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CN1665835A - 草花粉过敏原Phl p4 的 DNA 序列和用重组方法进行的制备 - Google Patents

草花粉过敏原Phl p4 的 DNA 序列和用重组方法进行的制备 Download PDF

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CN1665835A CN038151782A CN03815178A CN1665835A CN 1665835 A CN1665835 A CN 1665835A CN 038151782 A CN038151782 A CN 038151782A CN 03815178 A CN03815178 A CN 03815178A CN 1665835 A CN1665835 A CN 1665835A
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Abstract

本发明涉及提供主要的草花粉过敏原Phl p4的基因序列。本发明还包括具有低过敏反应的片段、部分序列的新组合和点突变体。重组DNA分子和衍生出的多肽、片段、部分序列的新组合以及变体能用于治疗花粉过敏性疾病。由重组方法制备的蛋白能用于花粉过敏症的体外和体内诊断。

Description

草花粉过敏原Phl p4的DNA序列和用重组方法进行的制备
背景技术
本发明涉及提供主要的草花粉过敏原Phl p4的基因序列。本发明还包括具有低过敏反应的片段、部分序列的新组合和点突变体。重组DNA分子和衍生出的多肽、片段、部分序列的新组合以及变体能用于治疗花粉过敏性疾病。由重组方法制备的蛋白能用于花粉过敏症的体外和体内诊断。
1型过敏症在世界范围内都是重要的。在工业化国家中有高达20％的人群患有例如过敏性鼻炎、结膜炎或支气管哮喘等疾病。这些过敏症由空气中的过敏原(空气过敏原)导致，它们从不同的起始源释放，例如植物花粉、微粒、猫或狗。这些1型过敏症患者中有高达40％依次表现出对草花粉过敏原的特异性IgE反应(Freidhoff等，1986，J.Allergy Clin.Immunol.78，1190-2001)。
引发1型过敏症的物质是蛋白、糖蛋白或多肽。从粘膜摄入后，这些过敏原与结合在致敏个体的肥大细胞表面上的IgE分子反应。如果两个IgE分子通过过敏原彼此交联，就会导致效应细胞释放介质(例如组胺、前列腺素)和细胞因子，从而产生相应的临床症状。
根据各过敏原分子与过敏症患者的IgE抗体反应的相对频率，将它们分为主要的和次要的过敏原。
到目前为止，梯牧草(Phleum pratense)、Phl p1(Petersen et al.，1993，J.Allergy Clin.Immunol.92：789-796)、Phl p5(Matthiesen andLowenstein，1991，Clin.Exp.Allergy 21：297-307；Petersen et al.，1992，Int.Arch.Allergy Immunol.98：105-109)、Phl p6(Petersen et al.，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108：49-54)、Phl p2/3(Dolecek et al.，1993，FEBS，335(3)299-304)、Phl p4(Haavik et al.，1985，Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.78：260-268；Valenta et al.，1992，Int.Arch.AllergyImmunol.97：287-294，Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98：189-198)和Phl p13(Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：324-332；Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)已经被认为是主要过敏原。
Phl p4已经作为分子量为50-60kDa的基础糖蛋白来提及(Haaviketal.，1985，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.78：260-268).Phl p4分子是胰蛋白酶抗性的(Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98：189-198)，70-88％的草花粉过敏症患者具有针对该分子的IgE抗体(Valenta et al.，1993，Int.Arch.Allergy Immunol.97：287-294；Rossi etal，2001，Allergy 56：1180-1185；Mari，2003，Clin.Exp.Allergy33：43-51)。还描述了来自相关草种的同源分子(Su et al.，1991，Clin.Exp.Allergy 21：449-455；Jaggi et al.，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89：342-348；Jaggi et al.，1989，J.Allergy Clin.Immunol.83：845-852；Leduc-Brodard et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98：1065-1072；14-17)。这些禾本科(Poaceae)的同源分子形成第4组过敏原，这些分子对单克隆小鼠抗体和人IgE抗体具有较高的免疫学上的彼此交叉反应(Fahlbusch et al.，1993 Clin.Exp.Allergy23：51-60；Leduc-Brodard et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98：1065-1072；Su et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.97：210；Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28：799-807；Gavrovic-Jankulovic et al.，2000，Invest.Allergol.Clin.Immunol.10(6)：361-367；Stumvoll et al.2002，Biol.Chem.383：1383-1396；Grote et al，2002，Biol.Chem.383：1441-1445；Andersson and Lidholm，2003，Int.Arch.Allergy Immunol.130：87-107；Mari，2003，Clin.Exp.Allergy，33(1)：43-51)。
与上面提及的梯牧草主要过敏原(Phl p1，Phl p2/3，Phl 5a和5b，Phl p6和Phl p13)相反，Phl p4的基本结构尚未阐明。类似地，也没有其它草种的第4组中的分子的完整序列。
迄今还未能成功地测定N-端氨基酸序列。但是，其原因尚不清楚。Fischer等人(J.Allergy Clin.Immunol.，1996；98：189-198)猜想是N-端封闭，但是用赖氨酰基内肽酶降解后能够纯化出内部肽并测定其序列：IVALPXGMLK(SEQ ID NO.7)。
该肽与豚草过敏原Amb a1和Amb a2的肽序列具有同源性，而且类似于来自玉米(Zm58.2)、西红柿(lat 59，lat 56)和烟草(G10)(Fischer et al.，1996，J.Allergy Clin.Immunol.98：189-198)的蛋白的序列。关于黑麦草(Lolium perenne)，在基本的第4组过敏原中已经描述了具有下述序列的肽片段：FLEPVLGLIFPAGV(SEQ ID NO.8)和GLIEFPAGV(SEQ ID NO.9)(Jaggi et al.，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89：342-348)。
通过酶降解类似地得到了来自鸭茅(Dactylus glomerata)的第4组过敏原的肽，并予以测序：
DIYNYMEPYVSK(P15，SEQ ID NO 10)，
VDPTDYFGNEQ(P17，SEQ ID NO 11)，
ARTAWVDSGAQLGELSY(P20，SEQ ID NO 12)，和
GVLFNIQYVNYWFAP(P22，SEQ ID NO13)(Leduc-Brodard etal.，1996，J.Allergy Clin.Immunol。98：1065-1072)。
还通过蛋白水解得到了亚热带狗牙根(Bermuda grass)(Cynodondactylon)的第4组过敏原的肽，并予以测序：
KTVKPLYIITP(S，SEQ ID NO 14)，
KQVERDFLTSLTKDIPQLYLKS(V49L，SEQ ID NO 15)，
TVKPLYIITPITAAMI(T33S，SEQ ID NO 16)，
LRKYGTAADNVIDAKWDAQGRLL(T35L，SEQ ID NO 17)，
KWQTVAPALPDPNM(P2，SEQ ID NO 18)，
VTWIESVPYIPMGDK(V26L，SEQ ID NO 19)，
GTVRDLLXRTSNIKAFGKY(L25L，SEQ ID NO 20)，
TSNIKAFGKYKSDYVLEPIPKKS(T22L，SEQ ID NO 21)，
YRDLDLGVNQWG(P3，SEQ ID NO 22)，
SATPPTHRSGVLFNI(V20L，SEQ ID NO 23)，和
AAAALPTQVTRDIYAFMTPYVSKNPRQAYVNYRDLD(V14L，SEQ ID NO 24)(Liaw et al.，2001，Biochem.Biophys.ResearchCommunication 280：738-743)。
但是，这些描述的Phl p4肽序列和第4组过敏原至今还没有导致第4组过敏原完整基本结构的阐述。
因此，本发明的目的包括提供Phl p4的完整DNA序列和相应的重组DNA，Phl p4过敏原可以由它们表达为蛋白，并使这样的或其修饰过的形式在药理学上的重要应用成为可能。
附图说明
图1：由基因组DNA获得的Phl p4基因扩增子的内部DNA序列(SEQ ID NO 25)用显示为斜体的降解引物NO.30(有义)和NO.37(反义)进行克隆，并测序。显示出的序列代表来自6个克隆的共有序列。从该序列产生的特异性有义引物No.82标有下划线。
图2：Phl p4基因的3’端核酸序列(SEQ ID NO 26)
用特异性有义引物No.82(显示为斜体)得到扩增子，用梯牧草cDNA得到3’-RACE PCR中的锚定引物，并测序。显示出的序列代表来自3个测序过程的共有序列，包括了Phl p4基因的3’端至终止密码子(双下划线)。用于构建反义引物No.85和No.86的序列区域标有下划线。
图3：Phl p4过敏原的推导氨基酸序列中的Phl p4肽的定位(SEQID NO2)
从纯化的成片段的Phl p4过敏原的氨基酸测序得到的肽P1-P6(SEQ ID NO’s 27-32)能明确地与从核酸序列衍生出的Phl p4基因的氨基酸序列比对。
图4：通过Western印迹、使用对nPhl p4特异性的单克隆抗体5H1(印迹A)和3C4(印迹B)测定重组Phl p4(rPhl p4)的身份。
第1道：含有rPhl p4片段1-200的E.coli总细胞提取物
第2道：含有rPhl p4片段185-500的E.coli总细胞提取物
第3道：含有rPhl p4的E.coli总细胞提取物
第4道：从梯牧草纯化出的nPhl p4
(←)：C-端rPhl p4片段或rPhl p4完整分子的终止或降解片段
图5：通过Western印迹、使用来自草花粉过敏症患者血清的IgE测定重组Phl p4(rPhl p4)的反应性。
用SDS-PAGE分离表达完整Phl p4基因或N-端片段1-200或C-端片段185-500的转化的大肠杆菌细胞的提取物，转移到硝酸纤维素膜上。印迹与来自草花粉过敏症供体A、B或C的血清一起孵育，随后通过与碱性磷酸酶偶联的抗-人IgE抗体比色检测结合的IgE。
第1道：含有rPhl p4片段1-200的大肠杆菌总细胞提取物
第2道：含有rPhl p4片段185-500的大肠杆菌总细胞提取物
第3道：含有rPhl p4的大肠杆菌总细胞提取物
第4道：从梯牧草纯化出的nPhl p4
上文和下文中使用的核苷酸或氨基酸序列“SEQ ID NO”的编号是指说明书所附的序列表。
发明内容
现在，本发明首次提供了主要的草花粉过敏原Phl p4的基因序列，并发现了从单核苷酸多态性(SNPs)产生的3个显性序列(SEQ IDNO1、3和5)。
因此，本发明涉及一种DNA分子，它相应于选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5的核苷酸序列，或者一种DNA分子，它相应于编码梯牧草的主要过敏原Phl p4的核苷酸序列。
本发明还包括具有低过敏反应的片段、部分序列的新组合和点突变体。
因此本发明还涉及编码免疫调节的、T-细胞反应性的禾本科第4组过敏原片段的相应的部分序列、部分序列的组合或交换、缺失或添加突变体。
除其它草种的第4组过敏原外，第13组过敏原也是本发明的目的，因为它们在SDS-PAGE中表现出与第4组过敏原非常相似的分子量，并且难以通过生化技术进行分离(Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：324-332；Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)。在本发明的蛋白和DNA序列的帮助下，它现在首次可以获得，但是，可以明确地证明第4和13组具有明显不同的氨基酸序列。
利用关于天然过敏原的DNA序列的知识，现在可能把这些过敏原制成用于诊断和治疗过敏性疾病的重组蛋白(Scheiner and Kraft，1995，Allergy 50：384-391)。
有效治疗过敏症的传统方案是特异性免疫治疗或脱敏(Fiebig，1995，Allergo J.4(6)：336-339，Bousquet et al.，1998，J.Allergy Clin.Immunol.102(4)：558-562)。在该方法中，以递增的剂量对患者皮下注射天然过敏原提取物。但是，该方法有过敏反应或甚至过敏性休克的风险。为了使这些风险最小化，采用了类过敏原形式的创新制品。它们是化学修饰的过敏原提取物，它们具有显著降低的IgE反应性，但是与未处理的提取物相比有等同的T-细胞反应性(Fiebig，1995，Allergo J.4(7)：377-382)。
关于重组方法制备的过敏原甚至还可能有更多的实质性的治疗优化。通过重组方法制备的高纯度过敏原的确定的鸡尾酒，任选地与患者的各个敏化模式相匹配，可以替换来自于天然过敏原来源的提取物，因为它们除了含有不同的过敏原以外，还含有相对大量的免疫原性的、但非过敏性的次要蛋白。
通过特异性的突变重组过敏原提供了现实的前景，这可以导致用表达产物可靠的脱敏，该突变重组过敏原中的IgE表位被特异性地去除，而未消弱治疗所必须的T-细胞表位(Schramm et al.，1999，J.Immunol.162：2406-2414)。
其它的在过敏症患者体内治疗性的影响紊乱的TH-细胞平衡的可能是免疫治疗性DNA疫苗。这包括用编码相关过敏原的可表达的DNA治疗。通过给啮齿动物注射编码过敏原的DNA，已经提供了过敏原特异性的影响免疫反应的初步实验证据(Hsu et al.，1996，NatureMedicine 2(5)：540-544)。
本发明因此还涉及作为药物的上文或下文所述的DNA分子、或相应的重组表达载体。
通过重组方法制备的相应蛋白可以用于花粉过敏症的治疗和体外、体内诊断。
为了制备重组过敏原，将克隆的核酸连接到表达载体上，该构建体在合适的宿主生物体中表达。生化纯化后，该重组过敏原可以通过已经建立的方法用于检测IgE抗体。
本发明因此还涉及含有上文或下文所述的DNA分子的重组表达载体，该DNA分子功能性地连接到表达控制序列上，以及用所述的DNA分子或所述的表达载体转化的宿主生物体。
本发明类似地涉及至少一种上述的DNA分子或至少一种上述的表达载体在制备用于过敏症患者的免疫治疗性DNA接种和/或预防该过敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
