CN1597961A

CN1597961A - 利用毕赤酵母生产高比活耐高温植酸酶

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Publication number: CN1597961A
Application number: CN 03151019
Authority: CN
Inventors: 姚泉洪; 彭日荷; 熊爱生; 吴伟; 刘承训
Original assignee: XINGHU BIOTECH CO Ltd ZHAOQING CITY GUANGDONG PROV
Current assignee: XINGHU BIOTECH CO Ltd ZHAOQING CITY GUANGDONG PROV
Priority date: 2003-09-17
Filing date: 2003-09-17
Publication date: 2005-03-23
Anticipated expiration: 2023-09-17
Also published as: CN1302112C

Abstract

本发明公开了利用毕赤酵母生产高比活耐高温植酸酶。本发明采用多个同源植酸酶基因，利用DNA酶进行部分酶介，回收所有的DNA降解片段，在体外进行DNA分子重排，将所有重排DNA分子酶切后，构建到表达载体中，电击入大肠杆菌通过植酸酶表达及活性筛选突变植酸酶基因，最终获得高比活且耐高温植酸酶基因Phy XH，再构建成植酸酶基因表达载体pPhy XH电击转入毕赤酵母菌，挑选出植酸酶高表达重组酵母菌。

Description

利用毕赤酵母生产高比活耐高温植酸酶

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说利用多个同源植酸酶基因片段进行体外重组，定向筛选获得比活高且耐受高温的植酸酶基因，该基因能在毕赤酵母中高效表达。

背景技术

植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中。不同的物种产生的植酸酶在比活、最适反应pH、耐热性等性质上存在很大差异。许多微生物都能产生高比活的植酸酶。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所有22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于曲霉Aspergillus terreus NO.9A-1，其最适pH为4.5，最适反应温度为70℃，pH在1.2～9.0范围内，该酶均能稳定维持一定活性。此后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶，其中来源于A.ficcum NR-RL3135(A.nigervar.awamori)的植酸酶phyA在酸性条件下有较高酶活性，被认为是目前最具应用前景的饲用植酸梅。植酸酶phyA是一种糖基化蛋白，分子量为85KD。酶反应最适pH为2.5和5.5，最适反应温度为55℃。在37℃、pH2.5的条件下，以植酸为底物的Km值为50mmol，Ca²⁺、Fe²⁺对酶活性无影响，Mn²⁺、Co²⁺有激活作用，能使酶活性分别提高30％和13％。Cu²⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Cu⁺对酶活性有抑制作用，其中Cu²⁺、Zn²⁺为非竞争性抑制，Fe²⁺、Cu⁺为竞争性抑制。对酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如L(+)-酒石酸对它却没有抑制作用。

禾谷类、豆科类及油料作物是人的食品和动物饲料中的主要原料。这些原料中虽含有大量的磷，但其中50％-70％是以植酸磷(六磷酸肌醇)的形式存在(Salunkhe 1982，食品研究进展)。单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率很低。植酸酶能将植酸磷水解成肌醇和磷酸，在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率。

开发植酸酶的直接原因来源于植酸带来的磷污染。一方面，植酸中螯合的磷无法吸收利用，另一方面则是必须在饲料和食品中添加大量无机磷，造成磷源浪费和环境污染(Cromwell 1991，生物技术在食品工业中的应用进展)。随着养殖业的发展，无机磷的排泄量大幅度上升，磷污染遍及河流、山川和平原耕作地，直接威胁人类自身的生存。自80年代中期，欧洲就致力于寻找全面解决无机磷污染的方案(CouncilDirective91/676/EEC)中，着重强调限制养殖业的磷排泄量。植酸酶是目前所有使用的添加剂中，具有最直接、最显著环保社会效益的酶制剂。由于磷是动物生长过程中的基本元素，为了弥补新陈代谢中磷的消耗，常常需要在食品和饲料中添加无机磷(Common1989，自然杂志)。植酸酶将植酸中鳌合的磷释放出来，从而减少了饲料中磷酸氢钙等无机磷的使用量，降低幅度达50％-70％。在中国，很多养殖区可以将磷酸氢钙的用量减少70％以上，杂粕用量较大的蛋鸡养殖区，甚至能够全部替代磷酸氢钙。使用植酸酶的饲料，向环境排泄的磷相应减少30％以上(Nelson 1968，畜牧科学)。使用植酸酶在减少饲料中无机磷添加量的同时，大幅度地减轻甚至完全杜绝了磷酸氢钙导致的氟和其它重金属中毒问题。使用植酸酶每年在饲料方面的成本即可减少9200多万元。在赖以生存的环境中，植酸酶从污染的源头轻而易举地消灭磷污染，比常规使用的后期治理的方法更为经济有效。可以预期，植酸酶将以显著的经济效益和社会效益对整个行业的可持续发展产生巨大促进作用。

