CN1757721B

CN1757721B - 碱性蛋白酶

Info

Publication number: CN1757721B
Application number: CN2005101082404A
Authority: CN
Inventors: 奥田光美; 佐藤刚; 泷村靖; 住友伸行; 小林徹
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2004-10-08
Filing date: 2005-10-08
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2025-10-08
Also published as: JP5202690B2; JP2011200249A; US7473544B2; US20060078978A1; CN1757721A; EP1645632B1; EP1645632A3; DK1645632T3; EP1645632A2; DE602005014600D1

Abstract

本发明提供可同时具有高洗净性与高生产率的碱性蛋白酶。在具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶或功能上与其等价的碱性蛋白酶中，通过取代和/或插入选自下述(a)～(e)的1种以上的氨基酸残基构成，且与具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶相比具有更高的比活性与洗净性。(a)将133位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它的氨基酸残基，(b)在133位与134位或与其相当位置的氨基酸残基之间插入其它的氨基酸残基，(c)将插入前的134位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它的氨基酸残基，(d)将插入前的135位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它的氨基酸残基，(e)将132位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它的氨基酸残基。

Description

碱性蛋白酶

技术领域

本发明涉及作为洗净剂配合酶有用的碱性蛋白酶，将其编码的基因及含有该碱性蛋白酶的洗净剂组合物。

背景技术

产业领域中使用蛋白酶的历史悠久，从以衣料用洗涤剂为首的洗净剂至作为纤维的改性剂，皮革处理剂，化妆材料，沐浴剂，食品改性剂或药品的利用，涉及得非常多。其中，最大量地工业化生产的是洗涤剂用蛋白酶，例如，已知碱性蛋白酶(alcalase)、Savinase(注册商标：Novozymes)、Maxacal(注册商标：Genencor)、Blap(注册商标：Henkel)、与KAP(花王)等。

在洗涤剂中配合蛋白酶的目的，是为了分解在衣料上附着的以蛋白质为主要成分的污垢，将其低分子化，促进源自表面活性剂的溶液化。但是，实际的污垢不仅是蛋白质，还有来自皮脂的脂质、固体粒子等，是其中包含着混入有机物与无机物的多种成分的复合污垢，因此，期望有对这样的复合污垢洗净性高的洗净剂。

出于这样的观点，本发明者们发现了几种即使在高浓度的脂肪酸存在下，仍然保持充分的酪蛋白分解活性，不仅对蛋白质，而且对皮脂等混合存在的复合污垢也具有优异洗净性的分子量约43,000的碱性蛋白酶，在先已申请专利(参阅专利文献1)。这样的碱性蛋白酶群，在其分子量、一次结构、酶学性质、具有非常强的耐氧化性方面，与已知的是来自杆菌属细菌的丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)不同，提议分类为新的枯草杆菌蛋白酶亚科(subfamily)(参阅非专利文献1)。

上述碱性蛋白酶群，即使在皮脂污垢等混合存在的条件下也具有高的洗净能力，但事实上还在谋求更高的洗净性能。另外，为在工业上大量生产这样的洗净性优异的蛋白酶，也必须提高生产率。作为提高生产率的方法，可以列举通过生产菌的突变育种的改良，改变编码蛋白酶的基因或相关其发现控制的基因，提高蛋白质分泌量的方法，改变编码蛋白酶的基因，使比活性提高的方法。因此，本发明者们针对上述碱性蛋白酶的基因改变进行了研究，发现提高蛋白质分泌能力与比活性的突变碱性蛋白酶(专利文献2、3)。

但是，生产大量且价格低廉的酶，更优选提高生产率，因此，致力于进一步提高比活性、提高分泌量或提高洗净能力等。

专利文献1 国际公开第99/18218号小册子

专利文献2 特开2004-000122号公报

专利文献3 特开2004-057195号公报

非专利文献1 Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279，313-319，2000

发明内容

本发明提供一种碱性蛋白酶，在具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶或功能上与其等效的碱性蛋白酶中，取代和/或插入选自下述(a)～(e)的1种以上的氨基酸残基组成，且与具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶相比具有更高的比活性和/或洗净性，

(a)将133位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；

(b)在133位与134位或与其相当位置的氨基酸残基之间插入其它氨基酸残基；

(c)将插入前的134位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；

(d)将插入前的135位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；和

(e)将132位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基。

此外，本发明还提供编码该碱性蛋白酶的基因、含有该基因的媒介物、含有该媒介物的转化体。

再者，本发明还提供含有该碱性蛋白酶的洗净剂组合物。

附图说明

图1是与序列号1表示的氨基酸序列同源性高的蛋白酶的氨基酸序列的排列图。

图2-1是表示本发明碱性蛋白酶的洗净能力的图。

图2-2是表示本发明碱性蛋白酶的洗净能力的图。

图2-3是表示本发明碱性蛋白酶的洗净能力的图。

图2-4是表示本发明碱性蛋白酶的洗净能力的图。

图2-5是表示本发明碱性蛋白酶的洗净能力的图。

图2-6是表示本发明碱性蛋白酶的洗净能力的图。

具体实施方式

本发明提供一种可以进一步提高对复合污垢有效的碱性蛋白酶的洗净性能，通过提高酶的比活性，同时具有高洗净性能和生产率的碱性蛋白酶。

本发明人在被提议分类为新的枯草杆菌蛋白酶亚科的分子量约为43,000的碱性蛋白酶中，通过对这些氨基酸序列进行适当的排列，尝试选择成为改变候补的氨基酸，进行了任意氨基酸的取代、插入、缺失等位点专一的突变导入。其结果发现某种碱性蛋白酶中，为使比活性提高，该氨基酸序列中的特定位置上必须有特定的氨基酸残基。本发明者们还发现，为提高洗净性能，该氨基酸序列中的特定位置上必须插入特定的氨基酸残基。

根据本发明，通过提高对复合污垢也具有优异洗净性的碱性蛋白酶的洗净性能和酶的比活性，可以提供一种适合于配合洗净剂的碱性蛋白酶。

本发明的碱性蛋白酶，在具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶或与其功能等价的碱性蛋白酶中，取代和/或插入选自下述(a)～(e)的1种以上的氨基酸残基组成，优选与具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶相比具有更高比活性或洗净性，还优选进一步提高比活性与洗净性。