如已经陈述的，本发明能用作含有重组过敏原或核酸的用于特异性免疫治疗的制品的主要组分。这里有许多种可能。首先，未改变基本结构的蛋白可以作为制品的组分。其次，通过特异性地去除整个分子或编码T-细胞表位的各片段制品的IgE表位，低过敏原性(类过敏原)形式可以根据本发明用于治疗，以防止不希望的副作用。最后，核酸本身，如果与真核表达载体连接，提供了一种制品，它的直接应用会在治疗意义上改善过敏免疫状态。
因此本发明涉及与SEQ ID NO 1、3或5相应的重组DNA分子，其中1-69位的核苷酸序列源自Phl p4 N-端的氨基酸序列。这里使用了大肠杆菌中常见的密码子。从70位，该DNA序列与已经在梯牧草的基因组和cDNA中识别鉴定的序列相同。
因此本发明还涉及含有从SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3或SEQ IDNO 5的70位开始的核苷酸序列的DNA分子，该DNA分子编码具有梯牧草的主要过敏原Phl p4的性质的多肽。
而且，本发明涉及由一个或多个上述的DNA分子编码的多肽，优选地它们的性质是作为药物。
更具体地说，它们是SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的多肽，其中已经通过分离的天然Phl p4过敏原的N-端氨基酸序列分析确定了氨基酸1-33位。24-500位源自SEQ ID NO 1、3和5的DNA序列。6、7、8和9位的可变氨基酸源自对天然Phl p4的不同制品N-端蛋白序列分析(表1)。
因此，本发明还涉及一种通过培养权利要求11的宿主生物体、从培养物中分离相应的多肽来制备这种多肽的方法。
本发明类似地涉及至少一种上述的多肽在制备用于诊断和/或治疗过敏症和用于预防该过敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
本发明的这些作为人过敏原的多肽或蛋白存在于梯牧草的花粉颗粒中。其它禾本科(例如黑麦草(Lolium perenne)，鸭茅(Dactylisglomerata)，早熟禾(Poa pratensis)，狗牙根(Cynodon dactylon)，绒毛草(Holcus lanatus)等)的花粉颗粒含有同源的过敏原分子(第4组过敏原)。
这些分子的同源性已经通过它们与鼠单克隆抗体和人IgE抗体的免疫学交叉反应性进行了证实。
因此，本发明还涉及与Phl p4 DNA序列同源的序列和其它禾本科(例如黑麦草，鸭茅，早熟禾，狗牙根，绒毛草，小麦(Triticumaestivum)和大麦(Hordeum vulgare))第4组过敏原的相应的DNA分子，由于它们存在序列同源性，它们在严格条件下会与Phl p4 DNA杂交，或者对Phl p4具有免疫学的交叉反应性。
进行下面的操作来测定Phl p4的蛋白和DNA序列。
根据已知的方法(Fahlbusch et al.1998，Clin.Exp.Allergy28：799-807，Suck et al.2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)纯化并分离天然过敏原Phl p4。根据Suck等人(2000，Clin.Exp.Allergy30：1395-1402)所述的方法进行微纯化，并去除第13组过敏原的痕迹。通过Edman降解测定从梯牧草分离的该Phl p4的N-端氨基酸序列。用不同批次的Phl p4测定的N-端序列(P1a-f)如表1所示。前15位的共有序列被认为是下述序列：YFPP′P′AAKEDFLGXL(SEQ ID NO33)。14位不能测定；它可能是被半胱氨酸占据。不同批次在6、7、8和9位的不同氨基酸暗示异构意义上的变化。4和5位被羟基脯氨酸(P′)占据，它在分析制品p1-a和-b时通过特异性分析清楚地予以确定。
用内肽酶Glu-C(Promega，Heidelberg，Germany)处理SDS-变性的Phl p4产生不同的肽。对两种肽(P2和P3)测定的氨基酸序列如表1所示。用内肽酶Lys-C(Roche，Mannheim，Germany)切割来纯化两种肽(P4和P5)并测序(表1)。通过CNBr切割分离另一种肽(P6)，测定其氨基酸序列(表1)。
N-端序列的氨基酸序列和内部肽2和6用作构建退火引物的基础。使用梯牧草基因组DNA，用有义引物No.30和反义引物No.37(表2)制备扩增子。对从这些扩增子得到的克隆进行测序(图1)，并用于构建特异性有义引物No.82(表2)。使用从梯牧草花粉的代表性mRNA群体制备出的cDNA、本发明的特异性有义引物No.82和锚定引物AUAP(Life Technologies，Karlsruhe，Germany)，在严格条件下进行PCR。对约450kb的扩增子进行测序，这样识别出直到Phl p4基因的3’端的缺失序列(图2)。以按照本发明确定的C-端Phl p4序列为基础，构建了特异性反义引物No.85和No.86(表2)。以Phl p4肽P1-a的N-端氨基酸序列(表1)为基础，构建了源自编码氨基酸24-33位(LYAKSSPAYP(SEQ ID NO 34))的DNA的退火有义引物No.29。
使用梯牧草基因组DNA，用引物No.29和No.86进行PCR。该PCR产物用作用引物No.29和No.85进行的第二次PCR(嵌套的PCR)的基础。将扩增子插入载体pGEM T-easy(Promega，Heidelberg，Germany)，克隆，测序。该序列开始于从N-端计算的24位或SEQ IDNO 1、3或5的DNA序列的70位，并延伸到引物No.85(SEQ ID NO1、3或5中的1402位)，它位于已经确定的Phl p4基因的C-端部分。使用这些数据，Phl p4分子的完整氨基酸序列可以从第一个33氨基酸位置开始构建，通过蛋白序列分析和推定的氨基酸序列(477个位置)进行测定，该氨基酸序列可以源自用引物No.29/No.85和No.82/锚定引物制备的克隆。这两个克隆的核苷酸序列在197个位置重叠。通过直接氨基酸序列分析进行测定，克隆No.29/No.85编码的肽与Phl p4的N-端序列(1-33位)在10个氨基酸位置重叠，这两种方法测定的氨基酸相应。
基于直接测定的N-端氨基酸和推导的氨基酸序列的Phl p4的氨基酸序列相应于序列表中SEQ ID NO 2、4和6列出的序列相同。
用特异性有义引物No.88(表2)和特异性反义引物No.86制备PCR产物，二者都使用梯牧草的基因组和cDNA，并直接测序。
这样可以排除PCR错误，发现遗传变异(单核苷酸多态性)。
在DNA序列SEQ ID NO 1中发现的单核苷酸多态性如表3所示。一些这样的单核苷酸多态性导致修饰的氨基酸。这些如表4所示。而且，对产生相对于显性序列SEQ ID NO 2、4和6发生偏离的氨基酸的DNA克隆进行测序(表5)。这些氨基酸变体认为是Phl p4分子的异构体。猜测这些异构体的存在是归因于天然Phl p4的不同等电行为。迄今已知的所有花粉过敏原都有这样的异构体。通过发现了对于天然Phlp4的已经识别出的内部肽P3、P4和P5(表1)的本发明重组Phl p4分子的推导氨基酸序列中的同源肽序列(图3)这一事实，可以证明另一事实，即引物No.29和86确定的DNA片段实际上编码与天然Phl p4过敏原相同的蛋白。所述的Phl p4氨基酸序列表明，它是由500个氨基酸组成的基础分子，具有计算出的等电点8.99(SEQ ID NO 2)、8.80(SEQ ID NO 4)或9.17(SEQ ID NO 6)。定量的氨基酸组合物如表6所示。计算出的重组Phl p4的分子量是55.762(SEQ ID NO 2)、55.734(SEQ ID NO 4)或55.624(SEQ ID NO 6)道尔顿。该计算出的分子量与通过SDS-PAGE测定的55kDa天然Phl p4的分子量非常吻合(Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy 28：799-807和Suck et al.，2000，Clin.Exp.Allergy 30：1395-1402)。
已经描述了分子量为50-60kDa的相关草物种的第4组过敏原(Suet al.，1991，Clin.Exp.Allergy 21：449-455；Jaggi et al.，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89：342-348；Jaggi et al.，1989，J.Allergy Clin.Immunol.83：845-852；LeducBrodard et al.，1 996，J.Allergy Clin.Immunol.98：1065-1072；14-17)。
为了制备重组Phl p4蛋白，将编码Phl p4的SEQ ID NO 1、3和/或5的DNA序列插入表达载体(例如pProEx，pλCro，pSE380)。关于从蛋白测序获知的N-端氨基酸，使用了大肠杆菌优化密码子。
转入大肠杆菌后，表达，用不同的分离方法纯化重组Phl p4，得到的蛋白再经历重新折叠过程。
这样方法得到的rPhl p4蛋白在SDS-PAGE中出现一条带，它包括了与天然Phl p4相同分子量的区域。通过与鼠单克隆抗体5H1和3C4的反应，该抗体5H1和3C4已经用天然Phl p4诱导并且与禾本科的同源蛋白(第4组)交叉反应(Fahlbusch et al.，1998，Clin.Exp.Allergy28：799-807；Gavrovic-Jankulovic et al.，2000，Invest.Allergol.Clin.Immunol.10(6)：361-367)(图4)，已经证明了rPhl p4的免疫学反应性。rPhl p4与已经证实了与天然rPhl p4的IgE反应性的过敏症患者体内的IgE抗体反应。该IgE反应性和作为过敏原的作用已经在点实验、Western印迹和聚苯乙烯微量滴定板上的过敏原吸附中予以证实。Western印迹的检测如图5所示。rPhl p4与第4组过敏原反应性的草花粉过敏症患者的嗜碱性细胞的反应时，刺激它们增加活化标记CD203c的表达。这种rPhl p4的嗜碱性细胞活化清楚地表明，该分子也作为过敏原起作用。该rPhl p4过敏原这样就可以用于草花粉过敏症患者的高特异性诊断。该诊断可以在体外通过检测特异性抗体(IgE，IgG1-4，IgA)和与携带IgE的效应细胞(例如来自血液的嗜碱性细胞)反应来进行，或者在体内通过皮试反应和对反应器官的刺激来进行。
利用新鲜制备的血液淋巴细胞中的T细胞和建立的nPhl p4反应性T细胞系和克隆，通过过敏原特异性刺激T淋巴细胞的扩增和细胞因子的合成，已经检测了rPhl p4与草花粉过敏症患者的T-淋巴细胞的反应。
以所述的rPhl p4 DNA序列为基础，将编码具有50-350个氨基酸的肽的部分序列克隆入表达载体。这些部分序列依次包括了rPhl p4的完整序列，有至少12氨基酸的重叠。表达的肽相应于Phl p4片段。单个的或混合的Phl p4片段与过敏症患者的IgE抗体不反应，或者仅仅是小范围的反应，因此它们可以归入低过敏原类。相反，这些片段的混合物能够以与完整的重组的或天然的Phl p4相同的方式刺激具有Phl p4反应性的草花粉过敏症患者的T淋巴细胞。
图4显示了作为实例的通过与Phl p4特异性单克隆鼠抗体结合而表征相应于氨基酸1-200和185-500的两个这样的Phl p4片段。C-端片段185-500仅仅与单克隆抗体5H1反应，而N-端片段1-200清楚地与单克隆抗体3C4反应。从图5可以看出，片段185-500与来自过敏症患者B和C的血清的IgE的反应强度较低，即过敏原性不如片段1-200，它具有降低的IgE反应性(低致敏性)，至少对患者血清C如此。
本发明因此还涉及上文或下文所述的DNA分子，它编码具有Phlp4的氨基酸1-200的片段1-200，
以及DNA分子，它编码具有Phl p4的氨基酸285-500的片段285-500。
通过位点特异性的谤变修饰编码半胱氨酸的三联密码子，使其编码其它的氨基酸，优选丝氨酸。已经制备了这样的两种突变体：其中各半胱氨酸被替换，其中2个半胱氨酸基团的不同组合或所有的5个半胱氨酸被修饰。这些半胱氨酸点突变体表达的蛋白对过敏症患者的IgE抗体具有降低的或零反应性，但是与这些患者的T-淋巴细胞反应。本发明因此还涉及上文或下文所述的DNA分子，其中相应多肽的一个、多个或所有的半胱氨酸基团已经通过定点诱变替换为其它氨基酸。
相应于具有T-细胞表位的多肽的低过敏原性片段的免疫调控活性和低过敏原性点突变体(例如半胱氨酸多态性)的免疫调控活性已经通过其与草花粉过敏症患者的T细胞的反应予以证实。
这种低过敏原性片段或半胱氨酸点突变体可以用作过敏症患者的脱敏制品，因为它们与T-细胞等效反应，但是由于降低了或完全没有IgE反应性，因而减少了IgE介导的副作用。
如果将编码低过敏原性Phl p4变体的核酸或未修饰的编码Phl p4的DNA与人表达载体连接，这些构建体可以同样用作免疫治疗的制品(DNA接种)。
最后，本发明涉及药物组合物，它含有至少一种上述的DNA分子或至少一种上述的表达载体，任选地含有其它用于过敏症患者的免疫治疗性DNA接种和/或预防该过敏证的活性成分和/或佐剂，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
另外一组本发明的药物组合物含有至少一种上述的多肽，而不是DNA，它适用于诊断和/或治疗所述的过敏症。
本发明意义上的药物组合物含有作为活性成分的本发明的多肽或表达载体和/或各自的药学上可有用的衍生物，包括它们所有比例的混合物。根据本发明的活性成分在这里可以与至少一种固体、液体和/或半液体赋形剂或佐剂，任选地与一种或多种其它的活性成分相组合，制成合适的剂型。
特别合适的佐剂是免疫刺激性DNA或具有CpG效果的寡核苷酸。
这些组合物可以用作人用药或兽用药中的治疗剂或诊断剂。合适的赋形剂是适合于肠胃外施用且对本发明的活性成分不产生负面影响的有机物或无机物。特别适合肠胃外施用的是溶液，优选基于油的或水性溶液，以及悬浮液、乳状液或灌注液。本发明的活性成分也可以冻干，得到的冻干物用于，例如，制备注射制品。所指的组合物可以是灭菌的，和/或含有佐剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂和/或润湿剂、乳化剂、用于调节渗透压的盐、缓冲物和/或多种其它的活性成分。
而且，用本发明的活性成分的相应制剂可以得到持续释放的制品。
因此本发明也用于提高体外诊断，该诊断作为过敏原组分诱发的对患者特异性敏感图谱的识别的一部分。本发明同样用于制备用于草花粉过敏症的特异性免疫治疗的显著改善的制品。
表1 Phl p4肽的氨基酸序列
制品 肽批次 氨基酸IDNO  1        6     11    16    21    26    31
完整Phl p4 P1-aP1-bP1-cP1-dP1-eP1-f 35  YFPP′P′AAKED FLGXL VKEIP PRLLY AKSSP AYP36  YFPP′P′AAKED FLGXL VKE-P PRLLY AKSSP37  YFPXX    AAKED FLGXL38  YFPXX    AKKED FLGXL39  YFPXX    AAKDD FLGXL40  YFPXX    LANED F
Glu-C片段 P2P3 41  SATPF    XHRKG VLFNI  QYV42  GLXYR    XLXPE
Lys-C片段 P4P5 43  KXMGD     DHFXA VR44  APEGA     VDII
CNBr片段 P6 45  MEPYV     SINPV QAYAN  Y
表2以Phl p4肽序列和DNA序列为基础构建的退火的和特异性有义引物和反义引物
引物No.  肽/DNA 有义/反义 SEQIDNO  核苷酸序列
29  Phl p4-P1 有义 46  YTN TAY GCN AAR WSN WSNCCN GCN TAY CC
30  Phl p4-P2 有义 47  CAY MGN AAR GGN GTN YTN TTYAAY ATM C
37  Phl p4-P6 反义 48  TAR TTN GCR TAN GCY TGN ACNGGR TT
82  Phl p4-DNA-NYW 有义 49  ACT ACT GGT TCG CCC CGG GAGCC
85  Phl p4-DNA-GLV 反义 50  TGA AGT ATT TCT GGC CCC ACACCA AAC C
86  Phl p4-DNA-QRL 反义 51  CCC TTG GTG ATG GCG AGC CTCTGG
88  Phl p4-DNA-PSV 有义 52  CTC AGT CCT GGG GCA GAC CATCC
引物82、85、86和88的核苷酸序列以通常的3字母密码显示。至于引物29、30和37，则使用IUPAC-IUB DNA码；这里的字母“N”代表次黄嘌呤核苷。
表3测得的单核苷酸多态性
 在序列中的位置  SEQ ID NO 1的核苷酸  测得的SNPs