最新的研究结果还发现了植酸酶的潜在营养价值。植酸通过与金属离子的螯合，降低单胃动物对营养的吸收，植酸酶可以提高动物对磷和钙的消化吸收，Jongbloed于1993年建立了一个关于植酸酶活力与饲料中磷酸盐的当量关系式。在含磷酸盐的饲料中添加500IU植酸酶相当于1g来自于磷酸一钙的磷或1.1g来自于二水磷酸氢钙的磷；Ofier等(1992)、Mroz等(1994)报道，植酸酶能够提高猪禽对氨基酸和氮的回肠消化率。植酸酶通过降低植酸盐的抗营养作用，增加动物对蛋白质和一些金属离子的吸收能力(Wyss1999，应用环境微生物科学)，提高饲料中蛋白质的消化利用率。应用植酸酶，加大了非常规原料资源的使用比例，可以大量节约蛋白质饲料。使用植酸酶能直接降低了饲料的原料成本，从而提高产品的价格竞争力。

目前生产上采用的植酸酶均来自黑曲霉(Aspergillus niger)。黑曲霉中的植酸酶(PhyA)具有比活高、结构稳定等优点。在植酸酶发展初期，均采用原始菌株发酵生产，然而，原始菌株表达量低，生产成本较高，通过化学诱变或物理诱变方法可以获得产酶量提高的菌株，然而诱变容易导致菌株其它功能的损失，为了获得目的基因高表达且其它功能不受影响的菌株，需要长期观察筛选，所需时间很长，另外，诱变菌株容易退化。利用分子家族进化方法，对已有的基因进行优化组合，可以获得编码聚很多功能于一体的新蛋白质基因。

发明内容

本发明采用DNA分子体外重组方法，由来源不同的多个植酸酶基因片段杂交形成植酸酶基因库，利用大肠杆菌表达质粒，从植酸酶基因库中寻找一种高比活且耐受高温的植酸酶基因。另一目的是提供酵母表达高比活植酸酶的方法。

本发明中利用的植酸酶基因含有四个不同的植酸酶基因，其一为通过基因重组筛选获得的耐高温植酸酶基因，其二为通过基因重组筛选高比活植酸酶基因，其三为来自无花果曲霉中的植酸酶基因，其四为大肠杆菌植酸酶基因，它们全部通过化学合成由酵母偏爱密码组成。

为了提高植酸酶的比活性，首先用PCR合成无花果植酸酶基因和大肠杆菌植酸酶基因。每个植酸酶基因设计并合成20个寡核苷酸引物，长度为70-90碱基，引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66将所有引物加入反应体系，进行PCR扩增，共进行35个循环，合成由酵母偏爱密码组成的无花果植酸酶基因和大肠杆菌植酸酶基因。本发明利用连续延伸PCR合成无花果曲霉植酸酶基因，引物长度为70-90bp，合成20个寡核苷酸引物，引物与引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20ng，两侧的引物量为100-200ng，PCR扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。

本发明利用连续延伸PCR合成大肠杆菌植酸酶基因。引物长度为70-90bp，合成20个寡核苷酸引物，引物与引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20ng，两侧的引物量为100-200ng。PCR反应体系为100μL。PCR扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。