(d)将插入前的135位或与其相当位置的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；

这样的碱性蛋白酶可以是野生型，野生型的突变体或施以人工突变的突变体。

此外，作为选自上述(a)～(e)的2种以上的氨基酸残基的取代和/或插入的适合的组合，例如可举出以下的1)～5)。

1)(a)表示的氨基酸残基的取代和(b)表示的氨基酸残基的插入的组合；

2)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入和(c)表示的氨基酸残基的取代的组合；

3)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入，(c)表示的氨基酸残基的取代和(d)表示的氨基酸残基的取代的组合；

4)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合；

5)(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合。

作为本发明的碱性蛋白酶优选的具体例子，还可以列举以下述6)～16)所表示的物质。

6)(a)表示的氨基酸残基的取代，其它的氨基酸残基是赖氨酸，苏氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸。

7)(b)表示的氨基酸残基的插入，其它的氨基酸残基是赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸或精氨酸。

8)(a)表示的氨基酸残基的取代和(b)表示的氨基酸残基的插入的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基，分别是(a)脯氨酸/(b)异亮氨酸、(a)亮氨酸/(b)丝氨酸、(a)亮氨酸/(b)甘氨酸、(a)亮氨酸/(b)苏氨酸、(a)丝氨酸/(b)丙氨酸、(a)丝氨酸/(b)天冬酰胺、(a)丝氨酸/(b)谷氨酰胺、(a)丝氨酸/(b)色氨酸、(a)丝氨酸/(b)组氨酸、(a)丝氨酸/(b)甘氨酸、(a)赖氨酸/(b)丝氨酸、(a)苏氨酸/(b)丝氨酸、(a)异亮氨酸/(b)丝氨酸、(a)蛋氨酸/(b)丝氨酸、(a)甘氨酸/(b)丝氨酸、(a)精氨酸/(b)丝氨酸、(a)谷氨酸/(b)丝氨酸、(a)天冬酰胺/(b)丝氨酸、(a)苯基丙氨酸/(b)丝氨酸、(a)色氨酸/(b)丝氨酸、(a)赖氨酸/(b)丙氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸、(a)赖氨酸/(b)甘氨酸或(a)丝氨酸/(b)丝氨酸。

9)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入与(c)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基，分别是(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸。

10)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入，(c)表示的氨基酸残基的取代与(d)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)丝氨酸/(d)丙氨酸、(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)丝氨酸/(d)精氨酸与(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)丝氨酸/(d)蛋氨酸。

11)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入与(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(e)丝氨酸、(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(e)谷氨酰胺与(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(e)蛋氨酸。

12)(b)表示的氨基酸残基的插入与(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(b)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或亮氨酸/(e)丝氨酸。

13)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入与(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)异亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)组氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)丝氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)赖氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸或(a)赖氨酸/(b)丝氨酸/(e)丝氨酸。

14)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入与(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)异亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺或(a)脯氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺。

15)(b)表示的氨基酸残基的插入与(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(b)丙氨酸/(e)蛋氨酸或苏氨酸。

16)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入与以(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)赖氨酸/(b)丝氨酸/(e)天冬酰胺或异亮氨酸。

作为具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶，例如可举出蛋白酶KP43[来自杆菌sp KSM-KP43(FERM BP-6532)，WO99/18218，GenBank accession no.AB051423]。

作为与具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶功能等价的碱性蛋白酶，也可以是野生型或野生型的突变体。例如，可举出在序列号1中，在132位、133位、134位或135位或相当于这些位置以外的氨基酸残基1个～几个缺失、取代或加成的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶，或与序列号1表示的氨基酸序列，具有80％以上，优选87％以上，更优选90％以上，特别优选95％以上的同源性的碱性蛋白酶，与具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶具有同样性质的物质。特别优选在pH8以上的碱性区域作用的，具有耐氧化性的，在50℃、pH10时处理10分钟时表示80％以上的残存活性，受二异丙基氟磷酸(DFP)及苯甲基磺酰氟(PMSF)阻碍，由SDS-PAGE测定的分子量为43,000±2,000的物质。这里，作为具有耐氧化性，可以列举30℃下，将该碱性蛋白酶放置在含有50mM过氧化氢，5mM氯化钙的20mM的Britton-Robinson缓冲液(pH10)中20分钟后的残存活性至少保持50％以上。

作为“具有与序列号1表示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶”，例如可举出来自蛋白酶KP9860[杆菌spKSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218，GenBank accessionno.AB046403]，蛋白酶E-1[来自杆菌No.D-6(FERM P-1592)，特开昭49-71191，GenBank accession no.AB046402]，蛋白酶Ya[来自杆菌sp Y(FERM BP-1029)，特开昭61-280268，GenBank accessionno.AB046404]，蛋白酶SD521[来自杆菌SD521(FERM P-11162)，特开平3-191781，GenBank accession no.AB046405]，蛋白酶A-1[来自NCIB12289，WO88/01293，GenBank accession no.AB046406]，蛋白酶A-2[来自NCIB 12531，WO98/56927]，蛋白酶9865[来自杆菌sp KSM-9865(FERM P-18566)，GenBank accession no.AB084155]，和特开2002-218989，特开2002-306176，特开2003-125783，特开2004-000122，特开2004-057195中所述的突变蛋白酶，将序列号1的氨基酸序列63位取代为丝氨酸的突变体，将89位取代为组氨酸的突变体，将120位取代为精氨酸的突变体，将63位与187位取代为丝氨酸的突变体，将226位取代为酪氨酸的突变体，将296位取代为缬氨酸的突变体，将304位取代为丝氨酸的突变体(特开2004-305175)，将序列号1的氨基酸序列的15位取代为组氨酸的突变体，将16位取代为苏氨酸或谷氨酰胺的突变体，将166位取代为甘氨酸的突变体，将167位取代为缬氨酸的突变体，将346位取代为精氨酸的突变体，将405位取代为天冬酰胺酸的突变体(特开2004-305176)等。

此外，氨基酸序列的同源性，由Lipman-Pearson法(Science，227，1435，(1985))计算。具体地，使用基因信息处理软件Genetyx-Win(Ver.5.1.1；软件开发)的同源性解析(Search homology)程序，将Unit size to compare(ktup)作为1进行解析并由此计算。