 85  T  A
 130  C  A
 159  G  A
 160  A  C
 169  G  A
 185  C  T
 186  C  A
 222  G  C
 226  G  A
 227  G  C
 228  T  C
 237  C  T
 273  C  T
 285  C  T
 286  C  T
 298  G  A
 299  A  C
 303  C  T
 309  C  G
 318  T  C
 320  G  A
 333  C  G
 348  G  C
 369  C  G
 409  C  T
 411  C  T
 420  T  C
 421  A  C
 423  A  C
 424  G  A
 425  T  C
 456  C  G
 462  C  A
 522  G  C
 525  C  G
 567  G  A
 618  C  T
 655  A  C
 657  G  A
 662  G  A
 680  C  T
 684  G  C
 690  C  A
 691  G  A
 693  G  A
 703  C  T，A
 710  A  C
 711  G  A
 713  C  T
 743  G  A
 750  G  A
 768  C  T
 773  A  C
 790  G  A
 798  G  C
 801  G  A
 804  C  G
 809  C  A
 834  G  C
 844  C  A
 859  A  T
 865  A  G
 879  G  C
 895  G  C
 900  G  C，A
 918  G  A
 961  A  G
 962  A  C
 964  A  C
 987  G  C
 994  A  T
 1020  G  A
 1023  G  C
 1036  G  C
 1040  C  T
 1041  G  C
 1047  C  A
 1051  A  G
 1052  G  A，C
 1053  G  A，C，T
 1056  G  C
 1069  T  C
 1073  G  A
 1084  C  G
 1086  G  C
 1090  C  T
 1098  G  C
 1151  G  C
 1152  G  C
 1155  G  C
 1161  G  C
 1185  C  G
 1229  G  C
 1233  G  C
 1239  A  C
 1240  T  C
 1242  G  C
 1257  G  C
 1266  C  T
 1269  C  T
 1278  A  C，G
 1305  C  G
 1308  C  T
 1311  C  A
 1335  G  C
 1350  G  C
 1357  T  A
 1359  A  G
 1370  G  C
 1377  T  C
 1378  T  A
 1379  T  A
 1383  G  C
 1398  C  T
 1411  T  C
 1414  C  G
 1425  C  A
 1428  C  T
 1443  G  C
 1449  C  T
 1464  G  A
 1485  G  A
 1498  A  C
表4单核苷酸多态性引起的氨基酸交换
 在序列中的位置  SEQ ID NO 2的氨基酸 测得的交换
6  A  L
7  A  K
8  K  N
9  E  D
29  S  T
54  I  L
57  V  I
62  A  V
76  G  T，N，S
100  E  T
107  S  N
137  H  Y
141  T  P
142  V  A，T
189  T  K
219  K  Q
221  R  K
227  P  L
231  V  I
235  P  T，S
237  K  T
238  A  V
248  R  K
258  D  A
264  V  I
270  T  K
282  Q  K
287  M  L
289  S  G
299  A  P
321  N  A
322  I  L
332  T  S
346  E  Q
347  P  L
 351  R  E，T
 357  F  L
 358  S  N
 362  L  V
 364  P  S
 384  W  S
 410  G  A
 419  E  D
 456  F  Y
 457  S  A，N
 460  L  K
 468  K  M
 472  Q  E
 498  K  Q
表5各重组Phl p4克隆与SEQ ID NO 2相比发生偏离的氨基酸位置
实例 偏离位置*
克隆1 L54，I57，V62，S76，T100，N107，Y137，P141，T142，K189，Q219，K221，L227，I231，S235，T237，V238，K248，A258，I264，K270，K282，L287，P299，A321，L322，S332，Q346，P347，T351，L357，N358，V362，S384，A410，D419，Y456，A457，K460，E472
克隆2 L54，I57，V62，T76，T100，N107，Y137，P141，T142，K189，Q219，K221，I231，S235，T237，V238，K248，A258，I264，K270，K282，L287，P299，A321，L322，S332，Q346，P347，T351，L357，N358，V362，S384，A410，D419，Y456，A457，K460，E472
克隆3 P141，K282，L287，P299，L347，E351
克隆4 G289，A410，D419，Y456，A457，K460，E472
克隆5 L347，E351，S384，A410，D419，Y456，A457，K460，E472
克隆6 N107，Y137，P141，T142，K189，Q219，K221，I231，S235，T237，V238，K248，A258，I264，K270，K282，L287，P299，A321，L322，S332，Q346，P347，T351，L357，N358，V362，S384，A410，D419，Y456，A457，K460
克隆7 K248，A258，I264，K270，K282，L287，P299，A321，L322，S332，Q346，P347，T351，L357，N358，V362，S384
克隆8 Q219，K221，I231，S235，T237，V238，K248，A258，I264，K270，K282，L287，P299，E351
克隆9 M231，T246，A251，C263，G289，L307，L309，E334
克隆10 Q219，K221，I231，S235，T237，M238，V242，V248，K248，A258，I264，K270，K282，L287，P299，A321，L322，S332，Q346，
P347，T351，N358，V362，S384，407与408位之间的GA插入，N452，Y456，A457，K460，E472
克隆11 407与408位之间的GA插入
*[SEQ ID NO 2的氨基酸/在序列中的位置/偏离的氨基酸]
表6 Phl p4的氨基酸组成
   氨基酸        数量             重量％
带电     138/138/138     33.89/33.88/33.93
酸性     45/46/43     9.82/10.05/9.38
碱性     54/53/55     13.67/13.39/13.78
极性     120/119/124     24.88/24.71/25.89
疏水性     180/180/180     35.64/35.66/35.43
A Ala     40/40/41     5.10/5.10/5.24
C Cys     5/5/5     0.92/0.93/0.93
D Asp     24/24/24     4.95/4.96/4.97
E Glu     21/22/19     4.86/5.10/4.41
F Phe     24/24/22     6.33/6.34/5.82
G Gly     42/42/40     4.30/4.30/4.10
H His     10/10/9     2.46/2.46/2.22
I Ile     29/29/30     5.88/5.89/6.10
K Lys     29/29/33     6.67/6.67/7.60
L Leu     33/33/35     6.70/6.70/7.12
M Met     11/11/10     2.59/2.59/2.36
N Asn     22/22/23     4.50/4.50/4.72
P Pro*     38/39/39     6.62/6.80/6.81
Q Gln     15/15/15     3.45/3.45/3.46
R Arg     25/24/22     7.00/6.73/6.18
S Ser     32/32/33     5.00/5.00/5.17
T Thr     22/21/22     3.99/3.81/4.00
V Val     41/41/40     7.29/7.29/7.13
W Trp     13/13/12     4.34/4.34/4.02
Y Tyr     24/24/26     7.02/7.03/7.63
*包括羟基脯氨酸
按照SEQ ID NO 2/SEQ ID NO 4/SEQ ID NO 6的顺序给出三个显性序列的值。
序列表
<110>Merck Patent GmbH
<120>草花粉过敏原Phl p4的DNA序列和用重组方法进行的制备
<130>P 02/101
<140>EP 02 013953.1
<141>2002-06-25
<160>52
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1503
<212>DNA
<213>梯牧草(Phleum pratense)
<220>
<221>人工DNA序列
<222>(1)..(69)
<223>来源于测序过的蛋白的DNA序列
<220>
<221>天然DNA序列
<222>(70)..(1503)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1503)
<223>
<400>1
tac ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt        48
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1               5                   10                  15
aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat        96
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
            20                  25                  30
ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg cgg tgg tcg tcg ccg       144
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
gac aac gtg aag ccg atc tac atc gtc acc ccc acc aac gcc tcc cac       192
Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His
    50                  55                  60
atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgg cac ggt gtc cgc atc cgc       240
Ile Gln Ser Als Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg
65                  70                  75                  80
gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tcc ctg       288
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
                85                  90                  95
cag ccc gag gag ttc gcc gtc gtc gac ctt agc aag atg cgg gcc gtg       336
Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val
            100                 105                 110
tgg gtg gac ggg aag gcc cgc acg gcg tgg gtc gac tcc ggc gcg cag       384
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
        115                 120                 125
ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc cac aag gcg agt cca gtg ctg gcg       432
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Pro Val Leu Ala
    130                 135                 140
ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acc atc ggc gtg ggc ggc aac ttc gcg       480
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145                 150                 155                 160
ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcg gcc gag       528
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
                165                 170                 175
aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc acg ctg cac gac       576
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp
            180                 185                 190
aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg       624
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
        195                 200                 205
ggc gag agc ttc ggc atc gtg gtc gcg tgg aag gtg agg ctc ctg ccg              672
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro
    210                 215                 220
gtg ccg ccc acg gtg acc gtg ttc aag atc ccc aag aag gcg agc gag              720
Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
