清液加到蓝色Sepha-rose柱(Pharmacia)除去白蛋白。另外，将得到的上清液加到已用结合缓冲液(20mMTris-HCl，pH值7.5；100mM NaCl；1mMMgCl₂；1mM CaCl₂；1mM MnCl₂；和15mM 2-ME)预先平衡过的Con A-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷的结合缓冲液洗脱所结合的蛋白。(Sigma，St.Louis，MO).

首先用20mM Tris-HCl、pH7.5和150mM NaCl的溶液透析ConA-琼脂糖凝胶结合的物质，然后加到Mono Q柱上，并用从150至400mM的NaCl梯度洗脱。将汇集的组分浓缩施加到Superose 12柱(Phar-macia)上。收集含有均质grp170的组分。

4.3.7.热休克蛋白和α2M的重组表达

在本发明的某些实施方案中，可以从通过重组方法高水平表达HSPs和α2M的细胞制备HSPs和α2M，许多HSPs和α2M的氨基酸序列和核苷酸序列通常可从序列数据库得到，例如GenBank。可使用计算机程序，例如Entrez等来浏览数据库，并通过登记号来检索任何感兴趣的氨基酸序列和遗传序列。还可以利用诸如FASTA和BLAST之类的程序搜索这些数据库，以鉴定及查询有着不同程度相似性的序列，这些程序以序列对比得分及统计将相似的序列分级。这类可用于本发明的组合物、方法和HSP肽-复合物制品的HSPs核苷酸序列的非限制性例子如下：人类的hsp70，Genbank登记号No.M24743，Hunt等人，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：6455-6489；人类的HSP90，Genbank登记号No.X15183，Yamazaki等人，Nucl.Acids Res.17：7108；；人gp96：Genbank登记号No.X15187，Maki等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：5658-5562；人类的BiP：Genbank登记号No.M19645；Ting等人，1988，DNA 7：275-286；人类的HSP27，Genbank登记号No.m24743；Hickey等人，1986，Nucleic Acids Res.14：4127-45；小鼠HSP70：Genbank登记No.M35021，Hunt等人，1990，Gene 87：199-204；小鼠gp96：Genbank登记号No.M16370，Srivastava等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：3807-3811；和小鼠BiP：Genbank登记号No.U16277，Haas等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2250-2254。还可以使用编码HSPs的简并序列。

本文中使用的术语“α2M”包括α2M的其它多肽片段、类似物和变体，它们与α2M至少有35％至55％、优选55％至75％、最优选75％至85％氨基酸相同性，并能够与抗原肽形成复合物，抗原递呈细胞能够摄取该复合物并引起针对抗原分子的免疫应答。本发明的α2M分子可商业购买或从天然来源提纯而得(Kurecki等人，1979，Anal.Biochem.99：415-420)、化学合成、或重组制备。可用于制备本发明α2M多肽的非限制性α2M序列的例子如下：Genbank登记号Nos.M11313、P01023、AAA51551；Kan等人，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.82：2282-2286。还可以使用编码α2M的简并序列。

一旦编码所选HSP或α2M的核苷酸序列已经鉴定，则可以获得该核苷酸序列或其片段，并将其克隆到用于重组表达的表达载体中。然后将表达载体引入宿主细胞，使HSP或α2M增殖。本文详细描述了HSPs或α2M的重组产生方法。

可以使用标准分子生物学技术(例如见Methods in Enzymology，1987，154卷，Academic出版社；Sambrook等人，1989 MolecularCloning-A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor出版社，New York；和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人(eds.)，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，New York，将每篇的全部引入本文中作为参考)，通过DNA扩增或直接从组织、细胞培养物或克隆的DNA(例如DNA”库”)进行分子克隆而获得所需DNA。除了编码区外，来源于基因组DNA的克隆可能含有调控区及内含子DNA区；来源于cDNA的克隆只含外显子序列。无论采用何种来源，HSP或α2M基因应该克隆到一个用于基因增殖的合适载体中。

在一个优选实施方案中，可以利用从相关或同源HSP或α2M的已知序列设计的引物的聚合酶链反应(PCR)扩增技术从基因组或cDNA扩增DNA。在选择之前，用PCR扩增DNA克隆或基因组或cDNA文库中的所需要的序列。例如，使用热循环仪和Taq聚合酶(Gene Amp)实施PCR。通常利用聚合酶链式反应(PCR)来获得感兴趣的基因或基因片段。例如，利用编码开放阅读框的核苷酸序列两侧的PCR引物可以产生任意目标长度的、编码HSP或α2M的核苷酸序列。另外，如果存在合适的断裂位点，可用限制性内切酶在HSP或α2M基因基因序列合适的位点断裂使编码HSP或α2M基因的DNA片段释放出来。如果合适的限制性位点不存在，可以利用本领域已知的定点诱变和/或DNA扩增方法在合适的位置产生这样的位点。(参见，例如Shankarappa等人，1992，PCR Method Appl.1：277-278).然后分离编码HSP或α2M的DNA片段，将其接入合适的表达载体，小心操作以保证合适的翻译阅读框得以保持。

在另一个实施方案中，为了从基因组DNA进行HSP或α2M基因的分子克隆，产生DNA片段以形成基因组文库。既然一些编码相关的HSPs或α2M的序列可以获得并可以提纯和标记，可以通过与标记探针进行核酸杂交来筛选基因组DNA库中所克隆的DNA片段(Benton和Davis，1977，Science 196：180；Grunstein和Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961)。与探针具有基本同源性的DNA片段将会杂交。也可以用限制性内切酶消化和将片段大小与依据已知限制性酶切图谱预期之片段比较，来鉴定合适的片段。

HSP或α2M基因组DNA的替代性分离方法包括但不局限于：从已知序列化学合成基因序列本身，或合成编码HSP或α2M的mRNA所对应的cDNA。例如，用于HSP或α2M基因的cDNA克隆的RNA，可以从表达HSP或α2M的细胞中分离。利用本领域已知的方法形成cDNA文库，并用例如已公开的基因组DNA库筛选方法进行筛选。如果针对HSP或α2M的抗体可获得，则将标记抗体与合成HSP或α2M的克隆相结合而鉴定HSP或α2M。

下面以实施例的方式而不加限制地描述了其它克隆编码HSP或α2M的核苷酸序列的具体实施方案：在一个具体的实施方案中，将包含编码HSP或α2M的核苷酸序列的探针在本领域为大家所熟知的各种严格条件(包括那些物种交叉杂交的情况)下进行杂交而鉴定和获得编码HSP或α2M的核苷酸序列。

可使用本领域任何已知的突变技术修饰DNA序列中的一个核苷酸，以在所表达的肽序列中产生氨基酸替换，或产生/删除限制性位点以促进进一步的操作。这种技术包括，但不局限于：化学诱变、体外定点诱变(Hutchinson等人，1978，J.Biol.Chem.253：6551)、寡核苷酸指导的诱变(Smith，1985，Ann.Rev.Genet.19：423-463；Hill等人，1987，Methods Enzymol.155：558-568)、基于PCR的重叠延伸(Ho等人，1989，Gene 77：51-59)、基于PCR的兆引物突变诱发突变(Sarkar等人，1990，Biotechniques 8：404-407)，等等。可以用双链双脱氧核苷酸DNA测序确认修饰是否成功。

在某些实施方案中，使用编码非分泌型HSP的分泌形式的核酸来实践本发明的方法。可以删除ER滞留信号-KDEL的编码序列来构建这种核酸。任选地，用分子标记代替KDEL编码序列以促进HSP的辨别和纯化，例如鼠IgG1的Fc部分。在另一个实施方案中，可以将分子标记加入到天然分泌的HSPs或α2M中。No.WO 99/42121的PCT出版物说明gp96的ER滞留信号缺失，导致gp96-Ig肽复合物从转染的肿瘤细胞中分泌，KDEL缺失的gp96与鼠IgG1的融合促进其通过ELISA和FACS分析检测，利用蛋白A辅助的亲和层析纯化也得以改进。

4.3.7.1表达系统

编码HSP或α2M分子的核苷酸序列可以插入到表达载体中，在重组细胞中得以增殖和表达。本文中使用的表达构建体是指，与一种或多种调控区操纵性相关、编码HSP或α2M的一段核苷酸序列，所述调控区使HSP或α2M分子可在合适的宿主细胞中表达。“操纵性相关”是指调控区和需要表达的HSP或α2M多肽序列以一种相关的方式相连并定位，以保证持续转录并最终翻译该HSP或α2M序列。可以用于HSPs或α2M表达的各种表达载体包括但不限于：质粒，粘粒，噬菌体，噬菌粒或改良病毒。实例包括细菌噬菌体例如λ衍生物，质粒例如pBR322或pUC质粒衍生物或Bluescript载体(Stratagene)。典型地，这样的表达载体包括一个使载体在合适的宿主细胞中增殖的功能性复制起点、一个或多个用于插入HSP或α2M基因序列的限制性内切酶位点和一个或多个选择标记。

为了在哺乳动物宿主细胞中表达HSPs或α2M，可使用各种调控区，例如SV40早和晚启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早启动子和劳氏肉瘤病毒长末端重复序列(RSV-LTR)启动子。可有效用于哺乳动物细胞的诱导型启动子包括但不局限于与金属硫蛋白II基因、小鼠乳腺瘤病毒糖皮质激素应答性长末端重复序列(MMTV-LTR)、β-干扰素基因和HSP70基因有关的启动子(Williams等人，1989，Cancer Res.49：2735-42；Taylor等人，1990，Mol.Cell.Biol.10：165-75)。在表达载体中包含合适的转录增强子可以提高HSP或α2M在宿主细胞中的表达效率，例如在SV40病毒、乙型肝炎病毒、巨细胞病毒、免疫球蛋白基因、金属硫蛋白、β-肌动蛋白中发现的增强子(参见Bittner等人，1987，Methods in Enzymol.153：516-544；German，1990，Curr.Op.in Biotechnol.1：36-47)。

表达载体也可包含使载体在不止一种宿主细胞中保持和复制的序列，或将载体合入宿主染色体的序列。这样的序列包括但不局限于复制起点、自主复制序列(ARS)、着丝粒DNA和端粒DNA。使用可在至少两种宿主细胞内复制与维持的穿梭载体也可能是一大优势。

另外，表达载体可能包含用于包含编码HSP或α2M的DNA的宿主细胞最初分离或鉴定的可选择或筛选标记基因。为了长期、高产率生产HSPs或α2M，优选将其在哺乳动物细胞中稳定表达。大量可用于哺乳动物细胞的选择系统包括但不局限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，Cell 11：223)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalski和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.48：2026)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，Cell22：817)，这些基因可分别用于tk、hgprt或aprt细胞。也可使用代谢拮抗剂的抗药性作为二氢叶酸还原酶(dhfr)的选择基础，二氢叶酸还原酶对氨甲喋呤产生抗药性(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：3567；0′Hare et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1527)；对霉酚酸产生抗药性的gpt(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：2072)；对氨基糖苷类G-418产生抗药性的新霉素磷酸转移酶(neo)(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.150：1)；和对潮霉素产生抗药性的潮霉素磷酸转移酶(hyg)(Santerre等人，1984，Gene 30：147).还可以使用其它选择性标记，例如但不局限于组氨醇和Zeocin^TM。

包含编码HSP-或α2M-的序列、与调控区操纵性有关的表达构建体可直接引入用于表达和生产本发明HSP或α2M复合物的合适宿主细胞中，而不需进一步克隆(见例如，美国专利号No.5,580,859)。表达构建体也可包含促进编码序列整合入宿主细胞基因组的DNA序列，通过同源重组而整和。在这种情况下，不必使用包含适合于合适宿主细胞的复制起点的表达载体，以在宿主细胞中繁殖和表达HSP或α2M分子。

可利用本领域已知的各种技术将包含所克隆的编码HSP或α2M序列的表达构建体引入哺乳动物宿主细胞中，这些技术包括但不局限于：磷酸钙介导的转染(Wigler等人，1977，Cell 11：223-232)，脂质体介导的转染(Schaefer-Ridder等人，1982，Science 215：166-168)，电穿孔法(Wolff等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.84：3344)，和显微注射(Cappechi，1980，Cell 22：479-488)。

本文中所描述的任何克隆和表达载体可以从已知的脱氧核糖核酸顺序通过本领域熟知的技术合成和组装。调控区和增强子元件可以是各种来源的，既可以是天然的也可以是合成的。一些载体和宿主细胞是可以商业上获得的。有效的载体的非限制的例子描述在：Appendix 5of Current Protocols in Molecular Biology，1988，ed.Ausubel等人，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，其引入本文中作为参考；商业供应商的目录为例如Clontech实验室，Stratagene公司，和Invitrogen公司。

另外，哺乳动物细胞也可利用一些基于病毒的表达系统来重组表达HSPs或α2M。已经从猿猴空泡病毒(SV40)(Hamer等人，1979，Cell 17：725)，腺病毒(Van Doren等人，1984，Mol.Cell Biol.4：1653)，腺病毒相关病毒(McLaughlin等人，1988，J.Virol.62：1963)，和牛乳头状瘤病毒(Zinn等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.79：4897)衍生了使用DNA病毒骨架的载体。在腺病毒作为表达载体的情况下，可将供体DAN序列连接至腺病毒转录/翻译控制区域，例如，晚期启动子和三叶型前导序列。然后用体外或体内重组的方法将嵌合基因插入腺病毒基因组。插入到病毒基因组的非必要区域(例如，E1或E3区)将会产生能存活并能在受感染宿主中表达异源产物的重组病毒(见例如，Logan和Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3655-3659)。

牛乳头状瘤病毒(BPV)可以感染包括人类的许多高等脊椎动物，并且其以附加体的形式进行其DNA复制。已经研制了大量穿梭载体用于重组体基因表达，其在哺乳动物细胞内以稳定的、多拷贝(20-300拷贝/细胞)染色体外元件存在。典型地，这些载体包含一段BPV DNA(全部基因组或69％转化片段)、具有广谱宿主启动子、聚腺苷酸化信号、剪接信号、选择性标记以及允许载体在大肠杆菌中繁殖的“无毒”质粒序列。在细菌中构建和扩增后，表达性基因构建体转染入培养的哺乳动物细胞，例如，利用磷酸钙共沉淀或电穿孔技术。对于那些不显示转化表型的宿主细胞，可利用优势选择标记，例如组氨醇和G418抗药性来选择转化体。例如，可使用BPV载体诸如pBCMGSNeo和pBCMGHis来表达HSPs或α2M(karasuyama等人，Eur.J.Immunol.18：97-104；Ohe等人，Human Gene Therapy 6：325-33)然后将其转染入多种多样的细胞类型以实现HSP或α2M表达。

另外，可以使用牛痘7.5k启动子(见，例如，Mackett等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79：7415-7419；Mackett等人，1984，J.Virol.49：857-864；Panicali等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79：4927-4931)在使用人类宿主细胞的情况下，可以使用基于EB病毒(EBV)起源(OriP)和EBV核抗原1(EBNA-1；一种反式作用复制因子)的载体。这样的载体可使用广泛的人类宿主细胞，例如，EBO-pCD(Spickofsky等人，1990，DNA Prot.Eng.Tech.2：14-18)，pDR2和λDR2(可从Clontech Laboratories获得)。

还可以用基于逆转录病毒的表达系统来获得重组HSP或α2M表达。与转染对比，逆转录病毒可有效地感染并将基因转移至各类细胞类型，包括例如初级造血细胞。在诸如Moloney鼠白血病病毒之类的逆转录病毒中，大部分病毒基因序列可以除去并用编码HSP或α2M序列替换，所丧失的病毒功能可以反式提供。逆转录病毒载体的感染宿主范围也可以通过选择用于载体包装的包膜来控制。

例如，逆转录病毒载体可以包括5′长末端重复序列(LTR)、3′LTR、包装信号、细菌复制起点和选择性标记。将ND-相关的抗原肽DNA插入5′LTR和3′LTR之间的位置，以便从5′LTR启动子的转录物转录克隆的DNA。5′LTR按顺序含有一个包括但不局限于LTR启动子的启动子、R区域、U5区域和引物结合位点。这些LTR元件的核苷酸序列在本领域为大家所熟知。异源启动子以及多个药物选择标记也可以加入到表达载体中，以促进受感染细胞的选择(参见McLauchlin等人，1990，Prog.Nucleic Acid Res.and Molec.Biol.38：91-135；Morgenstern等人，1990，Nucleic Acid Res.18：3587-3596；Choulika等人，1996，J.Virol 70：1792-1798；Boesen等人，1994，Biotherapy 6：291-302；Salmons和Gunzberg，1993，Human GeneTherapy 4：129-141；以及Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114)。

重组细胞可以在标准温度、孵育期、光密度和培养基组成的条件下进行培养。另外，细胞可以在仿效内源性表达HSP的细胞所需的营养和生理要求的条件下培养。改进的培养条件和培养基可用于提高HSP-肽复合物的产生。例如，重组细胞可以在促进诱导性HSP表达的条件下培养。

本发明的α2-巨球蛋白和HSP多肽可以融合蛋白的形式表达，以促进其从所表达的细胞中回收和纯化。例如，HSP或α2M多肽可包含信号序列前导肽以引导其转移穿过ER膜，从而分泌入培养基中。此外，HSP或α2M多肽可包含亲和标记，例如与HSP或α2M多肽中不参与和抗原肽结合的任何部分例如羧基末端融合的亲和标记。该亲和标记可通过结合亲合伴侣分子而促进蛋白的纯化。

产生这种融合蛋白的各种方法在本领域为大家所熟知。导致它们产生的操作可以在基因或蛋白水平上发生，优选在基因水平上发生。例如，可利用本领域许多已知的重组DNA方法中的任何方法对克隆的HSP或α2M多肽编码区进行改进(Sambrook等人，1990，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，New York；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，第8章，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，New York)。将替换、缺失、插入或其任何组合引入或组合以达到最终的编码HSP或α2M多肽的核苷酸序列，下列讨论将会使这一点变得显而易见。

在各种实施方案中，包含HSP或α2M多肽的融合蛋白可以使用重组DNA技术来制备。例如，编码HSP或α2M多肽的重组基因，可以通过将合适阅读框架中的HSP或α2M基因片段引入到包含亲和标记序列的载体中来构建，这样就可使HSP或α2M多肽以肽-标记融合蛋白来表达。可被特异结合伴侣识别的亲和标记，可以用于HSP或α2M多肽的亲和纯化。