另外，本发明中，作为确定“相当位置的氨基酸残基”的方法，可以由使用例如Lipman-Pearson法等公知的算法(algorithm)，比较氨基酸序列，通过在各碱性蛋白酶的氨基酸序列中存在的保存氨基酸残基中给予最大相同性进行。以这样的方法使蛋白酶的氨基酸序列整列，不仅能够在氨基酸序列中的插入、缺失，而且能够决定在相同氨基酸残基的各蛋白酶序列中的位置。相同位置，可以认为在三维结构中存在于相同位置，可以推定具有有关对象蛋白酶的特异功能类似的效果。

即，以上述方法，如图1使氨基酸序列整列，

(1)序列号1的132位的氨基酸残基是丙氨酸残基，相当该位置的氨基酸残基，通过使用上述方法可以特定为例如在蛋白酶E-1中131位的丙氨酸残基。

(2)序列号1的133位的氨基酸残基是丙氨酸残基，相当该位置的氨基酸残基，通过使用上述方法可以特定为例如在蛋白酶Ya中132位的脯氨酸残基。

(3)序列号1的134位的氨基酸残基是缬氨酸残基，相当该位置的氨基酸残基，通过使用上述方法可以特定为例如在蛋白酶KP9860中134位的缬氨酸残基。

(4)序列号1的135位的氨基酸残基是天冬酰胺残基，相当该位置的氨基酸残基，通过使用上述方法可以特定为例如在蛋白酶SD521中134位的天冬酰胺残基。

相当于蛋白酶KP43的氨基酸序列的(1)132位、(2)133位、(3)134位、(4)135位的位置及氨基酸残基的具体例子在上述例示的蛋白酶KP9860，蛋白酶E-1，蛋白酶Ya，蛋白酶SD521，蛋白酶A-1，蛋白酶A-2，蛋白酶9865中表示(表1)。

表1

本发明的碱性蛋白酶是突变体时，作为实施突变前的碱性蛋白酶(有时称为亲碱性蛋白酶)，作为符合以“具有序列号1表示的氨基酸序列的蛋白酶”或上述的“与其功能等价的碱性蛋白酶”表示的蛋白酶，通过在此上实施目的部位的突变可以得到本发明的碱性蛋白酶。

例如，对以蛋白酶KP43的序列号1表示的氨基酸序列，可以进行上述以6)～16)表示的氨基酸残基的取代和/或插入，或对与其功能等价的碱性蛋白酶的氨基酸序列中的相当该位置的位置的氨基酸残基，可以进行同样的取代和/或插入而得到。

本发明碱性蛋白酶，可以由例如以下的方法得到。即，对编码无性繁殖的亲碱性蛋白酶的基因(序列编号2)实施突变，使用得到的突变基因转化适当的宿主，培养该转换的宿主，从培养物中采取得到。编码亲碱性蛋白酶的基因的无性繁殖，可以使用通常的基因重组技术，例如可以根据WO99/18218、WO98/56927记载的方法进行。

作为编码亲碱性蛋白酶基因的突变方法，可以采用通常进行的位点专一的突变方法的任意一种。更具体地，可以使用例如Site-DirectedMutagenesis System Mutan-Super Express Km成套工具(kit)(TaKaRa)等进行。另外，通过使用PCR(polymerase chain reaction)法(PCRprotocols，Academic Press，New York，1990)，可以将基因的任意序列与相当于其它基因的该任意序列的序列取代。

作为使用得到的突变基因的本发明蛋白酶的生产方法，可以采用例如将该突变基因连接在可稳定放大的DNA媒介物上转化宿主菌的方法，或将该突变基因导入可稳定维持的宿主菌的染色体DNA上等的方法。作为满足该条件的宿主，例如，可举出杆菌属细菌，大肠菌，霉，酶，放线菌等，使用这些菌株，可以在含有可同化性的碳源，氮源及其它必须营养成分的培养基接种，用常规方法培养。

这样得到的本发明的碱性蛋白酶，具有耐氧化性，不受高浓度脂肪酸引起的酪蛋白分解活性的阻碍，由SDS-PAGE确认的分子量是43,000±2,000，在碱性区域具有活性的同时，与亲碱性蛋白酶相比，是可以确认新获得了比活性提高和/或洗净能力提高的性质。

因此，本发明的碱性蛋白酶，作为各种洗涤剂组合物配合用酶有用。

洗净剂组合物中配合的本发明品蛋白酶的配合量，只要是碱性蛋白酶表示活性的量就没有特别限制，对每1kg洗净剂组合物，可以配合O.1～5000PU，但考虑到经济性等，优选500PU以下。

本发明的洗净剂组合物，在本发明品蛋白酶以外，也可以并用各种酶。例如，加水分解酶，氧化酶，还原酶，转移酶，裂解酶，异构酶，连接酶，合成酶等。其中，优选本发明以外的蛋白酶，纤维素酶，角蛋白酶，酯酶，角质酶，淀粉酶，脂肪酶，支链淀粉酶，果胶酶，甘露聚糖酶，糖苷酶，聚糖酶，胆固醇氧化酶，过氧化物酶，漆酶等，特别优选蛋白酶，纤维素酶，淀粉酶，脂肪酶。作为蛋白酶，可以列举市售的Alcalase，Esperase、Savinase、Everlase、Kannase(注册商标；Novozymes社生产)，Properase，Purafect(注册商标；Genencor生产)，及KAP(花王生产)等。作为纤维素酶，可以列举Celluzyme，Carezyme(注册商标；Novozyme社生产)，另外有KAC，特开平10-313859号公报记载的杆菌sp KSM-S237株生产的碱性纤维素酶，特开2003-313592号公报记载的突变碱性纤维素酶(以上均为花王生产)等。作为淀粉酶，可以列举Termamyl，Duramyl，Stainzyme(注册商标；Novozymes社生产)，Purastar(注册商标；Genencor生产)，KAM(花王)等。作为脂肪酶，可以列举Lipolase、Lipolase Ultra，Lipex(注册商标；Novozymes社生产)等。

洗净剂组合物中，并用本发明品蛋白酶以外的蛋白酶时的配合量，优选每1kg洗净剂组合物0.1～500PU。并用纤维素酶时，基于特开平10-313859号公报的〔0020〕段落中记载的酶活性测定方法决定的单位(KU)，优选每1kg洗净剂组合物300～3000000KU。

另外，并用淀粉酶时，基于特开平11-43690号公报的〔0040〕段落中记载的淀粉酶活性测定方法决定的单位(IU)，优选每1kg洗净剂组合物50～500000IU。

