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CN1500097A - 抗Fcα受体(CD89)的人单克隆抗体 - Google Patents

抗Fcα受体(CD89)的人单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

公开了与Fcα受体(CD89)特异性结合的人单克隆抗体，包括与人效应细胞的IgA的Fc受体特异性反应的单克隆抗体。所述结合剂例如抗体可用于将人效应细胞(例如巨噬细胞)靶向靶细胞(例如癌细胞、感染性因子等)。为此，可以构建含有来源于抗Fcα受体抗体的结合区和靶特异性抗体的结合区的双功能抗体或异源抗体。靶效应细胞可以特异性地裂解靶细胞。

Description

抗Fcα受体(CD89)的人单克隆抗体
相关申请
本申请要求于2001年2月12日申请的美国临时申请第60/268,075号和于2001年11月5日申请的美国临时申请第60/338,956号的优先权，所述美国临时申请通过引用全部结合到本文中。
发明背景
免疫球蛋白Fc部分的受体在触发单核细胞、巨噬细胞和多形核细胞的许多保护性功能方面是重要的。已经广泛地研究了这些细胞上的IgG受体(Fcγ受体或FcγR)，并且产生了针对这些受体的单克隆抗体，表明所述单克隆抗体在治疗上是有效的(参见例如欧洲专利第255 249号，题为″Monoclonal Antibodies to Fc Receptor for Immunoglobulin G onHuman Mononuclear Phagocytes″)。
IgA受体(Fcα受体或CD89)也能够促进效应细胞功能。配体与CD89结合，在白细胞和带有CD89的细胞系中触发吞噬作用和抗体介导的细胞毒性。CD89也可以与效应细胞上的IgG受体协作，增强靶细胞的吞噬作用。
CD89是一种与人抗体中丰度最高的Ig-IgA的Fc部分结合的受体(Kerr，M.A.1990，Biochem.J.271：285-296)。CD89主要在包括多形核白细胞(PMN)、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞在内的细胞毒性免疫效应细胞上组成型表达。(Morton，H.C.等，1996Critical Reviews in Immunology 16：423)。CD89在淋巴细胞一个亚群(Morton，H.C.等，1996 Critical Reviews in Immunology 16：423)和肾小球血管系膜细胞上的表达也有报道(Gomez-Guerrero，C.等，1996 J.Immunol.156：4369-4376)。此外，CD89在单核细胞和PMN上的表达被TNF-α(Gesl，A.等，1994 Scad.J.Immunol.39：151-156；Hostoffer，R.W.等，1994，The J.Infectious Diseases 170：82-87)、IL-1、GM-CSF、LPS或佛波醇酯(Shen L.等，J.Immunol.152：4080-4086；Schiller，C.A.等，1994，Immunology，81：598-604)增强，而IFN-γ和TGF-β1降低FcαRI的表达(Reterink，T.J.F.等，1996，Clin.Exp.Immunol.103：161-166)。
人CD89的α-链是高度糖基化的1型跨膜分子，属于Ig超基因家族，该超基因家族也包括IgG和IgE的受体。位于19号染色体的一个基因编码几种可变剪接同种型的FcαRIα链(55-110 kDa；Morton，H.C.等，1996 Critical Reviews in Immunology 16：423)。已表明髓细胞CD89与FcRγ链缔合，有提示FcRγ链在CD89信号转导中起作用(Morton，H.C.等1995，J.Biol.Chem.270：29781；Pfefferkorn，L.C.等1995，J.Immunol.，153：3228-3236，Saito，K.等，1995，J.Allergy Clin.Immunol.96：1152)。
CD89既与抗原复合型也与单体型IgA1和IgA2结合(Mazangera，R.L.等，1990 Biochem.J.272：159-165)，这与所述受体在体内以与FcγR相同的方式被单体IgA饱和，而FcεRI分别被IgG和IgE饱和相一致。髓细胞样效应细胞上CD89被多聚IgA、IgA免疫复合物或所述配体结合结构域内或之外的表位特异性的mAb交联，刺激脱颗粒、释放超氧化物、分泌炎性细胞因子、内吞和吞噬作用(Patty，C.，A.Herbelin，A.Lihuen，J.F.Bach和R.C.Monteiro.1995 Immunology.86：1-5；Stewart，W.W.，R.L.Maz Yegera，L.Shen和M.A.Kerr.1994 J.LeucocyteBiology.56：481-487；Stewart，W.W.和M.A.Kerr.1990.Immunology.71：328-334；Shen，L.1992.J.Leukocyte Biology.51：373-378.)。通过CD89触发的这些生理反应可能在粘膜表面的第一道体液防线中是重要的(Morton，H.C.，M.van Egmond和J.G.J.van de Winkel.1996Critical Reviews in Immunology.16：423)。
发明概述
本发明提供利用细胞毒性触发分子-人CD89的治疗能力的改良免疫治疗药。特别是，本发明提供与人CD89结合的分离的人单克隆抗体、以及含有这种抗体的治疗组合物、双特异性抗体和分子复合物。
在本发明的一个具体实施方案中，所述抗体不被IgA抑制，例如它在与IgA结合位点不同的位点与CD89结合。在另一实施方案中，所述抗体抑制IgA与CD89的结合，例如它在IgA结合位点内或附近的位点与CD89结合。
在本发明的另一具体实施方案中，所述抗体具有在体内不激活补体(例如不诱导靶细胞的补体介导裂解)的附加的益处，这减小了治疗期间的毒副作用。在再一实施方案中，所述抗体触发至少一种Fc受体介导的效应细胞活性，例如吞噬作用或超氧化物阴离子的分泌。
在本发明的另一具体实施方案中，所述抗体是IgG1(例如IgG1k)抗体，例如具有IgG1重链和κ轻链的抗体。本发明也包括的其它抗体同种型包括IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。所述抗体可以是完整抗体或所述抗体的抗原结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fv和链Fv片段。
在本发明的另一具体实施方案中，所述抗体由人IgG重链和人κ轻链核酸编码，所述人IgG重链和人κ轻链核酸在其可变区中分别包含SEQ ID NO：1或5和SEQ ID NO：3或7中所示的核苷酸序列及其保守序列修饰。在另一实施方案中，所述人抗体包括分别包含SEQ ID NO：2或6和SEQ ID NO：4或8中所示的氨基酸序列及其保守序列修饰的IgG重链可变区和κ轻链可变区。
本发明的具体抗体包括例如人单克隆抗体(mAb)14.1、7.4和8.2(也分别称为14A8、7F12和8D2)、或者结合于与抗体14.1、7.4或8.2相同的表位(例如与其竞争)或者具有与抗体14.1、7.4或8.2相同的功能结合特性的抗体。
本发明的人抗体可以在宿主细胞(例如CHO细胞或淋巴细胞)中重组生产，或者直接从表达所述抗体的杂交瘤(即它包括从其基因组中包含编码所述抗体的人重链转基因和人轻链转基因的转基因非人类动物如转基因小鼠中获得的、与无限增殖化细胞融合的B细胞)中获得。
在本发明的另一具体实施方案中，本发明的人抗体的特征可以是以下特性中的一个或多个：
(a)对人CD89有结合特异性；
(b)与人CD89的结合平衡缔合常数(Ka)为至少约107M-1；
(c)与人CD89的解离常数(Kd)为约10-8S-1或更低；
(c)在体内与CD89结合时不激活补体；
(d)在不抑制人IgA结合的位点上与人CD89结合；
(e)一条包含SEQ ID NO：2或6中所示氨基酸序列及其保守序列修饰的重链、和一条包含SEQ ID NO：4或8中所示氨基酸序列及其保守序列修饰的轻链。
另一方面，本发明提供编码所述人单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸分子。本发明也包括包含编码本发明抗体的核酸的重组表达载体以及用这种载体转染的宿主细胞，还包括通过培养这种宿主细胞制备本发明抗体的方法，例如包含编码mAb 14.1、7.4或8.2的重链和轻链可变区和恒定区的核苷酸序列的表达载体。
再一方面，本发明提供得自转基因非人类动物的分离的B细胞，所述转基因非人类动物例如表达本发明的人抗CD89抗体的转基因小鼠。优选所述分离的B细胞得自已经用CD89抗原纯化或富集制备物和/或表达CD89的细胞免疫的转基因非人类动物，例如转基因小鼠。优选所述转基因非人类动物如转基因小鼠具有包含编码完整的本发明抗体或其一部分的人重链转基因和人轻链转基因的基因组。然后将所述分离的B细胞无限增殖化，以提供人抗CD89抗体源(例如杂交瘤)。
因此，本发明也提供能够产生与CD89特异性结合的本发明的人单克隆抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，所述杂交瘤包括从其基因组中包含编码完整的本发明抗体或其一部分的人重链转基因和人轻链转基因的转基因非人类动物如转基因小鼠中获得的、与无限增殖化细胞融合的B细胞。具体的本发明杂交瘤包括14.1、7.4和8.2。
再一方面，本发明提供一种转基因非人类动物，如转基因小鼠(这里也称为″HuMab″)，所述转基因非人类动物表达与CD89特异性结合的人单克隆抗体。在一个具体实施方案中，所述转基因非人类动物是其基因组中包含编码完整的本发明抗体或其一部分的人重链转基因和人轻链转基因的转基因小鼠。可以用CD89抗原的纯化或富集制备物和/或表达CD89的细胞免疫所述转基因非人类动物。优选所述转基因非人类动物如转基因小鼠能够通过经过V-D-J重组和同种型转换，产生人多种同种型的抗CD89单克隆抗体(例如IgG、IgA和/或IgM)。同种型转换可以通过例如经典或非经典同种型转换而发生。
另一方面，本发明提供生产与CD89特异性反应的人单克隆抗体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：用CD89抗原的纯化或富集制备物和/或表达CD89的细胞，免疫其基因组中包含编码完整的本发明抗体或其一部分的人重链转基因和人轻链转基因的转基因非人类动物如转基因小鼠。然后获得所述动物的B细胞(例如脾B细胞)，将其与骨髓瘤细胞融合，形成分泌抗CD89的人单克隆抗体的无限增殖杂交瘤细胞。
再一方面，本发明的人抗CD89抗体用另一功能性分子如另一种肽或蛋白质(例如抗体或抗体片段，例如Fab’片段)衍生化、连接或与其共表达。例如，本发明的抗体或抗原结合部分可以与一种或多种其它分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方式)，所述其它分子实体例如另一种抗体(例如以产生双特异性或多特异性抗体)、细胞毒素(cytoxin)、细胞配体或抗原。本发明的双特异性和多特异性抗体可用于将表达CD89的细胞如效应细胞靶向所选抗原，例如肿瘤细胞、产生自身抗体的细胞、病原体感染的细胞或任何其它不想要的细胞上的表位，从而引起所述细胞或者与所述抗原相关的病原体的细胞溶解或吞噬。其它靶抗原包括可溶性抗原或抗原复合物以及微生物，例如病毒、寄生虫和细菌。
本发明的多特异性分子也包括三特异性、四特异性和其它的多特异性分子。在一个实施方案中，所述多特异性分子包括抗增强因子(EF)部分，例如与涉及细胞毒性活性的表面蛋白结合的分子。
因此，本发明包括与CD89表达细胞结合并且将其它分子靶向所述细胞、或者与CD89结合及与其它分子或细胞结合的、种类繁多的抗体缀合物、双特异性和多特异性分子以及融合蛋白。
另一方面，本发明提供包含与治疗部分连接的本发明的人抗CD89抗体的缀合物，所述治疗部分例如细胞毒性药、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗肿瘤药。
或者，本发明的人抗体可以与这样的治疗和细胞毒性药共同给予，但不与其连接。它们可以与这类药物同时共同给予(例如在一种组合物中给予或者分别给予)，或者它们可以在给予这类药物之前或之后给予。这类药物可以包括：细胞因子，例如G-CSF、GM-CSF、IL-2或IFN-α；和化疗药，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲。本发明的人抗体也可以结合放射治疗给予。
另一方面，本发明提供包含药学上可接受的载体和至少一种与CD89特异性结合的本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分的组合物，例如药用和诊断组合物/试剂盒。在一个实施方案中，所述组合物包含所述人抗体或其抗原结合部分的组合，优选每种所述人抗体或其抗原结合部分与不同的表位结合。包含至少一种本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分和至少一种本发明的双特异性或多特异性分子的组合的组合物如药用组合物，也包括在本发明的范围内。
对于在体内治疗和预防与CD89表达(例如过量表达)相关的疾病中的应用，可以将本发明的人抗体，用任何合适的给药途径，例如采用注射和本领域已知的用于基于抗体的临床制品的其它给药途径，以治疗有效量给予患者(例如人类受治疗者)。
本发明的人抗体也可以用来调节效应细胞上的CD89水平，例如通过覆盖和消除所述细胞表面上的受体来进行调节。抗Fc受体的混合物也可以用于此目的。
在另一实施方案中，阻断或抑制IgA与CD89结合的本发明的人抗体，可用于治疗特征为循环的含IgA复合物和/或IgA-免疫复合物沉淀的疾病，例如慢性肝炎、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、IgA性肾病(Berger病)或IgA性肾小球性肾炎。可以将本发明的人抗体给予患有这种疾病的患者，以在体内抑制或负调节内源IgA与CD89的结合。
基于它们既结合带有CD89的免疫细胞、又结合特定靶细胞(即其消除可能对宿主有益的细胞)的能力，本发明的双特异性和多特异性分子可以用于治疗各种各样的疾病。这类疾病包括但不限于：自身免疫病和癌症(例如膀胱、乳腺、结肠、肾、卵巢、睾丸、前列腺、肺、脑、直肠、胰腺、肝、中枢神经系统、头颈部、肾、骨、血液和淋巴系统)、病原体感染例如病毒(例如HIV、HTLV和FELV)、原生动物(例如鼠弓形体(Toxoplasma gondii))、真菌(例如白色念珠菌(Candida albicans))和细菌(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血性链球菌(Streptococcus hemolyticus)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculsis))感染。本发明的另一方面提供通过包括得自患病生物体、受感染细胞、患病生物体的基因产物或癌细胞的抗原、可供抵抗疾病和癌症的疫苗接种用的分子。为此，本发明提供组合物，所述组合物是使有用的有效抗原与将所述抗原靶向免疫系统的结合决定簇连接的结合剂。
在一个实施方案中，所述患者另外用化疗药、放射或调节如增强或抑制Fc受体如Fcα受体或Fcγ受体的表达或活性的因子如细胞因子来治疗。在治疗期间给药用的典型的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。典型的治疗药其中包括抗肿瘤药如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲。
再一方面，本发明提供一种在体外或体内检测样品中CD89存在的方法，例如用于诊断CD89相关疾病的方法。在一个实施方案中，这通过使受试样品、任选地和对照样品，与本发明的人单克隆抗体(或其抗原结合部分)在允许所述抗体和CD89之间形成复合物的条件下接触来实现。然后检测复合物的形成(例如运用ELISA)。当使用对照样品与受试样品时，在两种样品中检测到复合物，并且在所述样品之间复合物形成的任何统计学显著性差异，指示受试样品中存在CD89。
根据以下详述和实施例，本发明的其它特征和优点是显而易见的，所述实施例不应解释为是限制性的。本申请中引用的所有参考文献、专利和已公开的专利申请的内容通过引用结合到本文中。
附图简述
图1显示了得自HuMAb 14.1的VH区的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。也描绘了CDR区。用于HuMAb 14.1 VH区的种系区段包括VH 3-30.3、D 6-13和JH4b。
图2显示了得自HuMAb 14.1的VK区的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。也描绘了CDR区。用于HuMAb 14.1 VK区的种系区段包括VK L18和JK3。
图3显示了得自HuMAb 8D2的VH区的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。也描绘了CDR区。用于HuMAb 8D2 VH区的种系区段包括VH 3-30.3、D7-27和JH3b。
图4显示了得自HuMAb 8D2的VK区的核苷酸序列和相应的氨基酸序列。也描绘了CDR区。用于HuMAb 8D2 VK区的种系区段包括VK A27和JK2。
发明详述
本发明提供与人IgA受体(CD89)上存在的表位结合的分离的人单克隆抗体，包括其抗原结合部分。在一个实施方案中，所述人抗体在能够通过经过V-D-J重组和同种型转换而产生多种同种型的人抗CD89单克隆抗体(例如IgG、IgA和/或IgE)的转基因非人类动物如转基因小鼠中产生。因此，本发明的特定方面不仅包括抗体、抗体片段及其药用组合物，而且还包括产生单克隆抗体的转基因非人类动物、B细胞和杂交瘤。本发明也包括用本发明的抗体在体外或者体内检测表达CD89的细胞或者在表达CD89的细胞中触发效应子功能(例如通过用包含本发明抗CD89抗体和针对靶细胞上抗原的另一种抗体的双特异性抗体来交联CD89分子)的方法。也提供用本发明的抗体阻断或抑制IgA与CD89结合的方法，所述方法可用于治疗特征为异常内源性IgA的疾病，例如特征为循环的含IgA复合物和/或IgA免疫复合物沉淀的疾病，例如慢性肝炎、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、IgA性肾病(Berger病)或IgA性肾小球性肾炎。
为了更好地理解本发明，首先定义某些术语。其它定义在详述中叙述。
此中所用的术语“CD89”、“人IgA受体”和“Fcα受体”(FcαRI)可互换使用，意指包括位于19号染色体上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知该基因编码55-110 kDa的几种可变剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2有中等亲和力(≈5×107M-1)，它在暴露于细胞因子如G-CSF或GM-CSF后增加(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology16：423-440)。FcαRI受体是供本发明用的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞例如单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达；(2)以高水平表达(例如5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性的介质(例如ADCC、吞噬作用)；(4)介导增强的靶向抗原包括自身抗原靶向其自身的抗原呈递。
此中所用的术语“效应细胞”是指参与免疫应答效应期的免疫细胞，而不是参与免疫应答的识别期和激活期的免疫细胞。示例性的免疫细胞包括骨髓起源或淋巴起源的细胞，例如淋巴细胞(例如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、多形核细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。某些效应细胞表达特异性Fc受体，并且执行特定的免疫功能。在优选实施方案中，效应细胞能够诱导抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)，例如能够诱导ADCC的嗜中性粒细胞。例如，表达FcR的单核细胞、巨噬细胞参与特异性杀伤靶细胞并且将抗原呈递给免疫系统的其它组分，或者与呈递抗原的细胞结合。在其它实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原、靶细胞或微生物。效应细胞上特定FcR的表达，可以受体液因子如细胞因子的调控。例如，已经发现FcαRI的表达被G-CSF或GM-CSF正调节。这种增强的表达，增强了带有FcαRI的细胞针对靶的效应子功能。效应细胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶细胞。