在一个优选实施方案中，亲和标记在其氨基末端融合至HSP或α2M的羧基末端。羧基末端融合的准确位点并不关键。最佳位点可以通过常规实验测定。

可以使用本领域已知的各种亲和标记，例如但不局限于，免疫球蛋白恒定区、多聚组氨酸序列(Petty，1996，Metal-chelateaffinity chromatography，in Current Protocols in MolecularBiology，第2卷，Ausubel等人编，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience)，谷胱甘肽S-转移酶(GST；Smith，1993，Methods Mol.Cell Bio.4：220-229)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(Guan等人，1987，Gene 67：21-30)和各种纤维素结合域(美国专利号5,496,934；5,202,247；5,137,819；Tomme等人，1994，Protein Eng.7：117-123)，等等。其它亲和标记可以给予HSP或α2M多肽荧光性质，例如绿色荧光蛋白部分，等等。其它可能的亲和标记为可获得的相应单克隆抗体的短氨基酸序列，例如下列众所周知的实例：FLAG表位、408-439位氨基酸的myc表位、流感病毒血凝素(HA)表位，但不局限于此。其它亲和标记可通过特异结合伴侣识别，并由此通过可以固定于固体载体上的结合伴侣的亲合性结合促进其分离。一些亲和标记可以赋予HSP或α2M多肽新的结构性质，例如能够形成多聚体。结合肽的HSP或α2M多肽形成二聚体，可以提高抗原呈递期间HSP或α2M多肽与其伴侣相互作用的亲合力。这些亲和标记通常来源于正常时以同聚体存在的蛋白。例如CD8的胞外域(Shiue等人，1988，J.Exp.Med.168：1993-2005)、或CD28的胞外域(Lee等人，1990，J.Immunol.145：344-352)、或免疫球蛋白分子中含链间二硫键位点部分的亲和标记，可以导致多聚体的形成。正如本领域技术人员所理解的那样，可使用许多方法获得以上所述的亲和标记的编码区，包括但不局限于DNA克隆、DNA扩增及合成方法。通过商业途径可获得一些亲和标记及其检测和分离试剂。

优选的亲和标记是免疫球蛋白分子的非可变部分。典型地，该部分包含至少一个功能性可操作的免疫球蛋白重链恒定区的CH2和CH3区域。也可用恒定区的Fc部分的羧基末端、或紧接重链或轻链CH1域氨基末端来制备融合体。合适的基于免疫球蛋白的亲和标记可以从IgG-1、-2、-3或-4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM处获得，但优选IgG1。当计划将HSP或α2M多肽在人体内使用时，优选人免疫球蛋白。许多编码免疫球蛋白轻或重链恒定区的DNA是已知的，或易从cDNA库获得。参见，例如Adams等人，Biochemistry，1980，19：2711-2719；Gough等人，1980，Biochemistry，19：2702-2710；Dolby等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77：6027-6031；Rice等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，79：7862-7865；Falkner等人，1982，Nature，298：286-288；and Morrison等人，1984，Ann.Rev.Immunol，2：239-256.因为许多免疫学试剂和标记系统可用于检测免疫球蛋白，所以用本领域已知的各种免疫技术，例如使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀反应、荧光活化的细胞分选(FACS)等等，可以很容易地检测HSP或α2M多肽-Ig融合蛋白并加以定量。类似地，如果亲和标记是容易获得抗体的表位，这种试剂可用于上述对含亲和标记的HSP或α2M多肽进行检测、定量和分离的技术中使用。在许多情况中，不需要研发针对HSP或α2M多肽的特异抗体。

一个特别优选的实施方案是将人免疫球蛋白G-1(IgG-1；见Bowen等人，1996，J.hnmunol.156：442-49)的铰链区、CH2和CH3区形成融合体。该铰链区包含三个半胱氨酸残基，其在正常情况下与Ig分子中的其它半胱氨酸形成二硫键。由于三者中任何一个都不是肽的标记功能所必需的，因而可任选地用另外的氨基酸残基例如丝氨酸代替其中的一个或多个半胱氨酸残基。

可使用本领域已知的各种前导序列，使细菌和哺乳动物细胞高效分泌HSP或α2M多肽(von Heijne，1985，J.Mol.Biol.184：99-105)。前导肽的选择基于计划的宿主细胞，可包括细菌，酵母，病毒，动物和哺乳动物序列。例如，疱疹病毒糖蛋白D前导肽适合用于各种哺乳动物细胞中。用于哺乳动物细胞的优选前导肽可从小鼠免疫球蛋白K链的V-J2-C区域处获得(Bernard等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.78：5812-5816)。用于在细菌细胞中靶向HSP或α2M多肽表达的优选前导序列包括但不局限于：大肠杆菌蛋白OmpA(Hobom等人，1995，Dev.Biol.Stand.84：255-262)、Pho A(Oka等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci 82：7212-16)、OmpT(Johnson等人，1996，Protein Expression 7：104-113)、LamB和OmpF(Hoffman & Wright，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5107-5111)、β-内酰胺酶(Kadonaga等人，1984，J.Biol.Chem.259：2149-54)、肠毒素(Morioka-Fujimoto等人，1991，J.Biol.Chem.266：1728-32)、和金黄色葡萄球菌蛋白A(Abrahmsen等人，1986，Nucleic Acids Res.14：7487-7500)、和枯草杆菌葡聚糖内切酶(Lo等人，Appl.Environ.Microbiol.54：2287-2292)、以及人造和合成信号序列(Maclntyre等人，1990，Mol.Gen.Genet.221：466-74；Kaiser等人，1987，Science，235：312-317)的前导序列。

编码所需要的亲和标记或前导肽的DAN序列，只要易于从文库处获得、合成制备、或从商业供应商获得，均适合于本发明的实践。这样的方法是本领域所熟知的。

4.4.蛋白和肽与HSP及α2M复合

本文描述的是用于体外将HSP或α2M与一组蛋白和/或肽形成复合物的示范性方法，其中这些蛋白和/或肽由抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒制备。该组蛋白和/或肽来自于第4.2.1部分所述的抗原细胞蛋白制品。在某些实施方案中，这些肽是抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒的蛋白制品的消化产物。复合反应可以导致在HSP和抗原细胞或病毒颗粒的蛋白或肽之间形成共价键。复合反应可以导致在α2M和抗原细胞或病毒颗粒的蛋白或肽之间形成共价键。复合反应还可以导致在HSP和蛋白和/或肽、或α2M和蛋白和/或肽之间形成非共价结合。

在复合之前，可以用ATP预先处理HSPs，或将其暴露于酸性条件下，以除去任何以非共价方式与目标HSP有关的任何肽。当使用ATP方法时，通过加入apyranase以除去制品中过量的ATP，正如Levy等人，1991，Cell 67：265-274所描述的。当使用酸性条件时，通过加入pH值调节试剂使缓冲液的pH值重新调整至中性。下面讨论了一个使一组肽(平均长度在7至20个氨基酸之间)与HSP体外形成非共价复合物的优选的、示范性方案：

将该组肽(1μg，可以溶于10％至50％二甲亚砜)和预先处理的HSP(9μg)混合，得到大约5个肽(或蛋白)：1个HSP的摩尔比。然后，将混合物在合适的结合缓冲液中，例如pH7.4的磷酸盐缓冲盐水，或包含20mM磷酸钠、pH值为7.2、350mM NaCl、3mM MgCl₂和1mM苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)的缓冲液，在4至45℃培育15分钟至3小时。将制品离心通过Centricon 10装置(Millipore)，以除去任何未结合的肽。用高效液相色谱(HPLC)或质谱(MS)测定蛋白/肽与HSPs之间的非共价结合。

在本发明的另一个实施方案中，优选制备HSP70与蛋白/肽的非共价复合物，5-10微克纯化的HSP70与等摩尔量的蛋白/肽在缓冲液中于37℃下培育1小时，该缓冲液含20mM磷酸钠、0.5M NaCl、3mM MgCl₂和1mM ADP、pH7.5，体积100微升。如果需要的话，可用Centricon10装置(Millipore)将培养混合物离心一或多次，以除去任何未结合的肽。

在本发明的另一个替换实施方案中，优选制备gp96或HSP90与蛋白/肽的非共价复合物，5-10微克纯化的gp96或HSP90与等摩尔或过量的蛋白/肽在合适的缓冲液中于60-65℃下培育5-20分钟，该缓冲液含20mM磷酸钠、0.5M NaCl、3mM MgCl₂，pH值7.5。使培养混合物冷却至室温，如果需要的话，可用Centricon 10装置(Millipore)将培养混合物离心一或多次，以除去任何未结合的肽。

与抗原蛋白和/或抗原肽形成复合物后，可用使用例如下述的混合淋巴细胞靶细胞试验(MLTC)来任选地测定免疫原性HSP复合物或α2M复合物。一旦分离出HSP一肽复合物和/或HSP-蛋白复合物并稀释，即可以用下文所讨论的优选施行方案和赋形剂在动物模型中任选地表征这些复合物。

作为制备HSPs和蛋白/肽非共价复合物的替代选择，一组蛋白/肽可以共价方式与HSPs结合。

在一个实施方案中，HSPs通过化学交联以共价方式偶联至蛋白制品中的蛋白和/或肽上。化学交联方法在本领域为大家所熟知。例如，在一个优选实施方案中，可以使用戊二醛交联。戊二醛交联已经用于在肽和HSPs之间形成共价复合物(参见Barrios等人，1992，Eur.J.Immunol.22：1365-1372)。优选，将1-2mg HSP-肽复合物在0.002％戊二醛的存在下交联2小时。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析过夜除去戊二醛(Lussow等人，1991，Eur.J.I mmunol.21：2297-2302)。另外，可在本领域已知的条件下用紫外(UV)交联法将HSP与一蛋白/肽交联。

在本发明的另一个实施方案中，将蛋白制品中的一组蛋白和/或肽与α2M以50∶1的摩尔比于50℃培育10分钟，接着在25℃培育30分钟，从而两者形成非共价复合物。可按大小排除过滤，除去游离(未复合的)肽。优选用闪烁计数器测定复合物，以确定以每摩尔HSP或α2M结合了等量的蛋白/肽(大约为肽起始量的0.1％)。细节见Binder，2001，J.Immunol.166(8)：4968-72，其整体引入到本文中作为参考。为了减少这些反应中α2M与蛋白和肽形成共价复合物的倾向，需要在复合之前抑制或除去蛋白酶活性。可用蛋白酶抑制剂按照4.2.1部分描述的方法达到这一目的。可能还需要在反应液中加入还原剂(例如2-巯基乙醇)以中和存在于蛋白制品中的、可以活化α2M而发生共价结合的亲核化合物。

在又一个实施方案中，用PCT出版物WO 94/14976和WO 99/50303中所述肽与α2M形成复合物的方法，将一组蛋白制品中的抗原蛋白和/或抗原肽与α2M以共价方式形成复合物，在此将PCT出版物完整引入作为参考。例如，使用加热法，可在亲核激活的逆转期间用氨或甲胺(或其它小分子胺亲核体例如乙胺)将抗原蛋白和/或抗原肽引入α2M上(Grn和Pizzo，1998，Biochemistry，37：6009-6014；其整体引入到本文中作为参考。使用能够使α2M偶然俘获肽的条件来制备本发明的α2M复合物。还可以使用双官能交联剂进行一组抗原蛋白/肽与α2M的共价连接。这种交联剂及其使用方法在本领域也是众所周知的。优选，在复合物形成之后将交联剂灭活和/或除去。共价偶联的方法已经预先描述(Osada等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.146：26-31；Osada等人，1988，Biochem.Biophys.Res.Commun.150：883；Chu and Pizzo，1993，J.Immunol.150：48；Chu等人，1994，Ann.N.Y.Acad.Sci.737：291-307；Mitsuda等人，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.101：1326-1331)。

在又一个实施方案中，利用如上所述的非共价或共价方法，一组蛋白/肽可与HSP和α2M的混合物在相同的反应中形成复合物。

在给予主体之前，来源于单独的共价和/或非共价复合反应的HSP和抗原蛋白和/或肽的复合物可任意组合形成组合物。在给予主体之前，来源于单独的共价和/或非共价复合反应的α2M和抗原蛋白和/或肽的复合物还可以任意组合形成组合物。

4.5.癌症和传染病的预防和治疗

按照本发明，将包含抗原肽与HSP和/或α2M的复合物的本发明组合物给予患有癌症或传染病的主体，其中抗原肽由抗原细胞或病毒颗粒的胞液和/或膜来源蛋白消化而来。在一个实施方案中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指癌症或传染病得到改善，或至少其中的一个可辨别症状得到改善。在另一个实施方案中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指至少一个与癌症或传染病有关的可测量的身体参数得到改善，主体未必可辨别所述参数。在又一个实施方案中，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指癌症或传染病的进展得到抑制，可以是身体性的，例如，可辨别症状的稳定，也可以是生理学上的，例如，身体参数或两者均得到缓解。

在某些实施方案中，本发明的组合物作为这种癌症或传染病的预防法给予主体。本文中使用的“预防(prevention)”或“预防(preventing)”是指降低患癌症或传染病的风险。在实施方案的一种模式中，本发明的组合物作为这种癌症或传染病的预防法给予具有癌症遗传倾向性的主体。在实施方案的另一个模式中，本发明的组合物作为这种癌症或传染病的预防措施给予直接暴露于致癌物质或传染病病原的主体，致癌物质包括但不局限于化学试剂和/或放射。

例如，在某些实施方案中，相对于没有给予所述组合物，给予本发明的组合物导致癌细胞或感染性病原的生长降低至少99％，至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少60％，至少50％，至少45％，至少40％，至少45％，至少35％，至少30％，至少25％，至少20％，或至少10％。

本发明方法制备的组合物，包含热休克蛋白与一组抗原肽的复合物、和/或α2-巨球蛋白与一组抗原肽的复合物。组合物在肿瘤位点可以诱导炎症反应，并可以最终导致医治的癌症患者肿瘤负荷的退化。本发明方法制备的组合物可以增强主体的免疫活性，并可以引起针对感染性病原的特异性免疫、或针对肿瘤前的和赘生性细胞的特异性免疫。这些组合物具有预防传染病的发病和进展、和抑制肿瘤细胞的生长和进展的性能。

联合治疗是指使用本发明的HSP复合物或α2M复合物与另外的方式来预防或治疗癌症和传染病。给予本发明复合物可以增加抗癌症病原或抗感染的效果，反之亦然。优选地，用药程式的附加形式是基于非HSP和非α2M程式的，即该程式不包含HSP或α2M作为组份。本方法通常被称为联合治疗、补充治疗或结合治疗(本文中可互换地使用该术语)。使用联合治疗，可以观察到累加的效能或累加的治疗效果。其中治疗效能大于累加效能的协同效果也是可能发生的。使用联合治疗还可以提供比单独给予治疗方式、或HSP复合物或α2M复合物更好的治疗特性。累加或增强效应可以调节任何一个或两个程式的剂量和/或给药频率，以降低或避免不需要的或不利的影响。

在各种具体的实施方案中，联合治疗包括给予用治疗方式治疗的主体HSP复合物或α2M复合物，其中单独给予的治疗方式在临床上不能使主体得到充分治疗，这样就需要主体接受补充有效的治疗，例如，对于不给予HSP复合物或α2M复合物的治疗方式，主体未能应答。包括在这样实施方案中的是包括给予接受治疗方式的主体HSP复合物或α2M复合物的方法，其中所述主体对治疗作出反应，然而要忍受副作用、复发、发生抗药等等。用单独的治疗方式治疗时，这样的主体可能不应答或难治疗，即至少癌细胞或病原体的一些重要部分不能被杀死，或它们的细胞分裂没有被阻止。当预期按照本发明的方法给予时，实施方案提供了包括给予单独治疗方式难治疗的主体HSP复合物的本发明方法可以提高治疗方式的疗效。当打算通过本发明的方法给药时，包括向单独治疗方式难治疗的患者给予α2M复合物的本发明方法还可以提高治疗方式的疗效。可以使用本领域已知的方法来体内或体外测定治疗方式的效果数据。本领域可接受的难治疗的含义在癌症范围内为大家所熟知。在一个实施方案中，癌症或传染病是难治疗的或没有应答，癌细胞或病原体的数目没有分别显著地降低或显著地提高。其中所治疗的患者是接受化疗或放射治疗的患者。

依据本发明，本发明的复合物可在与许多不同类型治疗方式的组合中使用。某些这样的程式对于特殊类型的癌症或传染病特别有用，并在4.5.1和4.5.2部分中讨论。许多其它程式对免疫系统功能有效，并通常对肿瘤和传染病这两者都适用。

在一个实施方案中，本发明的复合物在与一或多种治疗癌症或传染病的生物学应答调节剂的组合中使用。生物学应答调节剂的一个群组是细胞因子。在一个这样的实施方案中，给予接受HSP/α2M复合物的患者细胞因子。在另一个这样的实施方案中，给予接受化疗剂与细胞因子组合的患者HSP/α2M复合物。在各种实施方案中，可使用一种或多种细胞因子，其选自IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFα，TNFβ，G-CSF，GM-CSF，TGF-β，IL-15，IL-18，GM-CSF，INF-γ，INF-α，SLC，内皮单核细胞活化蛋白-2(EMAP2)，MIP-3α，MIP-3β，或MHC基因，例如HLA-B7.此外，其它示范性的细胞因子包括TNF家族的其它成员，包括但不局限于TNF-α-相关的凋亡-诱导配体(TRAIL)，TNF-α-相关激活-诱导细胞因子(TRANCE)，凋亡的TNF-α-相关弱诱导物(TWEAK)，CD40配体(CD40L)，淋巴细胞毒素α(LT-α)，淋巴细胞毒素β(LT-β)，OX40配体(OX40L)，Fas配体(FasL)，CD27配体(CD27L)，CD30配体(CD30L)，41BB配体(41BBL)，APRIL，LIGHT，TL1，TNFSF16，TNFSF17和AITR-L，或其功能性的部分。参见，例如，Kwon等人，1999，Curr.Opin.hnmunol.11：340-345 TNF家族的综述。优选地，HSP复合物或α2M复合物在治疗方式之前给予。在一个具体的实施方案中，本发明的复合物是在与治疗癌症的IL-12的组合中给予接受环磷酰胺的主体的。

在另一个实施方案中，本发明的复合物是在与一个或多个生物应答调节物的组合中使用的，生物应答调节物是各种配体、受体的激动剂或拮抗剂和免疫系统的信号转导分子。例如，生物反应调节物包括但不局限于Toll样受体(TLR-2、TLR-7、TLR-8和TLR-9的激动剂；LPS；41BB配体、OX40配体、ICOS和CD40的激动剂；和Fas配体、PD1和CTLA-4的拮抗剂。这些激动剂和拮抗剂可以是抗体，抗体片段，肽，多肽模拟化合物和多糖。

在又一个实施方案中，本发明的复合物是在与一个或多个生物反应调节物的组合中使用的，生物反应调节物是免疫刺激性核酸。这种核酸，其中许多是包含未甲基化的CpG基序的寡核苷酸，对于脊椎动物胸腺依赖性细胞是促有丝分裂的，并且能够增强免疫应答。参见Woolridge，等人，1997，Blood 89：2994-2998.这种寡核苷酸在国际专利公开说明书Nos.WO01/22972，WO01/51083，WO98/40100和WO99/61056中作出了描述，每篇以其整体引入到本文中，以及在美国专利号Nos.6,207,646，6,194,388，6,218,371，6,239,116，6,429,199，和6,406,705中作出了描述，每篇以其整体引入到本文中。其它种类的免疫刺激性寡核苷酸例如包含YpG-和CpR-基序的磷硫酰寡脱氧核糖核苷酸，已经由Kandimalla等人在″Effectof Chemical Modifications of Cytosine and Guanine in aCpG-Motif of Oligonucleotides：Structure-ImmunostimulatoryActivity Relationships.″Bioorganic & Medicinal Chemistry 9：807-813(2001)中作出了描述，每篇以其整体引入到本文中。还包括的是不含CpG二核苷酸的免疫刺激寡聚核苷酸，当通过粘膜途径给予(包括小剂量给予)或以高剂量通过肠胃外途径给予时，其可扩大抗体反应，常常和CpG核酸所起的作用一样，然而其应答偏向于Th2(IgG1＞＞IgG2a)。见美国专利公开申请号20010044416A1，以其整体引入到本文中作为参考。免疫刺激性寡核苷酸的活性测定方法可以按照上述专利和出版物所述的方法进行。而且，为了调整活性，免疫刺激寡聚核苷酸可以在磷酸盐骨架、糖、核碱基和核苷酸间连键之内进行修饰。这种修饰对于本领域技术人员是已知的。

在又一个实施方案中，本发明的复合物是在与一个或多个助剂的组合中使用的。可以单独地给予助剂或以与本发明复合物的混合物的组合形式给予。全身性助剂是可以胃肠外递送的助剂。系统性的助剂包括产生长效结果的助剂、激发免疫系统的助剂和具有两种效果的助剂。本文中使用的产生长期效果的助剂是导致抗原慢慢地在身体内释放、由此延长免疫细胞与抗原接触的助剂。这类助剂包括但不局限于明矾(例如，氢氧化铝，磷酸铝)；或基于乳状液的制剂包括矿物油、非矿物油、油包水或水包油型乳化油，水包油乳剂例如Montanide助剂(例如，Montanide ISA 720，AirLiquide，Paris，France)的Seppic ISA系列；MF-59(用Span 85和Tween 80稳定的水乳剂中的角鲨烯；Chiron Corporation，Emeryville，Calif)；和PROVAX(包含稳定去污剂和胶束成型剂的水包油型乳状液；IDEC，Pharmaceuticals Corporation，San Diego，Calif)。

其它助剂激发免疫系统，例如，导致免疫细胞产生和分泌细胞因子或IgG。这类助剂包括但不局限于免疫刺激性核酸，例如CpG寡聚核苷酸；由Q.肥皂草树的树皮提纯的皂草苷，例如QS21；聚[二(羧基酰基(carboxylato)苯氧基)膦腈(PCPP聚合物；Virus ResearchInstitute，USA)；脂多糖(LPS)的衍生物例如单磷酰基脂类A(MPL；RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)，胞壁酰二肽(MDP；Ribi)和苏氨酰胞壁酰二肽(t-MDP；Ribi)；OM-174(与脂质A相关的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，Switzerland)；和利什曼原虫延伸因子(提纯的利什曼原虫蛋白；Corixa Corporation，Seattle，Wash.).