并用脂肪酶时，基于特表平8-500013号公报的实施例1中记载的脂肪酶活性测定方法决定的单位(LU)，优选每1kg洗净剂组合物10000～1000000LU。

本发明的洗净剂组合物中，可以配合公知的洗净剂成分，作为该公知的洗净剂成分，可以列举例如以下物质。

(1)表面活性剂

在洗净剂组合物中，表面活性剂配合0.5～60质量％，特别在粉末状洗净剂组合物中优选配合10～45质量％，在液体洗净剂组合物中优选配合20～50质量％。另外，本发明洗净剂组合物是漂白剂或自动洗碗机用洗净剂时，表面活性剂一般是1～10质量％，优选配合1～5质量％。

作为本发明洗净剂组合物中可以使用的表面活性剂，可以列举阴离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂，两性表面活性剂，阳离子型表面活性剂的1种或组合，优选的是阴离子型表面活性剂，非离子型表面活性剂。

作为阴离子型表面活性剂，优选碳原子数10～18的醇的硫酸酯盐，碳原子数8～20的醇的烷氧基化物的硫酸酯盐，烷基苯磺酸盐，链烷烃磺酸盐，α-链烯烃磺酸盐，α-磺基脂肪酸盐，α-磺基脂肪酸烷基酯盐或脂肪酸盐。本发明中特别优选烷基链的碳原子数10～14的，更优选12～14的直链烷基苯磺酸盐，作为相对离子，优选碱金属盐与胺类，特别优选钠和/或钾，一乙醇胺，二乙醇胺。

作为非离子表面活性剂，优选聚氧化烯烷基(碳原子数8～20)醚，烷基多葡糖苷，聚氧化烯烷基(碳原子数8～20)苯基醚，聚氧化烯山梨糖醇酐脂肪酸(碳原子数8～22)酯，聚亚氧烷基二醇脂肪酸(碳原子数8～22)酯，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物。作为非离子型表面活性剂，特别优选碳原子数10～18的醇上加成4～20摩尔〔HLB值(以Griffin法算出)成为10.5～15.0，优选11.0～14.5〕环氧乙烷与环氧丙烷等烯化氧的聚氧化烯烷基醚。

(2)二价金属离子清除剂(scavenger)

二价金属离子清除剂以0.01～50质量％，优选以5～40质量％配合。作为在本发明洗净剂组合物中可以使用的二价金属离子清除剂，可以列举三聚磷酸盐，焦磷酸盐，正磷酸盐等的缩合磷酸盐，沸石等的铝硅酸盐，合成层状结晶性硅酸盐，氮川三乙酸盐，乙二胺四乙酸盐，柠檬酸盐，异柠檬酸盐，聚缩醛羧酸盐等。其中，特别优选结晶性铝硅酸盐(合成沸石)，A型，X型，P型沸石中，特别优选A型。合成沸石，优选使用平均一次粒径为0.1～10μm的，特别优选使用0.1～5μm的。

(3)碱剂

碱剂以0.01～80质量％，优选以1～40质量％配合。粉末洗净剂时，可以列举重灰与轻灰总称为碳酸钠等的碱金属碳酸盐，以及JIS1号、2号、3号等的非结晶的碱金属硅酸盐。这些无机性的碱剂在洗净剂干燥时，在粒子骨架的形成中有效果，可以得到比较硬的，流动性优异的洗净剂。作为此外的碱，可以列举倍半碳酸钠，碳酸氢钠等，另外，三聚磷酸盐等的磷酸盐也可以作为碱剂使用。此外，作为在液体洗净剂中使用的碱剂，除上述碱剂外，其它的可以使用氢氧化钠，以及一，二或三乙醇胺，也可以作为活性剂的相对离子使用。

(4)防止再污染剂

防止再污染剂以0.001～10质量％，优选以1～5质量％配合。作为本发明洗净剂组合物可以使用的防止再污染剂，可以列举聚乙二醇，羧酸类聚合物，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮等。其中，羧酸类聚合物，除防止再污染能力之外，还具有捕捉金属离子的功能，使固体粒子污垢从衣料分散到洗涤溶液中的作用。羧酸类聚合物是丙烯酸，甲基丙烯酸，衣康酸等的均聚物及共聚物，作为共聚物优选上述单体与马来酸的共聚物，分子量优选数千～10万。除上述羧酸类聚合物以外，从具有金属离子捕捉剂、分散剂以及防止再污染能力方面考虑，优选聚缩水甘油酸盐等的聚合物，羧甲基纤维素等的纤维素衍生物以及聚天冬酰胺酸等的氨基羧酸类的聚合物。

(5)漂白剂

优选配合例如过氧化氢、过碳酸盐等的漂白剂1～10质量％。使用漂白剂时，可以配合0.01～10质量％的四乙酰基乙二胺(TAED)和特开平6-316700号公报记载等的漂白活性化剂(活化剂)。

(6)荧光剂

作为在本发明洗净剂组合物中可以使用的荧光剂，可以列举苯基型荧光剂(例如Tinopal CBS-X等)和二苯乙烯型荧光剂(例如DM型荧光染料等)。荧光剂优选配合0.001～2质量％。

(7)其它成分

本发明品洗净剂组合物中，可以含有衣料用洗净剂领域公知的增效剂、柔软剂、还原剂(亚硫酸盐等)、抑制泡沫用剂(硅氧烷等)，香料，其它的添加剂。

本发明的洗净剂组合物，可以组合以上述方法得到的本发明品蛋白酶及上述公知的洗净剂成分，根据常法制造。洗净剂的形态可以根据用途选择，例如可以制成液体，粉体，颗粒，膏状，固体等。