“靶细胞”是指受治疗者(例如人或动物)体内可以被本发明组合物(例如人单克隆抗体、双特异性或多特异性分子)所靶向的任何不想要的细胞。在一个实施方案中，所述靶细胞是表达或过量表达CD89的细胞。在另一实施方案中，靶细胞包括肿瘤细胞。可以被靶向的肿瘤细胞是任何癌类型的肿瘤细胞，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、中枢神经系统癌症、肾癌、头部癌症、颈部癌症、骨癌、血癌和淋巴系统癌症。除肿瘤细胞以外，所述效应细胞可以被靶向产生自身抗体的淋巴细胞以治疗自身免疫病，或者被靶向产生IgE的淋巴细胞以治疗变态反应。所述靶也可以是微生物(细菌或病毒)或可溶性抗原(例如类风湿因子或其它自身抗体和毒素)。微生物意指包括病原体，例如病毒、细菌、真菌、原生动物。
术语“抗原”是指任何天然或合成的免疫原性物质、免疫原性物质的片段或部分、肽表位或半抗原。术语“抗原”也包括以非复合形式时无免疫原性、但在复合时有免疫原性的物质。术语“非复合的”包括未连接形成本发明的分子复合物的物质。术语“复合的”包括连接形成本发明的分子复合物的物质。
此中所用的术语“抑制生长”(例如涉及细胞)意指包括与未接触抗CD89抗体的相同细胞的生长相比，使与抗CD89抗体接触时细胞生长的任何可测量的降低，例如，细胞的生长被抑制至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
此中所用的术语“抑制结合”和“阻断结合”(例如涉及抑制/阻断CD89配体的结合，例如IgA与CD89的结合)可互换使用，包括部分抑制/阻断，也包括完全抑制/阻断。抑制/阻断IgA与CD89结合，优选降低或改变在无抑制或阻断下IgA与CD89结合时发生的效应细胞功能的正常水平或类型。抑制和阻断也意指包括与未接触抗CD89抗体时的配体相比，与抗CD89抗体接触时IgA对CD89的结合亲和力的任何可测量的降低，例如CD89配体与CD89结合被阻断至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
此中涉及的术语“抗体”包括完整的抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链或其抗原结合部分的糖蛋白。每条重链由重链可变区(此中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域-CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域-CL组成。VH和VL区还可以细分为散布有更为保守的称为构架区(FR)的区的超变区-称为互补决定区(CDR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端以下述顺序排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有一个与抗原相互作用的结合结构域。所述抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
此中所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体部分”)是指保留与抗原(例如CD89)特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。包括在术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1区组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包含由通过二硫桥在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH区和CH1区组成的Fd片段；(iv)由抗体一条臂的VL和VH区组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，由一个VH区组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个区-VL和VH由不同基因编码，但可以运用重组方法，通过合成接头将它们连接，使它们成为单链蛋白质，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242：423-426，和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA，85：5879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。采用本领域技术人员已知的常规技术，获得这些抗体片段，并且可以以与完整抗体的相同方式，根据用途对所述片段进行筛选。
术语“表位”是指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面集合(surface grouping)组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，是与前者的结合而非与后者的结合丧失。
术语“双特异性分子”意指包括具有两种不同结合特异性的任何因子，例如蛋白质、肽或者蛋白质或肽的复合物。例如，所述分子可以与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面的Fc受体如CD89结合或相互作用。术语“多特异性分子”或者“异特异性分子”意指包括具有不止两种不同结合特异性的任何因子，例如蛋白质、肽或者蛋白质或肽的复合物。例如，所述分子可以与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面的Fc受体和(c)至少一种其它组分结合或相互作用。因此，本发明包括但不限于针对细胞表面抗原如CD89和针对其它靶如效应细胞上的Fc受体的双特异性、三特异性、四特异性和其它多特异性分子。
术语“双特异性抗体”也包括双抗体(diabody)。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH区和VL区在一条多肽链上表达，但使用一个接头来表达，所述接头太短而不允许同一链上的两个区之间配对，从而迫使所述区与另一条链的互补区配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger，P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等(1994)Structure 2：1121-1123)。
此中所用的术语“异抗体(heteroantibody)”是指连接在一起两个或更多个抗体、抗体结合片段(例如Fab)、其衍生物或抗原结合区，其中至少两个具有不同的特异性。这些不同的特异性包括对效应细胞上的Fc受体的结合特异性和对靶细胞如肿瘤细胞上抗原或表位的结合特异性。
此中所用的术语“人抗体”意指包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或定点诱变或者通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，此中所用的术语“人抗体”不包括其中来源于另一哺乳动物种如小鼠种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。
此中所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一的结合特异性和亲和性。因此，术语“人单克隆抗体”是指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区、显示出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，所述人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从其基因组中包含人重链转基因和轻链转基因的转基因非人类动物如转基因小鼠中获得的、与无限增殖化细胞融合的B细胞。
此中所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、构建或分离的所有人抗体，例如(a)从对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(在以下小节I中有进一步的描述)，(b)利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(c)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列上的任何其它方法制备、表达、构建或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，可以对这样的重组人抗体进行体外诱变(或者当使用对于人Ig序列为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，因此所述重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是来源于人种系VH和VL序列并且与之相关、但可能在体内于通常情况下并不存在于人抗体种系库中的序列。
此中所用的“异源抗体”是对于产生这种抗体的转基因非人类生物体而言定义的。该术语是指具有对应于在不是由所述转基因非人类动物构成的生物体中存在的、一般得自除所述转基因非人类动物以外的物种的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体。
此中所用的“异源杂种抗体”是指具有来源于不同生物体的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链结合的人重链的抗体是一种异源杂种抗体。异源杂种抗体的实例包括嵌合抗体和人源化抗体，在上文有论述。
此中所用的术语“分离的抗体”是指基本上没有具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如基本上没有特异性结合非CD89的抗原的抗体的、与CD89特异性结合的分离的抗体)。然而，与人CD89的表位、同种型或变异体特异性结合的分离的抗体，可以与其它相关抗原如来自其它物种的抗原(例如CD89种同源物)有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上无其它细胞材料和/或化学物质。在本发明的一个实施方案中，具有不同特异性的“分离的”单克隆抗体的组合在一种成分充分确定的组合物中组合。
此中所用的“特异性结合”是指抗体与预定抗原结合。通常，所述抗体以至少大约1×107M-1的亲和力结合，并且与所述预定抗原的结合亲和力至少两倍于与除所述预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力。短语“识别一种抗原的抗体”和“对一种抗原特异性的抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
此中所用的术语IgG抗体的“高亲和性”是指结合亲和力至少为大约107M-1、优选至少大约108M-1、更优选至少大约109M-1、1010M-1、1011M-1或更高，例如高达1013M-1或更高。然而，“高亲和性”结合对于其它抗体同种型而言可能改变。例如，IgM同种型的“高亲和性”结合是指至少约为1×107M-1的结合亲和力。
此中所用的术语“Kassoc”或“Ka”是指特定抗体-抗原相互作用的缔合常数。
此中所用的术语“Kdis”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
此中所用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
此中所用的“同种型转换”是指抗体的类别或同种型从一种Ig类别变为其它Ig类别之一的现象。
此中所用的“非转换同种型”是指当不发生同种型转换时产生的重链的同种型类别；编码所述非转换同种型的CH基因通常是紧接功能性重排VDJ基因下游的第一个CH基因。同种型转换分为经典或非经典同种型转换。经典同种型转换通过涉及所述转基因中至少一个转换序列区的重组事件而发生。非经典同种型转换可能通过例如人σμ和人∑μ(δ相关缺失)之间同源重组而发生。替代的非经典转换机制例如其中有可能发生转基因间和/或染色体间重组，而完成同种型转换。
此中所用的术语“转换序列”是指负责转换重组的那些DNA序列。“转换供体”序列通常为μ转换区，位于在所述转换重组期间将被缺失的构建体区的5’(即上游)。“转换受体”区位于构建体待缺失区和取代恒定区(例如γ、ε等)之间。由于没有总是发生重组的特定位点，故此最终的基因序列通常不能根据所述构建体来预测。
此中所用的“糖基化模式”定义为与蛋白质共价连接、更具体地说与免疫球蛋白共价连接的糖单位的模式。当本领域技术人员认为，与所述转基因的CH基因来源的物种相比，所述异源抗体的糖基化模式与所述转基因非人类动物物种中的所述糖基化模式更为相似时，异源抗体的糖基化模式可以被描述为与在所述转基因非人类动物的物种所产生的抗体上正常发生的糖基化模式基本相似。
此中所用的术语“天然存在的”当用于物体时，是指物体可以在自然界中被发现的事实。例如，生物体(包括病毒)中存在的、可以从自然界的来源分离并且未经人类在实验室中有意修饰的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
此中所用的术语“重排的”是指其中在分别编码基本上完整的VH或VL区的构象中V区段紧邻D-J或J区段定位的重链或轻链免疫球蛋白基因座的构型。通过与种系DNA比较，可以鉴定重排的免疫球蛋白基因座；重排的基因座具有至少一个重组的七聚体/九聚体同源性元件。
此中所用的涉及V区段的术语“未经重排的”或“种系构型”是指其中V区段未经过重组而紧邻D区段或J区段的构型。
此中所用的术语“核酸分子”是指包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。
此中所用的涉及编码与CD89结合的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸的术语“分离的核酸分子”，是指其中编码所述抗体或抗体部分的核苷酸序列不含编码与除CD89以外的抗原结合的抗体或抗体部分的其它核苷酸序列的核酸分子，所述其它序列在人基因组DNA中可能天然位于所述核酸的侧翼。在一个实施方案中，所述人抗CD89抗体或其部分包括14.1、7.4、8.2的核苷酸序列或氨基酸序列以及分别具有SEQ ID NO：1、3、5、7和2、4、6、8中所示序列的重链(VH)和轻链(VL)可变区。
正如此中公开的和要求保护的，SEQ ID NO：1-8中所示的序列包括“保守的序列修饰”即不显著影响或改变所述核苷酸序列所编码的或者含有所述氨基酸序列的抗体的结合特性的核苷酸序列和氨基酸序列的修饰。这样的保守序列修饰包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。可以采用本领域已知的标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入SEQ ID NO：1-8中。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的一种氨基酸残基取代的保守氨基酸取代。在本领域已经确定了多组具有相似侧链的氨基酸残基。这些组包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，人抗CD89抗体中的预测非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链组的另一氨基酸残基取代。
或者，在另一实施方案中，可以例如通过饱和诱变，沿完整的抗CD89抗体编码序列或其部分随机引入突变，并且可以根据结合活性对所得的经修饰抗CD89抗体进行筛选。
因此，由此中公开的(重链和轻链可变区)核苷酸序列(即SEQ IDNO：1、3、5和7)所编码的和/或含有此中公开的(重链和轻链可变区)氨基酸序列(即SEQ ID NO：2、4、6和8)的抗体，包括由已经过保守修饰的相似序列所编码的或含有已经过保守修饰的相似序列的基本上相似的抗体。在下文提供可以如何根据此中公开为SEQ ID NO：1-8的部分的(即重链和轻链可变区)序列产生这类基本相似抗体的进一步的论述。
对于核酸而言，术语“实质同源性”表示当进行最佳比对和比较时，在适当插入或缺失核苷酸的情况下，两种核酸或其指定序列在至少约80％、通常至少约90％至95％、更优选至少约98％至99.5％的核苷酸中是相同的。或者，当所述区段在选择性杂交条件下与所述链的互补链杂交时，存在实质同源性。
考虑到进行两个序列最佳比对所需要引入的空位数和每个空位的长度，两个序列之间的百分同一性是所述序列共享的相同位置数的函数(即％同源性＝相同位置数/总位置数×100)。两种序列之间的序列比较和百分同一性的确定，可以用数学算法(如以下非限制性实施例中所述的)来完成。
可以运用  GCG软件包中的GAP程序(可得自http：//www.gcg.com)，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及40、50、60、70或80的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重，测定两个核苷酸序列之间的百分同一性。也可以用已经加入到ALIGN程序(version2.0)中的E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988))，用PAM120权重残基表、空位长度罚分为12以及空位罚分为4，测定两种核苷酸序列或氨基酸序列之间的百分同一性。另外，可以用已经加入到GCG软件包的GAP程序(可得自http：//www.gcg.com)中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及空位权重为16、14、12、10、8、6、或4和长度权重为1、2、3、4、5或6，测定两个氨基酸序列之间的百分同一性。
本发明的核酸序列和蛋白质序列还可以用作“查询序列”，对公共数据库进行搜索，以便例如鉴定相关序列。这样的搜索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)来进行。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序、score(分值)＝100、wordlength(字长)＝12来进行，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序、score(分值)＝50、wordlength(字长)＝3来进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得加入空位的比对以供比较，可以如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述，利用Gapped BLAST。当用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
所述核酸可能存在于全细胞、细胞裂解液中，或者以部分纯化或基本纯化形式存在。当用标准技术，包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术经过纯化而与其它细胞组分或其它污染物例如其它细胞核酸或蛋白质分离时，核酸是“分离的”或“成为基本纯的”。参见F.Ausubel等编著.Current Protocolsin Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)。
本发明的核酸组合物虽然常常在来自cDNA、基因组或混合物的天然序列中(除经修饰的限制位点等之外)，但可以依照提供基因序列的标准技术对其进行突变。对于编码序列，这些突变可以影响所需的氨基酸序列。特别是，考虑了与天然V序列、D序列、J序列、恒定区序列、转换序列和此中所述的其它这类序列基本同源或来源于此的DNA序列(其中“来源于”是指一种序列与另一序列相同，或者由另一序列经修饰而来)。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能关系中时，所述核酸被“操作上连接”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则所述启动子或增强子与所述序列操作上连接。关于转录调控序列，操作上连接是指所连接的DNA序列相邻，并且必要时使两个蛋白质编码序列相邻并且符合读框地连接。对于转换序列，操作上连接表示所述序列能够影响转换重组。