其它系统助剂是产生长期效果并激发免疫系统的助剂。这些化合物是具有系统助剂的上述两种确定功能的化合物。这类助剂包括但不局限于ISCOMs(包含混合的皂草苷、脂类并形成带有可容纳抗原的孔隙的病毒尺寸颗粒的免疫激发复合物；CSL，Melbourne，Australia)；SB-AS2(SmithKline Beecham助剂系统#2，其是包含MPL和QS21的水包油型乳状液：SmithKline Beecham Biologicals[SBB]，Rixensart，Belgium)；SB-AS4(SmithKline Beecham助剂系统#4，其包含明矾和MPL的水包油型乳状液：SBB，Belgium)；形成胶束的非离子嵌段共聚物例如CRL 1005(这些包含直链疏水性的聚氧丙烯(polyoxpropylene)，侧链是聚氧乙烯；Vaxcel，Inc.，Norcross，Ga.)；和Syntex助剂制剂(SAF，包含吐温80和非离子嵌段共聚物的水包油型乳状液；Syntex Chemicals，Inc.，Boulder，Colo.)。

依据本发明使用的粘膜助剂，是当与本发明复合物同时给予粘膜表面时，在主体中能够诱导粘膜免疫应答的助剂。粘膜助剂包括但不局限于CpG核酸(例如PCT公开的专利申请WO99/61056)，细菌毒素：例如，霍乱菌毒素(CT)，包括但不局限于CT B亚单位的CT衍生物(CTB)(Wu等人，1998，Tochikubo等人，1998)；CTD53(Val到Asp)(Fontana等人，1995)；CTK97(Val到Lys)(Fontana等人，1995)；CTK104(Tyr到Lys)(Fontana等人，1995)；CTD53/K63(Val到Asp，Ser到Lys)(Fontana等人，1995)；CTH54(Arg到His)(Fontana等人，1995)；CTN107(His到Asn)(Fontana等人，1995)；CTE114(Ser到Glu)(Fontana等人，1995)；CTE112K(Glu到Lys)(Yamamoto等人，1997a)；CTS61F(Ser到Phe)(Yamamoto等人，1997a，1997b)；CTS106(Pro到Lys)(Douce等人，1997，Fontana等人，1995)；和CTK63(Ser到Lys)(Douce等人，1997，Fontana等人，1995)，密闭小带毒素，zot，大肠杆菌热不稳定肠毒素，不稳定毒素(LT)，包括但不局限于LTB亚单位的LT衍生物(LTB)(Verweij等人，1998)；LT7K(Arg到Lys)(Komase等人，1998，Douce等人，1995)；LT61F(Ser到Phe)(Komase等人，1998)；LT112K(Glu to Lys)(Komase等人，1998)；LT118E(Glyto Glu)(Komase等人，1998)；LT146E(Arg到Glu)(Komase等人，1998)；LT192G(Arg到Gly)(Komase等人，1998)；LTK63(Ser到Lys)(Marchetti等人，1998，Douce等人，1997，1998，DiTommaso等人，1996)；and LTR72(Ala到Arg)(Giuliani等人，1998)，百日咳毒素，PT.(Lycke等人，1992，Spangler BD，1992，Freytagand Clemments，1999，Roberts等人，1995，Wilson等人，1995)包括PT-9K/129G(Roberts等人，1995，Cropley等人，1995)；毒素衍生物(见下文)(Holmgren等人，1993，Verweij等人，1998，Rappuoli等人，1995，Freytag and Clements，1999)；脂质A衍生物(例如，单磷酰基脂质A，MPL)(Sasaki等人，1998，Vancott等人，1998；胞壁酰二肽(MDP)衍生物(Fukushima等人，1996，Ogawa等人，1989，Michalek等人，1983，Morisaki等人，1983)；细菌外膜蛋白(例如，伯格多费疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)的外表面蛋白A(OspA)脂蛋白，脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白)(Marinaro等人，1999，Van de Verg等人，1996)；水包油乳剂(例如，MF59)(Barchfield等人，1999，Verschoor等人，1999，O′Hagan，1998)；铝盐(Isaka等人，1998，1999)；和皂草苷(例如，QS21)AquilaBiopharmaceuticals，Inc.，Worster，Me.)(Sasaki等人，1998，MacNeal等人，1998)，ISCOMs，MF-59(用Span 85和吐温80稳定的水乳胶中的角鲨烯；Chiron Corporation，Emeryville，Calif.)；Montanide助剂的Seppic ISA系列(例如，Montanide ISA 720；AirLiquide，Paris，France)；PROVAX(包含稳定去污剂和胶束成型剂的水包油型乳状液；IDEC Pharmaceuticals Corporation，SanDiego，Calif.)；Syntext助剂制剂(SAF；SyntexChemicals，Inc.，Boulder，Colo.)；聚[二(羧基苯氧基)膦腈(PCPP聚合物)；Virus Research Institute，USA)和利什曼原虫延伸因子(Corixa Corporation，Settle，Wash.).

4.5.1.目标癌症

在一个实施方案中，除了给予本发明的复合物之外，联合治疗包括辅助使用帮助预防或治疗癌症的一个或多个程式，该程式包括但不局限于化疗剂、免疫治疗剂、抗血管生成剂、细胞因子、激素、抗体、多核苷酸、放射和光动力治疗剂。在特定的实施方案中，联合治疗可用于防止癌症的复发、抑制转移或抑制生长和/或癌症的扩散或转移。

可以用本发明的方法治疗或预防的癌症类型包括但不局限于人类的肉瘤和恶性肿瘤，例如纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨源性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤(Ewing’s tumor)，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺恶性肿瘤，皮脂腺恶性肿瘤，乳头状癌，乳头状腺癌，囊腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞恶性肿瘤，肝癌，胆管恶性肿瘤，绒毛膜癌，精原细胞瘤，胚胎性癌，Wilms瘤，子宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神经胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，黑素瘤，神经母细胞瘤，成视网膜细胞瘤；白血病，例如，急性淋巴细胞性白血病和急性髓细胞性白血病(成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞(粒细胞)白血病和慢性淋巴细胞白血病)；和真性红细胞增多症，淋巴瘤(Hodgkin’s疾病和非Hodgkin’s疾病)，多发性骨髓瘤，瓦尔登斯特伦(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症，和重链病。

在另一个实施方案中，患有癌症的患者由于在给予HSP和/或α2M肽复合物或给予HSP和/或α2M激活的APC之前进行了抗癌症治疗(例如，化疗放射)而免疫功能受到抑制。

有许多原因可以说明为什么本发明提供的免疫疗法用于癌症患者是理想的。首先，带有麻醉的外科手术可以导致免疫抑制。在手术前的时间内使用合适的免疫疗法可以预防或逆转这种免疫抑制。这可以导致较少的感染性并发症并加速创伤愈合。第二，外科手术后肿瘤体积极小，在这种状态下，免疫疗法最有可能见效。第三个原因是，外科手术时肿瘤细胞可能进入循环中，此时采取有效的免疫疗法可以清除这些细胞。

本发明的预防和治疗方法致力于在外科手术之前或外科手术之后增强癌症患者的免疫能力，并诱导针对癌细胞的肿瘤特异性免疫，目标是抑制癌症，最终的临床目标是肿瘤的完全消退和根除。本发明的方法也可以用于某种特定癌症的高危险性个体，例如由于家族史或环境危险因素所导致的高危险性个体。

在各种实施方案中，除了本发明的复合物之外，给予癌症患者一或多种抗癌剂以对其进行治疗。抗癌剂是指参与肿瘤或癌症治疗的任何分子或化合物。可以用于本发明方法的抗癌剂的例子包括，但不局限于：阿西维辛；阿克拉霉素；盐酸阿考达唑；阿克罗宁；阿多来新；阿地流津；六甲蜜胺；安波霉素；乙酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；双奈法德二甲磺酸酯；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸柔红霉素；地西他滨；dexormaplatin；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；地吖醌；多西紫杉醇；多柔比星；盐酸多柔比星；屈落昔芬；柠檬酸屈落昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌氮芥；雌氮芥磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟脲嘧啶脱氧核苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白介素II(包括重组白介素II，或rIL2)，干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；乙酸兰瑞肽；来曲唑；乙酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；环己亚硝脲；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；乙酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；mitocarcin；丝裂红素；丝林霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；噻氨酯达唑；诺加霉素；奥马铂；亚磺酰吡啶；紫杉醇；培加帕酶；佩里霉素；戊氮芥；硫酸培来霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；波非霉素；松龙苯芥；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺(rogletimide)；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；二甲二苯四氮烯；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；表鬼臼毒噻吩糖苷；替罗昔隆；睾内酯；硫唑嘌呤胺(thiamiprine)；2-氨基嘌呤-6-巯基嘌呤；硫替派；噻唑呋啉；替拉扎明；枸橼酸托瑞米芬；乙酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亚胺；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏罗唑；折尼拉汀；新制癌菌素；盐酸佐柔比星。

其它可使用的抗癌症药物包括，但不局限于：20-epi-1，25二羟基维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；adecypenol；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；阿米斯汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌(prostatic cartinoma)；抗雌激素药；抗瘤酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸艾菲地可宁；凋亡基因调控剂；凋亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；azatoxin；重氮酪氨酸；浆果赤霉素衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚；benzoylstaurosporine；β内酰胺衍生物；β-alethine；β-克拉霉素B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；bisaziridinylspermine；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；布替诺林磺基肟；卡泊三醇；calphostin C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；carboxyamidotriazole；CaRest M3；CARN700；源自软骨的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳栗精胺(castanospermine)；天蚕抗菌肽B；西曲瑞克；chlorlns；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式-卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托(crisnatol)；自念珠藻环肽8；自念珠藻环肽A衍生物；curacin A；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷ocfosfate；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；德舍瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；didox；二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮胞苷；双氢紫杉酚，9-；dioxamycin；二苯基螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌氮芥类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀(flezelastine)；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin盐酸盐；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；德卟啉钆；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六甲撑双乙酰胺；金丝桃素；依班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；imidazoacridones；咪喹莫特；免疫刺激剂肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；层状素-N三乙酸酯；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；蘑菇多糖硫酸盐；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；醋酸亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋四咪唑；利阿唑；线型聚胺类似物；亲脂性的二糖肽；亲脂性的铂化合物；噻唑啉海洋环肽7(lissoclinamide)；乐铂；胍乙基磷酸丝氨酸；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；镥德卟啉；lysofylline；溶解的肽；美坦辛；mannostatin A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆；美替瑞林；methioninase；灭吐灵；MIF抑制剂；美非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；丙脒腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；米托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+myobacterium细胞壁sk；莫哌达醇；多耐药性基因抑制剂；基于的多肿瘤抑制剂1-治疗；芥末抗癌剂；印度洋海绵B；分支杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+镇痛新；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽链内切酶；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；一氧化氮抗氧化剂；nitrullyn；06-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；培加帕酶；培得星(peldesine)；戊聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷(perflubron)；培磷酰胺；紫苏子醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；血纤蛋白溶解原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；波非霉素；强的松；丙基双-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆酸化的血红蛋白聚氧乙烯共轭物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基的瑞替普汀(retelliptine)；铼Rel86依替膦酸盐；根霉素；核酶；RII retinamide；罗谷亚胺(rogletimide)；rohitukine；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdil模拟物；司莫司汀；衰老衍生抑制剂1；正义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；钠硼[10B]卡钠；苯基乙酸钠；solverol；促生长因子结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；spicamycin D；螺莫司汀；splenopentin；spongistatin 1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；基质降解酶抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；合成的氨基多糖；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；牛磺莫司汀；他扎罗汀(tazarotene)；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；表鬼臼毒噻吩糖苷；tetrachlorodecaoxide；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林(thiocoraline)；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；锡乙基初红紫素；替拉扎明；二氯二茂钛；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞生长因子；翻译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦衍生生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolinB；载体系统，红细胞基因治疗；维拉雷琐；藜芦明(veramine)；韦尔丹；维替泊芬；长春瑞宾；vinxaltine；vitaxin；伏罗唑；扎诺特隆；折尼斯汀；亚苄维；和净司他丁斯酯。

抗癌剂可以是化疗剂，包括但不局限于下列化合物：细胞毒抗生素，抗代谢剂，抗有丝分裂剂，烷化剂，铂化合物，砷化合物，DNA拓扑异构酶抑制剂，紫杉烷，核苷类似物，植物生物碱，和毒素；和它们的合成衍生物。表1列出示范性化合物：

表1

烷化剂

氮芥类：                                    环磷酰胺

                                            异环磷酰胺

                                            氯乙环磷酰胺

                                            苯丁酸氮芥

亚硝基脲：                                  亚硝脲氮芥(BCNU)

                                            环己亚硝脲(CCNU)

烷基磺酸盐：                                白消安

                                            曲奥舒凡

三氮烯：                                    达卡巴嗪

含铂的化合物：                              顺铂

                                            卡铂

                                            Aroplatin

                                            奥沙利铂

植物生物碱

长春花生物碱：                              长春新碱

                                            长春碱

                                            长春地辛

                                            长春瑞滨

紫杉烷：                                    紫杉醇

DNA拓扑异构酶抑制剂                         多西紫杉醇

Epipodophyllins：                           依托泊苷

                                            表鬼臼毒噻吩糖苷

                                            拓扑替康

                                            9-氨基喜树碱

                                            喜树碱

                                            克立那托

丝裂霉素：                                  丝裂霉素C

抗叶酸类：

DHFR抑制剂：                                氨甲喋呤

                                            三甲曲沙

IMP脱氢酶抑制剂：                           霉酚酸

                                            噻唑呋啉

                                            病毒唑

                                            EICAR

Ribonuclotide还原酶抑制剂：                 羟基脲

                                            去铁敏

嘧啶类似物：

尿嘧啶类似物：                              5-氟尿嘧啶

                                            氟脲嘧啶脱氧核苷

                                            去氧氟尿苷

                                            雷替曲塞

胞嘧啶类似物：                              阿糖胞苷(ara C)

                                            阿糖胞苷

                                            氟达拉滨

嘌呤类似物：                                巯基嘌呤

                                            2-氨基-6-巯基嘌呤

DNA抗代谢剂：                               3-HP

                                            2′-脱氧5-氟尿嘧啶核苷

                                            5-HP

                                            α-TGDR

                                            甘氨酸阿非迪霉素

                                            ara-C

                                            5-氮杂-2′-脱氧胞苷

                                            β-TGDR

                                                环胞苷

                                                胍唑

                                                次黄嘌呤核苷glycodialdehyde

                                                macebecin II

                                                吡唑并咪唑

抗有丝分裂剂：                                  allocolchicine

                                                软海绵素B

                                                秋水仙碱

                                                秋水仙碱衍生物

                                                dolstatin 10

                                                美登素

                                                根霉素

                                                硫代秋水仙碱

                                                三苯甲基半胱氨酸

其它：

异戊二烯化抑制剂：

多巴胺能的神经毒素：                            1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子

细胞周期抑制剂：                                十字孢碱(Staurosporine)

放线菌素：                                      放线菌素D

                                                放线菌素

博来霉素：                                      博来霉素A2

                                                博来霉素B2

                                                培洛霉素

蒽环霉素：                                      柔红霉素

                                                多柔比星(阿霉素)

                                                伊达比星

                                                表柔比星

                                                吡柔比星

                                                佐柔比星

                                                米托蒽醌

MDR抑制剂：                                     维拉帕米

Ca²⁺ATP酶抑制剂：                              毒胡萝卜素

本发明也包括包含一种或多种化疗剂(例如，FLAG，CHOP)的组合物。FLAG包括氟达拉滨、阿糖胞苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括环磷酰胺，长春新碱，多柔比星，和强的松。前面列表中的每一个是例证性的，不是打算限制。

在一个实施方案中，乳腺癌可以用包含本发明复合物的药物组合物与5-氟尿嘧啶、顺铂、多西紫杉醇、多柔比星、赫赛汀、吉西他滨、IL-2、紫杉醇和/或VP-16(依托泊苷)的组合来治疗。

在另一个实施方案中，前列腺腺癌可以用包含本发明复合物的药物组合物与紫杉醇、多西紫杉醇、米托蒽醌和/或雄激素受体拮抗剂(例如氟他胺)的组合来治疗。

在另一个实施方案中，白血病可以用包含本发明复合物的药物组合物与氟达拉滨、阿糖胞苷、吉姆单抗(gemtuzumab)(MYLOTARG)、柔红霉素、氨甲喋呤、长春新碱、6-巯基嘌呤、伊达比星、米托蒽醌、依托泊苷、天冬酰胺酶、强的松和/或环磷酰胺的组合来治疗。作为另一个实施例，骨髓瘤可以用包含本发明复合物的药物组合物与地塞米松的组合来治疗。优选地，白血病是慢性粒细胞性白血病(CML)，HSP复合物包含hsp70-肽复合物，并且治疗方式是甲磺酸伊马替尼或Gleevec^TM。