这样得到的本洗净剂组合物，可以作为衣料洗净剂、漂白剂、硬质表面洗净用洗净剂、排水管洗净剂、假牙洗净剂、医疗器具用的杀菌洗净剂等使用。

实施例

实施例1

从氨基酸序列的排列结果(图1)，对含有直到来自杆菌spKSM-KP43株的碱性蛋白酶结构基因的终止密码子的约2.0kb(序列号2)，导入位点专一的突变氨基酸残基，特定在63位、101位、133位，以导入任意氨基酸的方式设计引物。63位的突变导入中，使用引物1(序列号3)、引物2(序列号4)与引物3(序列号5)、引物4(序列号6)进行PCR；101位的突变导入中，使用引物1与引物5(序列号7)与引物6(序列号8)及引物4进行PCR；133位的突变导入中，使用引物1、引物7(序列号9)与引物8(序列号10)、引物4进行PCR。在引物1中，在读出有义链的5’末端一侧附有BamHI接头，在引物4中，在反义链的5’末端一侧附有XbaI接头，在引物2与引物3、引物5与引物6、引物7与引物8，分别从5’末端以10～15bp的长度设计成互补状。作为PCR的DNA聚合酶，使用Pyrobest(TakaRa)，PCR的条件，在94℃，使模型DNA变性2分钟后，使以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟为1循环，反应30个循环。在PCR productpurification kit(Roche)中精制放大DNA断片后，分别只以对应的放大断片，在94℃使DNA变性2分钟后，使以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟为1循环，反应30个循环，进行重组(recombinate)PCR。对得到的放大断片，由引物1与引物4进行PCR。94℃使模型DNA变性2分钟后，以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟为1个循环，反应30个循环，得到导入突变的全长基因。精制放大断片后，通过BamHI、XbaI(Roche)切割在末端附着的限制酶接头。与预先以BamHI、XbaI处理放大DNA断片的质粒pHA64(专利第349293号：在启动子64的下流具有BamHI、XbaI切割部位)混合后，由Ligation High(东洋纺)进行连接酶反应。使用从反应液由醇沉淀回收的质粒，转化宿主菌杆菌sp KSM9865株(FERM P-18566)。

使9865株的转化体在含有脱脂乳(skim milk)的碱琼脂培养基[脱脂乳(Difco)1％(w/v)，细菌用胰化胨(bactotryptone)(Difco)1％，酶提取物(Difco)0.5％，氯化钠1％，琼脂1.5％，碳酸钠0.05％，四环素15ppm]中培育，由晕(halo)的形成状况，判断有无导入突变的蛋白酶基因。转化体在5mL的种母培养基[6.0％(w/v)聚蛋白胨S，0.05％酶提取液，1.0％麦芽糖，0.02％硫酸镁七水合物，0.1％磷酸二氢钾，0.25％碳酸钠，30ppm四环素]中植菌，30℃，进行16小时的摇床培养。接着，在30mL的主培养基[8％聚蛋白胨S，0.3％酶提取液，10％麦芽糖，0.04％硫酸镁七水合物，0.2％磷酸二氢钾，1.5％无水碳酸钠，30ppm四环素]中将1％(v/v)种母培养液植菌，30℃，进行3日的摇床培养。

离心分离得到的培养液，测定培养上清液中的蛋白酶活性。蛋白酶活性由以Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA(以下，AAPF：∑)为基质的活性测定法测定，蛋白质量使用蛋白质化验组合(和光纯药)测定。通过与以相同条件培养具有野生型酶基因的转化体时的培养上清的值比较，选出可以确认蛋白酶活性提高的突变蛋白酶基因。

使用High pure plasmid isolation kit(Roche)，从选出的转化体中回收质粒，确定碱基序列。以质粒DNA300ng为模型，使用适当合成的引物与Big Dye DNA sequencing kit(Applied Biosystem)，在20μL的反应系统进行PCR，供给使用DNA Sequencer 377型(Applied Biosystem)的解析。

其结果，蛋白酶活性提高的突变体133位的丙氨酸是谷氨酰胺、天冬酰胺、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸。稀释该培养液的一部分，以含有2mM氯化钙的10mM盐酸缓冲液(pH7.5)增加平衡化的DEAE-Toyopearl(Tosoh Corporation)柱，回收非吸附成分，得到几乎均匀的蛋白酶。测定精制酶的蛋白质量、AAPF分解活性的结果，确认由于导入上述突变，比活性分别提高1.2倍～2倍(表2)。

表2

突变导入部位排列	蛋白酶相对活性(％)
		野生型	100
^*A133Q	121.7
		A133N	136.8
A133T	139.9
		A133V	153.9
A133I	160.2
		A133L	197.0
A133K	217.0

氨基酸以数字1表示，以数值表示取代氨基酸的部位。数值前表示取代前的氨基酸，数值后表示取代后的氨基酸。例如，A133Q，表示133位的丙氨酸取代为谷氨酰胺的突变体。以下，表3以及图2-1～2-6中表示相同的含义。

接着，为了提供133位的突变的多样性导入以下的突变：

(1)在133位与134位之间插入任意的1个氨基酸；

(2)将133位取代为任意的氨基酸，再插入任意的1个氨基酸；

(3)将133位取代为任意的氨基酸，再插入任意的1个氨基酸，将134位取代为任意的氨基酸；

(4)将133位取代为任意的氨基酸，再插入任意的1个氨基酸，将134位与135位取代为任意的氨基酸；

(5)将132位取代为任意的氨基酸，在133位与134位之间再插入任意的1个氨基酸；

(6)将132位与133位取代为任意的氨基酸，再插入任意的1个氨基酸；

在(1)的突变导入中使用引物1、引物7与引物9(序列号11)、引物4；在(2)的突变导入中使用引物1、引物7与引物10(序列号12)、引物4；在(3)的突变导入中使用引物1、引物7与引物11(序列号13)、引物4；在(4)的突变导入中使用引物1、引物7与引物12(序列号14)、引物4；在(5)的突变导入中使用引物1、引物13(序列号15)及引物14(序列号16)、引物4；在(6)的突变导入中引物1、引物7及引物15(序列号17)、引物4，通过上述那样的重组PCR，得到突变导入组成的基因。结合上述pHA64后，通过转化9865株，进行培养并由此进行突变体的评价。

其结果，确认在以下的突变体中超过野生型的蛋白酶活性的提高。

从(1)的突变导入，133位与134位之间的插入氨基酸残基：赖氨酸、酪氨酸；

从(2)的突变导入，133位+插入氨基酸残基：脯氨酸+异亮氨酸、亮氨酸+丝氨酸、亮氨酸+甘氨酸、亮氨酸+苏氨酸、丝氨酸+丝氨酸、赖氨酸+丝氨酸、异亮氨酸+丝氨酸、精氨酸+丝氨酸、赖氨酸+丙氨酸、赖氨酸+甘氨酸；