此中所用的术语“载体”是指能够转运与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，质粒是指可以将额外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以被连接到所述病毒基因组中。某些载体能够在所导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在被导入宿主细胞后可以整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与之操作上连接的基因的表达。这类载体在此被称为“重组表达载体”(或者简称“表达载体”)。一般而言，重组DNA技术中应用的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括用于等同功能的这样的其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
此中所用的术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指其中导入了重组表达载体的细胞。应该理解，这类术语不仅指特定的题述细胞，而且也指这种细胞的后代。因为在后续世代中可能由于或者突变或者环境影响而发生某些修饰，所以这样的后代可能事实上与亲代细胞不完全相同，但仍包括在此中所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如CHO细胞和淋巴细胞。
在以下小节中更详细地描述本发明的各个方面。
I.人抗CD89抗体的产生
本发明的单克隆抗体(mAb)可以用各种各样的技术，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术来产生。虽然优选体细胞杂交法，但是原则上，可以利用其它产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或癌基因转化。
用于制备杂交瘤的优选动物系统是鼠系统。在小鼠中产生杂交瘤是一种非常充分确立的方法。用于分离经免疫的脾细胞以供融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合组分(fusion partner)(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
在一个优选实施方案中，可以用携带人免疫系统的部分而非小鼠系统的部分的转基因小鼠，产生针对CD89的人单克隆抗体。这些转基因小鼠在此称为“HuMab”小鼠，含有编码未经重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)以及使内源μ链和κ链基因座失活的靶突变(Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，所述小鼠表现出小鼠IgM或κ表达减少，并且对免疫应答，所导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和力的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等，(1994)，参见上文；有关综述参见Lonberg，N.(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，以及Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad Sci 764：536-546)。HuMab小鼠的制备在以下小节II和以下文献中有描述：Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等，(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Taylor，L.等(1994)International Immunology 6：579-591；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有上述文献的内容通过引用全部结合到本文中。还参见Lonberg和Kay的GenPharm International-美国专利第5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,66 1,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429号；Surani等的美国专利第5,545,807号；国际公开说明书WO 98/24884，于1994年6月11日公开；WO 94/25585，于1 994年11月10日公开；WO 93/1227，于1993年6月24日公开；WO 92/22645，于1992年12月23日公开；WO92/03918，于1992年3月19日公开，所有上述文献的公开内容通过引用全部结合到本文中。另一方面，可以用实施例2中描述的HCO12转基因小鼠，来产生人抗CD89抗体。
HuMab免疫
为了产生全人抗CD89单克隆抗体，如以下文献所述：Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14：845-851和WO 98/24884，可以用CD89抗原的纯化或富集制备物和/或表达CD89的细胞，免疫HuMab小鼠。优选所述小鼠在首次输注时为6-16周龄。例如，可以用CD89抗原的纯化或富集制备物(5-20μg)(例如从表达CD89的LNCaP细胞中纯化的)，腹膜内免疫所述HuMab小鼠。在用CD89抗原的纯化或富集制备物的免疫不产生抗体时，也可以用表达CD89的细胞，例如肿瘤细胞系来免疫小鼠，以促进免疫应答。
使用各种抗原的积累的经验表明，所述HuMab转基因小鼠最初用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫、然后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内免疫(直至总共6次)时，应答最佳。可以在免疫方案实施的过程中，用通过眶后放血获得血浆样品，监测免疫应答。可以通过ELISA(如下所述)对血浆进行筛选，用具有足够效价的抗CD89人免疫球蛋白的小鼠进行融合。在处死和取出脾脏之前3天，可以用抗原给小鼠静脉内加强免疫。预计可能需要每种抗原进行2-3次融合。每种抗原免疫数只小鼠。例如，可以免疫总共12只HC07和HC012品系的HuMab小鼠。
生产人抗CD89单克隆抗体的杂交瘤的产生
可以根据标准方案，分离小鼠脾细胞，用PEG使其与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后根据抗原特异性抗体的产生，对所得的杂交瘤进行筛选。例如，使用50％PEG，使得自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与1/6数目的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRI 1580)融合。细胞以约2×105接种到平底微量滴定板中，然后在含有20％胎儿Clone Serum、18％″653″条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；HAT在融合后24小时加入)的选择培养基中孵育2周。2周后，在其中HAT被HT取代的培养基中培养细胞。然后通过ELISA，针对人抗CD89单克隆IgM和IgG抗体对各孔进行筛选。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天后观测培养基。将分泌所述抗体的杂交瘤再接种，再次进行筛选，如果人IgG仍为阳性，则可以通过有限稀释，将抗CD89单克隆抗体亚克隆至少两次。然后，体外培养稳定的亚克隆，以便在组织培养基中产生少量抗体，以供表征。
应用部分抗体序列来表达完整的抗体
抗体主要通过位于所述6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基，与靶抗原相互作用。因此，在各种抗体之间，CDR内的氨基酸序列比CDR之外的序列更为多样化。因为CDR序列负责大多数的抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建包含移植到得自具有不同特性的不同抗体的构架序列上的得自特定天然存在的抗体的CDR序列的表达载体，来表达模拟特定天然存在的抗体特性的重组抗体(参见例如Riechmann，L.等，1998，Nature 332：323-327；Jones，P.等，1986，Nature 321：522-525；和Queen，C.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033)。这样的构架序列可以得自包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库。这些种系序列将不同于成熟抗体基因序列，因为它们将不包括完全装配的可变区基因，后者在B细胞成熟期间通过V(D)J连接而形成。种系基因序列也将不同于在个体水平上均匀跨越的高亲和性次级抗体库的序列。例如体细胞突变在构架区的氨基端部分中相对稀少。例如，体细胞突变在构架区1的氨基端部分和构架区4的羧基端部分中相对稀少。此外，许多体细胞突变并不显著改变抗体的结合特性。因此，不必获得特定抗体的完整DNA序列，来重构建具有与原始抗体相似的结合特性的完整重组抗体(参见1999年3月12日申请的PCT/US99/05535，该文献通过引用结合到本文中用于所有目的)。对于这一目的，跨越所述CDR区的部分重链和轻链序列通常是足够的。用所述部分序列来确定哪些种系可变区基因区段和连接基因区段构成所述重组抗体可变区基因。然后，用所述种系序列补上所述可变区的丢失部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟期间被切割，并不影响最终抗体的特性。因此，表达构建体不必使用相应的种系前导序列。为了添加丢失的序列，可以通过连接或PCR扩增，将克隆化cDNA序列与合成寡核苷酸结合。或者，可以将完整的可变区作为一组短的重叠寡核苷酸来合成，然后通过PCR扩增连接，构建完全的合成可变区克隆。这一方法有一些优点，例如消除或包含特定的限制位点或者优化特定的密码子。
利用得自杂交瘤的重链和轻链转录物的核苷酸序列，来设计一组重叠的合成寡核苷酸，以构建具有与天然序列相同的氨基酸编码能力的合成V序列。所述合成重链和κ链序列可以以三种方式不同于天然序列：重复核苷酸碱基序列段被中断，以有助于寡核苷酸合成和PCR扩增；依照Kozak规则(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266L19867019870)掺入最适翻译起始位点；以及将HindIII位点工程化到翻译起始位点的上游。
对于重链和轻链可变区，将优化的编码链序列和相应的非编码链序列在相应的非编码寡核苷酸的大约中点处打断为30-50个核苷酸的区段。因此，对于每条链，可以将所述寡核苷酸装配为跨越150-400个核苷酸的区段的多组重叠双链。然后用所述库作为模板，产生150-400个核苷酸的PCR扩增产物。通常，将一组可变区寡核苷酸分为两个库，分别扩增所述库，产生两种重叠PCR产物。然后，通过PCR扩增合并这些重叠产物，形成完整的可变区。也可能需要在PCR扩增中包括重链或轻链恒定区的重叠片段(包括κ轻链的BbsI位点或γ重链的AgeI位点)，以产生可以容易被克隆到所述表达载体构建体中的片段。
重构建的重链和轻链可变区然后与克隆的启动子序列、翻译起始序列、恒定区序列、3’非翻译序列、聚腺苷酸化序列和转录终止序列结合，构成表达载体构建体。可以将所述重链和轻链表达构建体结合到一种载体中、共转染、顺序转染或分别转染到宿主细胞中，然后融合形成表达这两条链的宿主细胞。
下面描述用于构建人IgGκ表达载体的质粒。构建所述质粒，使得PCR扩增的V重链和Vκ轻链cDNA序列可以用来重构建完整的重链和轻链小基因(minigene)。这些质粒可以用来表达完整的人或嵌合IgG1κ或IgG4κ抗体。可以构建相似的质粒，用于表达其它重链同种型，或者用于表达包含λ轻链的抗体。
因此，在本发明的另一方面，本发明的人抗CD89抗体14.1、7.4或8.2的结构特征用来构建保留本发明抗体的至少一种功能特性如与CD89结合的、结构相关的人抗CD89抗体。更具体地讲，可以将14.1、7.4或8.2的一个或多个CDR区与已知的人构架区和CDR重组结合，构建另外的本发明的重组工程化人抗CD89抗体。
因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗CD89抗体的方法，所述方法包括：
制备一种抗体，所述抗体包含：(1)人重链构架区和人重链CDR，其中所述人重链CDR中至少一个包含选自图1或图3中所示CDR的氨基酸序列(或SEQ ID NO：2或6中的相应氨基酸残基)的氨基酸序列；和(2)人轻链构架区和人轻链CDR，其中所述人轻链CDR中至少一个包含选自图2或图4中所示CDR的氨基酸序列(或SEQ ID NO：4或8中的相应氨基酸残基)的氨基酸序列；
其中所述抗体保留与CD89结合的能力。所述抗体结合CD89的能力可以用标准结合测定例如实施例中所述的结合测定(例如ELISA)来测定。
由于本领域众所周知抗体重链和轻链的CDR3区在抗体对抗原的结合特异性/亲和性方面起着特别重要的作用，所以如上所述制备的本发明的重组抗体优选包含14.1、7.4或8.2的重链和轻链CDR3。所述抗体还可以包含14.1、7.4或8.2的CDR2。所述抗体还可以包含14.1、7.4或8.2的CDR1。因此，本发明还提供抗CD89抗体，所述抗CD89抗体包含：(1)人重链构架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区和人重链CDR3区，其中所述人重链CDR3区选自图1或图3中所示的14.1、7.4和8.2的CDR3(或SEQ ID NO：2或6中的相应氨基酸残基)；和(2)人轻链构架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区和人轻链CDR3区，其中所述人轻链CDR3区选自图2或图4中所示的14.1、7.4和8.2的CDR3(或SEQ ID NO：4或8中的相应氨基酸残基)，其中所述抗体结合CD89。所述抗体还可以包含14.1、7.4或8.2的重链CDR2和/或轻链CDR2。所述抗体还可以包含14.1、7.4或8.2的重链CDR1和/或轻链CDR1。
最好是，上述工程抗体的CDR1、CDR2和/或CDR3包含与此中公开的14.1、7.4或8.2完全相同的氨基酸序列。然而，本领域技术人员会认识到，可以允许与14.1、7.4和8.2准确的CDR序列有一些偏离，但仍保留所述抗体有效结合CD89的能力(例如保守取代)。因此，在另一实施方案中，所述工程抗体可以由例如与14.1、7.4或8.2的一个或多个CDR有90％、95％、98％或99.5％相同的一个或多个CDR组成。
除简单地结合CD89之外，可以对工程抗体例如上述那些抗体，根据其保留本发明抗体的其它功能特性的情况来进行选择。其它功能特性例如：
1)与表达CD89的活细胞结合；
2)与CD89高亲和性结合；
3)与CD89上的特有表位结合(以消除联合应用时具有互补活性的单克隆抗体竞争与同一表位结合的可能性)；
4)对表达CD89的细胞的调理作用；和/或
5)在人效应细胞存在下介导对表达CD89的细胞的生长抑制、吞噬作用和/或杀伤。
人抗CD89单克隆抗体结合的表征
为了表征本发明的人CD89单克隆抗体的结合，可以例如通过ELISA，检验得自免疫小鼠的血清。在ELISA方案的一个典型(但非限制性的)实施例中，用含0.25μg/ml纯化CD89的PBS溶液包被微量滴定板，然后用含5％牛血清白蛋白的PBS溶液封闭。将得自CD89免疫小鼠的血浆的稀释液加入到各孔中，于37℃保温1-2小时。所述板用PBS/Tween洗涤，然后与缀合了碱性磷酸酶的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂一起于37℃保温1小时。洗涤后，所述板用pNPP底物(1mg/ml)显色，分析405-650的OD。优选将产生最高效价的小鼠用于融合。
也可以用如上所述的ELISA测定，筛选显示出与CD89免疫原阳性反应的杂交瘤。将以高亲和力结合CD89的杂交瘤亚克隆，并且对其进一步表征。可以从每个杂交瘤中选择一个保留亲代细胞反应性(通过ELISA)的克隆，用于制备贮存于-140℃的5-10个小瓶的细胞库以及用于抗体纯化。
为了纯化人抗CD89抗体，可以让所选杂交瘤在2升旋动烧瓶中生长，以供纯化单克隆抗体用。在用A蛋白-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和色谱之前，可以将上清液过滤并浓缩。可以通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG，以确保纯度。可以将缓冲液交换为PBS，用1.43消光系数，根据OD280确定浓度。将单克隆抗体分成等份，贮存于-80℃。
为了确定所选的人抗CD89单克隆抗体是否与特有表位结合，可以用市售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素酰化。可以用如上所述的CD89包被的ELISA板，进行用未标记单克隆抗体和生物素酰化单克隆抗体的竞争研究。可以用链霉亲和素-碱性磷酸酶探针检测生物素酰化mAb结合。
为了确定纯化抗体的同种型，可以进行同种型ELISA。例如，可以用10μg/ml抗人Ig于4℃包被微量滴定板各孔过夜。在用5％BSA封闭后，让所述板与10μg/ml单克隆抗体或纯化的同种型对照在周围温度下反应2小时。然后，让各孔与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合探针反应。如上所述使板显色和进行分析。
为了证明单克隆抗体与表达CD89的活细胞结合，可以使用流式细胞术。在流式细胞术方案的一个典型(但非限制性)的实施例中，将表达CD89的细胞系(在标准生长条件下生长的)与含有0.1％Tween 80和20％小鼠血清的含各种浓度单克隆抗体的PBS溶液混合，于37℃孵育1小时。洗涤后，让细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体在与第一抗体染色的相同条件下反应。可以运用FACScan仪器，利用光散射和侧向散射特性对单细胞进行门控来分析样品。(除了或者替代)流式细胞术测定，可以使用利用荧光显微镜的替代测定。可以完全如上所述将细胞染色，然后用荧光显微镜检查。这一方法允许显现出各个细胞，但基于抗原的密度，可能降低了灵敏度。
还可以通过蛋白质印迹分析，检验抗CD89人IgG与CD89抗原的反应性。例如，可以制备得自表达CD89的细胞的细胞提取物，并且进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将分离的抗原转移到硝化纤维素膜上，用20％小鼠血清封闭，然后用待测单克隆抗体探测。人IgG结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶来检测，并且用BCIP/NBT底物片(tablets)(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)来显色。
II.产生人抗CD89单克隆抗体的转基因非人类动物的产生
再一方面，本发明提供能够表达与CD89特异性结合(优选以高亲和力结合)的人单克隆抗体的转基因非人类动物，例如转基因小鼠。在一个优选实施方案中，所述转基因非人类动物如转基因小鼠(HuMab小鼠)具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。在一个实施方案中，所述转基因非人类功能如转基因小鼠已用CD89抗原的纯化或富集制备物和/或表达CD89的细胞免疫。最好是，所述转基因非人类动物如转基因小鼠能够通过经历V-D-J重组和同种型转换，产生多种同种型的人抗CD89单克隆抗体(例如IgG、IgA和/或IgE)。同种型转换可以通过例如经典或非经典同种型转换而发生。
具有异源抗体库、对外源抗原刺激应答的转基因非人类动物的设计，要求在所述转基因动物体内所含有异源免疫球蛋白转基因，在B细胞发育途径中正确发挥功能。在一个优选实施方案中，异源重链转基因的正确功能包括同种型转换。因此，构建本发明的转基因，以便产生同种型转换和以下功能中的一个或多个：(1)高水平和细胞类型特异性的表达，(2)功能性基因重排，(3)激活等位基因排斥或者对等位基因排斥应答，(4)表达足够的初级库，(5)信号转导，(6)体细胞超变，和(7)在免疫应答期间所述转基因抗体基因座的显性化。
不是所有上述标准都需要符合。例如，在其中转基因动物的内源免疫球蛋白基因座被功能性破坏的那些实施方案中，所述转基因不需要激活等位基因排斥。此外，在其中所述转基因包含功能性重排的重链和/或轻链免疫球蛋白基因的那些实施方案中，功能性基因重排的第二条标准是不必要的，至少对于已经重排的所述转基因而言。关于分子免疫学的背景，参见Fundamental Immunology，2nd edition(1989)，PaulWilliam E.编著Raven Press，N.Y.，该文献通过引用结合到本文中。