在另一个实施方案中，黑素瘤可以用包含本发明复合物的药物组合物与达卡巴嗪的组合来治疗。

在另一个实施方案中，结肠直肠癌症可以用包含本发明复合物的药物组合物与伊立替康的组合来治疗。

在另一个实施方案中，肺癌可以用包含本发明复合物的药物组合物与紫杉醇，多西紫杉醇，依托泊苷和/或顺铂的组合来治疗。

在另一个实施方案中，非Hodgkin′s淋巴瘤癌可以用包含本发明复合物的药物组合物与环磷酰胺，CHOP、依托泊苷、博来霉素、米托蒽醌和/或顺铂的组合来治疗。

在另一个实施方案中，胃癌可以用包含本发明复合物的药物组合物与顺铂的组合来治疗。

在另一个实施方案中，胰腺癌可以用包含本发明复合物的药物组合物与吉西他滨的组合来治疗。

依据本发明，本发明的复合物可以在给予预防或治疗癌症的抗癌症病原之前、随后或同时给予。根据癌症的类型，患者的病史和情况、及所选的抗癌剂，使用本发明复合物可以与化疗剂量和次数相协调。

可以将本发明复合物的使用加入到化疗方案中。在一个实施方案中，化疗剂是吉西他滨，其剂量从100至1000mg/m²/周期。在一个实施方案中，化疗剂是达卡巴嗪，其剂量从200至4000mg/m²/周期。在一个优选实施方案中，达卡巴嗪的剂量从700至1000mg/m²/周期。在另一个实施方案中，化疗剂是氟达拉滨，其剂量从25至50mg/m²/周期。在另一个实施方案中，化疗剂是阿糖胞苷(Ara-C)，其剂量从200至2000mg/m²/周期。在另一个实施方案中，化疗剂是多西紫杉醇，其剂量从1.5至7.5mg/kg/周期。在另一个实施方案中，化疗剂是紫杉醇，其剂量从5至15mg/kg/周期。在又一个的实施方案中，化疗剂是顺铂，其剂量从5至20mg/kg/周期。在又一个的实施方案中，化疗剂是5-氟尿嘧啶，其剂量从5至20mg/kg/周期。在又一个的实施方案中，化疗剂是多柔比星，其剂量从2至8mg/kg/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是表鬼臼脂素，其剂量从40至160mg/kg/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是环磷酰胺，其剂量范围从50至200mg/kg/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是伊立替康，其剂量范围从50至75、75至100、100至125、或125至150mg/m²/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是长春碱，其剂量从3.7至5.4、5.5至7.4、7.5至11、或11至18.5mg/m²/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是长春新碱，其剂量从0.7至1.4、或1.5至2mg/m²/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是氨甲喋呤，其剂量范围从3.3至5、5至10、10至100、或100至1000mg/m²/周期。

在一个优选实施方案中，当化疗剂作为联合治疗方案的一部分时，本发明进一步包括使用低剂量的化疗剂。例如，用本发明复合物进行初步治疗，对于随后化疗剂剂量的使用，可以提高肿瘤的敏感性，当给予化疗剂而不给予本发明复合物时，化疗剂剂量接近或低于更低的剂量范围。

在一个实施方案中，将本发明复合物和小剂量(例如，6至60mg/m²/天或更少)的多西紫杉醇给予癌症患者。在另一个实施方案中，将本发明复合物和小剂量(例如，10至135mg/m²/天或更少)的紫杉醇给予癌症患者。在又一个实施方案中，将本发明复合物和小剂量(例如，2.5至25mg/m²/天或更少)的氟达拉滨给予癌症患者。在又一个实施方案中，将本发明复合物和小剂量(例如，0.5至1.5g/m²/天或更少)的阿糖胞苷(Ara-C)给予癌症患者。在另一个实施方案中，化疗剂是吉西他滨，其剂量从10至100mg/m²/周期。在另一个实施方案中，化疗剂是顺铂，例如，PLATINOL或PLATINOL-AQ(BristolMyers)，其剂量从5至10、10至20、20至40、或40至75mg/m²/周期。在又一个实施方案中，将剂量从7.5至75mg/m²/周期的顺铂给予卵巢癌症的患者。在又一个实施方案中，将剂量从5至50mg/m²/周期的顺铂给予膀胱癌的患者。在又一个实施方案中，化疗剂是卡铂，例如，PARAPLATIN(Bristol Myers)，其剂量从2至4、4至8、8至16、16至35或35至75mg/m²/周期。在又一个实施方案中，将剂量从7.5至75mg/m²/周期的卡铂给予卵巢癌症的患者。在另一个实施方案中，将剂量从5至50mg/m²/周期的卡铂给予膀胱癌的患者。在又一个实施方案中，将剂量从2至20mg/m²/周期的卡铂给予睾丸癌症的患者。在又一个实施方案中，化疗剂是多西紫杉醇，例如，泰索帝(Rhone Poulenc Rorer)，其剂量从6至10、10至30或30至60mg/m²/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是紫杉醇，例如，泰素(Bristol Myers Squibb)，其剂量范围从10至20、20至40、40至70或70至135mg/kg/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是5-氟尿嘧啶，其剂量从0.5至5mg/kg/周期。在又一个实施方案中，化疗剂是多柔比星，例如，阿霉素(Pharmacia & Upjohn)，DOXIL(Alza)，RUBEX(Bristol Myers Squibb)，其剂量从2至4、4至8、8至15、15至30或30至60mg/kg/周期。

在另一个实施方案中，本发明的复合物是在与一个或多个免疫治疗剂例如抗体和疫苗的组合中给予的。在一个优选实施方案中，抗体具有针对癌症体内治疗和/或预防的用途。在一些实施方案中，抗体可用于治疗和/或预防传染病。治疗和预防性抗体的例子包括，但不局限于：MDX-010(Medarex，NJ)，其是目前临床治疗前列腺癌症的人源化抗-CTLA-4抗体；SYNAGIS(MedImmune，MD)，其是目前用于治疗RSV感染患者的人源化抗-呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体；HERCEPTIN(Trastuzumab)(Genentech，CA)，其是目前用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2单克隆抗体；其它例子是人源化抗-CD18F(ab′)2(Genentech)；CDP860，其是人源化抗-CD18F(ab′)2(Celltech，UK)；PRO542，其是与CD4(Progenics/Genzyme Transgenics)融合的抗HIV gp120抗体；Ostavir，其是人类的抗乙型肝炎病毒抗体(Protein Design Lab/Novartis)；PROTOVIR^TM，其是人源化抗CMV IgG1抗体(Protein DesignLab/Novartis)；MAK-195(SEGARD)，其是鼠的抗TNF-αF(ab′)₂(Knoll Pharma/BASF)；IC14，其是抗CD14抗体(ICOS Pharm)；人源化抗VEGF IgG1抗体(Genentech)；OVAREX^TM，其是鼠的抗CA 125抗体(Altarex)；PANOREX^TM，其是鼠的抗17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2，其是鼠的抗个体基因型(GD3表位)IgG抗体(ImClone System)；IMC-C225，其是嵌合的抗EGFR IgG抗体(ImClone System)；VITAXIN^TM，其是人源化抗aβ3整合素抗体(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；Campath1H/LDP-03，其是人源化抗CD52 IgG1抗体(Leukosite)；SmartM195，其是人源化抗CD33 IgG抗体(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXAN^TM，其是嵌合的抗CD20 IgG1抗体(IDECPharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDE^TM，其是人源化抗CD22IgG抗体(Immunomedics)；Smart ID 10，其是人源化抗HLA抗体(Protein Design Lab)；ONCOLYM^TM(Lym-1)，其是经过放射性标记的鼠抗HLA诊断试剂T抗体(Techniclone)；ABX-IL8是人类抗IL8抗体(Abgenix)；抗-CDlla是人源化IgG1抗体(Genentech/Xoma)；ICM3是人源化抗ICAM3抗体(ICOS Pharm)；IDEC-114是灵长类源抗CD80抗体(IDEC Pharm/Mitsubishi)；ZEVALIN^TM是经过放射性标记的鼠的抗CD20抗体(IDEC/Schering AG)；IDEC-131是人源化抗CD40L抗体(IDEC/Eisai)；IDEC-151是灵长类源抗CD4抗体(IDEC)；IDEC-152是灵长类源抗CD23抗体(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化抗CD3 IgG(Protein Design Lab)；5G1.1是人源化抗补体因子5(C5)抗体(Alexion Pharm)；D2E7是人源化抗TNF-α抗体(CAT/BASF)；CDP870是人源化抗TNF-αFab片段(Celltech)；IDEC-151是灵长类源抗CD4 IgG1抗体(IDEC Pharm/SmithKlineBeecham)；MDX-CD4是人类的抗CD4 IgG抗体(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化抗TNF-α IgG4抗体(Celltech)；LDP-02是人源化抗α4β7抗体(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化抗CD4 IgG抗体(Ortho Biotech)；ANTOVA^TM是人源化抗CD40L IgG抗体(Biogen)；ANTEGREN^TM是人源化抗VLA-4 IgG抗体(Elan)；MDX-33是人类的抗CD64(FcγR)抗体(Medarex/Centeon)；SCH55700是人源化抗IL-5IgG4抗体(Celltech/Schering)；SB-240563和SB-240683分别是人源化抗IL-5和IL-4抗体(SmithKline Beecham)；rhuMab-E25是人源化抗IgE IgG1抗体(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems)；ABX-CBL是鼠源抗CD-147 IgM抗体(Abgenix)；BTI-322是大鼠抗CD2 IgG抗体(Medimmune/Bio Transplant)；Orthoclone/OKT3是鼠源抗CD3IgG2a抗体(ortho Biotech)；SIMULECT^TM是嵌合的抗CD25 IgG1抗体(Novartis Pharm)；LDP-01是人源化抗β2整合素IgG抗体(LeukoSite)；抗-LFA-1是鼠源抗CD18F(ab′)₂(Pasteur-Merieux/Immunotech)；CAT-152是人类抗TGF-β2抗体(CambridgeAb Tech)；和Corsevin M是嵌合的抗因子VII抗体(Centocor).上述所列的免疫活性试剂，以及任何其它免疫活性试剂，可以依据本领域技术人员已知的任何方案，包括免疫活性试剂的供应商建议的方案来给予。

在另一个实施方案中，本发明的复合物是在与一种或多种抗血管生成剂的组合中给予的，抗血管生成剂包括但不局限于：血管抑素，反应停，kringle 5，内皮他汀(endostatin)，塞尔潘(丝氨酸蛋白酶抑制剂)抗凝血酶，纤维连接蛋白的29kDa N-末端和40kDa C-末端蛋白水解片段，催乳素的16kDa蛋白水解片段，血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段，相当于血小板因子-4的片段的13-氨基酸肽(Maione等人，1990，Cancer Res.51：2077-2083)，相当于胶原I片段的14-氨基酸肽(Tolma等人，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，相当于血栓收缩蛋白I片段的19氨基酸肽(Tolsma等人，1993，J.Cell Biol.122：497-511)，相当于SPARC片段的20-氨基酸肽(Sage等人，1995，J.Cell.Biochem.57：1329-1334)，或其任何片段、家族成员、变体，包括其药学可接受的盐。

抑制血管生成并相当于层粘连蛋白、纤维连接蛋白、酸溶原胶原蛋白和EGF片段的其它肽也已经有了描述(参见，例如，Cao，1998，Prog MolSubcell Biol.20：161-176).已经证明了可阻滞某些结合RGD蛋白(即拥有肽基元的Arg-Gly-Asp)的整合素的单克隆抗体和环状五肽，具有抗血管形成活性(Brooks等人，1994，Science 264：569-571；Hammes等人，1996，Nature Medicine 2：529-533)。而且，通过受体拮抗剂抑制尿激酶纤溶酶原激活物受体，可以抑制血管生成、肿瘤生长和转移(Min等人，1996，Cancer Res.56：2428-33；Crowley等人，1993，Proc Natl Acad Sci.90：5021-25)。在与复合物的组合中使用这种抗血管生成剂，也包括在本发明范围内。

在又一个实施方案中，本发明的复合物与激素治疗联合使用。激素治疗包含激素激动剂，激素拮抗剂(例如，氟他胺，比卡鲁胺，他莫昔芬，雷洛昔芬，醋酸亮丙瑞林(LUPRON)，LH-RH拮抗剂)，生物合成和加工的激素抑制剂，和甾体(例如，地塞米松，类视黄醇，deltoids，倍他米松，氢化可的松，可的松，强的松，2-去氢睾酮，糖皮质激素，盐皮质激素，雌激素，睾酮，孕酮)，维生素A衍生物(例如，全反式视黄酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗孕酮(例如，米非司酮，奥那司酮)，和抗雄激素(例如，醋酸环丙孕酮)。

在又一个实施方案中，本发明的复合物与治疗癌症的基因治疗方案联合使用。在一个实施方案中，在与本发明复合物的组合中给予带有分泌白细胞介素-2的重组细胞的基因治疗，以预防或治疗癌症，特别是乳腺癌(参见，例如，Deshmukh等人，2001，J Neurosurg.94：287-92).在其它实施方案中，基因治疗借助于多核苷酸化合物进行，例如但不局限于反义多核苷酸、核酶，RNA干扰分子、三链螺旋多核苷酸等等，其中这种化合物的核苷酸序列与基因的DNA和/或RNA的核苷酸序列有关，所述基因与肿瘤或癌症的起始、进展和/或病变有关系。例如，许多基因是癌基因、生长因子基因、生长因子受体基因、细胞周期基因、DNA修复基因，并在本领域为大家所熟知。

在另一个实施方案中，本发明的复合物与放射治疗方案同时给予。对于放射治疗，放射可以是γ射线或X射线。该方法包括包含放射治疗的癌症治疗，例如外部射线放射治疗，放射性同位素(I-125，钯，铱)的间质植入，放射性同位素例如锶-89，胸放射治疗，腹膜内的P-32放射治疗和/或全部腹部和骨盆的放射治疗。对于放射治疗的普通综述，参见Hellman，Chapter 16：Principles of CancerManagement：Radiation Therapy，6th edition，2001，DeVita等人，eds.，J.B.Lippencott Company，Philadelphia.在优选实施方案中，以外粒子束放射或远距疗法的形式给予放射治疗，其中放射从远端源引入。在各种优选实施方案中，以内在的治疗或近距疗法给予放射治疗，其中放射源置于接近于癌细胞或肿瘤块的身体内部。还包括的是本发明复合物与光动力治疗联合使用，光动力治疗包括给予光敏剂例如血卟啉和其衍生物，Vertoporfin(BPD-MA)，酞菁，光敏剂Pc4，去甲氧基-竹红菌素A；和2Bα-2-DMHA。

在各种实施方案中，对于短治疗周期的治疗癌症的癌症患者，本发明复合物在与至少一种化疗剂的组合中给予。用化疗剂治疗的时间可以依据所使用的特定癌症治疗剂而改变。本发明还包括间断给予或将每天剂量分成若干部分给予。对于特定癌症治疗剂的合适治疗时间，熟练技术人员能够了解，并且本发明希望对于每种癌症治疗剂进行最佳治疗计划的连续评价。本发明包括至少一个周期，优选多于一周期，在此期间给予单一治疗剂或治疗系列。对于一周期的合适时间，熟练的技术人员可以了解，也会了解周期总数和周期之间的间隔。

在另一个实施方案中，本发明复合物与能够改善癌症症状(例如但不局限于疼痛)和本发明复合物产生的副作用(例如但不局限于流感样症状，发烧等等)的化合物组合使用。相应地，许多已知的减少疼痛、流感症状和发烧的化合物，可被用在与本发明复合物的组合或混合物中。这种化合物包括镇痛药(例如，对乙酰氨基酚)，解充血药(例如，假麻黄碱)，抗组胺剂(例如，扑尔敏)，和咳嗽抑制剂(例如，美沙芬)。

4.5.2.目标传染病

可以用本发明方法治疗或预防的传染病是由传染物所引起的，包括但不限于病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫和寄生虫。本发明不局限于治疗或预防由细胞内病原体所引起的传染病。许多医学相关的微生物已经在文献中广泛地描述，例如参见，C.G.A Thomas，MedicalMicrobiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，它们的全部内容在此引入作为参考。

除了给予本发明复合物之外，联合治疗包括使用一或多种帮助预防或治疗传染病的程式，这些程式包括但不局限于抗生素、抗病毒素、抗原生动物的化合物、抗真菌化合物和驱虫剂。可用于治疗或预防传染病的其它治疗方式包括免疫治疗剂、多核苷酸、抗体、细胞因子和激素，如上所述。

人类和非人类脊椎动物的感染性病毒包括逆转录病毒、RNA病毒和DNA病毒。已经在人类中发现的病毒的例子包括但不局限于：逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷性病毒，例如HIV-1(还称为HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；及其它分离物，例如HIV-LP)；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒，人类柯萨奇病毒，鼻病毒，艾柯病毒)；杆状病毒(例如引起胃肠炎的菌株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒，风疹病毒)；猪瘟病毒(例如登革热病毒，脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；棒状病毒科(例如水泡性口膜炎病毒，狂犬病病毒)；由线病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒，寄生性野菰病毒，phleboviruses和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠病毒科(例如呼肠孤病毒，环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科；肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳头多瘤空泡病毒科(乳头状瘤病毒，多形瘤病毒)；腺病毒科(多数是腺病毒)；泡疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒；痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；和未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原体，丁型肝炎的病原(认为是乙型肝炎病毒的有缺陷随伴体)，非甲、非乙肝炎的病原(类别1＝内传染；类别2＝胃肠外传染(即丙型肝炎)；Norwalk和相关病毒，和星状病毒)。

所说的逆转录病毒包括简单型逆转录病毒和复合逆转录病毒。简单逆转录病毒包括B型逆转录病毒、C型逆转录病毒和D型逆转录病毒的子群。B型逆转录病毒的例子是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C型逆转录病毒包括C型A组亚组(包括劳氏肉瘤病毒(RSV)、禽白血病病毒(ALV)和禽成髓细胞瘤病毒(AMV))和C型B组亚组(包括鼠白血病病毒(MLV)、猫白血病毒(FeLV)、鼠肉瘤病毒(MSV)、长臂猿白血病毒(GALV)、脾坏死病毒(SNV)、网状内皮组织增生病毒(RV)和猿肉瘤病毒(SSV))。D型逆转录病毒包括梅森-菲舍猴病毒(MPMV)和猿I型逆转录病毒(SRV-1)。复合逆转录病毒包括慢病毒属、T细胞白血病病毒和泡沫病毒的亚组。慢病毒属包括HIV-1，而且包括HIV-2，SIV，绵羊髓鞘脱落病毒，猫免疫缺陷病毒(FIV)，和马传染性贫血病毒(EIAV)。T细胞白血病病毒包括HTLV-1，HTLV-II，猿T细胞白血病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)