从(3)的突变导入，133位+插入氨基酸残基/134位：丝氨酸+丝氨酸/苏氨酸、丝氨酸+丝氨酸/丝氨酸、丝氨酸+丝氨酸/甘氨酸、丝氨酸+丝氨酸/丙氨酸；

从(4)的突变导入，133位+插入氨基酸残基/134位/135位：丝氨酸+丝氨酸/丝氨酸/丙氨酸、丝氨酸+丝氨酸/丝氨酸/精氨酸、丝氨酸+丝氨酸/丝氨酸/蛋氨酸；

从(5)的突变导入，132位/133位与134位之间插入氨基酸残基：丝氨酸/丙氨酸、丝氨酸/甘氨酸、蛋氨酸/丙氨酸、苏氨酸/丙氨酸；

从(6)的突变导入，132位/133位+插入氨基酸残基：丝氨酸/丝氨酸+丝氨酸、谷氨酰胺/丝氨酸+丝氨酸、蛋氨酸/丝氨酸+丝氨酸、丝氨酸/异亮氨酸+丙氨酸、丝氨酸/赖氨酸+丙氨酸、丝氨酸/赖氨酸+丝氨酸、天冬酰胺/脯氨酸+丙氨酸、天冬酰胺酸/赖氨酸+丝氨酸、异亮氨酸/赖氨酸+丝氨酸。

在上述的方法中，求得比活性的结果，确认在这些突变体中，提高野生型的1.2倍～4.8倍的比活性(表3)。

表3

	蛋白酶相对比活性(％)
		野生型	100
^*A133P+I	156.3
		A133L+T	198.9
A133L+S	243.3
		A133L+G	263.7
A133S+S	122.4
		+K	141.4
+Y	138.5
		A133K+S	125.2
A133I+S	167.8
		A133R+S	142.0
A133K+A	142.8
		A133K+G	135.3
A133S+S/V134G	125.0
		A133S+S/V134T	173.3
A133S+S/V134A	207.2
		A133S+S/V134S	216.2
A133S+S/V134S/N135A	190.7
		A133S+S/V134S/N135R	221.2
A133S+S/V134S/N135M	231.5
		A132Q/A133S+S	153.9
A132S/A133S+S	134.1
		A132M/A133S+S	224.3
A132S/A133I+A	263.7
		A132S/+A	126.4
A132S/+G	141.6
		A132S/A133K+A	171.8
A132S/A133K+S	179.2

A132N/A133P+A	486.4
		A132M/+A	253.2
A132T/+A	132.8
		A132D/A133K+S	148.2
A132I/A133K+S	228.0

以+表示133位与134位之间插入的氨基酸。例如，A133P+I时，表示将133位取代为脯氨酸，再插入异亮氨酸的突变体，+K时，表示133位与134位之间有插入赖氨酸的突变体。在图2-1～2-6表示同样的含义。

评价突变体洗净能力的结果，确认例如在以下的突变体中有超过野生型的洗净性能(图2-1～2-6)。

(1)132位：异亮氨酸、缬氨酸；

(2)133位与134位之间插入氨基酸残基：赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸、精氨酸；

(3)133位+插入氨基酸残基：丝氨酸+丝氨酸、丝氨酸+丙氨酸、丝氨酸+天冬酰胺、丝氨酸+谷氨酰胺、丝氨酸+色氨酸、丝氨酸+组氨酸、丝氨酸+甘氨酸、亮氨酸+丝氨酸、赖氨酸+丝氨酸、苏氨酸+丝氨酸、异亮氨酸+丝氨酸、蛋氨酸+丝氨酸、甘氨酸+丝氨酸、精氨酸+丝氨酸、谷氨酸+丝氨酸、天冬酰胺+丝氨酸、苯基丙氨酸+丝氨酸、色氨酸+丝氨酸、赖氨酸+丙氨酸、精氨酸+丙氨酸、赖氨酸+甘氨酸；

(4)133位+插入氨基酸残基/134位：丝氨酸+丝氨酸/丝氨酸、丝氨酸+丝氨酸/苏氨酸；

(5)133位+插入氨基酸残基/134位/135位：丝氨酸+丝氨酸/丝氨酸/蛋氨酸；

(6)132位/133位与134位之间插入的氨基酸残基：丝氨酸/丙氨酸、丝氨酸/精氨酸、丝氨酸/甘氨酸、丝氨酸/亮氨酸、苏氨酸/丙氨酸；

(7)132位/133位+插入氨基酸残基：丝氨酸/组氨酸+丙氨酸、丝氨酸/丝氨酸+丙氨酸、丝氨酸/亮氨酸+丙氨酸、丝氨酸/精氨酸+丙氨酸、丝氨酸/赖氨酸+丙氨酸、丝氨酸/赖氨酸+丝氨酸、天冬酰胺/异亮氨酸+丙氨酸、天冬酰胺/脯氨酸+丙氨酸、天冬酰胺酸/赖氨酸+丝氨酸。

另外，测定在2mM氯化钙水溶液中，75℃，热处理10分钟后的AAPF的分解活性，算出以未处理的酶样品作为100％时的残存活性，研究其耐热性。其结果，相对于野生型的残存活性50％，133位+插入氨基酸残基的组合丝氨酸+丝氨酸的突变体是76％，可以确认有约1.5倍的残存活性的提高。

上述本发明碱性蛋白酶突变体使相对AAPF的分解活性提高，洗净能力提高(133位+插入氨基酸残基的组合为丝氨酸+丝氨酸的突变体，使耐热性进一步提高)以外，亲碱性蛋白酶的特性，即，具有耐氧化性，由高浓度脂肪酸引起的酪蛋白分解活性不受阻碍，由SDS-PAGE确认的分子量为43,000±2,000，确认在碱性区域，保持着具有活性的性质。

试验例1：蛋白酶活性测定法(合成基质法)

加入100mM AAPF(溶解在DMSO中：最终浓度3mM)、0.2M硼酸缓冲液(pH10.5，最终浓度50mM)及50μL适当稀释的培养上清液，配制到100μL后，一边微量培养板(microplate)(iEMS Reader MF；Labsystems社制)，30℃摇床15分钟，一边定时地测定414nm的吸光度，求出每单位时间的吸光度的变化(OD414/min)。得到的斜率乘以酶的稀释率的值作为蛋白酶的效价，进行突变体的相对评价。

试验例2：蛋白酶活性测定法(酪蛋白法)