ggc gcc gtg gac atc atc aac agg tgg cag gtg gtc gcg ccg cag ctc              768
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
                245                 250                 255
ccc gac gac ctc atg atc cgc gtc atc gcg cag ggc ccc acg gcc acg              816
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr
            260                 265                 270
ttc gag gcc atg tac ctg ggc acc tgc caa acc ctg acg ccg atg atg              864
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met
        275                 280                 285
agc agc aag ttc ccc gag ctc ggc atg aac gcc tcg cac tgc aac gag              912
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
    290                 295                 300
atg tcg tgg atc cag tcc atc ccc ttc gtc cac ctc ggc cac agg gac              960
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305                 310                 315                 320
aac atc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac acc ttc aag ccc ttc             1008
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
                325                 330                 335
gcc gaa tac aag tcg gac tac gtc tac gag ccg ttc ccc aag gaa gtg             1056
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Glu Val
            340                 345                 350
tgg gag cag atc ttc agc acc tgg ctc ctg aag ccc ggc gcg ggg atc             1104
Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
        355                 360                 365
atg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc agc gcc acc ccg gag tgg             1152
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
    370                 375                 380
gcg acg ccg ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac             1200
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385                 390                 395                 400
gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc ggc gcg gcg cca ttg tcg tgg             1248
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
                405                 410                 415
agc aag gag atc tac aac tac atg gag cca tac gtg agc aag aac ccc             1296
Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
            420                 425                 430
agg cag gcc tac gcc aac tac agg gac atc gac ctc ggg agg aac gag             1344
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
        435                 440                 445
gtg gtg aac gac gtc tcc acc ttc agc agc ggt ttg gtg tgg ggc cag             1392
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Val Trp Gly Gln
    450                 455                 460
aaa tac ttc aag ggc aat ttc cag agg ctc gcc atc acc aag ggc aag    1440
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gln Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465                 470                 475                 480
gtg gat ccc acc gac tac ttc agg aac gag cag agc atc ccg ccg ctc    1488
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
                485                 490                 495
atc aaa aag tac tga                                                1503
Ile Lys Lys Tyr
            500
<210>2
<211>500
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>2
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
            20                  25                  30
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His
    50                  55                  60
Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg
65                   70                 75                  80
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
                85                  90                  95
Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val
            100                 105                 110
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Pro Val Leu Ala
    130                 135                 140
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
                165                 170                 175
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp
            180                 185                 190
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
        195                 200                 205
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro
    210                 215                 220
Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
                245                  250                255
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ale Gln Gly Pro Thr Ala Thr
            260                 265                 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met
        275                 280                 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
    290                 295                 300
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
                325                 330                 335
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Glu Val
            340                 345                 350
Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
        355                 360                 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
    370                 375                 380
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385                 390                 395                 400
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
                405                 410                 415
Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
            420                 425                 430
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
        435                 440                 445
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Val Trp Gly Gln
    450                 455                 460
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gln Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465                 470                 475                 480
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
                485                 490                 495
Ile Lys Lys Tyr
            500
<210>
<211>1503
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>人工DNA序列
<222>(1)..(69)
<223>来源于测序过的蛋白的DNA序列
<220>
<221>天然DNA序列
<222>(70)..(1503)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1503)
<223>
<400>3
tao ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt        48
Tys Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1               5                   10                  15
aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat        96
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
            20                  25                  30
ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg cgg tgg tcg tcg ccg       144
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
gac aac gtg aag ccg atc tac atc gtc acc ccc acc aac gcc tcc cac       192
Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His
    50                  55                  60
atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgg cac ggt gtc cgc atc cgc       240
Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg
65              70                      75                  80
gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tcc ctg       288
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
                85                  90                  95
cag ccc gag gag ttc gcc gtc gtc gac ctt agc aag atg cgg gcc gtg       336
Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val
            100                 105                 110
tgg gtg gac ggg aag gcc cgc acg gcg tgg gtc gac tcc ggc gcg cag       384
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
        115                 120                 125
ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc cac aag gcg agt aca gtg ctg gcg       432
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Thr Val Leu Ala
    130                 135                 140
ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acc atc ggc gtg ggc ggc aac ttc gcg       480
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145                 150                 155                 160
ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcg gcc gag       528
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
                165                 170             175
aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc acg ctg cac gac       576
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp
            180                 185                 190
aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg       624
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
        195                 200                 205
ggc gag agc ttc ggc atc ttg gtc gcg tgg aag gtg agg ctc ctg ccg       672
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro
    210                 215                 220
gtg ccg ccc acg gtg acc gtg ttc aag atc ccc aag aag gcg agc gag       720
Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
ggc gcc gtg gac atc atc aac agg tgg cag gtg gtc gcg ccg cag ctc       768
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arp Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
                245                 250                 255
ccc gac gac ctc atg atc cgc gtc atc gcg cag ggc ccc acg gcc acg       816
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr
            260                 265                 270
ttc gag gcc atg tac ctg ggc acc tgc caa acc ctg acg ccg atg atg       864
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met
        275                 280                 285
agc agc aag ttc ccg gag ctc ggc atg aac gcc tcg cac tgc aac gag       912
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
    290                 295                 300
atg tcg tgg atc cag tcc atc ccc ttc gtc cac ctc ggc cac agg gac       960
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305                 310                 315                 320
aac atc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac acc ttc aag ccc ttc      1006
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
                325                 330                 335
gcc gaa tac aag tcg gac tac gtc tac gag ccg ttc ccc aag agg gtg      1056
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Val
            340                 345                 350
tgg gag cag atc ttc agc acc tgg ctc ctg aag ccc ggc gcg ggg atc      1104
Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
        355                 360                 365
atg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc agc gcc acc ccg gag tgg      1152
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
    370                 375                 380
gcg acg ccg ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac      1200
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385                 390                 395                 400
gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc ggc gcg gcg cca ttg tcg tgg      1248
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
                405                 410                 415
agc aag gag atc tac aac tac atg gag cca tac gtg agc aag aac ccc      1296
Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
            420                 425                 430
agg cag gcc tac gcc aac tac agg gac atc gac ctc ggg agg aac gag      1344
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
        435                 440                 445
gtg gtg aac gac gtc tcc acc ttc agc agc ggt ttg gtg tgg ggc cag      1392
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Val Trp Gly Gln
    450                 455                 460
aaa tac ttc aag ggc aat ttc cag agg ctc gcc atc acc aag ggc aag     1440
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gln Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465                 470                 475                         480
gtg gat ccc acc gac tac ttc agg aac gag cag agc atc ccg ccg ctc     1488
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
                485                 490             495
atc aaa aag tac tga                                                 1503
Ile Lys Lys Tyr
            500
<210>4
<211>500
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>4
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
            20                  25                  30
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
Asp Asn Val Lys Pro Ile Tyr Ile Val Thr Pro Thr Asn Ala Ser His
    50                  55                  60
Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Gly Val Arg Ile Arg
65                  70                  75                  80
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
                85                  90                  95
Gln Pro Glu Glu Phe Ala Val Val Asp Leu Ser Lys Met Arg Ala Val
            100                 105                 110
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile His Lys Ala Ser Thr Val Leu Ala
    130                 135                 140
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
                165                 170                 175
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Thr Leu His Asp
            180                 185                 190
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp A la Val Arg Gly Gly Gly
        195                 200                  205
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Lys Val Arg Leu Leu Pro
    210                 215                 220
Val Pro Pro Thr Val Thr Val Phe Lys Ile Pro Lys Lys Ala Ser Glu
225                 230                 235                 240
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Arg Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
                245                 250                 255
Pro Asp Asp Leu Met Ile Arg Val Ile Ala Gln Gly Pro Thr Ala Thr
            260                 265                 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Gln Thr Leu Thr Pro Met Met
        275                 280                 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Ala Ser His Cys Asn Glu
    290                 295                 300
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305                 310                 315                 320
Asn Ile Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Thr Phe Lys Pro Phe