在脊椎动物中是抗原的RNA病毒的例子包括但不局限于下列病毒：呼肠病毒科家族成员，包括正呼肠病毒属(多血清型的哺乳动物和鸟类逆转录病毒)，环状病毒属(蓝舌病病毒，Eugenangee病毒，Kemerovo病毒，非洲马瘟病毒和科罗拉多蜱热病毒)，轮状病毒属(人类轮状病毒，内布拉斯加牛腹泻病毒，鼠轮状病毒，猿轮状病毒，牛或绵羊轮状病毒，鸟轮状病毒)；小核糖核酸病毒家族，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，人肠道细胞病变孤儿(ECHO)病毒，甲型肝炎病毒，猿肠道病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，鼠脊髓灰质炎病毒，牛肠道病毒，猪肠道病毒，心病毒属(脑炎心肌炎病毒(EMC)，门哥病毒)，鼻病毒属(包括至少113个亚型的人类鼻病毒；其它鼻病毒)，Aptho病毒属(口蹄疫(FMDV)；杯状病毒家族，包括猪水泡疹病毒，San Miguel海狮病毒，猫科细小核糖核酸病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒家族，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，基孔肯雅病毒，奥尼翁尼翁病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒(flavivirus)属(蚊子传播的黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，St.Louis脑炎病毒，墨菜溪谷脑炎病毒，西尼罗(West Nile)病毒，库京病毒，中欧蜱传播病毒，远东蜱传播的病毒，科萨努尔森林病毒，LoupingIII病毒，玻瓦桑病毒，奥姆斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪瘟病毒，边境病病毒)；布尼亚病毒家族，包括Bunyvirus属(Bunyamwera和相关的病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，白蛉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，里夫特山谷热病毒)；内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒)，和Uukuvirus属(Uukuniemi和相关的病毒)；正粘病毒科家族，包括流感病毒属(A型流感病毒类型，许多人类亚型)；猪流感病毒，和鸟和马流感病毒；B型流行性感冒(许多人类亚型)，和C型流行性感冒(可能分开的属)；副粘病毒科家族，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2至5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，辛德毕斯病毒，基孔肯雅病毒，奥尼翁尼翁病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊子传播黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，St.Louis脑炎病毒，墨菜溪谷脑炎病毒，West Nile病毒，库京病毒，中欧蜱传播的病毒，远东蜱传播病毒，科萨努尔森林病毒，LoupingIII病毒，玻瓦桑病毒，奥姆斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪瘟病毒，边境病病毒)；布尼亚病毒家族，包括Bunyvirus属(Bunyamwera和相关的病毒，加利福尼亚脑炎集团病毒)，白蚁热病毒属(白蛉热西西里岛病毒，里夫特山谷热病毒)；内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕绵羊病病毒)，和Uukuvirus属(Uukuniemi和相关的病毒)；正粘病毒科家族，包括流感病毒属(A型流感病毒类型，许多人类的亚型)；猪流感病毒，和鸟和马流感病毒；B型流行性感冒(许多人类的亚型)，和C型流行性感冒(可能分开的属)；副粘病毒科家族，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2至5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；棒状病毒家族，包括水泡病毒属(VSV)，钱迪普拉病毒，Flanders-Hart Park病毒)，狂犬病毒属(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒，和两个可能的弹状病毒(马尔堡病毒和埃博拉病毒)；沙粒病毒科家族，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，Tacaribe病毒复合物，和拉沙病毒；Coronoaviridae家族，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人类肠冠状病毒，和猫科感染性腹膜炎(猫科冠状病毒)。

在脊椎动物中是抗原的DNA病毒的例子包括但不局限于：痘病毒科家族，包括正痘病毒属(重型天花，轻型天花，猴痘牛痘，牛痘，Buffalopox，兔痘，先天性缺肢畸形)，兔痘病毒属(粘液瘤，纤维瘤)，禽痘病毒属(禽痘，其它鸟类痘病毒)，山羊痘病毒属(绵羊痘，羊痘)，猪痘病毒属(猪痘)，副痘病毒属(传染性脓泡性皮炎病毒，伪牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科家族(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼的淋巴囊炎病毒)；泡疹病毒科家族，包括α-疱疹病毒(1和2型单纯性疱疹，水痘-带状疱疹，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，伪狂犬病病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，牛传染性鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)β-疱疹病毒(人类巨细胞病毒和猪、猴子和啮齿类巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马立克氏病病毒，松鼠猴疱疹，蛛猴属疱疹病毒，兔疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒，卢克肿瘤病毒)；腺病毒科家族，包括哺乳动物腺病毒属(人类A，B，C，D，E亚群和未归类的)；猿腺病毒(至少23种血清型)，犬传染性肝炎，和牛、猪、羊、蛙和许多其它物种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；和非可培育的腺病毒；Papoviridae家族，包括乳头瘤病毒属(人类的乳头瘤病毒，牛乳头瘤病毒，肖普兔乳头瘤病毒，和其它物种的各种病原性的、乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿空泡形成剂(SV-40)，兔空泡形成剂(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，及其它灵长类多瘤病毒例如淋巴乳头瘤病毒)；细小病毒科家族包括腺病毒相关病毒属，细小病毒属(猫全白细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申貂病病毒，等等)。最后，DNA病毒可以包括不能归入上述家族的病毒，例如库鲁病毒和克雅氏病病毒和慢性传染性神经性病原。

可与本发明复合物组合使用的抗病毒化合物的许多例子在本领域是已知的，包括但不局限于：利福平，核苷逆转录酶抑制剂(例如，AZT，ddI，ddC，3TC，d4T)，非核苷逆转录酶抑制剂(例如，依法韦仑，奈韦拉平)，蛋白酶抑制剂(例如，aprenavir，茚地那韦，利托那韦和沙奎那韦)，碘苷，西多福韦，无环鸟苷，更昔洛韦，扎那米韦，金刚烷胺，和帕利珠单抗。其它抗病毒药剂的例子包括，但不局限于：醋孟南；无环鸟苷；无环鸟苷钠；阿德福韦；阿洛夫定；阿韦舒托；盐酸金刚烷胺；阿拉诺丁；阿立酮；甲磺酸阿替韦啶；阿夫立定；西多福韦；西潘茶碱；盐酸阿糖胞苷；甲磺酸地拉韦啶；地昔洛韦；去羟肌苷；二噁沙利；依度尿苷；恩韦拉登；恩韦肟；泛昔洛韦；盐酸抑感灵；非西他滨；非阿尿苷；磷利酯；膦甲酸钠；膦乙酸钠；更昔洛韦；更昔洛韦钠；碘苷；乙氧丁酮醛；拉米呋啶；洛布卡韦；盐酸美莫汀；甲吲噻腙；奈韦拉平；喷昔洛韦；吡罗达韦；病毒唑；盐酸金刚乙胺；甲磺酸沙奎那韦；盐酸索金刚胺；索立夫定；葡支青霉菌素；司他夫定；地酸替洛隆；三氟尿苷；盐酸伐西洛韦；阿糖腺苷；磷酸阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸钠；韦罗肟；扎西他滨；叠氮胸苷；净韦肟。

可通过本发明的方法治疗或预防的细菌感染或疾病是由以下细菌所引起的，包括但不限于：在其生命周期中具有细胞内阶段的细菌，例如分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌，牛分枝杆菌(M.Bovis)，鸟分枝杆菌(M.avium)，麻风分枝杆菌，或非洲分枝杆菌(M.Africanum))，立克次氏体，支原体，衣原体属和军团杆菌。所包括的其它细菌感染的例子包括但不局限于由下列所引起的感染：革兰氏阳性杆菌(例如，李司忒氏菌属，杆菌例如炭疽杆菌，丹毒丝菌属种)，革兰氏阴性杆菌(例如，巴尔通氏体属，布鲁氏菌属，弯曲杆菌属，肠杆菌属，埃希氏杆菌属，弗朗西斯氏菌属，嗜血杆菌，克雷伯氏杆菌属，摩根氏菌属(morganella)，变形杆菌，普罗威登斯菌属(providencia)，假单胞菌属，沙门菌属，沙雷氏菌属，志贺氏菌属，弧菌，和耶尔森氏菌属种)，螺旋细菌(例如，疏螺旋体物种包括导致莱姆病的博氏疏螺旋体)，厌氧菌(例如，放线菌属和梭状芽孢杆菌种)，革兰氏阳性和阴性球菌，肠球菌种，链球菌种，肺炎球菌种，葡萄球菌属种，奈瑟氏球菌属种。传染性细菌的具体的例子包括，但不局限于：幽门螺旋菌，博氏螺旋体(Borelia burgdorferi)，嗜肺性军团菌(Legionellapneumophilia)，结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌(M.Avium)，胞内分枝杆菌，堪萨斯分枝杆菌(M.Kansaii)，戈氏分枝杆菌(M.Gordonae)，金黄色葡萄球菌，淋病奈瑟氏菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，单核细胞增生李司忒氏菌，化脓性链球菌(A族链球菌)，无乳链球菌(B族链球菌)，草绿色链球菌，粪链球菌，牛链球菌，肺炎链球菌，流感嗜血杆菌，Bacillus antracis，白喉棒杆菌，红斑丹毒丝菌，产气英膜梭菌，破伤风杆菌，产气肠杆菌，肺炎克雷白杆菌属，败血性巴氏杆菌(Pasturella multocida)，具核梭杆菌，念珠状链杆菌，梅毒螺旋体，细弱密螺旋体，钩端螺旋体属，立克次氏体和伊色列放线菌属(Actinomyces israelli)。

可用于与本发明的复合物联合使用的抗菌剂或抗生素包括但不局限于：氨基糖苷类抗生素(例如，阿泊拉霉素，阿贝卡星，班贝霉素，丁酰苷菌素，地贝卡星，新霉素，新霉素，十一碳烯酸盐，奈替米星，巴龙霉素，核糖霉素，紫苏霉素，和壮观霉素)，酰胺醇类(amphenicol)抗生素(例如，叠氮氯霉素，氯霉素，氟苯尼考，和甲砜氯霉素)，安沙霉素抗生素(例如，利福酰胺和利福平)，碳头孢(例如，氯碳头孢)，碳青霉烯(例如，比阿培南和亚胺培南)，头孢菌素(例如，氯头孢菌素，头孢羟氨苄，头孢羟唑，羟胺唑头孢菌素，头孢西酮，头孢唑兰，头孢咪唑，头孢匹胺和头孢匹罗)，头霉素(例如，头孢拉宗，头孢美唑和头孢米诺)，单环内酰胺(例如，氨曲南，卡芦莫南和替吉莫南)，氧头孢烯类(例如，氟氧头孢和拉氧头孢)，青霉素(例如，氮卓脒青霉素，氮卓脒青霉素匹酯，羟氨苄青霉素，氨苄青霉素甲戊酯，苄基青霉酸，苄基青霉素钠，依匹西林，芬贝西林，氟氯青霉素，培那西林(penamccillin)，氢磺酸喷沙西林，邻苯明青霉素，青霉素0，青霉素V，苄星青霉素V，哈胺青霉素V，青哌环素，和phencihicillin钾)，林可胺类(例如，氯林可霉素，和林可霉素)，大环内酯类(例如，阿齐红霉素，碳霉素，克拉霉素，地红霉素，红霉素和醋硬脂红霉素)，安福霉素，杆菌肽，卷曲霉素，粘菌素，持久杀菌素，结核放线菌素，四环素(例如，阿哌环素，金霉素，羟甲金霉素和地美环素)，2，4-二氨基嘧啶类(例如，溴莫普林)，硝基呋喃类(例如，呋吗唑酮和呋唑氯铵)，喹诺酮和其类似物(例如，西诺沙星，环丙沙星，克林沙星，氟甲喹，和grepagloxacin)，磺胺类(例如，乙酰磺胺甲氧吡嗪，苄磺胺，苯丙磺胺二磺酸钠，酞磺醋胺，偶氮磺胺和磺胺乙胞嘧啶)，砜类(例如，地百里砜，葡胺苯砜钠和苯丙砜)，环丝氨酸，莫匹罗星和马铃薯球蛋白。

额外的抗菌剂的例子包括，但不局限于：二乙酰氨苯砜；乙酰砜钠；阿来霉素；阿立西定；氮卓脒青霉素；氮卓脒青霉素匹酯；阿米环素；氨氟沙星；甲磺酸氨氟沙星；氨丁卡那霉素；硫酸氨丁卡那霉素；氨基水杨酸；氨基水杨酸钠；羟氨苄青霉素；安福霉素；氨苄青霉素；氨苄青霉素钠；阿帕西林钠；阿泊拉霉素；天冬菌素；硫酸阿司米星；卑霉素；阿伏帕星；阿齐红霉素；阿洛西林；阿洛西林钠；盐酸氨苄青霉素碳酯；杆菌肽；亚甲基双水杨酸杆菌肽；杆菌肽锌；班贝霉素；苯沙酸钙；去氧红霉素；硫酸倍他霉素；比阿培南；二硝霉素；盐酸苯柳胺酯；硫酸镁双巯氧吡啶(BispyrithioneMagsulfex)；布替卡星；硫酸丁酰苷菌素；硫酸卷曲霉素；卡巴氧；羧苄青霉素二钠；羧茚苄青霉素酯钠；羧苄苯青霉素钠；羧苄青霉素钾；卡芦莫南钠；氯头孢菌素；头孢羟氨苄；头孢羟唑；头孢孟多酯钠；头孢孟多酯钠；头孢哌罗；羟胺唑头孢菌素；氟硫四唑头孢菌素钠；头孢唑啉；头孢唑啉钠；头孢拉宗；头孢地尼；头孢吡肟；盐酸头孢吡肟；头孢替考；头孢克肟；cefmnenoxime盐酸盐；头孢美唑(cefinetazole)；头孢美唑钠；头孢尼西钠；头孢尼西钠；头孢哌酮钠；头孢雷特；氨噻肟头孢菌素钠；头孢替坦；头孢替坦二钠；盐酸头孢替安；头孢噻吩；头孢噻吩钠；头孢咪唑；头孢咪唑钠；头孢匹胺；头孢匹胺钠；硫酸头孢匹罗；头孢泊肟酯；头孢丙烯；头孢沙定；头孢磺啶钠；头孢他啶；头孢布烯；头孢唑肟钠；头孢曲松钠；头孢呋辛；头孢呋辛酯；头孢呋辛匹赛酯；头孢呋辛钠；头孢赛曲钠；先锋霉素IV；盐酸先锋霉素IV；先锋霉素III；头孢利定；头孢噻吩钠；先锋霉素VIII钠；先锋霉素VI；盐酸西托环素；乙酰霉素；氯霉素；无味氯霉素；氯霉素泛酸酯复合物；氯霉素琥珀酸钠；氨基苯磷酸氯己定；刀氯二甲酚；氯四环素硫酸氢盐；盐酸氯四环素；西诺沙星；环丙沙星；盐酸环丙沙星；西罗霉素；克拉红霉素；盐酸克林沙星；氯林可霉素；盐酸氯林可霉素；盐酸氯林可霉素棕榈酸酯；磷酸氯林可霉素；氯苯吩嗪；苄星邻氯青霉素；邻氯青霉素钠；氯羟喹(Cloxyquin)；甲磺酸粘菌素钠；硫酸多粘菌素E；香豆霉素；香豆霉素钠；氨环己青霉素；环丝氨酸；达福普汀；氨苯砜；达托霉素；地美环素；盐酸地美环素；去甲四环素；地奴真菌素(Denofungin)；二氨藜芦啶；双氯青霉素；双氯青霉素钠；硫酸双氢链霉素；双吡硫翁；地红霉素；强力霉素；强力霉素钙；磷酸强力霉素复合物；盐酸强力霉素；屈克沙星钠；依诺沙星；依匹西林；盐酸表四环素；红霉素；醋硬脂红霉素；无味红霉素；琥乙红霉素；葡庚糖酸红霉素；乳糖红霉素；丙酸红霉素；硬脂酸红霉素；盐酸乙胺丁醇；乙硫异烟胺；氟罗沙星；氟氯青霉素；氟氘丙氨酸；氟甲喹；磷霉素；磷霉素氨丁三醇；呋莫西林；呋唑氯铵；酒石酸呋噻咪唑；夫西地酸钠；夫西地酸；硫酸庆大霉素；格洛莫南；短杆菌肽；卤丙炔氧苯；海他西林；海他西林钾；海克西定；依巴沙星；亚胺培南；异康唑；异帕米星；异烟肼；交沙霉素；硫酸卡那霉素；吉他霉素；左呋喃他酮；左普匹西林钾；来红霉素；林可霉素；盐酸林可霉素；洛美沙星；盐酸洛美沙星；甲磺酸洛美沙星；氯碳头孢；磺胺米隆；甲氯环素；磺基水杨酸甲氯环素；巨霉素磷酸钾；美喹多司；美洛培南；甲烯土霉素；盐酸甲烯土霉素；乌洛托品；马尿酸乌洛托品；杏仁酸乌洛托品；甲氧基苯青霉素钠；美替普林；甲硝唑盐酸盐；甲硝唑磷酸盐；美洛西林；美洛西林钠；二甲胺四环素；盐酸二甲胺四环素；盐酸米林霉素；莫能菌素；莫能菌素钠；乙氧萘青霉素钠；萘啶酮酸钠；萘啶酮酸；游霉素；暗霉素；棕榈酸新霉素；硫酸新霉素；新霉素十一碳烯酸盐；硫酸奈替米星；中性霉素；硝呋唑烯；硝呋氨氧腙；硝呋太尔；硝呋隆；硝呋羟乙咪酮；硝呋甲咪酮；硝呋吡醇；硝呋奎唑；硝呋噻唑；硝环素；呋喃妥因；硝米特；诺氟沙星；新生霉素钠；氧氟沙星；奥美普林；苯唑西林钠；肟莫南；肟莫南钠；奥索列酸；土霉素；土霉素钙；盐酸土霉素；帕地霉素；对氯酚；保洛霉素；培氟沙星；甲磺酸培氟沙星；青霉素G双酯；青霉素G苄星青霉素G；青霉素G钾；普鲁卡因青霉素G；青霉素G钠；青霉素V；青霉素V苄星青霉素G；哈胺青霉素V；青霉素V钾；戊胺唑酮钠；对氨水杨酸苯酯；哌拉西林钠；吡苄西林钠；吡地西林钠；盐酸吡利霉素；盐酸匹氨青霉素；双羟萘酸匹氨青霉素；丙苯酸匹氨青霉素；硫酸多粘菌素B；泊非霉素；普匹卡星；吡嗪酰胺；吡啶硫酮锌；乙酸喹地卡明；奎奴普丁；消旋甲砜霉素；雷莫拉宁；雷尼霉素；雷洛霉素；瑞普米星；利福布汀；利福美坦；利福克昔；利福酰胺；利福平；利福喷汀；利福昔明；吡咯甲基四环素；硝酸吡咯甲基四环素；蔷薇霉素；丁酸蔷薇霉素；丙酸蔷薇霉素；蔷薇霉素磷酸钠；硬脂酸蔷薇霉素；罗索沙星；硝羟苯胂酸；罗红霉素；脱甲脱氧四环素；山费培南钠；沙莫西林；沙匹西林；司可芬净(Scopafingin)；紫苏霉素；硫酸紫苏霉素；司帕沙星；盐酸大观霉素；螺旋霉素；盐酸司他霉素；斯替霉素；硫酸链霉素；烟肼链霉素；磺胺苯；磺胺苯酰；磺胺醋酰；磺胺醋酰钠；磺胺乙胞嘧啶；磺胺嘧啶；磺胺嘧啶钠；周效磺胺；磺胺林；磺胺甲基嘧啶；磺胺对甲氧嘧啶；磺胺二甲嘧啶；磺胺甲噻二唑；磺胺甲基异噁唑；磺胺莫托辛；磺胺噁唑；磺胺酸锌；磺胺硝苯；柳氮磺吡啶；磺胺甲基异噻唑；磺胺噻唑；磺胺甲苯吡唑；磺胺异噁唑；磺胺乙酰异噁唑；磺胺异噁唑二乙醇胺盐；磺粘菌素；硫培南；舒他西林；磺苄青霉素钠；氨苄青霉素酞酯盐酸盐；替考拉宁；盐酸替马沙星；替莫西林；四环素；盐酸四环素；磷酸四环素复合物；四氧普林；甲砜氯霉素；Thiphencillin钾；羧噻吩青霉素甲苯酯钠；羧噻吩青霉素二钠；羧噻吩青霉素钠；替克拉酮；氯化氯苯噻碘；罗布霉素；硫酸妥布霉素；托氟沙星；甲氧苄嘧啶；硫酸甲氧苄啶；三磺嘧啶；醋竹桃霉素；硫酸丙大观霉素；短杆菌素；万古霉素；盐酸万古霉素；维及尼霉素；佐尔博霉素。