在某些实施方案中，用以产生本发明的人单克隆抗体的转基因非人类动物，在其种系中含有重排的、未经重排的或者重排和未经重排的组合的异源免疫球蛋白重链和轻链转基因。每个重链转基因包含至少一个CH基因。另外，所述重链转基因可以含有功能性同种型转换序列，所述同种型转换序列能够支持所述转基因动物的B细胞中编码多个CH基因的异源转基因的同种型转换。这样的转换序列可以是在得自用作所述转基因CH基因来源的物种的种系免疫球蛋白基因座中天然存在的那些转换序列，或者这样的转换序列可以来源于在待接受所述转基因构建体的物种(所述转基因动物)体内存在的转换序列。例如，用来产生转基因小鼠的人转基因构建体，当其掺入了与在小鼠重链基因座中天然存在的转换序列相似的转换序列时，可以产生较高频率的同种型转换事件，因为推测所述小鼠转换序列被优化，从而可与小鼠转换重组酶系统一起发挥作用，而所述人转换序列则不能。可以用常规克隆方法分离和克隆转换序列，或者可以从基于涉及免疫球蛋白转换区序列的已发表的序列信息(Mills等，Nucl.Acids Res.15：7305-7316(1991)；Sideras等，Intl.Immunol.1：631-642(1989)，所述文献通过引用结合到本文中)设计的重叠合成寡核苷酸，从头合成转换序列。
对于每种上述转基因动物，在所述转基因动物的显著比率的B细胞(至少10％)中，发现功能性重排的异源重链和轻链免疫球蛋白转基因。
用来产生本发明转基因动物的转基因包括一种重链转基因，所述重链转基因包含编码至少一个可变区基因区段、一个多样性基因区段、一个连接基因区段和至少一个恒定区基因区段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因包含编码至少一个可变区基因区段、一个连接基因区段和至少一个恒定区基因区段的DNA。编码所述轻链和重链基因区段的基因区段，对于它们来源的转基因非人类动物是异源的，或者对应于来自不构成所述转基因非人类动物的物种的编码免疫球蛋白重链和轻链基因区段的DNA。在本发明的一个方面，构建所述转基因，使得所述各个基因区段是未经重排的，即没有重排而编码功能性免疫球蛋白轻链或重链。这样的未经重排的转基因支持V、D和J基因区段的重组(功能性重排)，优选支持在暴露于CD89抗原时整个D区基因区段或其部分掺入到所述转基因非人类动物的所产生的重排免疫球蛋白重链中。
在一个替代实施方案中，所述转基因包含未经重排的“小基因座(mini-locus)”。这种转基因通常包含C、D和J区段的显著部分以及一个亚组的V基因区段。在这种转基因构建体中，所述各种调控序列例如启动子、增强子、类别转换区、供RNA加工用的剪接供体和剪接受体序列、重组信号等，包含来源于所述异源DNA的相应序列。这样的调控序列可以掺入到来自与本发明中所用的非人类动物相同或相关的物种的转基因中。例如，人免疫球蛋白基因区段可以在转基因中与啮齿动物免疫球蛋白增强子序列结合，以供用于转基因小鼠。另一方面，可以将合成调控序列掺入到所述转基因中，其中这样的合成调控序列与已知在哺乳动物基因组中天然存在的功能性DNA序列不同源。根据共有序列规则(consensus rules)，例如确定剪接受体位点或启动子/增强子模体的允许序列(permissible sequence)的那些规则，设计合成调控序列。例如，小基因座包含与天然存在的种系Ig基因座相比具有至少一个非必需DNA部分(例如间插序列；内含子或其部分)的内部(即不在所述部分的末端)缺失的基因组免疫球蛋白基因座的一部分。
在本发明的一个优选实施方案中，用来产生人抗CD89抗体的转基因动物含有至少一个、通常2-10个、有时25-50个或更多拷贝的WO 98/24884的实施例12中所述的转基因(例如pHC1或pHC2)，让其与含有一个拷贝的WO 98/24884的实施例5、6、8或14中所述轻链转基因的动物配种，让其后代与WO 98/24884的实施例10中所述的JH缺失型动物配种，所述文献的内容通过引用结合到本文中。让动物繁育至这三个性状中的每个性状为纯合性。这样动物具有以下基因型：一个拷贝(每个单倍体组的染色体)的人重链未经重排的小基因座(WO 98/24884的实施例12中描述的)、一个拷贝(每个单倍体组的染色体)的重排人K轻链构建体(WO 98/24884的实施例14中描述的)和每个内源小鼠重链基因座的除去所有功能性JH区段的缺失(WO 98/24884的实施例10中所述的)。让这样的动物与JH区段缺失(WO 98/24884的实施例10)纯合型小鼠配种，产生JH缺失纯合型以及人重链构建体和轻链构建体半合型的后代。给所得的动物注射抗原，用来生产抗这些抗原的人单克隆抗体。
从这样的动物分离出的B细胞对于所述人重链和轻链而言是单特异性的，因为它们仅含有一个拷贝的每种基因。此外，它们对于人或小鼠重链是单特异性的，因为两个小鼠内源重链基因拷贝由于如WO98/24884的实施例9和12中所述引入的跨越JH区的缺失是无功能性的。此外，相当大部分的B细胞对于人或小鼠轻链是单特异性的，因为单拷贝的重排人κ轻链基因的表达，将会在相当大部分的B细胞中等位基因和同种型地排斥小鼠内源κ链和λ链基因的重排。
所述优选实施方案的转基因小鼠将表现出产生具有相当大的库(repertoire)、理想的是与天然小鼠的基本相似的库的免疫球蛋白。因此，例如，在其中内源Ig基因已被失活的实施方案中，总免疫球蛋白水平的范围将为约0.1-10mg/ml血清、优选0.5-5mg/ml，理想的是至少约1.0mg/ml。当将能够将实现从IgM转换为IgG的转基因引入到所述转基因小鼠中时，成年小鼠的血清IgG与IgM之比优选约为10∶1。IgG与IgM之比在未成熟小鼠中将低得多。一般而言，超过约10％、优选40-80％的脾和淋巴结B细胞仅表达人IgG蛋白。
所述库理想的是接近非转基因小鼠的所述库，通常至少高达约10％，优选25-50％或更高。一般而言，将产生至少约1000种不同的免疫球蛋白(理想的是IgG)，优选104-106或更多，主要取决于被引入到小鼠基因组中的不同V、J和D区的数目。这些免疫球蛋白通常将识别约一半或更多的高抗原性蛋白，例如葡萄球菌蛋白A。通常，所述免疫球蛋白将表现出对于预选抗原的亲和力至少约为107M-1，优选至少约109M-1，更优选至少约1010M-1、1011M-1、1012M-1或更高，例如高至1013M-1或更高。
在某些实施方案中，可能优选产生具有预定库的小鼠，以限制在对预定抗原类型的抗体应答中所表现出的V基因的选择。具有预定库的重链转基因可以包含例如在人类中优先用于针对预定抗原类型的抗体应答的人VH基因。另一方面，某些VH基因由于各种原因(例如有很小编码对预定抗原具有高亲和性的V区的可能性；有很小的经历体细胞突变和亲和性突降(sharpening)的倾向；或对于某些人有免疫原性)可能从特定库中被排斥。因此，在含有各种重链或轻链基因区段的转基因重排之前，可以例如通过杂交或DNA测序，容易将这样的基因区段鉴定为来自非转基因动物的生物体物种。
本发明的转基因小鼠可以如上所述，用CD89抗原的纯化或富集制备物和/或表达CD89的细胞免疫。所述小鼠将产生通过转基因内转换重组(顺式转换)经历类别转换并且表达与CD89反应的免疫球蛋白的B细胞。所述免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中所述重链和轻链多肽由人转基因序列编码，所述序列可以包括通过体细胞突变和V区重组连接衍生的序列以及种系编码的序列；这些人序列免疫球蛋白可以被认为与人VL或VH基因区段和人JL或JL区段所编码的多肽序列基本上相同，即使由于体细胞突变和差别V-J和V-D-J重组连接，可能存在其它非种系序列。关于这样的人序列抗体，每条链的可变区通常至少80％由人种系V、J基因区段编码以及就重链而言由D基因区段编码；常常至少85％的所述可变区由存在于所述转基因上的人种系序列编码；通常90％或95％或更多的所述可变区序列由存在于所述转基因上的人种系序列编码。然而，由于非种系序列由于体细胞突变以及VJ和VDJ连接而被引入，所以所述人序列抗体将常常具有某些不为在小鼠种系的人转基因中发现的人V、D或J基因区段所编码的可变区序列(和极少的恒定区序列)。通常，这样的非种系序列(或者个别核苷酸位置)将在CDR或已知体细胞突变聚集的区中或其附近聚集。
与预定抗原结合的人序列抗体，可以因同种型转换而产生，使得产生包含人序列γ链(例如γ1、γ2a、γ2B或γ3)和人序列轻链(例如K)的人抗体。这样的同种型转换的人序列抗体，由于亲和性成熟和抗原对B细胞的选择，特别是在二次(或后续)抗原攻击之后，通常含有一个或多个体细胞突变，通常在可变区中，通常在CDR中或在CDR的约10个残基内含有体细胞突变。这些高亲和性人序列抗体可以具有至少1×109M-1、通常至少5×109M-1、常常高于1×1010M-1、有时为5×1010M-1至1×1011M-1或更高的结合亲和力。
本发明的另一方面涉及得自这种小鼠的B细胞，所述B细胞可以用来产生表达以高亲和性(例如高于2×109M-1)与CD89结合的人单克隆抗体的杂交瘤。因此，在本发明的另一实施方案中，这些杂交瘤用来产生包含结合CD89的亲和性常数(Ka)至少约2×109M-1的免疫球蛋白的组合物，其中所述免疫球蛋白包含：
人序列轻链，所述人序列轻链由以下区组成：(1)轻链可变区，具有与人VL基因区段和人JL区段编码的多肽序列基本相同的多肽序列，和(2)轻链恒定区，具有与人CL基因区段编码的多肽序列基本相同的多肽序列；和
人序列重链，所述人序列重链由以下区组成：(1)重链可变区，具有与人VH基因区段、任选的D区和人JH区段编码的多肽序列基本相同的多肽序列，和(2)恒定区，具有与人CH基因区段编码的多肽序列基本相同的多肽序列。
采用一种在其基因组中包含整合的人免疫球蛋白转基因的转基因小鼠中扩增人可变区基因区段库的方法，有助于研制高亲和性人抗CD89单克隆抗体，所述方法包括：将包含所述整合人免疫球蛋白转基因中不存在的V区基因区段的V基因转基因引入到所述基因组中。通常，所述V区转基因是包含人VH或VL(Vκ)基因区段排布的一部分的酵母人工染色体，所述人基因区段可以是人基因组中天然存在的，或者可以是通过重组方法分别剪接在一起的，可以包括次序颠倒的或缺失型V基因区段。通常，在所述YAC中含有至少5个或更多个功能性V基因区段。在这种变体中，有可能制备通过所述V库扩增法产生的转基因小鼠，其中所述小鼠表达包含V区转基因上存在的V区基因区段编码的可变区序列和人Ig转基因上编码的C区的免疫球蛋白链。借助所述V库扩增法，可以产生具有至少5个不同V基因的转基因小鼠，也可以产生含有至少约24个或更多个V基因的小鼠。某些V基因区段可能是非功能性的(例如假基因等)；这些区段可以被保留，或者如果需要，可以通过技术人员可利用的重组方法来选择性地缺失。
一旦将小鼠种系工程改造，以使其含有具有在含有所述J和C基因区段的人Ig转基因中基本上不存在的扩增V区段库的功能性YAC，则可以将所述性状传播和繁育到其它遗传背景中，包括其中具有扩增V区段库的功能性YAC被繁育到具有不同人Ig转基因的小鼠种系中的背景。具有扩增V区段库的多种功能性YAC可以被繁育到一个种系中，从而与人Ig转基因(或多个人Ig转基因)一起起作用。虽然这样的转基因在此被称为YAC转基因，但当它们被整合到基因组中时，则可能基本上缺乏酵母序列，例如在酵母中自主复制所需的序列；这样的序列可以任选地在不再需要在酵母中复制之后(即在导入到小鼠ES细胞或小鼠prozygote中之前)，通过基因工程(例如限制性消化和脉冲场凝胶电泳或其它合适的方法)来去除。传播人序列免疫球蛋白表达的性状的方法，包括繁育具有人Ig转基因和任选地也具有有扩增V区段库的功能性YAC的转基因小鼠。VH和VL基因区段可以都存在于YAC上。可以将所述转基因小鼠繁育到从业者所需的任何背景中，包括带有其它人转基因、包括人Ig转基因和/或编码其它人淋巴细胞蛋白的转基因的背景。本发明也提供由具有扩增V区库YAC转基因的转基因小鼠所产生的高亲和性人序列免疫球蛋白。虽然，上文描述了本发明转基因动物的优选实施方案，但考虑了其它实施方案，所述其它实施方案分为四类：
I.含有未经重排的重链和重排轻链的免疫球蛋白转基因的转基因动物；
II.含有未经重排的重链和未经重排的轻链的免疫球蛋白转基因的转基因动物；
III.含有重排重链和未经重排的轻链的免疫球蛋白转基因的转基因动物；和
IV.含有重排重链和重排轻链的免疫球蛋白转基因的转基因动物。
在这些类别的转基因动物中，优选的优先顺序如下：II＞I＞III＞IV，其中内源轻链基因(或至少K基因)已经通过同源重组(或其它方法)而被敲除；和I＞II＞III＞IV，其中内源轻链基因未被敲除并且必需通过等位基因排斥而显性化。
III.与CD89结合的双特异性/多特异性分子
在本发明的再一实施方案中，可以将人抗CD89单克隆抗体或其抗原结合部分衍生化，或者与另一功能性分子例如另一种肽或蛋白质(例如Fab’片段)连接，产生与多个结合部位或靶表位结合的双特异性或多特异性分子。例如，本发明的抗体或抗原结合部分可以与一种或多种其它结合分子(例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性地连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其它方法)。也可以将所述抗体或抗体片段与抗原如肿瘤抗原连接，使得所述抗原被靶向表达CD89的免疫细胞，例如如果所述抗原被内化和呈递，则增强所述过程，并且最终刺激免疫应答。
因此，本发明包括包含至少一种对CD89的第一结合特异性和对靶细胞如肿瘤细胞的靶表位的第二结合特异性的双特异性和多特异性分子。包含针对CD89的鼠抗体和针对肿瘤抗原的第二抗体的双特异性抗体，已经证明是有效的抗肿瘤药。参见例如Valerius，T.等(1997)Blood  90：4485-4492(描述结合或不结合G-CSF疗法使用的FcαRI×HER-2/Neu双特异性抗体的抗肿瘤活性)；Elsasser，D.等(1999)Anticancer Res. 19：1525-1528(描述结合或不结合G-CSF或GM-CSF疗法使用的FcαRI×EGFR双特异性抗体的抗肿瘤活性)；Stockmeyer，B.等(2000)J.Immunol. 165：5954-5961(描述结合或不结合G-CSF或GM-CSF疗法使用的FcαRI×CD20双特异性抗体的抗肿瘤活性)；Stockmeyer，B.等(2001)J.Immunol.Methods  248：103-111(描述结合或不结合G-CSF或GM-CSF疗法使用的FcαRI×CD20和FcαRI×HER-2/neu双特异性抗体的抗肿瘤活性)；和Sundarapandiyan，K.等(2001)J.Immunol.Methods  248，：113-123(描述FcαRI×CD30双特异性抗体的抗肿瘤活性)。本发明的人抗CD89抗体可以用于作为抗肿瘤药的同一类型的双特异性构建体中。
可以作为靶的肿瘤细胞是任何类型癌的肿瘤细胞，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、中枢神经系统癌症、肾癌、头部癌症、颈部癌症、骨癌、血癌和淋巴系统癌症。优选的靶抗原包括癌胚抗原(CEA)、胃泌素释放肽受体抗原(GRP)、粘蛋白抗原、EGF-R、HER2/neu、HER3、HER4、CD20、CD30、MAGE抗原、SART抗原、MUC1抗原、c-erb-2抗原和TAG 72。TAG72见于例如乳腺、结肠和卵巢的肿瘤。对CEA特异性的抗原结合区可以例如来自称为MFE-23的单链抗体，描述于Casey等(1994)J.Immunol.Methods 179：105和Chester等(1994)Lancet 343：455。抗HER2/neu抗体可以用细胞系520C9(Ring等1991 J.Immunol.28：915-917)生产。抗体H425是一种人源化形式的抗EGF-R抗体M425。针对TAG 72的抗体是以下文献中描述的单克隆抗体cc49：公开的PCT申请WO 93/11161、对应于已授权的EP专利365 997号的公开的PCT申请WO 90/04410、公开的PCT申请WO 93/12231；和公开的PCT申请WO 89/01783。其它抗原可以是与B细胞淋巴瘤相关的抗原，例如HLA-DR、CD74、CD79、CD20、CD30、CD37和CD19。与其它血液疾病相关的抗原也在本发明范围内。因此，本发明也提供治疗血细胞疾病例如白血病和淋巴瘤的方法。
乳腺癌和卵巢癌可以是性激素依赖性癌症。乳腺肿瘤的特征可以是异常表达的受体，例如人EGF样受体家族(human-EGF-like receptorfamily)(HER)的那些受体，例如HER-2、HER-3和HER-4。本发明不限于HER抗原的这些实施方案。可以将天然的HER配体-Heregulin，掺入到人单克隆抗体中，例如掺入到双特异性抗体(BsAb)或多特异性分子中，作为靶向在癌症期间表达一种或多种HER受体的乳腺肿瘤细胞的工具。再者，heregulin分子是例如组合含有HER-2、HER-3或HER-4中每个的单体的异二聚体HER受体的结合决定因子。在一个实施方案中，单克隆抗体包含美国专利第5,367,060号中所示的heregulinβ2的氨基酸171-239。也可以使用heregulinβ2的其它部分以及其它heregulin分子的部分，例如美国专利第5,367,060号所公开的那些部分。
本发明的抗体或抗原结合部分也可以用于治疗中枢神经系统的肿瘤。在正常哺乳动物胎儿发育期间表达的nestin蛋白，在包括大多数形式的脑癌在内的中枢神经系统肿瘤上表达(McKay，D.G.Ronald，美国专利第5,338,839号，8/16/94)。nestin也在皮肤的黑素瘤以及已经转移到其它器官且难以检测和治疗的黑素瘤上表达(V.A.Florenes，R.Holm，O.Myklebost，U.Lendahl，O.Fodstad，Cancer Res.54：354-6，1994)。对于用本发明的分子治疗脑部肿瘤的优选递药部位是直接递药到中枢神经系统，或者通过脊髓注射或细针递药直接递药到脑部。对于转移癌，优选的递药途径是直接注射到循环系统中，或者通过此中所述的离体血液法。
本发明的方法适用的其它肿瘤类型例如但不限于Wilm肿瘤(A.J.Buckler，K.M.Call，T.M.Glaser，D.A.Haber，D.E.Housman，C.Y.Ito，J.Pelletier，Rose，E.A.Rose，美国专利第5,350,840号)，一种由于在患者的两个完整拷贝中通常发现的单拷贝基因中发生体细胞突变所致的小儿肾癌。Wilm肿瘤在95％的病例中可以通过手术治愈，设想一种结合剂适合作为手术患者的辅助治疗形式。本发明物质的组合物和方法所适合的已知癌相关蛋白的其它实例包括：与胃肠癌相关的那些蛋白(R.Fishel等，国际申请WO 95/14085，05/26/95)、特征为在化疗期间产生多种药物抗性的那些蛋白(J.M.Croop等，美国专利第5,198,344号)和技术人员熟知的大量癌基因，例如Rb、ras和c-myc，其序列是本领域技术人员可得到用于分析的。本发明的组合物例如适合于抑制被认为加强肿瘤转移的分泌型酶，例如基质金属蛋白酶(Liotta，L.A.等，(1991)，Cell，64：327-336)。在后一实施方案中，具有对于基质金属蛋白酶的结合决定簇和另一个对于FcαR的结合决定簇的结合剂，可能有助于抑制和清除这些酶的原位活性。如果与标准外科方案和化疗方案结合使用，则预期所述组合物降低癌症的复发并且增强长期存活。
除肿瘤细胞之外，可以将效应细胞靶向产生自身抗体的淋巴细胞以治疗自身免疫病，或者靶向产生IgE的淋巴细胞以治疗变态反应。可以用本发明的结合剂治疗的自身免疫病包括糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎)、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、牛皮癣、Sjgren综合征包括Sjgren综合征后继发的干性角膜结膜炎、斑形脱发、由于节肢动物叮咬反应引起的变态反应、节段性回肠炎、口疮溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、变应性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风逆转反应、麻风性结节性红斑、自身免疫性眼色素层炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感觉神经性听觉损失、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、Wegener肉芽肿病、慢性活动型肝炎、Stevens-Johnson综合征、特发性口炎性腹泻、扁平苔癣、节段性回肠炎、Graves眼病、肉样瘤病、原发性胆汁性肝硬变、后眼色素层炎和间质性肺纤维化。因此，通过例如给予患有自身免疫病的受治疗者一种具有至少一个对人CD89特异性的抗原结合区和对自身免疫细胞上表位特异性的抗原结合区的抗体，可以治疗自身免疫病。在一个实施方案中，所述靶表位是自身抗体上的表位。因此，桥连所述B淋巴细胞和表达CD89的效应细胞的多特异性抗体，可以靶向并且破坏其表面具有自身抗体的静息B淋巴细胞，从而诱导效应细胞功能，导致所述B淋巴细胞裂解。