                325                 330                 335
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Glu Pro Phe Pro Lys Arg Val
            340                 345                 350
Trp Glu Gln Ile Phe Ser Thr Trp Leu Leu Lys Pro Gly Ala Gly Ile
        355                 360                 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Trp
    370                 375                 380
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385                 390                 395                 400
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Gly Ala Ala Pro Leu Ser Trp
                405                 410                 415
Ser Lys Glu Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
            420                 425                 430
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
        435                 440                 445
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Phe Ser Ser Gly Leu Val Trp Gly Gln
    450                 455                 460
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Gln Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465                 470                 475                 480
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
                485                 490                 495
Ile Lys Lys Tyr
            500
<210>5
<211>1503
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>人工DNA序列
<222>(1)..(69)
<223>来源于测序过的蛋白的DNA序列
<220>
<221>天然DNA序列
<222>(70)..(1503)
<223>
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1503)
<223>
<400>5
tac ttc ccg ccg ccg gct gct aaa gaa gac ttc ctg ggt tgc ctg gtt         48
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1               5                   10                  15
aaa gaa atc ccg ccg cgt ctg ttg tac gcg aaa tcg tcg ccg gcg tat         96
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
            20                  25                  30
ccc tca gtc ctg ggg cag acc atc cgg aac tcg agg tgg tcg tcg ccg        144
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
gac aac gtg aag ccg ctc tac atc atc acc ccc acc aac gtc tcc cac        192
Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Val Ser His
    50                  55                  60
atc cag tcc gcc gtg gtg tgc ggc cgc cgc cac agc gtc cgc atc cgc        240
Ile Gln Ser Ala Val Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg
65                  70                  75                  80
gtg cgc agc ggc ggg cac gac tac gag ggc ctc tcg tac cgg tct ttg        288
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
                85                  90                  95
cag ccc gag acg ttc gcc gtc gtc gac ctc aac aag atg cgg gcg gtg        336
Gln Pro Glu Thr Phe Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val
            100                 105                 110
tgg gtg gac ggc aag gcc cgc acg gcg tgg gtg gac tcc ggc gcg cag        384
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
        115                 120                 125
ctc ggc gag ctc tac tac gcc atc tat aag gcg agc ccc acg ctg gcg        432
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu Ala
    130                 135                 140
ttc ccg gcc ggc gtg tgc ccg acg atc gga gtg ggc ggc aac ttc gcg        480
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145                 150                 155                 160
ggc ggc ggc ttc ggc atg ctg ctg cgc aag tac ggc atc gcc gcg gag        528
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
                165                 170                 175
aac gtc atc gac gtg aag ctc gtc gac gcc aac ggc aag ctg cac gac        576
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp
            180                 185                 190
aag aag tcc atg ggc gac gac cat ttc tgg gcc gtc agg ggc ggc ggg        624
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
        195                 200                 205
ggc gag agc ttc ggc atc gtg gtc gcg tgg cag gtg aag ctc ctg ccg       672
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Gln Val Lys Leu Leu Pro
    210                 215                 220
gtg ccg ccc acc gtg aca ata ttc aag atc tcc aag aca gtg agc gag       720
Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu
225                 230                 235                 240
ggc gcc gtg gac atc atc aac aag tgg caa gtg gtc gcg ccg cag ctt       768
Gly Ala Val Aep Ile Ile Asn Lys Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
                245                 250                 255
ccc gcc gac ctc atg atc cgc atc atc gcg cag ggg ccc aag gcc acg       816
Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gln Gly Pro Lys Ala Thr
            260                  265                270
ttc gag gcc atg tac ctc ggc acc tgc aaa acc ctg acg ccg ttg atg       864
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met
        275                 280                 285
agc agc aag ttc ccg gag ctc ggc atg aac ccc tcc cac tgc aac gag       912
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu
    290                 295                 300
atg tca tgg atc cag tcc ato ccc tto gtc cac ctc ggc cac agg gac       960
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305                 310                 315                 320
gcc ctc gag gac gac ctc ctc aac cgg aac aac tcc ttc aag ccc ttc      1008
Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe
                325                 330                 335
gcc gaa tac aag tcc gac tac gtc tac cag ccc ttc ccc aag acc gtc      1056
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gln Pro Phe Pro Lys Thr Val
            340                 345                 350
tgg gag cag atc ctc aac acc tgg ctc gtc aag ccc ggc gcc ggg atc      1104
Trp Glu Gln Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile
        355                 360                 365
arg atc ttc gac ccc tac ggc gcc acc atc agc gcc acc ccg gag tcc      1152
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser
    370                 375                 380
gcc acg ccc ttc cct cac cgc aag ggc gtc ctc ttc aac atc cag tac      1200
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385                 390                 395                 400
gtc aac tac tgg ttc gcc ccg gga gcc gcc gcc gcg ccc ctc tcg tgg      1248
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ser Trp
                405                 410                 415
agc aag gac atc tac aac tac atg gag ccc tac gtg agc aag aac ccc      1296
Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
            420                 425                 430
agg cag gcg tac gca aac tac agg gac atc gac ctc ggc agg aac gag      1344
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
        435                 440                 445
gtg gtc aac gac gtc tcc acc tac gcc agc ggc aag gtc tgg ggc cag      1392
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Tyr Ala Ser Gly Lys Val Trp Gly Gln
    450                 455                 460
aaa tac ttc aag ggc aac ttc gag agg ctc gcc att acc aag ggc aag     1440
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Glu Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465                 470                 475                 480
