CN1676531A - 一种含（Arg) 9肽段的基于假单胞菌外毒素的重组免疫毒素 - Google Patents

Abstract

本发明属于一种抗癌胚抗原的重组免疫毒素。具体地讲，涉及一种含9个精氨酸肽段(Arg) ₉的基于假单胞菌外毒素的抗癌胚抗原的重组免疫毒素，编码连接外毒素和抗癌胚抗原连接肽的核苷酸序列，含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞以及在制备治疗肿瘤药物中的应用。

Description

一种含(Arg)9肽段的基于假单胞菌外毒素的重组免疫毒素

技术领域

本发明属于一种抗癌胚抗原的重组免疫毒素。具体地讲，涉及一种含9个精氨酸肽段(Arg)₉的基于假单胞菌外毒素的抗癌胚抗原的重组免疫毒素，编码连接外毒素和抗癌胚抗原连接肽的核苷酸序列，含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞以及在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

某些细菌和植物产生的毒素与生长因子、抗体或其它具靶向细胞作用的分子相连可用于选择性杀死携带相应受体或抗原的靶细胞(Pastan等，1986；Vitetta等，1987；)。在这一类毒素中假单胞菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A，PE)是一种具有极高活性的单体蛋白，以PE为基础构建的免疫毒素具有诱人的应用前景。用以构建免疫毒素的PE分子有多种形式，包括PE40、PE38、PE37、PE35及相应的C末端为KDEL的改良形式(pastan等，1997)。免疫毒素发挥细胞杀伤作用的先决条件是免疫毒素的内化作用(internalization)。某些抗体由于不能有效地引发抗体抗原结合后的受体介导的内吞作用(receptor-mediatedendocytosis)，因此构建的免疫毒素活性不高，或者甚至不能作为免疫毒素的候选抗体，从而使免疫毒素的应用范围受到一定的限制(Matthew等，2000)。

PE是一个由绿脓杆菌(Pseudomonas areuginosa)分泌的由613个氨基酸组成的单链分子，由三个结构域Domain I、Domain II、Domain III组成，其中Domain I分为a、b两部分。Ia(1-252)为结合结构域，与真核细胞表面的α2巨球蛋白受体特异性结合；II(253-364)为转位结构域，在毒素跨越内质网膜进入胞质的过程中发挥作用；III(400-613)为催化结构域，包含ADP核糖基化酶，在NAD⁺的共同作用下导致真核细胞内的延伸因子2(EF2)核糖基化而失活，引起细胞内蛋白合成的抑制，促发细胞凋亡的发生，从而导致细胞的死亡。Ib(365-399)将II和III两个结构域分隔开来，功能不明。PE分子的C末端609-613的5个氨基酸REDLK是PE分子进入细胞后与高尔基体中的KDEL受体结合必需的序列，使PE能有效地由高尔基体反相进入内质网(Hwang等，1987；Allured等，1986)。PE38是将PE分子的Ia和Ib中365-380氨基酸去掉后的一种截短形式。PE38KDEL是在PE38的基础上将天然PE分子C末端的REDLK序列改为KDEL序列，从而使PE分子更有效地与KDEL受体结合，从而提高其生物学活性(Brinkmann等，1991)。PE35/KDEL是在PE38/KDEL的基础上将253~279和365~380的氨基酸序列截去，去掉了毒素中的二硫键，使得毒素在进入细胞后不用经过胞内蛋白酶解的作用而直接发挥催化活性，使活性提高(Mansfield等，1996)(图1.A)。

免疫毒素发挥杀伤靶细胞生物作用的先决条件是免疫毒素能有效而快速地进入细胞内，即免疫毒素的内化作用。通常免疫毒素的内化是由配体与受体结合后引起的受体介导的内吞作用引发的。抗体的内化受多种因素的影响：受体类型；结合表位；内化效率；内吞小体内药物的释放；抗原与抗体分离后有效的重新锚定于膜上。某些配体与受体的结合能有效地促进其内化，例如EGF受体，ErbB2受体，转铁蛋白(transferrin)受体等；某些抗原抗体的结合也能引发抗体的内化，但速率较慢，例如神经细胞黏附分子(NCAM)，前列腺特异性的膜抗原(PSMA)，癌胚抗原(CEA)以及粘蛋白等；而大多数的抗体抗原结合不能引发有效的抗体内化(Ulrik等，2000)。这就使免疫毒素的应用范围大大受到限制。目前较为成功地应用于临床的免疫毒素绝大多数集中在几类能快速有效内化的受体上。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是1965年Gold和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的。CEA属于非器官特异性肿瘤相关抗原，分泌CEA的肿瘤大多位于空腔脏器，如胃肠道、呼吸道、泌尿道等。因此，针对CEA的免疫毒素可用于对多种肿瘤的靶向治疗。然而由于CEA是一种内化速率缓慢的抗原，使得抗CEA免疫毒素的生物活性不能达到较高的水平，从而限制了它的临床应用。