可通过本发明的方法治疗或预防的真菌病包括但不局限于：曲霉病(aspergilliosis)，隐球菌病，孢子丝菌病，球孢子菌病，巴西芽生菌病，组织胞浆菌病，芽生菌病，接合菌病和念珠菌病。

可与本发明的复合物联合使用的抗真菌化合物包括但不局限于：多烯类(例如，两性霉素B，杀念珠菌素，美帕曲星，游霉素和制霉菌素)，烯丙胺类(例如，布替萘芬和萘替芬)，咪唑类(例如，联苯苄唑，布康唑，氯登妥因，氟曲马唑，硝酸异康唑，酮康唑和拉诺康唑)，硫代氨基甲酸酯(例如，托西拉酯，托林达酯和托萘酯)，三唑类(例如，氟康唑，伊曲康唑，沙康唑和特康唑)，溴柳氯苯胺，丁氯柳胺，丙酸钙，氯酚醚，环吡酮(ciclopirox)，偶氮丝氨酸，灰黄霉素，寡霉素，新霉素十一碳烯酸盐，吡咯尼群，干蠕孢菌素，杀结核菌素和绿胶霉素。抗菌素化合物的其他例子包括但不局限于：吖啶琐辛；安布鲁星；两性霉素B；阿扎康唑；偶氮丝氨酸；巴西芬净；联苯苄唑；盐酸苯柳胺酯；硫酸镁双巯氧吡啶(Bispyrithione Magsulfex)；硝酸布康唑；钙十一碳烯酸盐；杀念珠菌素；石炭酸-品红；氯登妥因；环吡酮；环吡酮胺；西洛芬净；顺康唑；克霉唑；堆囊粘菌素铜；地奴真菌素(Denofungin)；双吡硫翁；多康唑；益康唑；硝酸益康唑；恩康唑；硝酸依托南；硝酸芬替康唑；菲律宾菌素；氟康唑；氟胞嘧啶；真菌霉素；灰黄霉素；哈霉素；硝酸异康唑；伊曲康唑；卡拉真菌素；酮康唑；洛蒙真菌素(Lomofingin)；利迪霉素；美帕曲星；咪康唑；硝酸咪康唑；莫能菌素；莫能菌素钠；盐酸萘替芬；新霉素十一碳烯酸盐；硝呋太尔；硝呋氯乙酮；盐酸硝拉明；制霉菌素；辛酸；硝酸奥康唑；硝酸奥昔康唑；盐酸奥昔芬净；盐酸帕康唑；帕曲星；碘化钾；丙氯醇；吡啶硫酮锌；吡咯尼林；鲁塔霉素；血根氯铵；沙康唑；司可芬净；硫化硒；西奈芬净；硝酸硫康唑；特比萘芬；特康唑；福美双；替克拉酮；噻康唑；托西拉酯；托林达酯；托萘酯；三醋精；三嗪芬净(Triafuigin)；十一碳烯酸；绿黄菌素(Viridoflilvin)；十一烯酸锌和盐酸齐诺康唑。

可通过本发明的方法治疗或预防的寄生虫疾病包括但不局限于：变形虫病，疟疾，利什曼虫属，球虫目，贾第鞭毛虫病，隐孢球虫病，弓形体病和锥虫病。还包括的是各种蠕虫感染的疾病，例如但不局限于蛔虫病，钩虫病，鞭虫病，类圆线虫病，toxoccariasis，旋毛虫病，盘尾丝虫病，丝虫病和噁丝虫病。还包括的是通过各种吸虫感染的疾病，例如但不局限于血吸虫病，肺吸虫病和支睾吸虫病。引起这些疾病的寄生虫可以基于它们是否是细胞内或细胞外的寄生虫而将其归类。本文中使用的“胞内寄生物”是全部生命周期在细胞内的寄生虫。人类细胞内寄生虫的例子包括利什曼虫属，疟原虫属，克氏锥虫属，鼠弓形体属，巴贝虫属和旋毛虫属。本文中使用的“细胞外寄生虫”是全部生命周期在细胞外的寄生虫。能够感染人类的细胞外寄生虫包括痢疾内变形虫，肠兰伯鞭毛虫，肠微孢子虫，耐格虫属和棘阿米巴属以及大部分蠕虫。将寄生虫的又一个类别定义为：在它们的生命周期内，主要在细胞外但有一个关键性阶段必须存在于细胞内。这种寄生虫相当于本文中的“强制细胞内寄生虫”。这些寄生虫在细胞外环境中可以生存其一生中的大部分时间，或生存其一生中的少部分的时间，但所有的这些寄生虫在它们的生命周期中具有至少一次强制细胞内阶段。后一类型的寄生虫包括罗德西亚锥虫和冈比亚锥虫，等孢子球虫属，隐孢子虫(Cryptosporidium)属，艾美虫属，新孢虫(Neospora)属，肉孢子虫属和血吸虫属。

可与本发明复合物组合使用以治疗寄生虫疾病的抗原生动物的化合物的许多例子在本领域是已知的，包括但不局限于：奎宁，氯喹，甲氟喹，氯胍，乙胺嘧啶，甲硝哒唑，二氯尼特，磺甲硝咪唑，两性霉素，葡萄糖酸锑钠，复方新诺明(trimoxazole)，和依西酸喷他脒。可与本发明复合物组合使用以治疗寄生虫疾病的杀寄生虫药物的许多例子在本领域是已知的，包括但不局限于：甲苯咪唑，左旋四咪唑，氯硝柳胺，吡喹酮，丙硫咪唑，异阿凡曼菌素，乙胺嗪和噻苯达唑。抗寄生虫化合物的进一步的例子包括但不局限于：二乙酰氨苯砜；盐酸氨酚喹；氨喹酯；阿替夫林；氯喹；盐酸氯喹；磷酸氯喹；双羟萘酸氯胍；磷酸恩哌罗林；盐酸卤泛群；硫酸羟氯奎；盐酸甲氟喹；美诺酮；盐酸米林霉素；磷酸伯氨喹；乙胺嘧啶；硫酸奎宁和替布喹。

在不太优选的实施方案中，本发明复合物可以与基于非HSP和非α2M的疫苗组合物联合使用。这种用于的疫苗的例子在“The JordanReport 2000，Accelerated Development of Vaccines，NationalInstitute of Health”中作出了描述，其整体引入到本文中作为参考。用于治疗非人类脊椎动物的许多疫苗公开在“Bennett，K.Compendium of Veterinary Products，3rd ed.North AmericanCompendiums，Inc.，1995”中，其整体引入到本文中作为参考。

4.5.3.自体实施方案

HSPs和α2M的特定免疫原性并非源自HSPs或α2M本身，而是来自于与它们结合的抗原蛋白和/或肽。在本发明的一个优选实施方案中，用作癌症疫苗的本发明组合物中的复合物是自体的复合物，从而规避了癌症免疫治疗中两个最棘手的障碍。第一个障碍是与实验动物的癌症类似，人类癌症的抗原各不相同。为了规避这个障碍，在本发明的一个优选实施方案中，HSPs和/或α2M与抗原蛋白和肽形成复合物，并将复合物用于治疗蛋白或肽来源的同一患者的癌症。第二个障碍是，目前大部分癌症免疫治疗途径集中于确定癌细胞系的CTL识别表位。这种方法需要获得细胞系及针对癌症的CTLs。这些试剂对于绝大部分人类癌症是得不到的。在本发明的一个使用自身抗原蛋白和/或肽的实施方案中，癌症的免疫治疗不依赖细胞系或CTLs的获取，也不需要确定癌细胞的抗原表位。这些优势使结合了自身抗原蛋白和/或肽的HSPs和/或α2M的复合物成为有吸引力的癌症免疫原。

在其它实施方案中，治疗或预防性复合物中的抗原肽可以由一个对于另一个患者异源的患者的同型癌症的癌组织制备，给予另一个患者复合物。

4.6.过继性免疫疗法

过继性免疫疗法是指一种用于治疗癌症或传染病的治疗方法，这种方法将免疫细胞给予宿主，目的是使细胞介导直接或间接地针对肿瘤细胞和/或抗原组分的特异性免疫，使肿瘤退化或治疗传染病，视情况而定。(参见例如，美国专利No.5,985,270，1999年11月16日发表，将其全部引入到本文中作为参考)。

在一个实施方案中，使用与按照本文中描述的方法制备的抗原蛋白和肽复合的HSPs和/或α2M，激活用于过继性免疫疗法的抗原递呈细胞(APC)。复合物可以由热休克蛋白或α2-巨球蛋白与抗原蛋白复合而得，其中抗原蛋白来源于抗原细胞或病毒颗粒中存在的至少50％不同蛋白或至少100种不同蛋白，其中抗原细胞或病毒颗粒表达导致传染病的抗原决定簇。复合物还可以这样制备：(a)将来源于所述类型癌症细胞的蛋白制品用蛋白酶消化，或与ATP、盐酸胍和/或酸接触，产生一组抗原肽，和(b)使该组抗原肽与热休克蛋白或α2-巨球蛋白形成复合物。

在另一个实施方案中，通过给予利用本发明方法体外制备的抗原肽与HSPs和/或α2M复合物的治疗，可以与利用本领域任何已知方法(例如见美国专利No.5,985,270)制备的HSP和/或α2M与抗原肽的复合物所致敏的APC的过继性免疫疗法相结合，其中抗原肽显示出所需的抗原性(例如同类型癌症或病原体的抗原性)。致敏APC可以单独给予、与体外形成的蛋白/肽和HSPs和/或α2M复合物联用、或在给予蛋白/肽与HSPs和/或α2M的复合物之前或之后给予。特别地，使用致敏APC预防和治疗癌症可以进一步包括将有效治疗或预防量的、含与抗原蛋白/肽复合的热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的复合物给予患者，其中所述复合物由前述方法制备。类似地，使用致敏APC治疗或预防传染病，可以进一步包括将有效治疗或预防量的、包含与抗原蛋白/肽形成复合物的热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白的复合物给予患者。

此外，尽管优选的给予方式是皮内给予，但体外形成的抗原蛋白/肽和HSPs和/或α2M的复合物的给予方式是可以改变的，包括但不局限于例如皮下、静脉内或肌肉内给予。在另一个具体的实施方案中，给予依据本发明制备的复合物致敏的抗原递呈细胞的过继性免疫疗法，可以与给予利用本领域已知的任何方法(见例如，美国专利No.5,750,119，5,837,251，5,961,979，5,935,576，PCT出版物WO 94/14976或WO 99/50303)制备的HSP和/或α2M与抗原分子(例如肽)的复合物的治疗联用，其中抗原分子显示出所需要的抗原性(例如同类型癌症或病原体的抗原性)。

4.6.1.获得抗原呈递细胞

优选在体外由人类周围血液或骨髓干和祖细胞产生而获得抗原呈递细胞，包括但不局限于巨噬细胞、树突状细胞和B细胞，详见Inaba，K.等人，1992，J.Exp.Med.176：1693-1702。树突状细胞可以通过本领域任何已知的各种方法来获得。通过举例而不是限制，可以由Sallusto等人，1994，J Exp Med 179：1109-1118和Caux等人，1992，Nature 360，258-261中所述方法获得树突状细胞，在此将其全部引入到本文中作为参考。在优选的方面，使用从人类血细胞获得的树突状细胞。

可以通过本领域各种已知的方法获得APC。在一方面，使用从人类血细胞处获得的人类巨噬细胞。作为实例而不是限制，可以按如下方法获得巨噬细胞：

用Ficoll-Hypaque梯度离心法从患者(优选需治疗的患者)的外周血液中分离单核细胞，并接种到预先用患者本人血清或其它AB+人血清包被的组织培养皿中。将细胞在37℃培育1小时，然后用吸管除去非贴壁细胞。对于皿中保留的贴壁细胞，加入1mM溶于磷酸缓冲盐水中的冷(4℃)EDTA，在室温下将皿放置15分钟。收集细胞，用RPMI缓冲液洗涤，并悬浮在RPMI缓冲液中。在37℃与巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)一起培育可增加巨噬细胞的数量。

4.6.2.用HSP-肽或α2M-肽的复合物致敏巨噬细胞和抗原递呈细胞

优选在体外与复合物一起培育细胞，用结合了抗原肽的HSP或α2M致敏APC。通过在体外用HSP复合物或α2M复合物于37℃培育15分钟至24小时，用HSPs或α2M与抗原分子的复合物致敏APC。作为实例而不是限制，4×10⁷个树突状细胞可以与10微克gp96肽复合物/毫升或100微克HSP90肽复合物/毫升于37℃、在1毫升平的RPMI培养基中培育15分钟-24小时。将细胞洗涤三次，并以适当的浓度(例如，1×10⁷/ml)将细胞再悬浮于生理性介质中，优选无菌的，以注入患者体内。优选，注入致敏树突状细胞的患者与最初分离树状细胞的患者是同一人(自体实施方案)。

任选地，致敏APC激发例如抗原特异性、I类限制细胞毒素的T-胸腺依赖性细胞(CTL)的能力可以通过其激发CTLs释放肿瘤坏死因子的能力及作为CTLs靶子的能力而加以监测。

4.6.3.致敏APC的重新注入

用传统的临床方法将致敏APCs重新全身性注入患者，优选真皮内注入。优先选用自体患者实施这些活化细胞的重新全身性注入。根据患者的条件，患者通常接受约10⁶至约10¹²个致敏树突状细胞。在一些方案中，患者可以任选地接受额外合适剂量的生物反应调节物，包括但不局限于细胞因子IFN-α，IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-6，TNF或其它细胞因子生长因子。

4.7.药物制剂和给予方法

以治疗有效的剂量将利用本发明方法制备的与HSPs和/或α2M结合的抗原蛋白/肽的复合物给予患者，以治疗或改善细胞增殖紊乱或传染病。治疗有效剂量是指足够导致这种紊乱症状得到改善的复合物的量。当在组合中另一个治疗方式正在使用时，复合物的有效剂量可以不同。对于治疗方式例如化疗剂、放射治疗和生物学/免疫治疗病原例如细胞因子的合适和建议剂量、剂型、给予途径在本领域是已知的，并在这类文献如Physician′s Desk Reference(56th ed.，2002)中作出了描述。

4.7.1.有效剂量

将包含免疫原性的、有效量的一组抗原肽与HSP和/或α2M的复合物的本发明组合物，给予需要抗癌治疗或传染病治疗的患者，作为诱导针对癌症或传染病的免疫应答的方法。这种复合物的毒性和治疗效能，可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法来测定，例如测定LD50(使总体50％致死的剂量)和ED50(对总体50％治疗有效的剂量)。有毒性和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，其可以用LD50/ED50的比例来表示。优选治疗指数大的复合物。尽管可以使用显示毒性副作用的复合物，但应该小心设计靶向这种复合物至感染组织位点的递送系统，以使未感染细胞的潜在损害减到最小，从而减少副作用。

在一个实施方案中，从细胞培养物分析和动物研究获得的数据可用于计算人类使用的剂量范围。复合物剂量优选在包括ED50在内的循环浓度范围内，毒性极低或没有毒性。根据使用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在该范围之内改变。对于在本发明方法中使用的任何复合物，开始时可由细胞培养试验估计其治疗有效剂量。可以在动物模型中计算剂量，以获得包括在细胞培养物中测定的IC50(即试验化合物可使症状抑制到半数最高抑制作用的浓度)在内的循环血浆浓度范围。这种信息可用于更准确地确定人类有效剂量。可以用例如高效液相色谱法测定血浆中的水平。

在另一个实施方案中，对于人类患者，给予hsp70和/或gp96与抗原分子的复合物的量在约0.1微克至约600微克内，优选约1微克至约60微克。所给予的hsp70和/或gp96复合物的量是0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，200，250，300，400，500或600微克。优选用量小于100微克。最优选的所给予的hsp70和/或gp96复合物的量是5微克，25微克，或50微克。通过本发明提供的人类患者中hsp-90肽复合物的剂量在约5至5,000微克之内。优选，所给予的hsp90复合物的量是5，10，25，50，60，70，80，90，100，200，250，500，1000，2000，2500，或5000微克，最优选的剂量是100微克。该剂量优选皮内或皮下给予。该剂量可以一次或重复给予，例如每天，每隔一天，每周，每两周或每月。优选，复合物每周给予一次，持续约4-6周，并且优选给予的方式或位点随每次给予而变化。这样，举例而非限制，第一个注射可以在左臂皮下给予，第二次在右臂，第三次在左腹部，第四次在右腹部，第五次在左股，第六次在右股等等。相同部位可以在一次或多次注射间隙之后重复。同样，注射可以分开进行。这样，例如，将一半剂量可以在一个部位给予，另一半在同一天在其它部位给予。另外，按顺序改变给予方式，例如每周的注射可按皮内、肌肉内、皮下、静脉内或腹膜内的顺序给予。优选地，每周给予剂量一次，持续4周。4-6周之后，优选以两周间隔给予进一步的注射，持续一或几个月，或直至复合物的供给耗尽。随后的注射可以每月给予。后续注射的进度可以根据患者对于免疫治疗的临床进展和应答加以调整。在一个优选实施例中，进行皮内给予，每次给予部位的顺序改变。

相应地，本发明提供了预防和治疗患者中癌症或传染病的方法，包括给予能够激发宿主个体的免疫能力并引起针对肿瘤前和/或肿瘤细胞或受感染细胞的特异性免疫的组合物。

在一个具体的实施方案中，在联合治疗期间，当在没有治疗方式的情况下给予时，以次最佳量给予HSP复合物，例如不显示可检测的治疗益处的量，如通过本领域已知的方法所确定的。在这种方法中，给予接受治疗方式的患者次最佳量的复合物，可使治疗效果的总体改进。在另一个具体的实施方案中，在联合治疗期间，以次最佳量给予α2M复合物。在这种方法中，给予接受治疗方式的患者次最佳量的α2M复合物，可使治疗效果的总体改进。