同样，具有至少一种对CD89的结合特异性和至少一种对产生IgE的淋巴细胞上表位的结合特异性的抗体，可以用来治疗变态反应。供治疗受治疗者的变态反应的抗体，也可以是具有至少一个对IgE抗体上表位特异性的抗原结合区的结合剂。因此，这样一种结合剂可以连接表达CD89的效应细胞和其表面覆盖有IgE的靶细胞如嗜碱性粒细胞和肥大细胞，导致所述靶细胞裂解。这样一种治疗也可以防治抗原与IgE分子结合，从而防止这些细胞分泌参与变态反应的介质，例如组胺。另外，所述抗体可以结合可溶性IgE，从而防止IgE与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合。
所述靶也可以是微生物(细菌或病毒)或可溶性抗原(例如类风湿因子或其它自身抗体和毒素)。微生物包括病原体，例如病毒、细菌、真菌、原生动物。通过靶向受微生物感染的细胞，例如病原体感染的细胞，也可以靶向微生物。
因此，本发明提供治疗传染病的方法，所述方法包括例如通过给予患有传染病的受治疗者有效量的本发明的双特异性分子，所述双特异性分子具有至少一个对CD89特异性的抗原结合区和至少一个对微生物上表位特异性的抗原结合区。术语“传染病”意指包括由引起疾病的生物(统称为“病原体”)的细菌、病毒、真菌和原生动物中的一种或多种引起的疾病。在本发明中，病原体例如但不限于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M. leprae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteria)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、溶血性链球菌(Streptococcushemolyticus)、肺炎嗜血菌(Hemophilus pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)血清型0157、衣原体(Chlamydia species)、螺杆菌(Helicobacter species)；HIV-1、-2和-3、HTLV、FELV、HSV-I和-II、乙型肝炎病毒、(例如HBV主要表面抗原)、非甲非乙非丙型肝炎病毒、EB病毒(EBV糖蛋白)、痘病毒、狂犬病病毒；曲霉(Aspergillus species)；溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、贾第鞭毛虫(Giardia species)；新城疫病毒；鼠弓形体(Toxoplasma gondii)；以及白色念珠菌(Candidaalbicans)。通过筛选蛋白质以及通过体外分析肽从这些生物获得独特表位是本领域技术人员众所周知的。因此，本发明的优选抗体具有至少一个对任何这些微生物上的表位特异性的抗原结合区。
在一个优选实施方案中，所述抗体具有对HIV病毒的包膜糖蛋白如HIV的gp41特异性的抗原结合区。对gp120或CD4特异性的抗体也在本发明范围内。在一个实施方案中，所述抗体来源于人抗HIV-1IgG1 mAb，即DZ33。
IgA在粘膜防御中起重要作用，CD89已经在效应细胞上发现，例如在得自粘膜区的单核细胞和巨噬细胞上发现(参见例如Shen，L.和Collins，J.(1989)Immunology 68：491)。例如，发现粘膜表面例如肺部的单核细胞和巨噬细胞表达CD89(Shen，L.和Collins，J.(1989)Immunology 68：491)。因此，本发明提供从粘膜区消除微生物或任何不想要的细胞的方法。这样的方法从粘膜部位是入侵生物体通常的进入点这一事实以及超氧化物是有效的微生物剂这一事实来看特别有用。例如，已经表明氧代谢产物例如超氧化物阴离子(superanion)具有杀细菌和抑制细菌的效应。
针对靶表位的抗原结合区也可以是针对受体的配体，例如生长因子或分化因子，它们可以将所述结合剂靶向具有这些生长因子或分化因子的受体的细胞。例如，本发明的抗体可以包含表皮生长因子(EGF)或其能够与表皮生长因子受体(EGF-R)相互作用的至少其一部分或修饰形式。所述抗体也可以包含heregulin的结合部分。在本发明的另一优选实施方案中，所述配体是小肽，例如铃蟾肽、胃泌素释放肽(GRP)、雨滨蛙肽、神经调节肽B或神经调节肽C。所述肽的序列可以例如在美国专利第5,217,955号中找到，其内容通过引用结合到本文中。所述配体也可以是这些肽中任一种的修饰形式。所述修饰可以增强与所述受体的结合、降低与受体的结合或不影响与受体的结合。所述配体的修饰也可以将激动剂转变为拮抗剂，使得所述配体抑制而不是刺激细胞增殖。所述配体的修饰可以是添加、缺失、取代或修饰至少一个氨基酸。
用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，优选巨噬细胞。其它细胞包括单核细胞和其它带有IgA受体的细胞。如果需要，可以从待治疗宿主获得用于靶向的效应细胞。
靶效应细胞，即包有本发明结合剂的效应细胞，可以以生理上可接受的溶液中的细胞悬浮液给予。给予的细胞数可以约为108-109，但将视治疗目的而变。一般而言，所述量足以获得在靶细胞上定位，并且通过依赖抗体介导的细胞溶解(ADCC)实现杀伤靶细胞。给药途径也可以改变。例如，在肿瘤治疗中，根据肿瘤的定位，可以将所述靶效应细胞静脉内给予或者直接给予肿瘤部位，例如在卵巢癌的情况下直接给予腹腔。
本发明的双特异性和多特异性分子还可以包括第三结合特异性。在一个实施方案中，所述第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白结合的分子，从而增强针对所述靶细胞的免疫应答。“抗增强因子部分”可以是与给定分子如抗原或受体结合的抗体、功能性抗体片段或配体，从而导致增强针对Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效应。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。另一方面，所述抗增强因子部分可以与不同于所述第一和第二结合特异性所结合的实体的实体结合。例如，所述抗增强因子部分可以结合细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致增强针对靶细胞的免疫应答的其它免疫细胞)。
在一个实施方案中，本发明的双特异性和多特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体或其抗体片段，包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或单链Fv。所述抗体也可以是轻链或重链二聚体、或者任何其最小片段，例如Fv或1990年8月7日授予的Ladner等的美国专利第4,946,778号中所述的单链构建体，所述文献的内容通过引用结合到本文中。
虽然优选人单克隆抗体，但是可以用于本发明的双特异性或多特异性分子中的其它抗体是鼠单克隆抗体、嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体。
嵌合小鼠-人单克隆抗体(即嵌合抗体)可以用本领域已知的重组DNA技术产生。例如，编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因用限制性酶消化，以除去编码鼠Fc的区，并且用编码人Fc恒定区的基因的等同部分取代。(参见Robinson等，国际专利公开说明书PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988 Science 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等，1987，Cane.Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等，1988，J.NatlCancer Inst.80：1553-1559)。
还可以通过将不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列用得自人Fv可变区的等同序列取代，使所述嵌合抗体进一步人源化。Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207以及Oi等，1986，BioTechniques 4：214提供了有关人源化嵌合抗体的全面综述。那些方法包括分离、操作和表达编码得自重链或轻链中至少一种的完整免疫球蛋白Fv可变区或其部分的核酸序列。这类核酸的来源是本领域技术人员众所周知的，例如可以得自7E3，一种抗GPIIbIIIa抗体生产杂交瘤。然后，可以将编码所述嵌合抗体或其片段的重组DNA克隆到合适的表达载体中。或者，合适的人源化抗体可以通过CDR置换来产生，美国专利5,225,539；Jones等1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等1988 Science239：1534；以及Beidler等1988 J.Immunol.141：4053-4060。
特定人抗体的所有CDR都可以用非人CDR的至少一部分取代，或者仅所述CDR中的一些被非人类CDR取代。仅需要取代所述人源化抗体与Fc受体结合所需数目的CDR。
可以用能够用来源于非人类抗体的CDR取代人抗体的至少一部分CDR的任何方法将抗体人源化。Winter描述了一种可以用来制备本发明的人源化抗体的方法(英国专利申请GB 2188638A，于1987年3月26日申请)，所述文献的内容通过引用结合到本文中。所述人CDR可以用寡核苷酸定点诱变，用非人类CDR来取代，如下述文献中所述：国际申请WO 94/10332，题为Humanized Antibodies to Fc Receptorsfor Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes。
其中取代、缺失或添加特定氨基酸的嵌合抗体和人源化抗体也在本发明的范围内。特别是，优选的人源化抗体在构架区中有氨基酸取代，例如以改进与抗原的结合。例如，在具有小鼠CDR的人源化抗体中，位于人构架区中的氨基酸可以用位于小鼠抗体中相应位置的氨基酸取代。已知这样的取代在某些情况下改进人源化抗体与抗原的结合。其中有氨基酸添加、缺失或取代的抗体在此被称为修饰型抗体或改变型抗体。
术语修饰型抗体也包括通过例如缺失、添加或取代所述抗体的部分而修饰的抗体，例如单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。例如，抗体可以通过缺失恒定区并且用意图增加所述抗体的半寿期如血清半寿期、稳定性或亲和力的恒定区取代来修饰。任何修饰都在本发明的范围内，只要所述双特异性和多特异性分子具有至少一个对CD89特异性的抗原结合区并且触发至少一种效应子功能。
本发明的双特异性和多特异性分子可以用化学技术(参见例如D.M.Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5807)、“polydoma”技术(参见Reading的美国专利4,474,893)或重组DNA技术来制备。
特别是，通过用本领域已知的和此中提供的实施例中描述的方法，将组成结合特异性例如抗靶细胞和抗CD89结合特异性缀合，可以制备本发明的双特异性和多特异性分子。例如，所述双特异性和多特异性分子的每种结合特异性可以分别产生，然后相互连接。当所述结合特异性是蛋白质或肽时，可以用各种各样的偶联剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰-硫代乙酸(SATA)、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺基酯(sulfo-SMCC)(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其它方法包括Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(Science(1985)229：81-83)，和Glennie等(J.Immunol.(1987)139：2367-2375)所述的方法。优选的缀合剂是SATA和sulfo-SMCC，都可得自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。
当所述结合特异性是抗体(例如两种人源化抗体)时，它们可以通过两条重链C末端铰链区的硫氢基结合来缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前修饰所述铰链区，以使其含有奇数的硫氢基残基，优选为一个硫氢基残基。
或者，两种结合特异性可以在同一载体中编码，并且在同一宿主细胞中表达和装配。这一方法在所述双特异性和多特异性分子为mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab′)2或配体×Fab融合蛋白时特别有用。本发明的双特异性和多特异性分子例如双特异性分子，可以是单链分子，例如单链双特异性抗体、包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链双特异性分子或者包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性和多特异性分子也可以是单链分子，或者可以包含至少两个单链分子。用于制备双特异性和多特异性分子的方法描述于例如美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；和美国专利第5,482,858号。
所述双特异性和多特异性分子与其特异性靶的结合，可以通过以下测定来证实：酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定。这些测定中的每种一般通过用对感兴趣的复合物特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，FcR-抗体复合物可以用例如识别和特异性结合所述抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测。或者，所述复合物可以用多种其它免疫测定中的任一种来检测。例如，可以对所述抗体进行放射性标记，并且用于放射免疫测定(RLA)(参见例如Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，March，1986，所述文献通过引用结合到本文中)。所述放射性同位素可以通过诸如应用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影的方法来检测。
IV.结合测定
可以进行几种测定来表明本发明的抗体或其抗原结合部分与CD89如人CD89特异性地结合。例如，可以进行结合测定，所述结合测定比较所述抗体和IgA与多种细胞的结合，其中某些细胞被IgA结合(例如单核细胞和巨噬细胞)，而某些细胞不被IgA结合(例如K-562细胞)。本发明的抗体应该基本上结合与IgA所结合的相同的细胞群。使用所述抗体和IgA的竞争结合实验将指出两种因子是否识别同一表位。结合实验其中可以是流式细胞术实验、间接免疫荧光测定或ELISA。此外，IgA和所述抗体应该免疫沉淀来自同一细胞的具有相似分子量的蛋白质。另外，用IgA预先清除具有CD89的细胞裂解液，应该导致与在无所预先清除的情况下相比，用所述抗体免疫沉淀的蛋白质较少。同样，用所述抗体预先清除所述细胞裂解液，应该导致与在无所预先清除的情况下相比，用IgA免疫沉淀的蛋白质较少。用以表明本发明的抗体或其抗原结合部分与IgA识别相同的抗原的其它试验是本领域已知的。另外，由于已经克隆了CD89，例如人CD89，所以有可能使用重组产生的CD89或其部分或者经转染以表达CD89的细胞，来表明抗体与CD89结合。
在一个实施方案中，本发明的抗体在将靶细胞与效应细胞连接时，刺激所述效应细胞吞噬所述靶细胞。例如，本发明优选的具有至少一个对CD89特异性的抗原结合区和至少一个针对靶细胞上表位的抗原结合区的双特异性抗体，可以诱导吞噬所述靶细胞。事实上，已经表明，一种My 43(一种小鼠抗CD89抗体)与抗红细胞F(ab)’2连接的异抗体，介导单核细胞吞噬红细胞。
吞噬作用测定可以如下进行。将压积(packed)靶细胞例如牛红细胞(OE)(10μl)与20μl预先测量导致最大玫瑰花结形成的浓度的所述F(ab’)2-Ig缀合物，于10℃下混合16小时。洗涤异抗体包被的OE，调至4×107细胞/ml，然后与等体积2×106细胞/ml的髓细胞混合。将该混合物于37℃孵育10分钟，将细胞沉淀，再孵育20分钟，然后未被摄入的OE用缓冲的氯化铵于4℃裂解。可以通过显微镜检查Wright′s吉姆萨(Sigma)染色的cytospin标本(preparations)，评价吞噬作用。在一式两份的玻片中计数至少200个细胞。吞噬作用可以以含有一个或多个被摄入的红细胞的细胞的百分率来定量。
优选的抗体触发氧化爆发，即在与效应细胞上的CD89结合时在效应细胞中产生超氧化物阴离子。例如，已表明My 43(一种小鼠抗CD89抗体)触发经干扰素-γ处理的U937细胞产生超氧化物阴离子。
可以在固相上或在溶液中进行超氧化物测定。固相超氧化物测定可以如下进行。可以用1ml/孔的含100μg/ml多聚L-赖氨酸(Sigma，St.Louis，MO)的PBS溶液，于室温处理平底6孔PVC组织培养板(FalconPlastics Baxter Corporation，Bedford MA)达30分钟。吸干后，可以加入戊二醛(2％，Sigma)，于室温孵育15分钟。用PBS洗涤4次后，可以加入含有所需量Ig的1ml PBS，于周围温度下孵育2小时。然后各孔用PBS洗涤，装满含100mM甘氨酸/0.1％BSA的PBS，于4℃孵育18小时。然后它们可以用PBS洗涤2次，在Krebs Ringer Hepes缓冲盐溶液(KRH)中洗涤1次，在含1mM KCN和1mg/ml马心高铁细胞色素c(Sigma)的KRH中加入3×10+6细胞/孔。可以将细胞以100×g离心5分钟离心到板上，于37℃孵育。加入PMA(Sigma)至所示的终浓度，作为阳性对照。30分钟后，可以取出内容物，离心，在Dynatech分光光度计(Dynatech Labs，Chantilly，VA)上于550nm读取上清液的OD。
悬浮液超氧化物测定可以如下进行。可以将细胞与mAb一起于4℃孵育45分钟，然后在KRH中洗涤，重悬于含有1mM KCN和1mg/ml马心高铁细胞色素c(Sigma)的KRH中，开始于37℃孵育。可以加入PMA(Sigma)至所示的终浓度，作为阳性对照。30分钟后，可以取出样品，离心，在Dynatech分光光度计(Dynatech Labs，Chantilly，VA)上于550nm读取上清液的OD。
V.抗体缀合物/免疫毒素
另一方面，本发明的特征在于与治疗部分缀合的人抗CD89单克隆抗体或其片段，所述治疗部分例如细胞毒素、药物或放射性同位素。当与细胞毒素缀合时，这些抗体缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀伤)的任何药剂。实例包括紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、普卡霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗药包括但不限于抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶decarbazine)、烷化剂(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链佐星、丝裂霉素C和顺式二胺二氯铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(旧称道诺霉素)和多柔比星)、抗生素类(例如放线菌素D(旧称放线菌素)、博来霉素、普卡霉素和安曲霉素(AMC))以及抗有丝分裂药(例如长春新碱和长春花碱)。本发明的抗体可以与放射性同位素例如放射性碘缀合，产生用于治疗CD89相关疾病如癌症的细胞毒性放射性药物。
本发明的抗体缀合物可以用来修饰给定的生物反应，所述药物部分不应解释为限于典型的化疗药。例如，所述药物部分可以是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质可以包括例如酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或者是生物反应调节剂，例如淋巴因子、白介素-1(″IL-1″)、白介素-2(″IL-2″)、白介素-6(″IL-6″)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(″GM-CSF″)、粒细胞集落刺激因子(″G-CSF″)或其它生长因子。