某些蛋白包含某种使蛋白通过质膜而进入细胞内的活性转位亚单位。典型的例子就是HIV-1蛋白的基本结构域的Tat_48-67(RKKRRQRRR)氨基酸序列构成的亚单位(Lindgren等，2000；Jeang等，1999)。为了建立跨膜转运所需的优化的亚结构，开发能将各类分子运送到细胞内的传输分子，研究者们构建了一系列的Tat_48-67的类似分子。它们的跨膜转运功能已经在Jurkat细胞中得到了证实。通过对一系列类似分子的研究表明，Tat_48-67中带正电荷的氨基酸残基在跨膜运输中发挥主要作用。然而仅有电荷作用是不够的，同样是带正电荷的氨基酸残基，组氨酸、赖氨酸和鸟氨酸构成的肽段，其跨膜转运的效率大大低于Tat_48-67；相反，一种由9个L-型精氨酸残基构成的肽段(R9)的跨膜运输效率是Tat_48-67的20倍；由9个D-型精氨酸残基构成的肽段(r9)的跨膜运输效率是Tat_48-67的100倍以上(Wender等，2000)。这些研究表明Tat_48-67中的精氨酸残基组分在跨膜转运功能中发挥着比电荷作用和氨基酸主链结构更为重要的作用。因此，精氨酸丰富的肽段可用于将各类分子运输到细胞内部。

以上背景技术涉及有关的引文，其详细出处见本发明具体实施方案之后的参考文献。

发明内容

基于背景技术所述，大多数的抗体抗原结合不能引发有效的抗体内化。CEA是一种内化速率缓慢的抗原，使得抗CEA免疫毒素的生物活性不能达到较高的水平，从而限制了它的临床应用，这就使免疫毒素的应用范围大大受到限制。某些抗体由于不能有效地引发抗体抗原结合后的受体介导的内吞作用，因此构建的免疫毒素活性不高，或者甚至不能作为免疫毒素的候选抗体，从而也使免疫毒素的应用受到一定的限制。

针对目前存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种由抗CEA单链抗体与截短并改造的假单胞菌外毒素PE35/KDEL构成的，并在毒素的607位氨基酸与单链抗体之间加入不同连接肽，能将内化作用较弱的抗CEA免疫毒素快速而有效地运送到细胞内，显著提高其杀伤靶细胞作用的一种新型抗CEA免疫毒素。抗CEA的单链抗体片段基因是由文献报道(参考文献11)的抗CEA单克隆抗体的VH和VL部分氨基酸序列，以重复性连接肽(G₄S)₃连接，反向翻译成核苷酸序列，经本实验室合成、拼接而成。

本发明具体地提供了所述抗CEA单链抗体与毒素之间的连接肽的氨基酸序列和其编码该连接肽氨基酸的核苷酸序列。

连接肽氨基酸序列分别如下所示：

(Gly₄Ser)₂连接肽：Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser；(Arg)₉(Gly₄Ser)₂连接肽：Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly GlyGly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

所述的编码连接肽的核苷酸序列，不限于、但其中包括如下所示核苷酸序列：

编码(Gly₄Ser)₂连接肽的核苷酸序列：

GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGT GGT GGT AGC

编码(Arg)₉(Gly₄Ser)₂连接肽的核苷酸序列：

CGC CGC CGT CGT CGC CGC CGC CGC CGT GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGT GGTGGT AGC

本发明的另一个目的是提供一种含有如上所述的核苷酸序列的表达载体，它们分别是如图2所示的表达载体pCIT35g、pCIT35a。

本发明的另一个目的是提供一种含有如上所述的核苷酸序列的或pCIT35g或pCIT35a表达载体的宿主细胞。其中之一，宿主细胞选自大肠杆菌E coli。

本发明还有一个目的是提供一种用于治疗肿瘤的药物，其中之一，如上所述的抗CEA免疫毒素，或者说是提供一种按照本发明有关技术步骤，在制备治疗肿瘤药物的方法，该方法可以在制备治疗肿瘤相关抗原药物，如：鼻咽癌和结肠癌药物中应用。