30℃，5分钟恒温1mL含有1％(w/v)酪蛋白(Hammerstein法：Merck)的50mM硼酸缓冲液(pH10.5)后，添加0.1mL的酶液，开始反应。反应15分钟后，加入2mL的反应停止液(0.11M三氯乙酸/0.22M乙酸钠/0.33M乙酸)。在室温放置30分钟，用Whatman.No1滤纸过滤沉淀物。分解产物由Lowry等的方法定量。即，在0.5mL的滤液中加入2.5mL的碱性铜溶液(1％罗谢尔盐∶1％硫酸铜五水合物∶2％碳酸钠/0.1N氢氧化钠溶液＝1∶1∶100)，30℃恒温10分钟后，添加0.25mL的苯酚试剂[在去离子水中将市售的苯酚试剂(关东化学)稀释为2倍的溶液]，充分搅拌，30℃放置30分钟。此后，测定在660nm的吸光度。1单位(1PU)蛋白酶，为在上述反应条件下，1分钟内生成相当于1mmol酪氨酸的酸可溶性蛋白质所必须的酶量。

试验例3：相对洗净率

突变酶的洗净能力评价，使用Terg-O-Tometer(上岛制作所生产)进行。在将从市售的洗衣用洗净剂(Attack：花王，2002年10月制造)除去所配合的酶颗粒后配制为规定的使用浓度的溶液中，添加酶使其最终浓度40mPU/L。接着，添加将污染布EMPA117(EMPA社生产，血液/乳剂/碳)剪裁为6×6cm的布块，特别是在20℃进行不间断的洗净(80rpm)。通过自来水漂洗后，用色彩色差计(MINOLTA，CM3500d)测定亮度，从洗净前后的亮度变化，计算洗净率(下式)。

洗净率(％)＝(L2-L1)/(L0-L1)×100

L0：污染布的原来布的亮度

L1：洗净前的污染布的亮度

L2：洗净后的污染布的亮度

相对洗净率是将野生型酶的洗净率作为100时突变体的洗净率。

序列表

<110>花王株式会社

<120>碱性蛋白酶

<130>CGJPL51184

<150>日本2004-297023

<151>2004-10-08

<160>17

<170>Patentln Ver.3.1

<210>1

<211>434

<212>PRT

<213>杆菌sp.KSM-KP43

<400>1

Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser

1 5 10 15

Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly

20 25 30

Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp

50 55 60

Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly

65 70 75 80

Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser

85 90 95

Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln

100 105 110

Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn

115 120 125

Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn

130 135 140

Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala

145 150 155 160

Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala

165 170 175

Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe

180 185 190

Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg

195 200 205

Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly

210 215 220

Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe

225 230 235 240

Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met

245 250 255

Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe

260 265 270

Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala

275 280 285

Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn

290 295 300

Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr

305 310 315 320

Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser

325 330 335

Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser

340 345 350

Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu

355 360 365

Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp

370 375 380

Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu

385 390 395 400

Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val

405 410 415

Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile

420 425 430

Val Asn

<210>2

<211>1923

<212>DNA

<213>杆菌sp.KSM-KP43

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1920)

<223>

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(618)

<223>

<220>

<221>mat_peptide

<222>(619)..()

<223>

<400>2

atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca 45

Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala

-205 -200 -195

gcg att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt 90

Ala Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly

-190 -185 -180

gca agg aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act 135

Ala Arg Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr

-175 -170 -165

gat gct aaa ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct 180

Asp Ala Lys Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala

-160 -155 -150

ttt ctg gtg gaa tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag 225

Phe Leu Val Glu Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln

-145 -140 -135

aag aag ctt gaa aca gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc 270

Lys Lys Leu Glu Thr Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile

-130 -125 -120

caa ttc aat gga cca att tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa 315

Gln Phe Asn Gly Pro Ile Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu

-115 -110 -105

aaa aca ggg gca aag att ctc gac tac ata cct gat tat gct tac att 363

Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile

-100 -95 -90

gtc gag tat gag ggc gat gtt aag tca gca aca agc acc att gag cac 411

Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His

-85 -80 -75 -70

gtg gaa tcc gtg gag cct tat ttg ccg ata tac aga ata gat ccc cag 459

Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr Leu Pro Ile Tyr Arg lle Asp Pro Gln

-65 -60 -55

ctt ttc aca aaa ggg gca tca gag ctt gta aaa gca gtg gcg ctt gat 507

Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp

-50 -45 -40

aca aag cag aaa aat aaa gag gtg caa tta aga ggc atc gaa caa atc 555

Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile

-35 -30 -25

gca caa ttc gca ata agc aat gat gtg cta tat att acg gca aag cct 603

Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro

-20 -15 -10

gag tat aag gtg atg aat gat gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat 651

Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp

-5 -1 1 5 10

gtg gct cag agc agc tac ggg ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg 699

Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala

15 20 25

gtt gcc gat aca ggg ctt gat aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat 747

Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His

30 35 40

gaa gcc ttc cgc ggg aaa att act gca tta tat gca ttg gga cgg acg 795

Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr

45 50 55

aat aat gcc aat gat acg aat ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc 843

Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser

60 65 70 75

gta tta gga aac ggc tcc act aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat 891

Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn

80 85 90

cta gtc ttc caa tct atc atg gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta 939

Leu Val Phe Gln Ser Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu

95 100 105

cct tcg aat ctg caa acc tta ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc 987

Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala

110 115 120

aga att cat aca aac tcc tgg gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca 1035

Arg Ile His Thr Asn Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr

125 130 135

aca gat tcc aga aat gtg gat gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg 1083

Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr

140 145 150 155

atc ctt ttc gct gcc ggg aat gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt 1131

Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser

160 165 170

gca cca ggc aca gct aaa aat gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac 1179

Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn

175 180 185

ctc cgc cca agc ttt ggg tct tat gcg gac aat atc aac cat gtg gca 1227

Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala

190 195 200

cag ttc tct tca cgt gga ccg aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat 1275

Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp

205 210 215

gtc atg gca ccg gga acg ttc ata cta tca gca aga tct tct ctt gca 1323

Val Met Ala Pro Gly Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala

220 225 230 235

ccg gat tcc tcc ttc tgg gcg aac cat gac agt aaa tat gca tac atg 1371

Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met

240 245 250

ggt gga acg tcc atg gct aca ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag 1419

Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln

255 260 265

ctt cgt gag cat ttt gtg aaa aac aga ggc atc aca cca aag cct tct 1467

Leu Arg Glu His Phe Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser

270 275 280

cta tta aaa gcg gca ctg att gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc 1515

Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly

285 290 295

tac ccg aac ggt aac caa gga tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc 1563

Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser

300 305 310 315

ctg aac gtt gcc tat gtg aac gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa 1611

Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln

320 325 330

aaa gcg acg tac tcg ttt act gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc 1659

Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile

335 340 345

tcc ctg gta tgg tct gat gcc cct gcg agc aca act gct tcc gta acg 1707

Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr

350 355 360

ctt gtc aat gat ctg gac ctt gtc att acc gct cca aat ggc aca cag 1755

Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln

365 370 375

tat gta gga aat gac ttt act tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc 1803

Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly

380 385 390 395

cgc aat aac gta gaa aat gta ttt att aat gca cca caa agc ggg acg 1851

Arg Asn Asn Val Glu Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr

400 405 410

tat aca att gag gta cag gct tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc 1899

Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr

415 420 425

ttc tcg ttg gca att gtg aat taa 1923

Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn

430

<210>3

<211>47

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<222>低聚核苷酸作为从杆菌sp.KSM-KP43碱性蛋白酶基因的核苷序列设计的PCR正义引物

<400>3

aaatggatcc gtgaggaggg aaccgaatga gaaagaagaa aaaggtg 47

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>低聚核苷酸作为从杆菌sp.KSM-KP43碱性蛋白酶基因的核苷序列设计的PCR反义引物

<400>4

attattcgtc cgtcccaatg c 21

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<223>低聚核苷酸作为从杆菌sp.KSM-KP43碱性蛋白酶基因的核苷序列设计的PCR正义引物

<400>5

ggacgaataa tgccnnngat ccgaatggtc atgg 34

<210>6

<211>36

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>6

atattctaga cgattaccat attaattcct ctaccc 36

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>7

ctatccatga tagattggaa g 21

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>8

tctatcatgg atagcnnngg gggacttgga ggactacc 38

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>9

gctccccagg agtttgtatg 20

<210>10

<211>37

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>10

caaactcctg gggagcannn gtgaatgggg cttacac 37

<210>11

<211>40

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>11

caaactcctg gggagcagca nnngtgaatg gggcttacac 40

<210>12

<211>40

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>12

caaactcctg gggagcannn nnngtgaatg gggcttacac 40

<210>13

<211>40

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>13

caaactcctg gggagcannn nnnnnnaatg gggcttacac 40

<210>14

<211>43

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>14

caaactcctg gggagcannn nnnnnnnnng gggcttacac aac 43

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>15

tccccaggag tttgtatgaa ttc 23

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>16

caaactcctg gggannngca nnngtgaatg gggcttacac 40

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人造序列

<220>

<400>17

caaactcctg gggannnnnn nnngtgaatg gggcttacac 40

Claims

1.一种碱性蛋白酶，其特征在于，

该碱性蛋白酶是对序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶进行选自下述(a)～(e)的一种以上的氨基酸残基的取代和/或插入后而形成的碱性蛋白酶，并且该碱性蛋白酶与具有序列号1表示的氨基酸序列的碱性蛋白酶相比具有更高的比活性和/或洗净性：

(a)将133位的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；

(b)在133位与134位的氨基酸残基之间插入其它氨基酸残基；

(c)将在进行所述(b)的插入其它氨基酸残基之前的134位的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；

(d)将在进行所述(b)的插入其它氨基酸残基之前的135位的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；

(e)将132位的氨基酸残基取代为其它氨基酸残基；

氨基酸残基的取代和/或插入如下述6)～16)所示：

6)(a)表示的氨基酸残基的取代，其它的氨基酸残基是赖氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；

7)(b)表示的氨基酸残基的插入，其它的氨基酸残基是赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸或精氨酸；

8)(a)表示的氨基酸残基的取代与(b)表示的氨基酸残基的插入的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)脯氨酸/(b)异亮氨酸、(a)亮氨酸/(b)丝氨酸、(a)亮氨酸/(b)甘氨酸、(a)亮氨酸/(b)苏氨酸、(a)丝氨酸/(b)丙氨酸、(a)丝氨酸/(b)天冬酰胺、(a)丝氨酸/(b)谷氨酰胺、(a)丝氨酸/(b)色氨酸、(a)丝氨酸/(b)组氨酸、(a)丝氨酸/(b)甘氨酸、(a)赖氨酸/(b)丝氨酸、(a)苏氨酸/(b)丝氨酸、(a)异亮氨酸/(b)丝氨酸、(a)蛋氨酸/(b)丝氨酸、(a)甘氨酸/(b)丝氨酸、(a)精氨酸/(b)丝氨酸、(a)谷氨酸/(b)丝氨酸、(a)天冬酰胺/(b)丝氨酸、(a)苯基丙氨酸/(b)丝氨酸、(a)色氨酸/(b)丝氨酸、(a)赖氨酸/(b)丙氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸、(a)赖氨酸/(b)甘氨酸或(a)丝氨酸/(b)丝氨酸；

9)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入和(c)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸或丙氨酸；

10)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入，(c)表示的氨基酸残基的取代和(d)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)丝氨酸/(d)丙氨酸、(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)丝氨酸/(d)精氨酸或(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(c)丝氨酸/(d)蛋氨酸；

11)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(e)丝氨酸、(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(e)谷氨酰胺或(a)丝氨酸/(b)丝氨酸/(e)蛋氨酸；

12)(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(b)丙氨酸、精氨酸、甘氨酸或亮氨酸/(e)丝氨酸；

13)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)异亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)组氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)丝氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)精氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)赖氨酸/(b)丙氨酸/(e)丝氨酸、(a)赖氨酸/(b)丝氨酸/(e)丝氨酸；

14)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)异亮氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺或(a)脯氨酸/(b)丙氨酸/(e)天冬酰胺；

15)(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(b)丙氨酸/(e)蛋氨酸或苏氨酸；

16)(a)表示的氨基酸残基的取代，(b)表示的氨基酸残基的插入和(e)表示的氨基酸残基的取代的组合，被取代及插入的其它氨基酸残基分别是(a)赖氨酸/(b)丝氨酸/(e)天冬酰胺或异亮氨酸。

2.一种编码权利要求1所述的碱性蛋白酶的基因。

3.一种含有权利要求2所述的基因的重组载体。

4.一种导入权利要求3所述的载体的转化体，其特征在于，宿主是微生物。

5.一种含有权利要求1所述的碱性蛋白酶的洗净剂组合物。