本发明采用基因合成、基因族分子体外重组筛选高比活耐高温植酸酶基因，通过载体构建、酵母电击转化、高活性菌株筛选、高密度发酵等步骤来制备高比活耐高温植酸酶。

本发明以耐高温植酸酶基因为模板，FphyZ1，FphyF1为引物扩增耐高温植酸酶基因，FphyZ1：(5’-TTGGATCCTCCAAATCCTGCGACACCGTTGACT TG-3’)；FphyF1：(5’-CGAGCTCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCA C-3’).以高比活植酸酶基因为模板，phyiZ1，phyiF1为引物扩增高比活植酸酶基因，phyiZ1：(5’-TTGGATCCTTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAAC-3’)；phyiF1：(5’-CGAGCTCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCAC-3’).以无花果曲霉植酸酶基因为模板，phyiZ1，phyiF1为引物扩增其植酸酶基因，phynZ1：(5’-TTGCCTATTCCTGCTCAAAACACTTC-3’)；phynF1：(5’-GAGCTCATTATTCGGAAGGAACGAAACCGCAC-3’).以高比活植酸酶基因为模板，phyiZ1，phyiF1为引物扩增耐高温植酸酶基因，EphyZ1：(5’-ATGAAAGCGATCTTAATCCCATTTTTATC-3’)；EphyF 1：(5’-CTCATTACAAACTGCACGCCGGTATGCGTGC-3’).

本发明以筛选获得的耐高温植酸酶基因、重组筛选高比活植酸酶基因、无花果植酸酶基因和大肠杆菌植酸酶基因为出发基因，利用DNA酶进行部分酶解，回收所有的DNA降解片段，在体外进行DNA分子重排，将所有重排DNA分子酶切后，构建到表达载体中，电击入大肠肝菌，通过植酸酶表达及活性筛选突变植酸酶基因，最终获得高比活且耐高温的植酸酶基因PhyXH。新的植酸酶氨基酸序列与phyA2具有97.5％的同源性。PhyXH和PhyA2的氨基酸数相同，但有12个氨基酸发生了改变。其中包括：11T＞V，41K＞Q，53Q＞K，91K＞E71S＞T，112E＞F，157G＞A，191L＞V等。

GAGACTTCTCATTTGTGGGGTCAATACGCTCCATTCTTCTCTTTGGCTAACAAGTCTGCTATCTCTCCAGAT

E T S H L W G Q Y A P F F S L A N Q S A I S P D

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R G L S F A R S G G D W A E C F A K D E L -

按筛选获得的高比活耐高温植酸酶基因的两端序列设计出引物，在基因5’端加入XhoI切点和信号态序列，引物为PhyXH1，在基因3’端加入Not I切点，引物为PhyXH2，扩增片段克隆后，XhoI和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体，构建成PhyXH的酵母表达载体(图1)，含有植酸酶基因表达的载体pPhyXH 9.4Kb电击转入毕氏酵母菌，该酵母菌不能利用甲醇作碳源生长，该酵母菌中只含一拷贝的植酸酶基因。挑选植酸酶高表达重组酵母P.Pastoris菌种，进行高密度发酵，表达的植酸酶具有较高的比活，且耐受较高的温度。

附图说明

图1是构建成PHYXH的酵母表达载体图。

图2是重组菌株高密度发酵时间与植酸酶表达量的关系。

图3表示PH值对植酸酶活力的影响。

本发明有益效果

通过偏爱密码改造及DNA分子重排获得的植酸酶基因具有以下优点：

1基因能在酵母中高效表达，表达量高于1.8克/升。

2基因表达产物具有很高的酶比活，新的植酸酶基因PhyXH的比活比原先PHYA2高50倍。

3新的植酸酶PhyXH在酵母中也能糖基化。

4新的植酸酶PhyXH对温度具有较高的耐受性，最适反应pH值与原始基因一致，为pH2.5-5.5。

具体实施方式

实施例1：植酸酶基因的化学合成

1.1利用连续延伸PCR合成无花果曲霉植酸酶基因。引物长度为70-90bp，合成20个寡核苷酸引物，引物与引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20ng，两侧的引物量为100-200ng。PCR反应体系为100μL。PCR扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。