另外，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它方面对本领域的普通技术人员来说是显而易见的。

本发明所涉及的以假单胞菌外毒素免疫毒素A(Pseudomonas exotoxinA，PE)的截短形式PE35为基础构建的重组免疫毒素，其PE35是PE的一种截短形式。在天然PE的基础上将结合结构域Domain Ia(1～252)以及转位结构域Domain II(253~364)中的253～279的氨基酸序列截去，去掉了毒素内的二硫键，使免疫毒素进入细胞后无需经过蛋白酶降解的过程，而直接以活性形式进入细胞内发挥作用。PE35/KDEL是将PE35的C末端氨基酸序列由REDLK突变为KDEL的形式，可提高毒素与高尔基体上的受体结合的效率，使毒素能更有效地反向进入到内质网，进而转运到胞质中发挥生物学作用(图1.A)。以PE35为基础构建的免疫毒素由于无需经过蛋白酶切的过程，使其活性较之相应的PE38免疫毒素大大提高。在PE35免疫毒素中，抗体分子通常是以化学耦(偶)联和基因重组两种形式与毒素相连的。对于用单链抗体(scFv)构建的免疫毒素多以基因重组的形式构建而成。PE35免疫毒素中，单链抗体基因通常位于毒素的607位氨基酸的下游，再紧接604～613位的氨基酸序列，这种形式的插入被证明不影响毒素功能的发挥(图1.B)。

用于构建免疫毒素的抗体分子大多在与相应的抗原或受体结合后引发快速而有效的受体介导的内吞作用(Receptor-mediatedendocytosis)，这也是免疫毒素发挥生物学功能的先决条件。对于大多数不能有效而快速内化的抗体来说，免疫毒素的活性就会大打折扣。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种内化速率比较缓慢的抗原。本发明构建的一种抗CEA PE35免疫毒素是在编码毒素的607位氨基酸的基因下游直接插入抗CEA单链抗体的基因片段，再紧接编码604～613位氨基酸序列的基因。这种形式的免疫毒素与相应的PE38免疫毒素相比，活性并无提高，且略有下降。原因主要是抗体序列位于毒素内部，抗原结合活性受到影响，内化作用降低，引起活性的下降。在抗体与毒素607位氨基酸之间加入连接肽(Gly₄Ser)₂后，抗体的结合活性得到改善，杀伤活性与PE38免疫毒素区别不大。说明抗CEA抗体与抗原结合后引发的内化作用不明显。

本发明所提供的一种以假单胞菌外毒素免疫毒素A(Pseudomonasexotoxin A，PE)的截短形式PE35为基础构建的重组免疫毒素，是在毒素的607位氨基酸与抗体序列之间插入(Arg)₉(Gly₄Ser)₂，既保持抗原结合活性和特异性不受影响，又显著提高了免疫毒素的内化效率，使免疫毒素的细胞杀伤活性显著提高，本发明与相应未经改造的PE35免疫毒素相比活性大大的提高，具有显著的技术进步。本发明可应用于自身不能有效内化的被认为不适合构建为免疫毒素的抗体，使免疫毒素的可应用范围大大提高，具有很好的实用性。