在一个优选实施方案中，当在没有治疗方式的情况下给予所述HSP复合物时，以不导致肿瘤退化或癌症症状缓解的量、或以癌细胞没有显著地减少或增加的量给予HSP复合物。在一个优选实施方案中，给予接受治疗方式的患者次最佳量的HSP复合物，由此治疗的总体效果得到提高。在另一个优选实施方案中，当在没有治疗方式的情况下给予所述α2M复合物时，以不导致肿瘤退化或癌症症状缓解的量、或以癌细胞没有显著地减少或增加的量给予α2M复合物。在一个优选实施方案中，给予接受治疗方式的患者次最佳量的α2M复合物，由此治疗的总体效果得到提高。这些用HSP或α2M复合物治疗的患者是那些接受化疗或放射治疗的患者。次最佳量可以通过合适的动物研究来确定。这种人类的次最佳量由通过动物实验中的外推法来确定。

在某些具体的实施方案中，给予已接受化疗剂例如Gleevec^TM(例如，以胶囊形式，每天400-800mg，400-600mg每天给予一次，或800mg剂量，每天分为两个400的剂量给予)的患者HSP或α2M复合物。Gleevec^TM在下文中被用作可用于组合中的化疗剂的非限制性实例。对于许多其它的化疗剂，可使用相似的给药方案。在这样的实施方案中，开始给予患者合适的HSP/α2M复合物，所述患者在除给予Gleevec^TM外给予HSP/α2M复合物之前，已经在没有HSP/α2M复合物的情况下接受了Gleevec^TM2天，2天到1周，1周到1个月，1个月到6个月，6个月到1年。在一个具体的实施方案中，给予患者HSP/α2M复合物，其中患者对于单独用Gleevec^TM治疗显示了抗药性。

在其它实施方案中，开始给予HSP/α2M复合物，同时开始给予Gleevec^TM。

在其它具体的实施方案中，将Gleevec^TM(例如，以胶囊形式400-800mg/天)给予已经接受了包括给予HSP/α2M复合物的治疗的患者。在这样的实施方案中，开始给予患者合适的Gleevec^TM，所述患者在除给予HSP/α2M复合物外给予Gleevec^TM复合物之前，已经在没有Gleevec^TM的情况下接受了HSP/α2M复合物2天，2天到1周，1周到1个月，1个月到6个月，6个月到1年。

在一个具体实施方案中，口服给予化疗剂例如Gleevec^TM。在另一个具体的实施方案中，皮内给予HSP/α2M复合物。

在上面所包括的每一种方法中，举例来说，患者每天接受50毫克至100毫克，100毫克至200毫克，200毫克至300毫克，300毫克至400毫克，400毫克至500毫克，500毫克至600毫克，600毫克至700毫克，700毫克至800毫克，800毫克至900毫克，或900毫克至1000毫克的化疗剂，例如Gleevec^TM。在某些实施方案中，以两个25mg至50毫克，50毫克至100毫克，100毫克至200毫克，200毫克至300毫克，300毫克至400毫克，或400毫克至500毫克的日剂量给予患者全部日剂量。

4.7.2.治疗方案

对于如上所述治疗或预防癌症和传染病的任何组合治疗，可以在给予非HSP和非α2M方式之前、同时或之后给予本发明复合物。非HSP和非2M方式可以是如上所述用于治疗或预防癌症或传染病方式的任一项。

在一个实施方案中，在适当的同一时间与另一个程式同时给予患者本发明复合物。这种方法规定两个给予在相互小于一分钟至约五分钟、或至多约六十分钟的时间之内进行，例如在同一医生的访问时间。

在另一个实施方案中，正好同时给予本发明复合物和一个程式。在又一个实施方案中，以一定顺序并在一定时间间隔之内给予本发明复合物和程式，这样，本发明复合物和程式可以一起起作用，以提供比单独给予它们增加的益处。在另一个实施方案中，以足够接近的时间给予本发明复合物和程式，以便提供所需要的治疗或预防效果。其可以以任何合适的形式并通过任何合适的途径同时或单独地给予。在一个实施方案中，通过不同的给药途径给予本发明复合物和程式。在一可选的实施方案中，通过相同给药途径给予。可以在相同或不同的部位给予本发明复合物，例如手臂和腿。当同时给予时，可以以混合物的形式或通过相同给药途径在相同的给予部位给予本发明复合物和方式，或可不以上述方式给予。

在一个优选实施方案中，依据4.7.1部分描述的方案给予本发明复合物。在各种实施方案中，给予本发明复合物和程式的时间间隔小于1小时间隔，大约1小时间隔，1小时至2小时间隔，2小时至3小时间隔，3小时至4小时间隔，4小时至5小时间隔，5小时至6小时间隔，6小时至7小时间隔，7小时至8小时间隔，8小时至9小时间隔，9小时至10小时间隔，10小时至11小时间隔，11小时至12小时间隔，不超过24小时间隔或不超过48小时间隔。在其它实施方案中，给予本发明复合物和疫苗组合物的时间间隔是2至4天间隔，4至6天间隔，1周间隔，1至2周间隔，2至4周间隔，一个月间隔，1至2个月间隔，或2或几个月间隔。在优选实施方案中，以本发明复合物和程式还具有活性的时间范围给予本发明复合物和程式。通过确定所给予的各个组份的半衰期，本领域技术人员能够确定这样的时间范围。

在一个实施方案中，在同一患者访视时间给予本发明复合物和程式。在一个具体的优选实施方案中，在给予程式之前给予本发明复合物。在一可选的具体实施方案中，在给予程式后给予本发明复合物。

在某些实施方案中，周期性地给予患者本发明复合物和程式。周期治疗包括给予一段时间的本发明复合物，接着给予一段时间程式并重复这种给予顺序。周期疗法可以降低对于一种或多种疗法的抗药性的形成，避免或降低一种疗法的副作用，和/或提高治疗效果。在这样的实施方案中，本发明包括交替给予本发明复合物4至6天后，接着给予程式，优选2至4天后，更优选1至2天后，其中这种周期可以依照要求重复许多次。在某些实施方案中，以小于3周的周期交替地给予本发明复合物和程式，每两周一次，每10天一次或每周一次。在一个具体的实施方案中，在给予程式之后的1小时至24小时的时间范围之内给予患者本发明复合物。如果使用缓释或连续释放的程式类型，可以将时间范围进一步延长几天或更多。

4.7.3.制剂和用法

可以将依据本发明使用的药物组合物以常规方法、使用一或多种生理学可接受的载体或赋形剂进行配制。

因此，可以将复合物及其生理学可接受的盐和溶剂化物配制成以吸入或吹入(通过口或鼻子)的方式、通过口腔、颊、肠胃外、直肠或透皮给予的剂型。同样包括非损伤给予方法。

对于口服，药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，片剂或胶囊可以用药学可接受的赋形剂例如粘合剂(例如预凝胶化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如，乳糖，微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如，硬脂酸镁，滑石粉或硅胶)、崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠)、或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)以常规方法制备。片剂可以用本领域众所周知的方法包衣。用于口服的液体药剂可以采取例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可以干品存在，使用之前用水或其它合适的溶媒制成液体制剂。这种液体药剂可以用药学可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆，纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)、非水溶媒(例如，杏仁油，油酯，乙醇或分离植物油)和防腐剂(例如，甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)以常规方法制备。视情况而定，制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。

可以将口服制剂适当地配制成活性复合物的控制释放剂型。

对于口含给药，可以将组合物以常规方法配制成片剂或糖锭的形式。

对于吸入方式给予，可以采用带有增压包装或喷雾器的气溶胶喷射形式、借助于合适的发射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，很方便地递送依据本发明使用的复合物。在加压气雾剂的情况下，可以通过一种递送按计量的阀门来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器等等的胶囊和柱体，可以将其配制成含有复合物与合适的粉末基料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

对于肠胃外给药，可以将复合物配制成注射用的肠胃外给药形式，例如快速浓注或连续输液。用于注射的制剂，可以单位剂型存在，例如在加入防腐剂的安瓿或在多剂量容器中。组合物可以采用悬浮液、在油状或含水赋形剂中的溶液或乳状液的形式，并且可以含有调配(formulatory)试剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性组分可以是粉末形式，于使用之前与合适的溶媒例如无菌的无热原的水组合。

还可以将复合物以直肠组合物例如栓剂或滞留灌肠剂的形式配制，例如，含有常规的栓剂基料例如可可脂或其它甘油脂。

除了先前描述的制剂之外，还可以将复合物配制为长效制剂。这种长效制剂可以通过植入法给予(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉注射给予。因此，例如复合物可以与合适的聚合或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂进行配制，或以微溶的衍生物形式，例如微溶的盐。

如果需要的话，组合物可以以包含一或多种含有活性组分的单位剂型的包装或分配装置存在。包装可以包括例如金属或塑料薄膜，例如薄膜包装。包装或分配装置可以附有给药说明书。

还包括的是，在与本发明复合物的组合中、在与本发明复合物的混合物中使用助剂。所包括的助剂包括但不局限于无机盐助剂或无机盐凝胶助剂、颗粒助剂、微粒助剂、粘膜助剂和免疫刺激助剂，例如在4.5部分中所描述的那些助剂。可以将助剂以与本发明复合物的混合物方式给予患者，或如4.7.2部分所述，在与复合物的组合中使用。

还包括的是，在与本发明复合物的组合中、或与本发明复合物的混合物中使用腺苷二磷酸(ADP)，本发明复合物优选gp96复合物。

4.7.4.试剂盒

本发明还提供了实施本发明方法和/或治疗方案的试剂盒。

在一个实施方案中，这种试剂盒的一个或多个容器内包括含抗原蛋白和肽的蛋白制品，其中抗原蛋白和肽用于与第二个容器所提供的HSPs和/或α2M混合。在另一个实施方案中，这种试剂盒的一个或多个容器中包括含抗原肽的消化肽，其中抗原肽用于结合第二个容器所提供的HSPs和/或α2M。另外，一个或多个容器可以提供蛋白和/或肽，用于和从特定患者分离出的HSPs和/或α2M形成复合物，用于自体给予。任选地，第二个容器中进一步提供与蛋白和肽形成复合物的纯化的HSP。

在另一个实施方案中，这种试剂盒包括装于一个或多个容器内的、治疗或预防有效量的、与HSPs和/或α2M复合的蛋白/肽，优选纯化的、药学可接受的形式。试剂盒任选地进一步包括装于第二容器内的致敏APCs，优选纯化的致敏APCs。

在本发明的试剂盒容器中，HSP或α2M复合物可以是药学可接受的溶液形式，例如与无菌生理盐水、葡萄糖溶液或缓冲溶液、或其它药学可接受的无菌流体的组合。另外，HSP和α2M复合物可以是冻干或干燥的；在这一情况下，试剂盒任选地进一步包括装于容器内的药学可接受的溶液(例如生理盐水，葡萄糖溶液等等)，优选无菌的溶液，以便将含有HSPs和α2M的复合物或含有α2M和HSP复合物重构成可注射的溶液。

在另一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括用于注射HSP和α2M复合物的针头或注射器，优选无菌包装形式，和/或包装好的洒精垫。任选包括临床医生或患者使用的α2M和HSP肽复合物的使用说明书。

还提供了实施本发明组合治疗的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括含有纯化HSP复合物或α2M制品的第一个容器，和含有非HSP及非α2M癌症治疗方式的第二个容器。优选地，癌症是CML，HSP复合物包括hsp70-肽复合物，治疗方式是Gleevec^TM。在一个具体的实施方案中，第二个容器含有甲磺酸伊马替尼。在另一个具体的实施方案中，甲磺酸伊马替尼是纯化的。

在一个具体的实施方案中，试剂盒包括含有单独给予时治疗疾病无效量的、纯化的HSP复合物或α2M复合物的第一个容器；和含有非HSP及非α2M治疗方式的第二个容器，当在第一个容器中的HSP复合物或α2M复合物给予之前、同时或之后给予第二个容器中的非HSP和非α2M时，非HSP和非α2M治疗方式的量应能够有效提高各个组份单独给予的总体治疗效果。在另一个具体的实施方案中，试剂盒包括含有单独给予时治疗疾病无效量的、纯化的HSP复合物或α2M复合物的第一个容器；和含有一或多种非HSP及非α2M治疗方式的第二个容器，当在第一个容器中的HSP复合物或2M复合物给予之前、同时或之后给予第二个容器中的非HSP和非α2M方式时，非HSP和非α2M的量应能够有效提高单独给予HSP复合物或α2M复合物、或单独给予治疗方式的总体治疗效果。在又一个特定的实施方案中，试剂盒包括含有单独给予时治疗疾病或障碍无效量的、纯化的HSP复合物或α2M复合物的第一个容器；和第二和第三个容器，每个容器含有非HSP及非α2M方式，当在第一个容器中的HSP复合物或α2M复合物给予之前、同时或之后给予第二和第三个容器中的非HSP和非α2M方式时，非HSP和非α2M方式的量应能够有效提高单独给予HSP复合物或α2M复合物、或单独给予治疗方式的总体治疗效果。在一个优选的具体实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，试剂盒包括：在第一个容器中，包含一组本发明非共价HSP肽复合物或α2M肽复合物的纯化HSP复合物或α2M；在第二个容器中，包含抗癌剂的组合物；和在第三个容器中，包含含细胞因子或助剂的组合物。

试剂盒可以包括例如金属或塑料薄膜，例如薄膜包装。试剂盒可以附有一个或多个用于给药的可重复使用的或一次性的用具(例如，注射器，针头，分配器)和/或给药说明书。

4.8.HSP和α2M复合物的免疫原性测定

任选地，本发明的HSP-蛋白复合物、HSP-肽复合物、α2M-蛋白复合物和α2M-肽复合物，可以使用任何本领域已知的方法测定其免疫原性。可使用下文以实例而非限制的方式描述的一种测定方法。在一个优选实施方案中，使用ELISPOT测定法(见下文4.9.4部分)。

4.8.1.MLTC测定法

简要地说，给小鼠用任何适当的给药途径注入一定量的HSP和/或α2M复合物。给小鼠注入例如与由正常组织制备的蛋白和/或肽相复合的HSP，作为阴性对照。已知含有特异抗原的细胞例如肿瘤细胞或受传染病的病原感染的细胞，可以充当测定中的阳性对照。给小鼠注射两次，间隔7-10天。最后一次接种之后十天，取出脾，将淋巴细胞释放出来。随后通过加入表达感兴趣抗原的死细胞，再次对所释放的淋巴细胞进行体外刺激。

例如，对于在3ml含有10％胎牛血清的RPMI培养基中的8×10⁶个免疫脾细胞，可以用4×10⁴个丝裂霉素C处理或γ-照射(5-10,000rads)的、含有使人感兴趣抗原的细胞(或用合适基因转染的细胞，视情况而定)刺激。在某些情况下，可将33％二级混合淋巴细胞培养上清液包括在培养基内，作为T细胞生长因子的来源(参见，Glasebrook，等人，1980，J.Exp.Med.151：876).为了试验接种之后的原发细胞毒性T细胞的应答，可以不经刺激作用来培养脾细胞。在一些实验中，还可以用抗原不同的细胞对免疫小鼠的脾细胞进行再次刺激，以测定细胞毒性T细胞应答的特异性。

六天后，用4小时⁵¹Cr-释放分析法试验培养物的细胞毒性(参见，Palladino，等人，1987，Cancer Res.47：5074-5079和Blachere，等人，1993，J.Immunotherapy 14：352-356).在这种分析测定中，将混合淋巴细胞培养液加入到靶细胞悬浮液中，以得到不同的效应细胞∶靶细胞(E∶T)比值。通过将1×10⁶个靶细胞在含有20mCi ⁵¹Cr/ml的培养基中、于37℃培育一小时而将靶细胞预先加以标记。标记之后将细胞洗涤三次。每一测定点(E∶T比值)重复三次，并引入合适的对照组以测定自发性⁵¹Cr释放(不加入胸腺依赖性细胞测定)和100％释放(用去污剂裂解细胞)。细胞混合物培育4小时之后，以200g离心细胞5分钟以沉淀细胞。用γ计数器测定释放入上清液的⁵¹Cr量。试验样品cpm减去自发性释放cpm所得的值除以总去污剂释放cpm减去自发性释放cpm所得的值，测定百分率细胞毒性。

为了阻断I类MHC级联，将来源于K-44杂交瘤细胞(一种抗I类MHC杂交瘤)的浓缩杂交瘤上清液加入到试验样品中，最后浓度为12.5％。

4.8.2.CD4+T细胞增殖测定

原发T细胞取自脾、新鲜血液或CSF，并基本上按Kruse和Sebald，1992，EMBO J.11：3237-3244所描述的方式，用FICOLL-PAQUE PLUS(Phannacia，Upsalla，Sweden)离心加以纯化。外周血单核细胞与表达抗原分子的细胞裂解液一起培育7-10天。为了对裂解液中的抗原进行加工和呈递，在测定之前24至48小时，可以任选地在培养物中加入抗原递呈细胞。然后离心收集细胞，并在RPMI 1640培养基(GibcoBRL，Gaithersburg，Md.)中洗涤。将活化T细胞以5×10⁴个/孔的密度接种入96孔板中，于37℃培育72小时，其中T细胞在含有10％胎牛血清、10mM HEPES、2mM pH7.5的L-谷酰胺、100单位/毫升青霉素G和100μg/ml硫酸链霉素的RPMI 1640培养基中，加入1μCi/孔的³H-胸腺嘧啶脱氧核苷(DuPont NEN，Boston，Mass.)，6小时后收集细胞，并用TOPCOUNT闪烁计数器(PackardInstrument Co.，Meriden，Conn.)测定放射性。

4.8.3.抗体应答测定

在本发明的一个特定实施方案中，通过测定对于复合物接种应答所产生的抗体，来测定HSP-或α2M复合物的免疫原性。在一个实施方案的模式中，用50μl/孔纯化的、用于PBS中疫苗的蛋白/肽的非HSP或α2M复合形式的0.75μg/ml溶液，将微量滴定板(96孔免疫板II，Nunc)在4℃包被16小时，然后在20℃包被1小时。将孔倒空，并用每孔200μl PBS-T-BSA(含有0.05％(v/v)TWEEN 20和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS)的量于20℃封闭1小时，然后用PBS-T洗涤3次。加入50μl/孔源于预防接种动物(例如模型小鼠或人类患者)的血浆或CSF，在20℃放置1小时，并用PBS-T洗涤滴定板3次。用50μl/孔的羊抗小鼠或抗人免疫球蛋白在20℃培育1小时之后然后用量热法测定抗肽抗体活性，(如同上述用PBS-T进一步洗涤3次之后)用50μl邻苯二胺(OPD)-H₂O₂底物溶液，视情况而定，可将免疫球蛋白与用PBS-T-BSA以1∶1，500稀释的辣根过氧化酶(Amersham)偶联。5分钟之后，用150μl的2M H2SO4停止反应，用Kontron SLT-210光度计(SLT Lab-instr.，Zurich，Switzerland)测定492纳米处的吸光度(参考波长620纳米)。