用于将这样的治疗部分与抗体缀合的技术是众所周知的，参见例如Arnon等，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy″，载于Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编著)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，″Antibodies For Drug Delivery″，载于Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等(编著)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review″，载于Monoclonal Antibodies′84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等(编著)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy″，载于Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等(编著)，pp.303-16(Academic Press 1985)，以及Thorpe等，″The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.，62：119-58(1982)。
VI.药用组合物
另一方面，本发明提供一种组合物，例如药用组合物，所述组合物包含与药学上可接受的载体一起配制的一种或者一个组合物本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分。在一个优选实施方案中，所述组合物包括多种(例如两种或更多种)本发明的分离的人抗体或其抗原结合部分的组合。优选所述组合物中每种所述抗体或其抗原结合部分与CD89的不同预选表位结合。
在一个实施方案中，所述组合物包含一种或者一个组合的本发明双特异性或多特异性分子(例如它含有至少一个针对靶细胞的结合特异性和至少一个针对CD89的结合特异性)。
本发明的药用组合物也可以在联合疗法中给予，即与其它药剂联合给予。例如，所述联合疗法可以包括本发明的组合物与至少一种抗肿瘤药或其它常规疗法。
此中所用的“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂以及生理上相容的类似的载体。优选所述载体适用于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。根据给药途径，所述活性化合物即抗体、双特异性和多特异性分子可以用保护所述化合物免遭酸和可以使所述化合物失活的其它天然条件的作用的材料来包衣。
“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性并且不引起任何不想要的毒理学效应的盐(参见例如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括由无毒无机酸以及无毒有机酸衍生的盐，无毒无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等，无毒有机酸例如脂族一和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等。碱加成盐包括由碱土金属以及无毒有机胺衍生的盐，碱土金属例如钠、钾、镁、钙等，无毒有机胺例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等。
本发明的组合物可以通过本领域已知的各种各样的方法来给予。正如本领域技术人员将会认识到的，给药途径和/或方式将视所需结果而变。所述活性化合物可以与保护所述化合物抵抗快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递药系统。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的许多方法是专利方法或者是本领域技术人员普遍已知的。参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
为了通过某些给药途径给予本发明的化合物，可能必需用防止其失活的材料来包衣，或者将所述化合物与所述材料共同给予。例如，所述化合物可以在合适的载体例如脂质体或稀释剂中给予受治疗者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲液。脂质体包括水包油包水型CGF乳液以及常规的脂质体(Strejan等(1984)J.Neuroimmunol.7：27)。
药学上可接受的载体包括无菌水性溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。将这样的介质和药剂用于药用活性物质是本领域已知的。除非由于任何常规介质或药剂与所述活性化合物不相容，考虑了其在本发明药用组合物中的应用。也可以将补充的活性化合物掺入到所述组合物中。
治疗组合物通常必需是无菌的，并且在生产和贮存条件下稳定。所述组合物可以配制为溶液、微乳剂或适合于高药物浓度的其它有序结构。所述载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如通过应用包衣，例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒径，以及通过利用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。通过在所述组合物中包括延迟吸收的药剂，例如一硬脂酸盐和明胶，可以引起注射用组合物的延长吸收。
通过将所需量的所述活性化合物与根据需要的一种或一个组合的上述组分掺入到合适的溶剂中，然后微过滤除菌，可以制备无菌注射液。一般而言，通过将所述活性化合物掺入到含有基本分散介质和上述的所需其它组分的无菌载体中，制备分散体。就供制备无菌注射液用的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由预先过滤除菌的其溶液得到的所述有效成分加上任何额外的所需组分的粉末。
调节给药方案，以提供最适所需反应(例如治疗反应)。例如，可以给予一次大剂量，可以在规定时间内给予几个分次剂量，或者根据治疗情况的需要所指示的，所述剂量可以按比例减少或增加。尤其有利的是配制单位剂型的胃肠外组合物，以便于给药和给药的一致性。此中所用的单位剂型是指对于待治疗的受治疗者适合作为单位剂量的物理上分离的单位；每个单位含有计算用以与所需药用载体结合产生所需疗效的预定量的活性化合物。对于本发明的单位剂型的规定由以下因素决定或者直接取决于以下因素：(a)所述活性化合物的独特特性和待达到的特定疗效，和(b)用于治疗个体的敏感性的这样一种活性化合物的配制领域中固有的限制。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)脂溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
对于所述治疗组合物，本发明的制剂包括适合于经口、鼻、局部(包括口腔含化和舌下)、直肠、阴道和/或胃肠外给药的制剂。所述制剂通常可以以单位剂型存在，并且可以采用制药领域已知的任何方法来制备。可以与载体材料联合产生单剂量形式的有效成分的量，可以根据待治疗的受治疗者和特定的给药方式而变。可以与载体材料联合产生单剂量形式的有效成分的量，一般是所述组合物产生疗效的量。一般而言，照百分率计，该量的范围将为约0.01-99％的有效成分，优选约0.1-70％，更优选约1-30％。
适用于阴道给药的本发明的制剂也包括含有本领域已知的合适的这类载体的子宫托、阴道塞、乳油、凝胶剂、糊剂、泡沫制剂或喷雾制剂。用于本发明组合物的局部给药或透皮给药的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳油、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。所述活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂混合。
此中所用的短语“胃肠外给药”和“在胃肠外给药”是指肠道给药和局部给药之外的给药方式，通常为注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可以用于本发明药用组合物中的合适的水性载体和非水载体的实例包括水、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的混合物、植物油如橄榄油、和注射用有机酯例如油酸乙酯。例如通过应用包衣材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒径，以及利用表面活性剂，可以维持适当的流动性。
这些组合物也可以含有辅料，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过上述灭菌方法，以及通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。也可能需要在所述组合物中包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收的药剂，例如一硬脂酸铝和明胶，可以导致注射用药物形式的延迟吸收。
当本发明的化合物作为药物给予人类和动物时，它们可以单独给予，或者作为含有例如0.01-99.5％(更优选0.1-90％)的有效成分以及药学上可接受的载体的药用组合物给予。
无论选择何种给药途径，可以以合适的水合形式和/或本发明的药用组合物形式应用的本发明的化合物，可以用本领域技术人员已知的常规方法，配制为药学上可接受的剂型。
本发明的药用组合物中的所述有效成分的实际剂量水平可以改变，以便对于特定患者、组合物和给药方式而言获得有效达到所需治疗反应且对于所述患者无毒的所述有效成分的量。所选择的剂量水平将取决于各种各样的药代动力学因素，包括所用的本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、给药时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗时间长度、与所用特定组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康状况和先前的用药史和药物领域熟知的类似因素。
具有本领域技术的医师或兽医可以容易地确定和所需的药用组合物的有效量并且开出处方。例如，所述医师或兽医可以开始给予水平低于达到所需疗效所需的水平的所述药用组合物中所用的本发明的化合物，然后逐渐增加剂量，直至达到所需的效应。一般而言，本发明组合物的合适日剂量将是所述化合物有效产生疗效的最低剂量的量。这样的有效量一般将取决于上述因素。优选通过静脉内、肌内、腹膜内或皮下给药，优选接近靶部位给药。如有需要，治疗组合物的有效日剂量可以以2个、3个、4个、5个、6个或更多个分剂量，在一天内以合适的间隔分别给予，任选地以单位剂型给予。当有可能单独给予本发明的化合物时，优选所述化合物作为药用制剂(组合物)给予。
治疗组合物可以用本领域已知的药物装置给予。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物用无针皮下注射装置，例如美国专利第5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556号中所述的装置给予。可用于本发明的众所周知的植入物和组件的实例包括：美国专利第4,487,603号，它公开了一种用于以受控速率分配药物的可植入微量输注泵；美国专利第4,486,194号，它公开了一种用于透过皮肤给药的治疗装置；美国专利第4,447,233号，它公开一种用于以精确的输注速率递药的药物输注泵；美国专利第4,447,224号，它公开了一种用于连续递药的可变流动可植入输注装置；美国专利第4,439,196号，它公开了一种具有多室区室的渗透性递药系统；和美国专利第4,475,196号，它公开了一种渗透性递药系统。这些专利通过引用结合到本文中。许多其它这样的植入物、递药系统和组件是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可以配制为确保体内的适当分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如有需要)，它们可以例如配制在脂质体中。关于生产脂质体的方法，参见例如美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。所述脂质体可以包含被选择性地转运到特定细胞或器官、从而增强靶药物传递的一个或多个部分(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)、示例性的靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如Low等的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)，其不同的种类可以包含本发明的制剂以及本发明分子的组分；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。在本发明的一个实施方案中，本发明的治疗化合物可以配制到脂质体中；在一个更优选的实施方案中，所述脂质体包含一个靶向部分。在一个最优选的实施方案中，所述脂质体中的所述治疗化合物可以通过大剂量注射传递到接近肿瘤或感染的部分。所述组合物必须是流动的，使得存在易于注射性。它必须在生产和贮存条件下稳定，必须加以防腐以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。
“治疗有效量”优选相对于未经治疗的受治疗者而言，抑制肿瘤生长至少达约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，再更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤的能力可以用预测在人类肿瘤中的功效的动物模型系统来评估。或者，组合物的这种特性可以通过检查所述化合物抑制的能力来评估，这类抑制用技术人员已知的测定在体外来检查。治疗化合物的治疗有效量可以减少肿瘤大小，或者缓解受治疗者的症状。本领域技术人员根据诸如受治疗者的体型、受治疗者症状的严重程度以及所选的特定组合物或给药方式的因素，来确定这样的量。
所述组合物必须是无菌的，且是流动的，使得所述组合物可通过注射器给予。除水之外，所述载体可以是等渗缓冲盐溶液、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和它们的合适混合物。例如通过应用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒径，以及通过应用表面活性剂，可以维持适当的流动性。在许多情况下，优选在所述组合物中包含等渗剂，例如糖类、多元醇例如甘露醇或山梨醇以及氯化钠。通过在所述组合物中包括延迟吸收的药剂，例如一硬脂酸铝或明胶，可以导致所述注射用组合物的长期吸收。
当所述活性化合物被如上所述地适当保护时，所述化合物可以例如与惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起口服给予。
VII.本发明的应用和方法
本发明的组合物(例如人抗CD89单克隆抗体及其衍生物/缀合物)具有体外和体内诊断和治疗用途。例如，可以将这些分子给予培养的细胞，例如体外或离体给予，或者给予受治疗者体内的细胞，例如体内给予，以治疗、预防或诊断各种各样的疾病。此中所用的术语“受治疗者”是指包括人类和非人类动物。优选的人类动物包括患有特征为表达、通常为异常表达(例如过量表达)CD89的疾病的人类患者
例如，所述组合物可以体外或体内用来诊断由CD89介导的疾病。本发明的抗体可以用来检测CD89的水平、或者在其膜表面含有CD89的细胞的水平，然后可以将所述水平与某些疾病症状相联系。或者，所述抗体可以用来抑制或阻断CD89功能，后者又可以与某些疾病症状的预防或缓解相联系，从而暗示CD89为疾病介质。通过使样品和对照样品与所述抗CD89抗体在允许在所述抗体和CD89之间形成复合物的条件下接触，可以达到这一点。检测所述样品和对照中的所述抗体和CD89之间所形成的任何复合物，并将其进行比较。
在另一实施方案中，本发明的人抗体或结合部分可以用来调节效应细胞上的CD89水平，例如通过捕获并消除所述细胞表面的受体来调节。抗Fc受体抗体的混合物也可以用于此目的。
本发明的范围内还有用上述双特异性和多特异性人抗体治疗疾病例如自身免疫病、癌症或病原体感染的方法。这类抗体包括至少一个针对CD89的结合特异性和至少一个针对靶抗原的抗原结合区的结合特异性。在另一实施方案中，所述抗体对于针对同一靶抗原和/或受体的不同表位的抗原结合区的结合特异性而言，包括一个第三结合特异性。用于消除受治疗者体内不想要的细胞即靶细胞或者抗原的方法包括用本发明的双特异性或多特异性抗体治疗所述受治疗者。在一个实施方案中，这样的方法包括从受治疗者中获取等份的血液或血细胞样品，用药学上可接受载体中的治疗有效量的本发明的双特异性或多特异性抗体离体治疗所述血液或血细胞，然后将所述经治疗的血液或血细胞回输给所述受治疗者。优选所述血样的细胞是分离的并且经培养扩充，更优选所述血样的细胞用增强CD89数或活性的因子治疗。这样的因子包括细胞因子、淋巴因子或生长因子，例如G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、TNF和白介素例如IL-2、IL-10和IL-12。
在另一实施方案中，本发明提供给受治疗者免疫以抵抗癌抗原、病原体或受病原体感染的细胞上发现的抗原的方法。这样的方法包括给予受治疗者在药学上可接受的载体中包含双特异性或多特异性抗体的组合物，所述抗体具有一种对CD89的结合特异性和一种对致病感染性生物体或受感染细胞或者癌细胞抗原的表位的结合特异性。或者，所述组合物可以包含与致病感染性生物体的一种或多种抗原或者受感染细胞或癌细胞的抗原连接的抗CD89抗体。
在另一实施方案中，本发明的阻断或抑制IgA与CD89结合的人抗体，用于治疗特征为异常内源IgA的疾病，例如特征为循环的含IgA复合物和/或IgA免疫复合物沉淀的疾病，例如慢性肝炎、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、IgA肾病(Berger病)或IgA性肾小球性肾炎。可以将本发明的人抗CD89抗体给予患有这种疾病的患者，以抑制或负调节内源IgA与CD89的结合。例如，虽然不希望受机理的限制，但是给予本发明的抗CD89抗体，可以导致阻断CD89，使得内源异常IgA不能占用所述受体，因而不能触发不想要的效应子功能。
在另一实施方案中，本发明的人单克隆抗体的优点为不诱导或者仅在最低程度上诱导补体介导的细胞裂解，因此有很小的触发补体激活的疾患如痤疮方面的副作用。
本发明组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)的合适给药方法是基于抗体的疗法领域中已知的。所述分子的合适用量将取决于所述受治疗者的年龄和体重以及所用的特定药物。所述分子可以与放射性核素例如131I、90Y、105Rh等偶联，如Goldenberg，D.M.等(1981)Cancer Res.41：4354-4360和EP 0365 997中所述。本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可以与抗感染药偶联。
人抗CD89抗体及其抗原结合部分也可以与另一治疗药例如细胞因子或化疗药共同给予，或者可以与其它已知疗法例如抗肿瘤疗法如放射疗法共同给予。这类治疗药其中包括细胞因子例如G-CSF、GM-CSF、IL-2、IFN-γ和IFN-a；本身仅在对患者有毒或亚毒性水平下有效的抗肿瘤药，如多柔比星(阿霉素)、顺铂硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲。顺铂以100mg/m2的剂量每4周静脉内给予1次，阿霉素以60-75mg/m2的剂量每21天静脉内给予1次。本发明的人抗CD89抗体或其抗原结合片段与化疗药共同给予，提供通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性效应的不同机制运作的两种抗肿瘤药。这样的共同给药可以解决由于产生抗药性或者肿瘤细胞的抗原性改变可能使其与所述抗体不反应所引起的问题。
具有补体结合位点例如来自结合补体的IgG1、IgG2或IgG3或IgM的部分的本发明组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)，也可以在补体存在下应用。在一个实施方案中，通过添加补体或含补体的血清，可以补充用本发明的结合剂和适当的效应细胞对包含靶细胞的细胞群体的离体治疗。对包有本发明结合剂的靶细胞的吞噬作用，可以通过补体蛋白的结合得以改进。在另一实施方案中，包有本发明组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)的靶细胞，也可以通过补体裂解。在另一实施方案中，本发明的组合物不失活补体。