目前，国内外未见到有与本发明相同的报道。

附图说明

附图1.不同形式的PE和以PE为基础构建的抗CEA免疫毒素的结构示意图

1.A.假单胞菌外毒素及其截断改造形式的结构示意图

(a)PE；(b)PE38/KDEL；(c)PE35/KDEL

1.B.以PE38/KDEL和PE35/KDEL为基础构建的抗CEA免疫毒素的结构示意图

上：CEA(Fv)/PE38/KDEL；下：PE35/CEA(Fv)/KDEL

附图2.质粒pCIT35、pCIT35g、pCIT35a的结构示意图

附图3.表达产物的SDS-PAGE和western blotting分析

图3.A.表达产物的SDS-PAGE分析

A：PE35/GS/CEA(Fv)/KDEL；B：PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL

图3.B.表达产物包涵体洗涤的SDS-PAGE分析

a：蛋白分子量标准；b：表达产物超声上清；

c：表达产物超声沉淀；d：洗涤后的包涵体

图3.C.表达产物的western blotting分析

a：PE35/GS/CEA(Fv)/KDEL；b：PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL

c：预染蛋白分子量标准

附图4.流式细胞术测定细胞结合活性

附图5.不同形式的抗CEA免疫毒素内化的共聚焦显微图像

A：CEA(Fv)/PE38/KDEL  B：PE35/CEA(Fv)/KDEL

C：PE35/GS/CEA(Fv)/KDEL  D：PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL

附图6.不同作用时间及不同作用温度下PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL的内化效果的共聚焦显微图像；A：37℃0.5hr、B：37℃1h、C：37℃2h、

D：4℃2h左：FITC染色；中：PI染色；右：叠加图像

附图7.不同形式的抗CEA PE35免疫毒素对人鼻咽癌细胞CNE-2的杀伤作用

附图8.PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL对不同肿瘤细胞的杀伤作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

设计合成适当大小的核苷酸片段，通过重叠PCR扩增得到(Arg)₉(Gly₄Ser)₂的基因序列，并在末端引入适当酶切位点。将扩增产物经限制性内切酶消化后，插入经相应酶切后的PE35/CEA(Fv)/KDEL表达载体pCIT35中，构建含连接肽(Gly₄Ser)₂的免疫毒素PE35/GS/CEA(Fv)/KDEL的表达载体pCIT35g和含连接肽(Arg)₉(Gly₄Ser)₂的免疫毒素PE35/r9/CEA(Fv)/KDEL的表达载体pCIT35a。用构建好的表达载体pCIT35a和pCIT35g的质粒转化宿主细胞大肠杆菌菌株BL21(DE3)star。挑取阳性克隆菌转接到含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中，37℃培养至OD₅₅₀为0.5左右，向培养物中加入终浓度为0.4mmol/l的IPTG，诱导培养4小时。收集表达产物，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，上清和沉淀分别进行12％SDS-PAGE分析和western印迹分析。表达的包涵体经过洗涤过程，变性后经稀释和变性剂浓度梯度透析相结合的方法复性。产物进行生物学活性的鉴定，包括流式细胞术鉴定细胞表面抗原结合活性，间接免疫荧光共聚焦显微技术鉴定产物的内化性质，四唑盐(MTT)法鉴定细胞杀伤活性。具体操作流程如下：

实施例1、表达载体pCIT35的构建：

PE35KDEL是PE分子的一种截短和改造形式，它的基因片段是以PE38的基因(来自载体pMS8-38f+T，由NIH Brinkmann博士惠赠)为模板，设计如下引物：(1)Nde35：5’-gACATATgTgggAACAACTggAgCAgTgC-3’和

(2)EcoR：5’-CAggAATTCATATTCgATTgggCTg-3’扩增改造得到的。

在PE35KDEL的编码607位氨基酸的核苷酸序列位点之后用XhoI和SacI的酶切位点，插入抗CEA单链抗体的基因片段，得到PE35/CEA(Fv)KDEL的基因片段。pCIT35是在通用表达载体pET21a(+)(Novagen公司)的基础上将PE35/CEA(Fv)/KDEL的基因片段插入到NdeI，EcoRI双酶切位点中构建而成(图2.A)。

实施例2、表达载体pCIT35a的构建：

本表达载体在pCIT35的基础上将含有(Gly₄Ser)₂连接肽核苷酸序列的引物以pCIT35质粒为模板扩增出含(Gly₄Ser)₂且5’端含SacII，，3’端含XhoI的核苷酸片段，双酶切后插入经相同限制性内切酶消化的pCIT35载体中，构建成表达载体pCIT35g(图2.B)。将含有(Arg)₉(Gly₄Ser)₂连接肽核苷酸序列的引物以pCIT35质粒为模板扩增出含(Arg)₉(Gly₄Ser)₂且5’端含SacII，3’端含XhoI的核苷酸片段，双酶切后插入经相同限制性内切酶消化的pCIT35载体中，构建成表达载体pCIT35a(图2.C)。