gtc gat cct acc gac tac ttc agg aac gag cag agc atc ccg ccg ctc     1488
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
                485                 490                 495
atc aaa aag tac tga                                                 1503
Ile Lys Lys Tyr
            500
<210>6
<211>500
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>6
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Cys Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
            20                  25                  30
Pro Ser Val Leu Gly Gln Thr Ile Arg Asn Ser Arg Trp Ser Ser Pro
        35                  40                  45
Asp Asn Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Thr Asn Val Ser His
    50                  55                  60
Ile Gln Ser Als Val Val Cys Gly Arg Arg His Ser Val Arg Ile Arg
65                  70                  75                  80
Val Arg Ser Gly Gly His Asp Tyr Glu Gly Leu Ser Tyr Arg Ser Leu
                85                  90                  95
Gln Pro Glu Thr Phe Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Met Arg Ala Val
            100                 105                 110
Trp Val Asp Gly Lys Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln
        115                 120                 125
Leu Gly Glu Leu Tyr Tyr Ala Ile Tyr Lys Ala Ser Pro Thr Leu Ala
    130                 135                 140
Phe Pro Ala Gly Val Cys Pro Thr Ile Gly Val Gly Gly Asn Phe Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gly Gly Phe Gly Met Leu Leu Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Ala Glu
                165                 170                 175
Asn Val Ile Asp Val Lys Leu Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu His Asp
            180                 185                 190
Lys Lys Ser Met Gly Asp Asp His Phe Trp Ala Val Arg Gly Gly Gly
        195                 200                 205
Gly Glu Ser Phe Gly Ile Val Val Ala Trp Gln Val Lys Leu Leu Pro
    210                 215                 220
Val Pro Pro Thr Val Thr Ile Phe Lys Ile Ser Lys Thr Val Ser Glu
225                 230                 235                 240
Gly Ala Val Asp Ile Ile Asn Lys Trp Gln Val Val Ala Pro Gln Leu
                245                 250                 255
Pro Ala Asp Leu Met Ile Arg Ile Ile Ala Gln Gly Pro Lys Ala Thr
            260                 265                 270
Phe Glu Ala Met Tyr Leu Gly Thr Cys Lys Thr Leu Thr Pro Leu Met
        275                 280                 285
Ser Ser Lys Phe Pro Glu Leu Gly Met Asn Pro Ser His Cys Asn Glu
    290                 295                 300
Met Ser Trp Ile Gln Ser Ile Pro Phe Val His Leu Gly His Arg Asp
305                 310                 315                 320
Ala Leu Glu Asp Asp Leu Leu Asn Arg Asn Asn Ser Phe Lys Pro Phe
                325                     330             335
Ala Glu Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Tyr Gln Pro Phe Pro Lys Thr Val
            340                 345                 350
Trp Glu Gln Ile Leu Asn Thr Trp Leu Val Lys Pro Gly Ala Gly Ile
        355                 360                 365
Met Ile Phe Asp Pro Tyr Gly Ala Thr Ile Ser Ala Thr Pro Glu Ser
    370                 375                 380
Ala Thr Pro Phe Pro His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr
385                 390                 395                 400
Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Leu Ser Trp
                405                 410                 415
Ser Lys Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro
            420                 425                 430
Arg Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr Arg Asp Ile Asp Leu Gly Arg Asn Glu
        435                 440                 445
Val Val Asn Asp Val Ser Thr Tyr Ala Ser Gly Lys Val Trp Gly Gln
    450                 455                 460
Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Glu Arg Leu Ala Ile Thr Lys Gly Lys
465                 470                 475                 480
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu
                485                 490                 495
Ile Lys Lys Tyr
            500
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(60)..(6)
<223>未确定的氨基酸
<400>7
 Ile Val Ala Leu Pro Xaa Gly Met Leu Lys
 1               5                   10
<210>8
<211>14
<212>PRT
<213>黑麦草(Lolium Perenne)
<400>8
Phe Leu Glu Pro Val Leu Gly Leu Ile Phe Pro Ala Gly Val
1               5                   10
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>黑麦草
<400>9
Gly Leu Ile Glu Phe Pro Ala Gly Val
1               5
<210>10
<211>12
<212>PRT
<213>鸭茅(Dactylus glomerata)
<400>10
Asp Ile Tyr Asn Tyr Met Glu Pro Tyr Val Ser Lys
1               5                   10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>鸭茅
<400>11
Val Asp Pro Thr Asp Tyr Phe Gly Asn Glu Gln
1               5                   10
<210>12
<211>17
<212>PRT
<213>鸭茅
<400>12
Ala Arg Thr Ala Trp Val Asp Ser Gly Ala Gln Leu Gly Glu Leu Ser
1               5                   10                  15
Tyr
<210>13
<211>15
<212>PRT
<213>鸭茅
<400>13
Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln Tyr Val Asn Tyr Trp Phe Ala Pro
1               5                   10                  15
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>狗牙根(Cynodon dactylon)
<400>14
Lys Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro
1               5                       10
<210>15
<211>22
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>15
Lys Gln Val Glu Arg Asp Phe Leu Thr Ser Leu Thr Lys Asp Ile Pro
1               5                   10                  15
Gln Leu Tyr Leu Lys Ser
            20
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>16
Thr Val Lys Pro Leu Tyr Ile Ile Thr Pro Ile Thr Ala Ala Met Ile
1               5                   10                  15
<210>17
<211>24
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>17
Leu Arg Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Asp Asn Val Ile Asp Ala Lys Val
1               5                   10                  15
Val Asp Ala Gln Gly Arg Leu Leu
            20
<210>18
<211>14
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>18
Lys Trp Gln Thr Val Ala Pro A la Leu Pro Asp Pro Asn Met
1               5                    10
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>19
Val Thr Trp Ile Glu Ser Val Pro Tyr Ile Pro Met Gly Asp Lys
1               5                   10                  15
<210>20
<211>19
<212>PRT
<213>狗牙根
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>未确定的氨基酸
<400>20
Gly Thr Val Arg Gln Leu Leu Xaa Arg Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe
1               5                   10                  15
Gly Lys Tyr
<210>21
<211>23
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>21
Thr Ser Asn Ile Lys Ala Phe Gly Lys Tyr Lys Ser Asp Tyr Val Leu
1               5                   10                  15
Glu Pro Ile Pro Lys Lys Ser
            20
<210>22
<211>13
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>22
Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Val Asn Gln Val Val Gly
1               5                   10
<210>23
<211>15
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>23