4.8.4.细胞因子检测试验

CD4+T细胞对于本发明的HSP或α2M复合物的增殖反应，可以通过检测和定量特异细胞因子的水平而测定。例如在一个实施方案中，可用IFN-γ检测试验来测定细胞内的细胞因子检测本发明复合物的免疫原性。在该方法的一个实施例中，对来源于HSP肽或α2M肽复合物治疗过的患者的外周血单核细胞，用给定肿瘤的肽抗原或用传染病的病原的抗原肽刺激。然后用可以通过流式细胞光度术检测的T细胞特异标记抗体对细胞染色，例如FITC共轭抗CD8抗体和PerCP标记的抗CD4抗体。洗涤之后，将细胞固定、透化，并与染料标记的抗体反应，其中该抗体对人IFN-r(PE-抗IFN-γ)具有反应性。使用标准技术对样品进行流式细胞术分析。

另外，可以使用过滤免疫测定法、酶连接免疫印迹试验(ELISPOT)检测T细胞周围的特异细胞因子。例如在一个实施方案中，用纯化细胞因子特异一级抗体，即抗IFN-γ包被硝化纤维素作基底的微量滴定板，然后封闭微量滴定板，避免其它蛋白的非特异性结合产生的背景。将从HSP肽和/或α2M肽复合物治疗过的患者处获得的、含有分泌细胞因子的细胞的单核血细胞样品于微量滴定板的孔中稀释。加入标记的，例如生物素标记的次级抗-细胞因子抗体。然后通过目视、镜检或电子测量方法来检测抗体细胞因子复合物，即通过酶共轭的链霉抗生物素蛋白-细胞因子分泌细胞将显示为“点”。

4.8.5.四聚物试验

在另一个实施方案中，可以使用“四聚物染色”试验(Altman等人，1996，Science 274：94-96)鉴定抗原特异性T细胞。例如，在一个实施方案中，使含有特异性肽抗原例如肿瘤特异抗原的MHC分子形成多聚体，以制备可溶性肽四聚物，并使之与例如链霉抗生物素蛋白形成复合物加以标记。然后将MHC-肽抗原复合物与一组从HSP或α2M复合物治疗过的患者处获得的T细胞混合。然后使用生物素对表达使人感兴趣的抗原，即肿瘤特异抗原的T细胞加以染色。

4.9.癌症预防和免疫治疗期间的效果监测

可用本领域技术人员已知的任何方法监测HSP或α2M复合物在肿瘤疾病的发展和恶化中的免疫治疗效果，包括但不局限于下列指标：a)作为细胞免疫评价的迟发型过敏反应；b)溶细胞T淋巴细胞的体外活性；c)肿瘤特异抗原例如癌胚(CEA)抗原的水平；d)利用例如计算机断层(CT)扫描的技术所观察的肿瘤形态学变化；和e)高风险个体中特定癌症的假定危险生物标志物水平的变化，和f)使用声波图的肿瘤形态学变化。

下列各部分描述了任选的示范性方法。

4.9.1.迟发过敏性皮试

迟发过敏性皮肤试验在总体免疫能力和对抗原的细胞免疫性方面具有巨大价值。不能对一组通用皮肤抗原产生反应称为无反应性(Sato，T.，等人，1995，Clin.Immunol.Pathol.74：35-43)。

适当的皮试技术要求将抗原于4℃无菌、避光保存，在使用之前迅速重构。用25号或27号规格的针头确保将抗原经皮内而不是皮下给予。抗原经皮内给予24和48小时之后，用尺测定红斑和硬结的最大尺寸。通过高浓度抗原，或在有分歧的情况下用中间试验重复测试来确定对任何给定抗原或一组抗原的低活性。

4.9.2.溶细胞T淋巴细胞的体外活性

在3ml含10％胎牛血清的RPMI培养基中，对于利用Ficoll-Hypaque离心梯度技术分离的源于外周血液的8×10⁶个T淋巴细胞，用4×10⁴个丝裂霉素C处理的肿瘤细胞再刺激。在一些实验中，将33％二级混合淋巴细胞培养上清液或IL-2作为T细胞生长因子的来源加入到培养基中。

为了测定免疫之后溶细胞T淋巴细胞的初级反应，培养T细胞时不加入刺激物肿瘤细胞。在其它实验中，用抗原不同的细胞重新刺激T细胞。六天之后，用4小时⁵¹Cr-释放试验测定培养物的细胞毒性。靶细胞的自发⁵¹Cr-释放应该低于20％。对于抗I类MHC阻断活性，在试验品中加入W6/32杂交瘤的十倍浓缩上清液，最后浓度为12.5％(Heike M.，等人，J.Immunotherapy 15：165-174)。

4.9.3.肿瘤特异抗原的水平

尽管不可能检测所有肿瘤的独特肿瘤抗原，许多肿瘤仍然显示出与正常细胞相区别的抗原。单克隆抗体试剂可以实现抗原的分离和生化特性鉴定，并对于非转化细胞转化和转化细胞的区分和细胞谱系确定的诊断具有很高的价值。最好鉴定的人类肿瘤相关抗原是癌胚抗原。这些抗原在胚胎发育期间表达，但在正常的成人组织中缺少或很难检测到。典型抗原是癌胚抗原(CEA)，是一种在胎儿内脏的人类结肠癌细胞上发现的糖蛋白，但在正常成人结肠细胞中没有发现。既然CEA来源于结肠癌细胞，并在血清中发现，最初人们认为血清中这种抗原的存在可用于筛选结肠癌患者。然而，患有其它肿瘤例如胰腺和乳腺癌的患者，其血清CEA的水平也升高。因此，对于预测肿瘤进展及对治疗的反应来说，监测治疗中癌症患者CEA水平的下降和升高已经证明是有用的。

其它若干癌胚抗原在诊断和监测人类肿瘤方面是非常有用的，例如α-胎蛋白，其是一种正常情况下通过胎儿肝脏和卵黄囊细胞分泌的α-球蛋白，可在肝脏和生殖细胞肿瘤患者的血清中发现，并作为疾病状态的一项内容。

4.9.4.计算机断层(CT)扫描

CT仍然是对癌症精确分级的可选技术。在检测转移方面，已经证明CT比其它任何图像技术更灵敏和更具体。

4.9.5.假定生物标志的测定

测定具体癌症危险性的假定生物标志水平，来监测含胞液和膜来源蛋白的组合物的效果。例如，用Brawer，M.K.，等人，1992，J.Urol.147：841-845和Catalona，W.J.，等人，1993，JAMA 270：948-958所述方法测定前列腺癌症高危险个体的血清前列腺-特异抗原(PSA)；或在结肠直肠癌症的高危个体中，按上面4.5.3部分所述方法测定CEA；和用Schneider，J.等人，1982Proc.Natl.Acad.Sci.ISA 79：3047-3051所述方法测定乳腺癌高危个体的雌二醇的16-α-羟基化。在上面引用的所有参考文献以其全部引入本文中作为参考。

4.9.6.声波图

声波图仍然是对癌症精确分级的替代可选技术。

5.实施例

下列实验说明，(a)来源于细胞组分的抗原肽，与(b)HSP或α2-巨球蛋白(α2M)形成的复合物，对于预防性的保护动物免于癌细胞生长是有效的。

5.1.材料和方法

5.1.1蛋白纯化

对于α2M的纯化，将来源于小鼠的血清用pH7.6的0.04M Tris和0.15M NaCl以1∶1的比例稀释，然后加到一用相同缓冲液平衡和65ml Sephacryl S 300R(SIGMA)柱中进行洗脱。通过点印迹方法测定α2M阳性组分，组分中的缓冲液用PD-10柱转换为pH7.5的0.01M磷酸钠缓冲液。将含有蛋白的组分加到刀豆素A琼脂糖凝胶柱上。将结合的蛋白用0.2M甲基甘露糖吡喃糖苷洗脱，并加到用0.05M乙酸钠缓冲液平衡过的DEAE柱上。α2M是以纯净的形式洗脱出来的，用SDS-PAGE和0.13M乙酸钠免疫印迹法分析其纯度。

在一些实验中，α2M购自SIGMA。

Gp96由4.3.3部分所述方法获得。

5.1.2肿瘤排斥试验

在100μl体积的PBS中完成所有的皮内接种。间隔一周给予两次接种。每次注射使用7微克α2M或1微克gp96，α2M或gp96以复合物形式使用或单独使用。将活的肿瘤细胞(100,000个)洗至不含培养基，并再悬浮于PBS中，并于最后一次接种之后一周进行皮内注射。对肿瘤进行二维测量。平均值的一半作为肿瘤的半径以计算肿瘤的体积。使用单因素方差分析(ANOVA)测定P值。

5.1.3复合物的产生

用杜恩斯(dounce)匀浆器从活Meth A细胞中获得细胞裂解液，接着超速离心。用0.1％三氟乙酸(TFA)和3mM ATP对100,000g上清液处理10小时，接着用10kDa截流限的CENTRICON膜滤器(Millipore)离心。通过将小于10kDa的肽(称为“MethA10”)与C18反相柱结合、用甲醇洗脱肽、在真空中干燥肽、并用适合于形成复合物的缓冲液重构而进一步分离。在过量50摩尔MethA10的存在下，将Gp96、α2M或白蛋白(作为对照)加热至50℃。将含有所得复合物的反应物室温放置30分钟，然后放置冰上。使用CENTRICON 50(Millipore)除去未复合的游离肽。将由此制备的复合物用于接种。

5.2.结果

在该实验中，使用Meth A肿瘤模型来说明gp96-肽复合物和α2M-肽复合物所引起的抗肿瘤免疫。该肿瘤的抗原MHC I表位是未知的。Meth A细胞裂解液用ATP和三氟乙酸(TFA)处理，收集小于10kD(MethA10)的肽组分，按如上所述方法与α2M或gp96形成复合物。用与MethA10形成复合物或未形成复合物的α2M或gp96免疫BALB/c小鼠。同样用白蛋白-MethA10或PBS免疫的BALB/c小鼠作为阴性对照。接种间隔一周，两次完成。最后一次接种一周之后，所有小鼠用100,000个活Meth A细胞进行皮内刺激。刺激之后每5天监测肿瘤生长状况，直至20天。

表1

接种小鼠所用组合物	在第0天用肿瘤细胞刺激的小鼠数量	在第20天具有可测量肿瘤的小鼠数量
			只有MethA10	5	5
白蛋白-MethA10	5	5
			PBS	5	5
α2M-MethA10复合物	5	0
			Gp96-MethA10复合物	5	0
从肝脏纯化的Gp96	5	5
			从血清纯化的α2M	5	4

表1中的数据显示，用α2M-MethA10(p＜0.05)或gp96-MethA10(p＜0.05)复合物免疫，对小鼠具有显著的肿瘤保护作用，但单独用α2M、单独用gp96、白蛋白-MethA10或PBS免疫，对小鼠没有保护作用。

5.3.讨论

本文描述的针对肿瘤的接种实验，演示了一种新的肿瘤免疫治疗方法，方法中包括自身和抗原肽在内的一组肿瘤的总体细胞肽与HSP或α2M形成复合物。正如本文所示，这样的复合物有效地刺激宿主免疫系统产生特异反应。数据表明，本方法在预防中的用途可延至治疗预先存在的疾病，以及治疗和预防病原性感染。

本文引用的所有参考文献，均以其全部引入本文中作为参考，并用于相同程度的所有目的，正如将每一单独出版物或专利或专利申请，具体和分别地指出以其所有目的全部引入本文作为参考那样。

在不背离本发明精神和范围的条件下，可以对本发明作出许多修饰和变更，其对本领域技术人员是显而易见的。本文描述的具体实施方案仅以实例的方式提供，并且本发明仅受附加的权利要求的条款以及权利要求所赋予的全部同等范围的限制。

Claims (39)

1.治疗或预防癌症的方法，包括

给予需要这种治疗或预防的患者包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原蛋白，其中所述一组复合物是通过热休克蛋白或α2-巨球蛋白与下列物质形成复合物来制备的：(i)抗原蛋白，其是存在于所述类型癌细胞中的至少50％的不同蛋白，或(ii)至少50种存在于所述类型癌细胞中的不同蛋白；和

给予所述患者至少一种不包括热休克蛋白或α2-巨球蛋白的治疗方式。

2.治疗或预防癌症的方法，包括

给予需要这种治疗或预防的患者包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原蛋白，其中所述一组复合物是通过包含消化蛋白制品的方法产生的，蛋白制品包括(i)存在于所述类型癌细胞中的至少50％的不同蛋白，或(ii)至少50种存在于所述类型癌中的不同蛋白，与一种或多种蛋白酶产生一组抗原肽，并将该组抗原肽与热休克蛋白或α2-巨球蛋白复合；和

给予所述患者至少一种不包括热休克蛋白或α2-巨球蛋白的治疗方式。

3.治疗或预防癌症的方法，包括

给予需要这种治疗或预防的患者包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(i)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白和(ii)抗原肽，其中所述一组复合物是通过下列方法产生的，包括(a)将包含(A)存在于所述类型癌细胞中的至少50％的不同蛋白或(B)至少50种存在于所述类型癌细胞的不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、盐酸胍和/或酸性条件中，以产生一组抗原肽；(b)回收该组抗原肽；和(c)将该组抗原肽与热休克蛋白或α2-巨球蛋白复合；和

给予所述患者至少一种不包括热休克蛋白或α2-巨球蛋白的治疗方式。

4.治疗或预防传染病的方法，包括

给予需要这种治疗或预防的患者包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原蛋白，其中所述一组复合物是通过将热休克蛋白或α2-巨球蛋白与抗原蛋白复合产生的，其中抗原蛋白是在表达导致传染病的抗原决定簇的抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒中存在的至少50％的不同蛋白或至少50种不同的蛋白；和

给予所述患者至少一种不包括热休克蛋白或α2-巨球蛋白的治疗方式。

5.治疗或预防传染病的方法，包括

给予需要这种治疗或预防的患者包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原蛋白，其中所述一组复合物是通过下列方法产生的，包括(i)将蛋白制品用一种蛋白酶或多种不同的蛋白酶消化，其中蛋白制品包含存在于表达导致传染病的抗原决定簇的抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒中的至少50％的不同蛋白或至少50种不同蛋白；和(ii)将该组抗原肽与热休克蛋白或α2-巨球蛋白复合；和

给予所述患者至少一种不包括热休克蛋白或α2-巨球蛋白的治疗方式。

6.治疗或预防传染病的方法，包括

给予需要这种治疗或预防的患者包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原肽，其中所述复合物是通过下列方法产生的，包括(i)将蛋白制品暴露于ATP、盐酸胍和/或酸性条件中，以产生一组抗原肽，其中蛋白制品包含存在于表达导致传染病的抗原决定簇的抗原细胞、其细胞组分或病毒颗粒中的至少50％的不同蛋白或至少50种不同蛋白；(ii)回收该组抗原肽；和(iii)将该组抗原肽与热休克蛋白或α2-巨球蛋白复合；和

给予所述患者至少一种不包括热休克蛋白或α2-巨球蛋白的治疗方式。

7.权利要求1的方法，其中所述抗原蛋白组与热休克蛋白的复合是通过共价键形成的。

8.权利要求1的方法，其中所述抗原蛋白组与热休克蛋白的复合是通过非共价键形成的。

9.权利要求2或3的方法，其中所述抗原肽组与热休克蛋白的复合是通过共价键形成。

10.权利要求2或3的方法，其中所述抗原肽组与热休克蛋白的复合是通过非共价键形成的。

11.权利要求4的方法，其中所述抗原蛋白组与α2-巨球蛋白复合是通过共价键形式。

12.权利要求4的方法，其中所述抗原蛋白组与α2-巨球蛋白的复合是通过非共价键形成的。

13.权利要求5或6的方法，其中所述抗原肽组与α2-巨球蛋白的复合是通过共价键形成的。

14.权利要求5或6的方法，其中所述抗原肽组与α2-巨球蛋白的复合是通过非共价键形成的。

15.权利要求1的方法，其中所述一组包含热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白和抗原蛋白的复合物是提纯的。

16.权利要求4的方法，其中所述复合物组是提纯的。

17.权利要求2或3的方法，其中所述复合物组是提纯的。

18.权利要求5或6的方法，其中所述复合物组是提纯的。

19.权利要求1，2或3的方法，其中同型癌细胞来源于转移灶。

20.权利要求1，2或3的方法，其中治疗或预防的癌是转移灶。

21.权利要求5，6或7的方法，其中抗原细胞是由导致传染病的病原感染的。

22.权利要求5，6或7的方法，其中抗原细胞是由显示了所述病原的抗原性的所述病原的变异体感染。

23.权利要求1，2或3的方法，其中至少治疗方式包含化疗剂、抗血管生成剂、细胞因子、生物应答调节物、激素、抗体、多核苷酸、免疫刺激寡核苷酸、光动力治疗剂或放射。

24.权利要求4，5或6的方法，其中至少一种治疗方式包括抗生素、抗病毒素、抗原生动物的化合物、抗真菌化合物、驱虫剂化合物、抗体、细胞因子、激素、免疫刺激寡核苷酸或多核苷酸。

25.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中所述组合物是在给予至少一种治疗方式之前、同时或之后给予的。

26.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中患者先前对于用在没有所述组合物的情况下的所述至少一种治疗方式治疗不应答。

27.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中所述组合物的所述给药是每隔一星期重复的。

28.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中所述组合物的所述给药是在患者的相同部位重复的。

29.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中所述组合物的所述给药皮内或皮下给药的。

30.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中给予次最佳量的所述组合物。

31.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中给予次最佳量的所述至少一种治疗方式。

32.权利要求1，2，3，4，5或6的方法，其中患者是人类。

33.权利要求1的方法，其中抗原蛋白是患者自体的。

34.权利要求4的方法，其中抗原蛋白是患者自体的。

35.权利要求2或3的方法，其中抗原肽是患者自体的。

36.权利要求5或6的方法，其中抗原肽是患者自体的。

37.试剂盒，包括：

第一容器，含有包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原蛋白，其中所述一组复合物是通过热休克蛋白或α-2-巨球蛋白与抗原蛋白复合产生的，抗原蛋白是存在于抗原细胞中的至少50％的不同蛋白或存在于抗原细胞中的至少50种不同的蛋白；和

第二容器，含有不包括热休克蛋白或α2-巨球蛋白的治疗方式。

38.试剂盒，包括：

第一容器，含有包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原蛋白，其中所述一组复合物是通过下列方法产生的，包括(i)用一或多种蛋白酶消化存在于抗原细胞中的包括至少50％不同蛋白或至少50种不同蛋白的蛋白制品以产生一组抗原肽，和(ii)将该组抗原肽与热休克蛋白或α2-巨球蛋白复合；和

含有基于非热休克蛋白和非α-2-巨球蛋白的治疗方式的第二容器。

39.试剂盒，包括：

第一容器，含有包含一组复合物的组合物，所述复合物包括(a)热休克蛋白和/或α2-巨球蛋白，和(b)抗原蛋白，其中所述一组复合物是通过下列方法产生的，包括(i)将包含存在于抗原细胞中的至少50％的不同蛋白或至少50种不同蛋白的蛋白制品暴露于ATP、盐酸胍和/或酸性条件中，以产生一组抗原肽；(ii)回收该组抗原肽；和(iii)将该组抗原肽与热休克蛋白或α-2-巨球蛋白复合；和

含有基于非热休克蛋白和非α-2-巨球蛋白的治疗方式的第二容器。