设计合成4个寡核苷酸片段，

SacFor：5’-CAC CCgCggCACgCAgAACT-3’          20nts

GSArg1：5’- ACGACGGCGGCG ATCGAT

           CGGTTTGCCGGG-3’     48nts

GSArg2：5’-CCG CTCGAGGCTACCACCACCACCCGTGCCGCCGCC

           

-3’               54nts

GS：5’-CCG CTCGAGGCTACCACCACCACCCGTGCCGCCGCCGCCA

        ATCGATCGGTTTGCCGGG-3’   58nts

下划线标记酶切位点；阴影部分为重叠PCR中互补的核苷酸序列。

1.载体pCIT35质粒的提取

采取碱法小量提取质粒：挑取pCIT35转化大肠杆菌宿主菌TOP10后的阳性克隆的单菌落于5ml LB培养液(含Amp 100μg/ml)中37℃培养过夜，12000rpm离心1分钟收集菌体。沉淀悬于100μlSolutionI(50mmol/l Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l Tris pH8.0)中，充分混匀。加入200μl新配制的SolutionII(0.2mol/l NaOH，1％SDS)，盖紧管盖，轻柔的颠倒4-5次，将离心管至于冰浴中放置3分钟。加入150μl预冷的SolutionIII(3mol/l Kac，pH4.8)，反复颠倒数次，于冰浴放置5分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，将上清转入另一离心管中。加等量体积的酚∶氯仿(1∶1)，振荡混合有机相和水相，于4℃以12000rpm离心2分钟，将上清转移到另一离心管中。用2倍体积的乙醇于室温沉淀核酸，振荡混合，于室温放置2分钟。于4℃，12000rpm离心5分钟，收集核酸沉淀。小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出排干。加1ml70％乙醇于沉淀中，洗涤DNA沉淀，沉淀干燥后溶于50μlddH₂O中。

2.重叠PCR扩增含连接肽序列的核苷酸片段

2.1 编码含Arg₉(Gly₄Ser)₂连接肽的核苷酸序列的扩增

以pCIT35质粒为模板采取两步扩增得到全长片段。第一步以SacFor和GSArg1为上下游引物各10pmol加入离心管中，加入质粒模板1μl，10×PCR buffer 2μl，2μldNTPs(2mmol/l)，0.2μl pfu DNA聚合酶(5u/μl)，用ddH₂O补足总体积至20μl，混匀，进行30轮PCR循环：94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用申能博彩琼脂糖凝胶DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。以回收的DNA片段为模板加入10pmol于离心管中，加入引物SacFor和GSArg2各10pmol，10×PCR buffer 2μl，2μldNTPs(2mmol/l)，0.2μlpfu DNA聚合酶(5u/μl)，用ddH₂O补足总体积至20μl，混匀，进行30轮PCR循环：94℃变性1分钟，55℃退火30秒℃，72℃延伸40秒。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用申能博彩琼脂糖凝胶DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。

2.2 编码含(Gly₄Ser)₂连接肽的核苷酸序列的扩增

以pCIT35质粒为模板采取两步扩增得到全长片段。第一步以SacFor和GS为上下游引物各10pmol加入离心管中，加入质粒模板1μl，10×PCR buffer 2μl，2μldNTPs(2mmol/l)，0.2μl pfu DNA聚合酶(5u/μl)，用ddH₂O补足总体积至20μl，混匀，进行30轮PCR循环：94℃变性1分钟，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，利用申能博彩琼脂糖凝胶DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。

3.PCR扩增产物的限制性内切酶消化及纯化

用SacII和XhoI对PCR扩增产物进行消化：取约1μg DNA片段在40μl反应体系中(1×buffer K，30u的SacII和30u的XhoI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波紫外灯下切胶回收所需的条带，参照申能博彩生物技术公司胶回收kit说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。

4.载体质粒pCIT35的限制性内切酶消化及纯化

用SacII和XhoI对载体DNA进行消化：取1μg质粒在40μl反应体系中(1×Buffer K，30u的SacII和30u的XhoI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波紫外灯下切胶回收所需的条带，参照申能博彩生物技术公司胶回收kit说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。