本发明组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可以与补体一起给予。因此，包含人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物也在本发明范围内。这些组合物的优点在于：补体紧邻所述人抗体、多特异性或双特异性分子定位。或者，可以分别给予本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子和所述补体或血清。
在本发明范围内还有包含本发明组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)和使用说明的试剂盒。所述试剂盒可以还含有至少一种另外的试剂，例如补体，或者一种或多种另外的本发明的人抗体(例如具有补体活性、与CD89抗原上不同于第一人抗体的表位结合的人抗体)。
本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可以用来靶向表达CD89的细胞，例如用以标记这类细胞。为此，所述结合剂可以与可以被检测的分子连接。因此，本发明提供用于离体或体外定位表达CD89的细胞的方法。所述可检测标记可以是例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。
在一个实施方案中，本发明提供检测样品中CD89抗原存在情况、或者测量CD89抗原量的方法，所述方法包括使所述样品和对照样品与特异性结合CD89的人单克隆抗体或其抗原结合部分，在允许所述抗体或其部分与CD89之间形成复合物的条件下接触。然后检测复合物的形成，其中复合物形成在所述样品与对照样品之间有差异，则指示在所述样品中存在CD89抗原。
在再一实施方案中，本发明提供一种体内或体外检测表达Fc的细胞存在或者定量所述细胞的量的方法。所述方法包括：(i)给予受治疗者与可检测标记缀合的本发明组合物(例如多特异性或双特异性分子)或其片段；(ii)使所述受治疗者暴露于用于检测所述可检测标记的工具，以鉴定含表达Fc的细胞的区。
通过以下实施例进一步说明本发明，不应解释为以下实施例是进一步限制性的。所有附图和本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用结合到本文中。
                       实施例
实施例1    用于生产全人抗CD89单克隆抗体的转基因(Cμ被打中)
                       小鼠的产生
CMD打靶载体的构建
质粒pICEμ(即pICEmu)含有一个跨越μ基因的鼠Ig重链基因座的EcoRI/XhoI片段，得自Balb/C基因组λ噬菌体文库(Marcu等，Cell，198022：187)。将这一基因组片段亚克隆到质粒pICEMI9H(Marsh等，Gene32：481-485，1984)的XhoI/EcoRI位点。pICEμ中包括的重链序列从恰好位于μ内含子增强子3’的EcoRI位点下游延伸至位于μ基因最后一个跨膜外显子下游约1kb的XhoI位点；然而，μ转换重复区中的大部分已经由于在大肠杆菌中传代而缺失。
如下构建所述打靶载体。从pICEμ切下一个1.3kb HindIII/SmaI片段，将其亚克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)中。这一pICEμ片段从位于Cμl 5’大约1kb的HindIII位点延伸至Cμl内的SmaI位点。所得的质粒用SmaI/SpeI消化，插入得自pICEμ、从Cμl 3’中的SmaI位点延伸至恰好位于最后一个Cμ外显子下游的XbaI位点的约4kb SmaI/XbaI片段。将所得质粒pTAR1在SmaI位点线性化，并插入一个neo表达盒。该盒由小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(XbaI/TaqI片段；Adra等，(1987)Gene 60：65-74)的转录控制下并且含有pgk聚腺苷酸化位点(PvuII/HindIII片段；Boer等(1990)Biochemical Genetics 28：299-308)的neo基因组成。该盒得自质粒pKJ1(由Tybulewicz等描述，(1991)Cell 65：1153-1163)，从所述质粒中切取作为EcoRI/HindIII片段的neo盒，将其亚克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)中，产生pGEM-7(KJ1)。通过EcoRI/SalI消化，从pGEM-7(KJ1)中切取neo盒，将其平端化，并以与基因组Cμ序列相反的方向亚克隆到质粒pTAR1中的SmaI位点。所得的质粒用NotI线性化，插入单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)盒，以便于富集带有同源重组子的ES克隆，如Mansour等，(1988)Nature 336：348-352所述。该盒由以小鼠pgk启动子和聚腺苷酸化位点作支架的tk基因的编码序列组成，如Tybulewicz等，(1991)Cell 65：1153-1163所述。所得的CMD打靶载体与所述重链基因座有总共大约5.3kb的同源性，设计用以产生其中neo表达盒插入第一个Cμ外显子的唯一SmaI位点中的突变型μ基因。所述打靶载体电穿孔到ES细胞中之前，用在质粒序列内切割的PvuI线性化。
被打中ES细胞的产生和分析
基本上按照已描述的方法(Robertson，E.J.(1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach(E.J.Robertson编著)Oxford：IRL Press，p.71-112)，让AB-1 ES细胞(McMahon，A.P.和Bradley，A.，(1990)Cell 62：1073-1085)在无有丝分裂活性的SNL76/7细胞饲养层(出处同前)上生长。采用Hasty等所述的方法(Hasty，P.R.等，(1991)Nature 350：243-246)，将线性化的CMD打靶载体电穿孔到AB-1细胞中。将电穿孔细胞以1-2×106细胞/皿的密度接种到100mm培养皿中。24小时后，向培养基中加入G418(200微克/ml有效成分)和FIAU(5×10-7M)，让抗药性克隆在8-9天内产生。挑出克隆，用胰酶处理，将其分为两个部分，进一步扩大培养。然后将得自每个克隆的一半细胞冷冻，分析另一半细胞的载体和靶序列之间的同源重组。
通过DNA印迹杂交法进行DNA分析。如Laird等所述(Laird，P.W.等，(1991)Nucleic Acids Res.19：4293)，从克隆中分离DNA。分离的基因组DNA用SpeI消化，用915bp SacI片段即探针A探测(参见图1)，探针A与μ内含子增强子和μ转换区之间的序列杂交。探针A从野生型基因座检测到一个9.9kb SpeI片段，从μ基因座检测到一个已经与CMD打靶载体同源重组(neo表达盒含有一个SpeI位点)的7.6kb鉴别性条带。在通过DNA印迹分析筛选出的1132个G418和FIAU抗性克隆中，3个克隆显示出指示在μ基因座同源重组的所述7.6kb SpeI条带。这3个克隆进一步用酶BglI、BstXI和EcoRI消化，以证实所述载体同源整合到μ基因中。当用探针A杂交时，用BglI、BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的DNA印迹分别产生15.7、7.3和12.5kb的片段，而7.7、6.6和14.3kb的片段分别指示被打中μ等位基因的存在。所有3个通过SpeI消化所检测的阳性克隆都显示出预期的鉴别所述neo盒插入Cμl外显子中的BglI、BstXI和EcoRI限制性片段。
带有突变型μ基因的小鼠的产生
将指定编号为264、272和408的所述3个被打中ES克隆解冻复苏，如Bradley所述(Bradley，A.，(1987)载于 Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：a Practical Approach.(E.J.Robertson编著)Oxford：IRL Press，p.113-151)，注射到C57BL/6J胚泡中。将经注射的胚泡转移到假孕雌性小鼠的子宫中，产生代表来源于输入ES细胞和宿主胚泡的细胞混合物的嵌合小鼠。根据刺豚鼠毛色中C57BL/6J黑色背景上来源于所述ES细胞系的量，可以肉眼估计ES细胞对所述嵌合体的贡献程度。克隆272和408仅产生低百分比的嵌合体(即刺豚鼠着色的百分比低)，而克隆264产生高百分比的雄性嵌合体。让这些嵌合体与C57BL/6J雌性配种，产生指示ES细胞基因组种系遗传的刺豚鼠后代。通过对BglI消化的尾部活检样品的DNA的DNA印迹分析(如上文关于ES细胞DNA分析所述的方法)，筛选所述被打中的μ基因。大约50％的所述刺豚鼠后代除显示15.7kb的野生型条带之外，还显示出一个7.7kb的BglI杂交条带，证明所述被打中μ基因的种系遗传。
转基因小鼠的μ基因的功能失活的分析
为了确定neo盒插入到Cμl中是否使所述Ig重链基因失活，让克隆264嵌合体与JHD突变纯合型小鼠配种，JHD突变由于JH基因区段的缺失而使重链表达失活(Chen等，(1993)Immunol.5：647-656)。产生了4个刺豚鼠后代。从1月龄这些动物中获得血清，通过ELISA分析鼠IgM的存在。所述4个后代中的2个完全缺乏IgM(参见表1)。尾部活检样品DNA通过BglI消化并使其与探针A(参见图1)杂交、以及通过StuI消化并与475bp EcoRI/StuI片段(出处同前)杂交进行DNA印迹分析，分析所述4只动物的基因型，证明不能表达血清IgM的动物是其中所述重链基因座中的一个等位基因带有所述JHD突变、而另一个等位基因带有所述Cμl突变的动物。JHD突变杂合型小鼠显示出血清Ig的野生型水平。这些数据证明，所述Cμl突变使μ基因的表达失活。
表1
小鼠 血清IgM(微克/ml) IgH链基因型
42 ＜0.002 CMD/JHD
43 196 +/JHD
44 ＜0.002 CMD/JHD
45 174 +/JHD
129×BL6 F1 153 +/+
JHD ＜0.002 JHD/JHD
表1显示了通过ELISA检测的携带CMD突变和JHD突变的小鼠(CMD/JHD)、JHD突变杂合型小鼠(+/JHD)、野生型小鼠(129Sv×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)以及B细胞缺陷型JHD突变纯合型小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。
实施例2    用于生产全人抗CD89单克隆抗体的CHO12转基因小
                          鼠的产生
HCO12人重链转基因
通过将pHC2(Taylor等，1994，Int.Immunol.，6：579-591)的80kb插入片段和pVx6的25kb插入片段共同注射，产生HCO12转基因。质粒pVx6如下所述构建。
将包含人种系VH1-18(DP-14)基因与约2.5kb 5′侧翼基因组序列和5kb 3′侧翼基因组序列的8.5kb HindIII/SalI DNA片段，亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)中，产生质粒p343.7.16。将包含人种系VH5-51(DP-73)基因与约5kb 5′侧翼基因组序列和1kb 3′侧翼基因组序列的7kb BamHI/HindIII DNA片段，克隆到基于pBR322的质粒克隆载体pGP1f(Taylor等1992，Nucleic Acids Res.20：6287-6295)中，产生质粒p251f。由pGP1f衍生的一种新克隆载体pGP1k用EcoRV/BamHI消化，与包含人种系VH3-23(DP47)基因以及约4kb 5′侧翼基因组序列和5kb 3′侧翼基因组序列的10kb EcoRV/BamHI DNA片段连接。所得的质粒p112.2RR.7用BamHI/SalI消化，与p251f的7kb纯化BamHI/SalI插入片段连接。所得的质粒pVx4用XhoI消化，与p343.7.16的8.5kb XhoI/SalI插入片段连接。
获得一个具有与另外两个V基因方向相同的VH1-18基因的克隆。命名为pVx6的该克隆然后用NotI消化，如Hogan等所述(B.Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，2nd edition，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview NY)，将经纯化的26kb插入片段与纯化的pHC2的80 kb NotI插入片段以1∶1的摩尔比共同注射到半日龄(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎的原核中。从由经注射胚胎发育而成的小鼠，建立了三个独立的包含得自Vx6以及HC2的序列的转基因小鼠系。这些系命名为(HCO12)14881、(HCO12)15083和(HCO12)15087。然后，这三个系中的每个系与包含实施例1中所述的CMD突变、JKD突变(Chen等1993，EMBO J.12：811-820)和(KCo5)9272转基因(Fishwild等1996，Nature Biotechnology 14：845-851)的小鼠配种。所产生的小鼠在内源小鼠重链和κ轻链基因座被破坏纯合型的背景中表达人免疫球蛋白重链和κ轻链转基因。
实施例3    人抗CD89单克隆抗体和双特异性抗体的产生
通过用重组可溶性CD89抗原免疫HCO12小鼠，产生人抗CD89单克隆抗体。
具体地说，HCO12小鼠最初用20μg在完全弗氏佐剂中乳化的抗原免疫，然后用在不完全弗氏佐剂中的所述抗原再免疫两次。小鼠通过腹膜内注射每2周进行免疫。
最后一次免疫后10天，通过EILSA(如下所述)测定人IgG抗CD89效价。产生足够效价(抗CD89 IgG应答)的小鼠在脾切除术之前3天和2天，用23μg抗原进行第四次加强。收获得自应答小鼠的脾，将其分散为单细胞。
为了产生生产抗CD89抗体的杂交瘤，用PEG，将得自血浆中含有抗CD89抗体的小鼠的脾细胞与P3X63-Ag8.653细胞(保藏于ATCC，保藏号为ATCC CRL 1580，非分泌型小鼠骨髓瘤细胞)融合。在杂交瘤生长后，根据人IgG的产生，用抗人IgG ELISA，筛选含有杂交瘤的各孔。
根据以下特性筛选和选择阳性杂交瘤：(1)产生人IgG1κ抗体，(2)与可溶性重组CD89结合，和(3)与表达CD89的免疫系统结合。发现称为7.4(7F12)、8.2(8D2)和14.1(14A8)的3个阳性克隆符合这些标准。
在结合研究中使用基于固相ELISA的测定。简而言之，用含可溶性重组CD89的PBS包被96孔微量滴定板(1μg/ml)，于室温保温过夜。然后所述板用PBS-0.2％Tween-20(PBST)洗涤，于室温下用含鸡血清白蛋白的PBST封闭1小时。得自产生抗CD89的杂交瘤的上清液或纯化抗体(在PBS中)加入到各孔中，于室温保温2小时。所述板如上所述用PBST洗涤，然后与50μl HRP缀合山羊抗人一起于室温保温1小时。洗涤后，向各孔中加入100μl ABTS(含150mg 2，2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的500ml 0.1M柠檬酸，pH4.35)/H2O2(10μl30％H2O2/10ml ABTS溶液)chromagen/底物溶液，用酶标仪于405nm波长下读出所述样品的读数。
用ELISA(人κ)(上述相同的方案)，根据同种型进一步表征产生结合CD89的人IgG的杂交瘤。
根据结合可溶性CD89、具有人IgG1κ同种型的抗体的产生，选择3个细胞系-7.4、8.2和14.1。从使用含有1-5％Fetalclone(Hyclone，Logan，UT)的HyQ-CCM1培养基的Cellmax生物反应器(Cellco，LagunaHills，CA)中分离抗体，并且通过柱色谱纯化。纯化抗体在0.3M碳酸钠缓冲液pH 9.5中充分透析，以供用异硫氰酸荧光素(FITC)标记用。通过将1mg固体FITC溶于1ml DMSO中，制备FITC储液。在恒定混合下滴加FITC储液，其加入量提供50μg FITC/mg抗体蛋白质。在加入FITC之后，将溶液于室温避光保温1-3小时。通过在用PBS平衡的Sephadex G-10柱上通过凝胶过滤，分离FITC标记的抗体。
如以下实施例中所述，根据结合特异性和活性，进一步表征纯化抗体。
实施例4    人抗CD89单克隆抗体的表征
I.结合/特异性研究
通过ELISA检测显示出与CD89显著结合的杂交瘤上清液纯化的单克隆抗体(Mab)(例如7.4、8.2和14.1)用流式细胞术(FACS分析)如下作进一步测试，证实与以下表达CD89的细胞结合：(1)被转化以表达人CD89的鼠2a1.6细胞(″2a1.6/CD89细胞″)，(2)人PMNL细胞(″HuPMN″)和(3)从表达人CD89的转基因小鼠中分离出的PMNL细胞(″FcαRITg MsPMN″)。
特别是，证实MAb 14.1识别CD89(FcαRI)，其识别位置位于胞外结构域2内、IgA结合位点之外，这使其区别于已知的鼠抗CD89Mab，例如My43(小鼠IgM)，后者阻断FcαRI配体结合结构域(Shen，L.等，1989 J.Immunol.143：4117)。
PMNL分离
通过Ficoll-Histopaque(Sigma)密度梯度离心，从健康志愿者的肝素化静脉血中分离出 人PMNL。用cytospin制剂测定的PMNL纯度超过95％，细胞活力为＞98％(通过锥虫蓝排除测定)。
在分离 鼠PMNL之前，给小鼠皮下注射15μg聚乙二醇粒细胞集落刺激生长因子(PEG-G-CSF，由J.Andreson博士友好提供，Amgen，Thousand Oaks，CA)，以增加PMNL数目。3天后从眶后血管丛采集血液。通过低渗裂解除去红细胞，然后用补充10％FCS的RPMI 1640培养基(Gibco BRL，Grand Island，NY)洗涤剩余的白细胞3次。在FACSsan(Becton Dickinson，San Jose，CA)上进行的FACS分析表明，白细胞由约55％PMNL、约40％淋巴细胞、约3％单核细胞和约1％嗜酸性粒细胞组成。通过锥虫蓝排除测定的细胞活力总是超过95％。
FACS分析1(结合研究)
将50微升抗体稀释液加入到含50,000个2a1.6/CD89细胞的50微升Facsbuffer中，于4℃孵育30分钟。然后细胞用100微升Facsbuffer洗涤3次，与兔(Fab2)抗Hu IgG-FITC一起于4℃孵育30分钟，用100微升Facsbuffer洗涤3次。将细胞重悬于200微升Facsbuffer中。在Facscalibur(Becton Dickinson)上测定荧光。
FACS分析2(特异性研究1)
将含25微升1mg/ml的Facsbuffer加入到含50,000 2a1.6/CD89细胞的50微升Facsbuffer中，于4℃孵育15分钟。加入25微升抗体稀释液，于4℃孵育30分钟，并用100微升Facsbuffer洗涤3次。然后将细胞与兔(Fab2)抗Hu IgG-FITC一起于4℃孵育30分钟，用100微升Facsbuffer洗涤3次，重悬于200微升Facsbuffer中。在Facscalibur(Becton Dickinson)上测定荧光。
FACS分析3(特异性研究2)
将50微升抗体稀释液加入到含50,000 2a1.6/CD89细胞以及对照细胞Jurkat/IIIa、CHO/IIIbNA.2、CHO/IIIbNA.1、2a 1.6/CD64或SLC细胞的50微升Facsbuffer中，于4℃孵育30分钟，并用100微升Facsbuffer洗涤3次。然后将细胞与兔(Fab2)抗Hu IgG-FITC一起于4℃孵育30分钟，用100微升Facsbuffer洗涤3次。将细胞重悬于200微升Facsbuffer中。在Facscalibur(Becton Dickinson)上测定荧光。
FACS分析4(全血结合研究)
将50微升抗体稀释液加入到50微升人、小鼠或CD89 Tg小鼠全血中，于4℃孵育30分钟。细胞用FACS裂解缓冲液裂解，于4℃孵育，并用100微升Facsbuffer洗涤3次，与兔(Fab2)抗Hu IgG-FITC一起于4℃孵育30分钟，用100微升Facsbuffer洗涤3次。将细胞重悬于200微升Facsbuffer中。在Facscalibur(Becton Dickinson)上测定荧光。
II.竞争研究
在下述的阻断研究和抑制ELISA中，测试Mab 14.1和7.4抑制人IgA和Mab My43(一种小鼠抗CD89抗体)与CD89结合的能力。
同IgA一样，MY43在所述天然配体结合位点与CD89结合，因此与IgA结合竞争。也测试Mab 14.1和7.4抑制Mab A77和A59(它们在天然配体IgA的结合位点之外结合)与CD89结合的能力。