1.2利用连续延伸PCR合成大肠杆菌植酸酶基因。引物长度为70-90bp，合成20个寡核苷酸引物，引物与引物之间连接通过20-30bp重叠序列，Tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20ng，两侧的引物量为100-200ng。PCR反应体系为100μL。PCR扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。

实施例2：植酸酶基因的DNA分子重排(DNA Shuffling)

2.1 PCR扩增酸性植酸酶基因及回收

以耐高温植酸酶基因为模板，FphyZ1，FphyF1为引物扩增耐高温植酸酶基因，FphyZ1：(5’-TTGGATCCTCCAAATCCTGCGACACCGTTGACTTG-3’)；FphyF1：(5’-CGAGCTCTTAGGAGAAGCATTCACCCCAGTTACCAC-3’).

以高比活植酸酶基因为模板，phyiZ1，phyiF1为引物扩增高比活植酸酶基因，phyiZ1：(5’-TTGGATCCTTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAAC-3’)；phyiF1：(5’-CGAGCTCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCAC-3’).

以无花果曲霉植酸酶基因为模板，phyiZ1，phyiF1为引物扩增其植酸酶基因，phynZ1：(5’-TTGCCTATTCCTGCTCAAAACACTTC-3’)；phynF1：(5’-GAGCTCATTATTCGGAAGGAACGAAACCGCAC-3’).

以高比活植酸酶基因为模板，phyiZ1，phyiF1为引物扩增耐高温植酸酶基因，EphyZ1：(5’-ATGAAAGCGATCTTAATCCCATTTTTATC-3’)；EphyF1：(5’-CTCATTACAAACTGCACGCCGGTATGCGTGC-3’).

反应条件为：94℃10min预变性，94℃变性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30个循环，1％Agrose电泳，透吸袋法回收1.4kp的基因片段。

2.2DNase I降解DNA及回收小片段

回收植酸酶基因片段以DNase I缓冲液(50mmol/L Tris-ClpH7.4+1mmol/L MgCl₂)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10％丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl 10×无引物PCR缓冲液(Primerless PCR Buffer)(50mmol/LKCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。

2.3无引物PCR(Primerless PCR)

进行Primerless PCR扩增。反应体系：5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/LdNTPs+4.5μl 25mmoljm/LMgCl₂+Taq2U+ddH₂O to 50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环)，2％Agrose电泳检测PCR扩增结果。2.4有引物PCR(Primer PCR)

进行PrimerPCR扩增反应。反应体系：5μlPrimerless PCR产物+phyiZ10.2ng+phyiF1 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH₂O to 50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35个循环，1％Agrose电泳检测，回收1.4kb基因片段。

2.5高活性耐高温植酸酶筛选

回收1.4kb的重排植酸酶基因片段，经BamH I和SacI双酶切后，构建入原核表达载体pG251(CN1338515)启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。

电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到10⁷，进行高比活植酸酶的筛选。方法如下：利用100ml LB培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化钠)培养细菌过夜至细菌浓度为OD600＝0.5-0.8。5000转/秒离心收集培养好的细菌，利用灭菌的双蒸水洗离心菌体两次，每次25ml，再用灭菌的10％甘油洗一次，最后利用1ml 10％甘油悬浮菌体。将重组植酸酶基因与载体连接物利用电击仪(Bio-rad Gene pulser)(美国BIO-RED公司)电击转化大肠杆菌，50μl大肠杆菌中加入2μg连接DNA片段。转化参数如下：25KV，200 Ω，25μF。转化连接DNA片段浓度达到每微升1微克。