5.DNA连接反应

取回收的双酶切pCIT35约40ng，双酶切PCR片段20ng，加入2μl10×T₄连接酶(约20u)，加ddH₂O至总体积20μl，混匀，16℃连接过夜。

6.感受态细胞的制备

用氯化钙制备大肠杆菌的感受态细胞：从培养平板上挑取单克隆，转接在5ml培养基中37℃振荡培养过夜。按1∶100的比例转接至20~40ml无抗生素培养基中，快速振荡培养至OD₆₀₀为0.4~0.6时，冰浴15分钟。4℃4000rpm离心10分钟收集菌体，弃上清，加入20ml预冷的0.1mol/LCaCl₂，重悬混匀，冰浴40分钟。4℃4000rpm离心10分钟，弃上清后加入预冷的含15％甘油0.1mol/L CaCl₂ 1~2ml，轻轻悬起菌体，分装。存于-80℃。

7.重组DNA的转化，阳性克隆的筛选及测序鉴定

在200μl感受态细胞中加入10μl连接混合物，混匀。冰浴30分钟，42℃热激100秒，  然后迅速冰浴2分钟。加入0.8ml LB培养基，37℃轻摇(＜150rpm)45分钟复苏，10,000rpm离心1分钟，弃上清，加100～200μlLB培养基重悬沉淀，涂布于含Amp 100μg/ml的LB平板上，37℃培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒，分别用SacII和XhoI双酶切；SacFor，GSArg2为引物的PCR鉴定插入外源片段的质粒。将鉴定后的质粒送博亚生物技术公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒pCIT35a。

实施例3、含不同连接肽的抗CEA免疫毒素的表达

1.免疫毒素的表达

表达载体质粒pCIT35a和pCIT35g转化大肠杆菌E.coli菌株BL21(DE3)star，(Novagen公司)挑取单克隆于LB(含100μg/ml Amp)培养基中30℃培养过夜。以10％的比例转接，37℃生长至OD₆₀₀约0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/ml，继续培养4小时，离心收集菌体。菌体重悬于超声缓冲液中，冻融三次，离心，12000rpm，30分钟。沉淀重悬于超声缓冲液中，冰浴超声。离心收集上清和沉淀，进行12％SDS-PAGE分析。

聚丙烯酰胺的配制参见下表1：

                       浓缩胶5  分离胶12  封口胶

                       ％       ％

30％Acr/Bis(29∶1)(ml) 0.5      6.0       0.53

5M Tris-HCl(pH8.8)(ml) -        3.8       -

1.0M                   0.38     -         0.5

Tris-HCl(pH6.8)(ml)    0.03     0.15      0.02

10％SDS(ml)            0.03     0.15      0.02

10％AP(ml)             0.003    0.006     0.0012

TEMED(ml)              2.1      4.9       0.93

ddH₂O

样品的处理：适量蛋白样品与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液(100mmol/Tris-HCl pH6.8，200mmol/DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)混合，沸水浴加热5分钟，待上样。

电泳：电泳缓冲液25mmol/Tris-HCl，pH8.3，0.1％SDS。取适量体积的样品上样，恒压60V，待样品进入分离胶，恒压120V。

染色及脱色：采用考马斯亮蓝R250染色(0.25g考马斯亮蓝R250溶于100ml甲醇-冰乙酸溶液中(90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸)，室温染色6-12小时。用甲醇-冰乙酸溶液脱色，室温脱色至具有明显条带，照相，结果参见附图3.A，两种免疫毒素在分子量标准的66kDa左右有明显蛋白条带。

Western印迹：上述SDS-PAGE分离的样品用amersham pharmacia biotech的Hoefer TE 22 Mighty Small^TM Transphor Tank Transfer Unit装置，在转移缓冲液(39mmol/甘氨酸，40mmol/l Tris碱，0.03％SDS，20％甲醇)400mA转移1.5小时，将转印后的膜放入封闭液中封闭2小时(封闭液：5％脱脂牛奶溶解于TBS中(TBS：100mmol/l Tris-HCl，pH7.5，0.9％NaCl)，用TBST(含0.1％Tween 20的TBS)洗三遍，每次5分钟。与按1∶1000稀释于TBS中的抗E-tag小鼠单克隆抗体室温结合1小时，TBST洗三次。再加入按1∶5000比例稀释于TBS中的HRP标记的羊抗鼠抗体室温结合1小时，TBST洗5遍。最后在底物显色液中(6mg/ml DAB，1％H₂O₂)显色5-15分钟，拍照，结果见附图3.C。