Mab 14.1不抑制IgA和MY43与CD89的结合，但抑制A77和A59与CD89的结合，表明它在所述天然配体结合位点之外结合。
Mab 7.4不抑制IgA、MY43、A77或A59与CD89的结合，表明它也在所述天然配体结合之外结合，但结合位点与14.1不同。
阻断研究
将25微升抗体稀释液加入到含50,000 2a1.6/CD89细胞的50微升Facsbuffer中，于4℃孵育15分钟。加入25微升亚适浓度的A77-FITC、A59-PE或MY43，于4℃孵育30分钟，用100微升Facsbuffer洗涤3次。将经MY43处理的细胞与兔(Fab2)抗Hu-IgG-Fc-FITC一起于4℃孵育30分钟，用100微升Facsbuffer洗涤3次。将细胞重悬于200微升Facsbuffer中。在Facscalibur(Becton Dickinson)上测定荧光。
抑制ELISA
96孔ELISA(平)底板用100微升/孔含可溶性重组CD89(1微克/ml)的PBS包被，于室温保温过夜。将ELISA板排空，与100微升/孔PBS/0.05％Tween 1％鸡血清(PBST/Ch)一起于室温保温60分钟。将板排空，与过量的在PBST/Ch中稀释的抗体(50微升/孔)一起保温10分钟。将50微升/孔的aIgA2溶液以剂量反应加入到PBST/Ch中，于室温保温60分钟。然后所述板用PBS/0.05％Tween(PBST)洗涤3次，与100微升/孔4E8-生物素(小鼠抗IgA)一起于室温保温60分钟。然后所述板用PBST洗涤3次，与100微升/孔含Strep-HRP的PBST/Ch一起于室温保温60分钟，用PBST洗涤3次，用ABTS使ELISA显色。在Bio-tek读出仪中读出405nm波长下的光密度。
III.免疫沉淀研究
发现Mab 14.1和7.4免疫沉淀可溶性重组CD89(sCD89)。
简而言之，ProtG Sepharose Fast Flow柱用PBS洗涤3次。用含经洗涤微珠的PBS于4℃将sCD89预纯化(preclear)2小时。经预纯化的sCD89与抗体即小鼠IgG或人IgG一起于4℃保温2小时。CD89/IgG溶液用Prot G于4℃洗涤1小时，然后用PBS洗涤5次。然后将样品重悬于SDS-PAGE样品缓冲液中，在SDS-PAGE梯度凝胶中电泳，然后凝胶用考马斯亮蓝染色。
IV.亲和性研究
Mab 14.1和7.4的亲和性动力学即结合平衡缔合常数(Ka)和解离常数(Kd)如下测量。
测量Mab 14.1的Ka约为1.5×109，而Kd约为6.8×10-10。
测量Mab 7.4的Ka约为2.0×108，而Kd约为5.1×10-9。
通过将sCD89固定在芯片上，然后让所述Mab以不同浓度流过所芯片，用BIAcore测定测量亲和性动力学。也通过让sCD89流过Mab，进行Mab捕获测定。通过胺偶联，进行所述抗原和人IgG的固定化。试剂盒购自BIAcore，包括芯片和缓冲液。使用langmuir模型描述拟合。通过所述仪器所带的软件上得到的模型，进行数据分析。
       实施例5  人抗CD89单克隆抗体的活性
I.钙流出研究
如下测试Mab 14.1，表明它诱导钙流出。Mab 7.4不诱导钙流出。
将细胞洗涤3次之后，将38微升SNARF-1和38微升FLUO-3加入到在1.52ml无血清培养基中重悬浮的3e6细胞中。所述细胞于37℃避光孵育，加入5ml温热(37℃)无血清培养基，将细胞于37℃再孵育5分钟。然后细胞用无血清培养基洗涤2次，用抗体抗FcαR1包被，然后再次洗涤。将细胞重悬于Ca++Mobilisation缓冲液中，在流式细胞仪上运行24秒，以建立基线水平。接着，加入交联抗体抗HuIgG-Fc细胞，监测4分钟。让所用的细胞不与抗FcαR1一起孵育，以便建立阴性对照。
II.人C1q结合研究
如以下小节中所述，通过ELISA和FACS测试Mab 14.1和7.4在ELISA中以及当与表达CD89的细胞结合时(在FACS分析中)固定hC1q的能力。
Mab 14.1能够在ELISA中固定hC1q，当与细胞结合时固定能力弱。Mab 7.4能够在ELISA中固定hC1q，但在与细胞结合时不固定hC1q。这些Mab当与细胞结合时(这反映体内条件)不能固定hC1q，使其对于治疗应用特别有用，例如在不希望启动补体级联(导致靶细胞裂解)的情况下。
ELISA分析
简而言之，96孔ELISA(平)底板用100微升/孔含人IgG(3微克/ml)的PBS(hIgG1、hIgG2、hIgG3和hIgG4用作对照)包被，于室温保温过夜，将ELISA板排空，然后与100微升/孔Phosphate/NaCl/明胶/Tween缓冲液(C1q-ELISA稀释剂)一起于室温保温60分钟。将板排空，与在C1a-ELISA稀释剂中稀释的20微克/ml(100微升/孔)一起于室温保温60分钟，用C1q-ELISA稀释剂洗涤3次。接着，所述板与100微升/孔在C1q-ELISA稀释剂中稀释的兔抗hC1q一起于室温保温60分钟，用C1q-ELISA稀释剂洗涤3次，与100微升/孔在C1q-ELISA稀释剂中稀释的PO-缀合猪抗Rb IgG-Fc一起于室温保温60分钟。然后所述板用C1q-ELISA稀释剂洗涤3次。所述ELISA用ABTS显色，在Bio-tek读出仪中读出405nm波长下的光密度。
FACS分析
将25微升C1q-Facsbuffer中的抗体稀释液加入到含50,0002a1.6/cd89细胞的50微升Facsbuffer加NaCl(C1q-Facsbuffer)中，于4℃孵育15分钟，向其中加入25微升C1q-Facsbuffer中的hC1q(20微克/ml)，于4℃孵育30分钟。然后细胞用100微升C1q-Facsbuffer洗涤3次，与兔抗hC1q-Fitc一起于4℃孵育30分钟，用100微升C1q-Facsbuffer洗涤3次。将细胞重悬于200微升C1q-Facsbuffer中。在Facscalibur(Becton Dickinson)上测定荧光。
等同方案
本领域技术人员会认识到或者能够仅用常规实验就确定此中所述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这类等同方案将包括在以下权利要求书中。
序列表
<110>米德列斯公司(Medarex，Inc.)等
<120>抗Fcα受体(CD89)的人单克隆抗体
<130>MXI-211PC
<150>US 60/338,956
<151>2001-11-05
<150>US 60/268,075
<151>2001-02-12
<160>4
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>357
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
caggtgcaac tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc  60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatgttc tgcactgggt ccgccaggct  120
ccaggcaagg ggctggattg ggtggcagtg atatcagatg atggaaggaa taaatacttc  180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat  240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgt gagagaaggg  300
tatagcggca gctggtttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca     357
<210>2
<211>119
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Val Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Asp Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Phe Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Glu Gly Tyr Ser Gly Ser Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>3
<211>321
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>3
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
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gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa a                                           321
<210>4
<211>107
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
 1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Glu Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105
<210>5
<211>357
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>5
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ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgc attactgtgc gaggcttgac  300
tggggatatg atgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttca     357
<210>6
<211>119
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Asp Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val His Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Leu Asp Trp Gly Tyr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
    115
<210>7
<21l>327
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>7
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gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag  240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctcc gtacactttt  300
ggccagggga ccaagctgga gatcaaa                                      327
<210>8
<211>109
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
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Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu GluIle Lys
            100                 105

Claims (51)

1.一种与人CD89结合的分离的人单克隆抗体。
2.权利要求1的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体不激活补体。
3.权利要求1的分离的抗体，其中所述抗体在与所述受体的IgA结合位点不同的位点与CD89结合。
4.权利要求1的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体抑制IgA与CD89的结合。
5.权利要求4的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体对IgA与CD89结合的抑制至少达约50％。
6.权利要求1的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体以至少108M-1的平衡缔合常数(Ka)与人CD89结合。
7.权利要求1的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体以至少109M-1的平衡缔合常数(Ka)与人CD89结合。
8.权利要求1的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体重链是IgG1重链，而所述抗体轻链是κ轻链。
9.权利要求1的分离的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体包含由包含选自SEQ ID NO：1和5的核苷酸序列的核酸所编码的重链以及由包含选自SEQ ID NO：3和7的核苷酸序列的核酸所编码的轻链以及它们的保守序列修饰。
10.权利要求1的分离的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体包含含有选自SEQ ID NO：2和6的氨基酸序列的重链以及含有选自SEQID NO：4和8的氨基酸序列的轻链以及它们的保守序列修饰。
11.一种分离的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体与人CD89结合，并且具有至少一种选自以下的特性：
(a)与人CD89的结合平衡缔合常数(Ka)为至少约107M-1；
(b)与人CD89的解离常数(Kd)为约10-8S-1或更低；
(c)在体内与人CD89结合时不激活补体；
(d)所述抗体与人CD89上不抑制人IgA与所述受体结合的表位结合；
(e)所述抗体包含含有选自SEQ ID NO：2和6的氨基酸序列及其保守序列修饰的重链、和含有选自SEQ ID NO：4和8的氨基酸序列及其保守序列修饰的轻链。
12.权利要求1的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体是Fab片段或单链抗体。
13.权利要求1的分离的人单克隆抗体，其中所述抗体由杂交瘤生产，所述杂交瘤包括得自其基因组中包含人重链转基因和人轻链转基因的转基因非人类动物的、与无限增殖化细胞融合的B细胞。
14.一种杂交瘤，所述杂交瘤包括得自其基因组中包含人重链转基因和人轻链转基因的转基因非人类动物的、与无限增殖化细胞融合的B细胞，其中所述杂交瘤产生可检测量的权利要求1的人单克隆抗体。
15.选自名为7.4、8.2和14.1的杂交瘤的权利要求14的杂交瘤。
16.一种分离的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体与人CD89上由选自mAb 7.4、8.2和14.1的抗体所限定的表位结合。
17.一种分离的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体与人CD89上由mAb 14.1所限定的表位结合，并且具有SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列和SEQ ID NO：4中所示的轻链氨基酸序列。
18.一种分离的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体具有选自mAb7.4、8.2和14.1的抗体的结合特性。
19.一种分离的人单克隆抗体，所述人单克隆抗体具有mAb 14.1的结合特性，并且具有SEQ ID NO：2中所示的重链氨基酸序列和SEQID NO：4中所示的轻链氨基酸序列。
20.一种转基因非人类动物，所述转基因非人类动物表达权利要求1的抗体，其中所述转基因非人类动物具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组。
21.生产权利要求1的抗体的方法，所述方法包括：
用CD89或表达CD89的细胞，免疫其基因组中包含人重链转基因和人轻链转基因的转基因非人类动物，使得所述动物的B细胞产生抗体；
分离所述动物的B细胞；且
将所述B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成分泌所述抗体的无限增殖杂交瘤细胞。
22.一种双特异性或多特异性分子，所述分子包含权利要求16的人抗体和一个与非CD89的靶抗原结合的部分。
23.权利要求22的双特异性或多特异性分子，其中所述抗体是Fab片段或单链抗体。
24.权利要求22的双特异性或多特异性分子，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
25.权利要求22的双特异性或多特异性分子，其中与所述靶抗原结合的所述部分包含抗体或肿瘤配体。
26.权利要求22的双特异性或多特异性分子，所述分子包括融合蛋白。
27.权利要求22的双特异性或多特异性分子，所述分子包括化学连接的缀合物。
28.权利要求22的双特异性或多特异性分子，所述分子在存在表达CD89的效应细胞时诱导表达所述靶抗原的细胞裂解(ADCC)。
29.权利要求22的双特异性或多特异性分子，其中所述抗原选自癌胚抗原(CEA)、胃泌素释放肽受体抗原(GRP)、粘蛋白抗原、表皮生长因子受体(EGF-R)、HER2/neu、HER3、HER4、CD20、CD30、MAGE抗原、SART抗原、MUC1抗原、c-erb-2抗原和TAG 72。
30.一种分子缀合物，所述分子缀合物包含与抗原连接的权利要求16的人抗体。
31.权利要求30的分子缀合物，其中所述抗体是Fab片段或单链抗体。
32.权利要求30的分子缀合物，所述分子缀合物包括融合蛋白。
33.权利要求30的分子缀合物，所述分子缀合物包括化学连接的缀合物。
34.权利要求30的分子缀合物，其中所述抗原
35.一种组合物，所述组合物包含权利要求1的人抗体和药学上可接受的载体。
36.一种组合物，所述组合物包含权利要求22的双特异性分子和药学上可接受的载体。
37.一种组合物，所述组合物包含权利要求30的分子缀合物和药学上可接受的载体。
38.一种组合物，所述组合物包含两种或更多种权利要求1的人抗体的组合，其中每种所述抗体与人CD89的一种不同表位结合。
39.权利要求35的组合物，所述组合物还包含细胞毒性药。
40.一种免疫毒素，所述免疫毒素包含与细胞毒性药连接的权利要求2的抗体。
41.一种抑制细胞生长的方法，所述方法包括让所述细胞与有效量的权利要求22的双特异性抗体接触，使得所述细胞的生长被抑制，其中所述双特异性抗体包括一个与所述细胞上一种抗原结合的部分。
42.权利要求41的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。
43.权利要求42的方法，其中所述肿瘤抗原来自选自卵巢癌、乳腺癌、睾丸癌、前列腺癌、白血病和淋巴瘤的癌症的癌细胞。
44.权利要求41的方法，其中所述抗原是自身抗原。
45.权利要求41的方法，其中所述抗原来自微生物。
46.权利要求45的方法，其中所述微生物选自细菌、病毒和寄生虫。
47.一种治疗或预防特征为IgA免疫复合物沉淀的疾病的方法，所述方法包括给予需要治疗的受治疗者对于治疗或预防所述疾病有效量的与CD89特异性结合的分离的人单克隆抗体，其中所述单克隆抗体阻断IgA与CD89的结合。
48.权利要求47的方法，其中所述特征为IgA免疫复合物沉淀的疾病选自慢性肝炎、Henoch-Schonlein紫癜(HSP)、Berger病和IgA性肾小球性肾炎。
49.权利要求47的方法，其中所述单克隆抗体与CD89上由抗体8.2所限定的表位结合。
50.一种检测样品中CD89或表达CD89的细胞存在的方法，所述方法包括：
使所述样品与权利要求1的抗体在允许所述抗体和CD89之间形成复合物的条件下接触；并且
检测所述复合物的形成。
51.一种表达载体，所述表达载体包含编码与人CD89结合的人单克隆抗体的重链和轻链可变区和恒定区的核苷酸序列，其中所述重链核苷酸序列选自SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5，而所述轻链核苷酸序列选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7。
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