Ser Ala Thr Pro Pro Thr His Arg Ser Gly Val Leu Phe Asn Ile
1               5                   10                  15
<210>24
<211>36
<212>PRT
<213>狗牙根
<400>24
Ala Ala Ala Ala Leu Pro Thr Gln Val Thr Arg Asp Ile Tyr Ala Phe
1               5                   10                  15
Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro Arg Gln Ala Tyr Val Asn Tyr
            20                  25                  30
Arg Asp Leu Asp
        35
<210>25
<211>149
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>25
caccggaagg gggtgctgtt caacatccag tacgtcaact actggttcgc cccgggagcc      60
ggcgcggcgc cattgtcgtg gagcaaggag atctacaact acatggagcc gtacgtgagc     120
aaggaccccg tccaggccta cgccaacta                                       149
<210>26
<211>299
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>26
actactggtt cgccccggga gccggcgcgg cgccattgtc gtggagcaag gagatctaca      60
actacatgga gccatacgtg agcaagaacc ccaggcaggc ctacgccaac tacagggaca     120
tcgacctcgg gaggaacgag gtggtgaacg acgtctccac cttcagcagc ggtttggtgt     180
ggggccagaa atacttcaag ggcaacttcc agaggctcgc catcaccaag ggcaaggtgg     240
atcccaccga ctacttcagg aacgagcaga gcatcccgcc gctcatcaaa aagtactga      299
<210>27
<211>33
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>27
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
            20                  25                  30
Pro
<210>28
<211>18
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>未确定的氨基酸
<400>28
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln
1               5                   10                  15
Tyr Val
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(8)
<223>未确定的氨基酸
<400>29
Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu
1               5                   10
<210>30
<211>12
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(9)
<223>未确定的氨基酸
<400>30
Lys Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg
1               5                   10
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>31
Ala Pro Glu Gly Ala Val Asp Ile Ile
1               5
<210>32
<211>16
<212>PRT
<213>未确定的氨基酸
<400>32
Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Val Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr
1               5                   10                  15
<210>33
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>33
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1               5                   10                  15
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>34
Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr Pro
1               5                   10
<210>35
<211>33
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>35
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Ile Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro Ala Tyr
                20              25                  30
Pro
<210>36
<211>29
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>36
Tyr Phe Pro Pro Pro Ala Ala Lys Glu Asp Phs Leu Gly Xaa Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Pro Pro Arg Leu Leu Tyr Ala Lys Ser Ser Pro
            20                  25
<210>37
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>37
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1               5                   10                  15
<210>38
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>38
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Lys Lys Glu Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1               5                   10                  15
<210>39
<211>15
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(14)
<223>未确定的氨基酸
<400>39
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Ala Ala Lys Asp Asp Phe Leu Gly Xaa Leu
1           5                   10                      15
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(5)
<223>未确定的氨基酸
<400>40
Tyr Phe Pro Xaa Xaa Leu Ala Asn Glu Asp Phe
1               5                   10
<210>41
<211>18
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>未确定的氨基酸
<400>41
Ser Ala Thr Pro Phe Xaa His Arg Lys Gly Val Leu Phe Asn Ile Gln
1               5                   10                  15
Tyr Val
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(8)
<223>未确定的氨基酸
<400>42
Gly Leu Xaa Tyr Arg Xaa Leu Xaa Pro Glu
1               5                   10
<210>43
<211>12
<212>PRT
<213>梯牧草
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(9).
<223>未确定的氨基酸
<400>43
Lys Xaa Met Gly Asp Asp His Phe Xaa Ala Val Arg
1               5                   10
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>44
Ala Pro Glu Gly Ala Val Asp Ile Ile
1               5
<210>45
<211>16
<212>PRT
<213>梯牧草
<400>45
Met Glu Pro Tyr Val Ser Ile Asn Pro Val Gln Ala Tyr Ala Asn Tyr
1               5                   10                  15
<210>46
<211>29
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(29)
<223>′n′表示次黄嘌呤核苷
<400>46
ytntaygcna arwsnwsncc ngcntaycc               29
<210>47
<211>28
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>′n′表示次黄嘌呤核苷
<400>47
caymgnaarg gngtnytntt yaayatmc                28
<210>48
<211>26
<212>DNA
<213>梯牧草
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(26)
<223>′n′表示次黄嘌呤核苷
<400>48
tarttngcrt angcytgnac nggrtt                                    26
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>49
actactggtt cgccccggga gcc                                       23
<210>50
<211>28
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>50
tgaagtattt ctggccccac accaaacc                                  28
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>51
cccttggtga tggcgagcct ctgg                                      24
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>梯牧草
<400>52
ctcagtcctg gggcagacca tcc                                       23

Claims (20)

1.DNA分子，它相应于选自SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 3和SEQID NO 5的核苷酸序列。
2.DNA分子，它含有从70位开始的权利要求1的核苷酸序列，它编码具有梯牧草的主要过敏原Phl p4的性质的多肽。
3.DNA分子，它相应于编码梯牧草的主要过敏原Phl p4的核苷酸序列。
4.DNA分子，它在严格条件下与权利要求1～3中的一项或多项所述的DNA分子杂交，并且源自禾本科物种的DNA序列。
5.DNA分子，它编码能与梯牧草的主要过敏原Phl p4发生免疫学上的交叉反应的多肽，并且源自禾本科物种的DNA序列。
6.DNA分子，它相应于权利要求1～5中的一项或多项所述的部分序列或部分序列的组合，它编码免疫调控性的T-细胞反应性的第4组禾本科过敏原的片段。
7.根据权利要求6的DNA分子，它编码选自下组的Phl p4片段：
片段1-200，具有Phl p4的氨基酸1-200；
片段185-500，具有Phl p4的氨基酸185-500。
8.DNA分子，它相应于权利要求1～7中的一项或多项所述的核苷酸序列，它编码免疫调控性的T-细胞反应性的片段，其特征在于，所述的核苷酸序列已经通过各个密码子的特异性突变、去除或增加进行了特异性的修饰。
9.根据权利要求8的DNA分子，其特征在于，所述的突变导致相应多肽中一个、多个或所有半胱氨酸替换为其它的氨基酸。
10.重组DNA表达载体或克隆系统，它含有与表达控制序列功能性连接的权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA分子。
11.宿主生物体，它被权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA分子或权利要求10的表达载体所转化。
12.通过培养权利要求11的宿主生物体、从培养物中分离相应的多肽来制备权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA序列编码的多肽的方法。
13.权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA序列编码的多肽。
14.用作药物的权利要求13的多肽。
15.药物组合物，它含有至少一种权利要求14的多肽，任选地含有其它用于过敏症的诊断和/或治疗的活性成分和/或佐剂，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
16.至少一种权利要求14的多肽在制备用于诊断和/或治疗过敏症和/或预防该过敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
17.用作药物的权利要求1～9中的一项或多项所述的DNA分子。
18.用作药物的权利要求10所述的重组表达载体。
19.药物组合物，它含有至少一种权利要求17的DNA分子或至少一种权利要求18的表达载体，任选地含有其它用于过敏症患者的免疫治疗性DNA接种和/或预防该过敏症的活性成分和/或佐剂，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
20.至少一种权利要求17的DNA分子或至少一种权利要求18的表达载体在制备用于过敏症患者的免疫治疗性DNA接种和/或预防该过敏症的药物中的应用，其中禾本科的第4组过敏原参与该过敏症的诱发。
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