2.包涵体的复性

包涵体经洗涤(50mM Tris-HC，pH8.0；50mM Tris-HC，pH8.0，10mMEDTA和2％Triton各一次，每次30分钟)后，纯度可明显提高(图3.B)。洗涤后的包涵体蛋白溶解于包涵体裂解液(10mM pH7.2磷酸钠缓冲液，8M尿素)中，37℃裂解1小时，12,000rpm离心30分钟，取上清。变性蛋白透析到含4M尿素的10mM pH7.2磷酸钠缓冲液，然后用稀释复性液稀释10倍，4℃放置过夜使蛋白复性。将复性的蛋白溶液装入透析袋对PBS溶液透析过夜，12,000rpm离心20分钟，取上清，测定蛋白浓度，分装，4℃贮存备用。

实施例4、免疫毒素的活性测定

3.免疫毒素细胞结合活性的测定

采用间接荧光标记的方法，运用流式细胞术检测抗CEA免疫毒素对靶细胞的结合活性。10⁵个人鼻咽癌细胞CNE-2分别与10μg/ml的免疫毒素200μl于4℃孵育90min，未加样品的细胞作对照组，PBA(1％BSA/PBS)洗三次。加入按1∶1000稀释后的鼠抗E-tag单克隆抗体200μl 4℃孵育60min，PBA洗三次。加入200μl FITC-羊抗鼠Ig(1μg/10⁶细胞)4℃孵育60min，PBA洗三次，流式细胞仪检测。图4结果表明，在抗体与毒素之间加入(Gly₄Ser)₂能有效提高免疫毒素的细胞结合活性，避免因抗体插入位置的改变引起的抗原结合能力的降低。

4.免疫毒素的内化实验

在6孔细胞培养板的孔内放置盖玻片，按每孔10⁵个细胞将CNE-2细胞铺于孔内，于37℃，5％CO₂过夜培养。倾尽培养液，在孔内分别加入10μg/ml免疫毒素样品1ml，设立对照孔，加入相同体积的PBA。于37℃温育2h。PBA洗三次后，用pH4.0的Gly-HCl缓冲液洗三次，每次10min，以除去细胞表面抗原结合的免疫毒素。PBA洗三次后，用4％多聚甲醛于室温固定5min，PBA洗三次。加入冰丙酮作用30s，PBA洗三次。加入按1∶1000稀释后9E10腹水1ml 4℃孵育60min，PBA洗三次。加入1ml按1∶500稀释的FITC-羊抗鼠Ig 4℃孵育60min，PBA洗三次。将盖玻片从培养板中取出，倒扣于滴加有封片剂(90％甘油，10％PBS，5mM对苯二胺)的载玻片上，于共聚焦显微镜下进行观察。结果表明，在抗体与毒素之间插入Arg₉肽段能有效的提高免疫毒素的内化效率，并且在较短的时间及4℃均能有效发挥作用(图5、6)。

3.免疫毒素的体外杀伤活性测定

稀释生长良好的表达CEA的肿瘤细胞CNE-2、SW1116及不表达CEA的人卵巢癌细胞SKOV3和人鼻咽癌细胞CNE-1 10⁵个/ml，每孔100μL铺96孔细胞培养板，置5％CO₂恒温培养箱培养。在细胞接近铺满孔底表面时，加入不同浓度的免疫毒素，继续培养48h。加入终浓度为0.5mg/ml四唑盐(MTT)溶液温育4h，倾尽培养液。附着于培养孔壁上的氧化态MTT紫色结晶以二甲基亚砜(DMSO)充分溶解，570nm测定光密度值。每种细胞均设死细胞和活细胞对照，其它步骤同上。肿瘤细胞杀伤效果由下列公式计算得出：

图7、8的结果表明，含Arg₉的抗CEA/PE35免疫毒素对肿瘤细胞的特异性杀伤活性明显提高。

参考文献

1.Pastan I，Willingham MC，& FitzGerald DJ：免疫毒素(Immunotoxins).细胞(Cell)，1986，47(5)：641-648.

2.Vitetta ES，Fulton RJ，May RD，等：天然毒素的重设计用于构建抗肿瘤制剂(Redesigning nature s poisons to create anti-tumorreagents).科学(Science)，1987，238(4830)：1098-1104.