取1μl细菌稀释96倍，等量加入96孔细菌培养板(12×8)，在每一个孔中加入150μl的LB培养液至OD₆₀₀＝0.4-0.6，从培养板的孔中取出10μl菌液转移到试管中培养，同一行的12个孔和同一列的8个孔中的细菌放置同一根试管中培养，共20根试管，每管加入带氨苄青霉素的LB培养液3mL，培养8-12小时后，离心回收菌体，超声破碎细胞，离心取上清100μl，100℃处理60分钟后，加入植酸钾钠底物，37℃反应30分钟，加入钼蓝显色剂(钼酸胺，硫酸亚铁，浓硫酸)显色。

取每行中活性最高和每列中活性最高的交接点，将10μl培养板交接点孔中的细菌稀释96倍后，加入另一块培养板培养，每孔150μl LB培养液，10μl菌液，进行新一轮筛选。3-5轮筛选后，取交接点中细菌稀释10-100倍涂布在含氨苄抗生素的LB固体培养板上，挑取单菌落进行活性比较，获得高比活的植酸酶基因phyXH。将筛选获得植酸酶基因进行序列测定。

实施例4：酵母表达植酸酶载体构建

按筛选获得耐高温高比活基因的两端序列设计引物，在基因5’端加入XhoI切点和信号态切割序列，引物为：PHY1Z(5’-AACTCGAGAAAAGAGAACCTCCGGATT GGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCC-3’)，在基因3’端加入Not I切点：引物为：PHY1F(5’-AACGCGGCCGCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCACCACCGGTAC-3’)。扩增片段克隆后，Xho I和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体(Invitrogen company产品)，构建成PhyXH的酵母表达载体pPphyXH(图1)。

实施例5：植酸酶高表达重组酵母筛选

将活化的酵母菌株Pichia Pastoris G315于500ml YPD中30℃培养18hr，至OD₆₀₀＝1.7，5000r/min离心收集菌体，先后用500，250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清夜，用20ml预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5ml预冷的山梨醇悬浮，用于电击感受态。

大量抽提酵母表达载体pPphyXH，BglII酶切回收小片段，取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞，冰浴5min，用Bio-Red GenePulser电击仪电击，参数为2.5Kv，25μF。电击结束后立即加入1.0ml预冷的1mol/L山梨醇，取200μL涂布于固体选择培养基平板(18.6％山梨醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，2％琼脂糖)，30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到MM(1.34％YNB，0.00004％生物素，0.5％甲醇，1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB，0.00004％生物素，2％葡萄糖，1.5％琼脂糖)平板上，30℃培养2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子为阳性克隆。

将重组酵母接种于20ml BMGY(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB0.000004％生物素，1％甘油)，30℃培养，离心收集菌体，加入20ml诱导培养基BMMY(用0.5％甲醇代替BMGY中的甘油)，30℃下继续诱导培养36hr。

以甲醇为唯一碳源的MM培养基和以葡萄糖为碳源的MD培养基进行对应培养，进一步筛选定点整合的重组转化子168个，命名为P.pastoris PHYXH1、2、3……168。

将所有的阳性克隆单独接种三角瓶中，30℃培养至OD₆₀₀＝4-5，利用甲醇诱导培养36hr，每个诱导菌株取5μl上清液进行SDS-PAGE检测，另取10μl上清液稀释100倍，以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶活性测定方法采取钼黄法(BASF Company)。植酸酶酶活性单位(U)定义为：在37℃下，每分钟分解植酸盐释放出1nmol/L无机磷酸所需要的酶量为1U。结合电泳条带和酶活力单位，筛选到1株高效表达植酸酶基因的重组子P.pastorisPHYXH。

实施例6：重组菌株的高密度发酵

挑取植酸酶高表达重组酵母P.pastoris PHYXH菌株接种200ml YPED培养基，30℃培养至OD₆₀₀＝3.0，转入B.Braun 5L发酵罐中进行高密度发酵，以YPED培养重组酵母，利用氨水控制pH值为5.5，发酵过程中氧含量控制在20％，培养90hr，甘油耗尽，加入0.5％甲醇，30℃诱导培养。