3.Hwang J，FitzGerald DJ，Adhya S，等：通过缺失基因在大肠杆菌中的表达鉴定假单胞菌外毒素的功能结构域(Function domains ofPseudomonas exotoxin identified by deletion analysis of the geneexpressed in E.coli).细胞(Cell)；1987，48：129-136.4.Allured VS，Collier RJ，Carroll SF，等：3.0埃分辨率的假单胞菌外毒素A的结构(Structure of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0 Angstromresolution).美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)，1986，83：1320-1324.

5.Brinkmann U，Pai LH，FitzGerald DJ，等：B3(Fv)-PE38KDEL，一种使小鼠中人肿瘤完全消退的单链免疫毒素(B3(Fv)-PE38KDEL，asingle-chain immunotoxin that causes complete regression of a humancarcinoma in mice).美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)，1991，88(19)：8616-8620.

6.Mansfield E，Pastan I，FitzGerald D J：靶向B细胞恶性肿瘤细胞CD22分子的免疫毒素RFB4-Pseudomonas exotoxin A的性质鉴定(Characterization of RFB4-Pseudomonas exotoxin A immunotoxinstargeted to CD22 on B cell malignancies.)生物组合物化学(Bioconjug.Chem)，1996，7(5)：557~563。

7.Lindgren，M.，H llbrink，M.，Prochiantz，A. .：细胞渗透肽(Cell-penetrating peptides).2000，药理学进展(Trends Pharmacol.Sci.).21，99-103.

8.Jeang，K-T，Xiao，H.& Rich，E.A.：HIV-1转录本-转录激活蛋白Tat的多方面活性(Multifaceted activities of the HIV-1transactivator of transcription，Tat).1999，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，274，28837-28840.

9.Wender P A.，Mitchell D J，Pattabiraman K，等：促进细胞内吞作用的分子-肽分子转运体的设计、合成和评价(The design，synthesis，and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake：Peptoid molecular transporters).美国科学院院刊(Proc Natl AcadSci USA).2000，97(24)：13003-13008.

10.Pastan I，& Fitzgerald D J.：活性提高的重组假单胞菌外毒素(Recombinant Pseudomonas exotoxin with increased activity)Feb.11，1997.US Patent：5,602,095.

11.Koga H，Kanda H，Nakashima M，等：抗癌胚抗原鼠-人嵌合单克隆抗体：体外和体内活性(Mouse-human chimeric monoclonal antibody tocarcinoembryonic antigen(CEA)：in vitro and in vivo activities).杂交瘤(Hybridoma).1990，9(1)：43-56.

Claims (11)

1.一种抗CEA免疫毒素，其特征在于是由抗CEA单链抗体与截短并改造的假单胞菌外毒素PE35/KDEL构成的，并在毒素的607位氨基酸与单链抗体之间加入不同连接肽，能将内化作用较弱的抗CEA免疫毒素快速而有效地运送到细胞内，显著提高其杀伤靶细胞作用的一种抗CEA免疫毒素。

2.根据权利要求1所述的一种抗CEA免疫毒素，其不同连接肽的氨基酸序列，其中包括：(Gly₄Ser)₂连接肽：Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer；或(Arg)₉(Gly₄Ser)₂连接肽：Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ArgGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

3.一种编码权利要求2所述连接肽的核苷酸序列。

4.编码权利要求2所述的(Gly₄Ser)₂连接肽的核苷酸序列：

GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGT GGT GGT AGC；

编码(Arg)₉(Gly₄Ser)₂连接肽的核苷酸序列：

CGC CGC CGT CGT CGC CGC CGC CGC CGT GGC GGC GGC GGC ACG GGT GGT

GGT GGT AGC。

5.一种含有根据权利要求3或4所述的核苷酸序列的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，是一种如图2所示的表达载体pCIT35g或pCIT35a。

7.一种含有权利要求5或6所述表达载体的宿主细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞是大肠杆菌E coli。

9.根据权利要求1-8所述的，任选其中之一项在制备治疗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的在制备鼻咽癌和结肠癌药物中的应用。

11.按照权利要求8或9所述权项要求制备的一种用于治疗肿瘤的抗CEA免疫毒素药物。

Images