30℃培养6hr后，重组酵母进入对数生长期，氧消耗加快，须充入纯氧，氧含量控制在20％，在发酵过程中，持续加入氨水调节pH值恒定在5.5，发酵90hr后，OD₆₀₀＝110，加入0.5％甲醇诱导培养，诱导不同时间后取3ul无菌体的诱导培养液进行SDS-PAGE检测。结果(图2)，随着诱导时间的增加，植酸酶的表达量不断提高，60h后，上清液中的表达量保持稳定。重组子P.pastoris PHYXH诱导60hr后，植酸酶表达量高达1.8mg/ml。表达的植酸酶分子量大小约为79kD。

分子量大小约为79kD。

在37℃ pH5.5的条件下对含表达产物的培养液进行植酸酶活性测定，重组酵母P.pastoris PHYXH培养60hr后，酶活力为2,010,000FTU/ml，增加诱导表达时间，植酸酶的表达量仅缓慢增加。

实施例7：植酸酶性质测定

将底物分别配制成pH＝1.5；2.5；3.5；4.5；5.5；6.5，以pH＝5.5时的酶活单位为100％，以高密度发酵上清液测定不同pH条件下植酸酶的相对活力。结果表明该植酸酶在pH2.5-6.5之间均有酶活力，pH值为2.5和5.5时，植酸酶活性最高，表现出两个峰值(图3)。

将上清液用90℃处理不同时间，放置冰上冷却，加入酶反应底物，37℃反应30min，以未经高温处理的发酵液为参比，测定上清液中的残存酶活性。经过90min处理，植酸酶的活性仍保持50％。90℃高温处理120min，仍有部分活性。

本发明以上所提及的培养基配方均为重量百分比。

(1)一般信息：

(i)发明名称：利用毕赤酵母生产高比活耐高温植酸酶

(1)序列数目：2

(2)序列SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1290bp

(B)类型：核酸

(C)链性：双链

(D)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：DNA

(ii)序列描述：SEQ NO：1

GAGACTTCTCATTTGTGGGGTCAATACGCTCCATTCTTCTCTTTGGCTAACAAGTCTGCTATCTCTCCAGAT

GTTCCAGCTGGTTGTAAAGTTACTTTCGCTCAAGTTTTGTCCAGACATGGTGCTAGATACCCAACTGATACT

AAAGGTAAGAAATATTCTGCTTTGATTGAGGAGATTCAACAAAACGCTACTACTTTTGAGGAGAAATACGCT

TTTTTGAAAACTTACAACTATTCTTTGGGTGCTGATGATTTGACTCCATTTGGTGAACAAGAATTGGTTAAT

TCTGGTGTTAAGTTTTACCAAAGATACGAATCTTTGACTAGAAATATTGTTCCATTTATTAGATCCTCTGGT

TCTTCCAGAGTTATTGCTTCTGGTAATAAATTCATTGAAGCTTATCAATCTACTAAATTGAAAGATCCAAGA

GCCCAACCAGGTCACTCTTCTCCAAAAATTGATGTTGTTATTTCTGAGGCTTCTACTTCTAATAATACTGTG

GACCCAGGTACTTGTACTGTTTCTGAAGATAACGAATTGGCTGATGATTTCGAAGCTAATTTTACTGCTACT

TTTGTTCCATCTATTAGACAATCTTTGGAAAATAACTTGTCTGGTGTTGCTTTGACTGATACTGAAGTTACT

TACTTGATGGACTTGTGTTCTTTTGATACTATCTCTACTTCTACTGTTGATACTAAATTGTCTCCATTTTGT

GATTTGTTTACTCATGAAAAATGGATTAATTATGATTATTTGCAATCTTTGAACAAGTACTACGGTCATGGT

GCTGGTAATCCATTGGGTCCAACTCAAGGTGTTTGTTACGCTAATGAATTGATTTCCAGATTGACTCATTCT

CCAGTTCATGATTACACTTCTTCTAATCATATTTTGGATTCTTCTCAAGATACTTTTCCATTGAACTCTACT

TTGTACGCTGATTTCTCTCTTAACAATGGTATTATCTCTATTTTGTTTGCTTGGGGTTTGAACAAAGGTACT

AAACCATTGTCTTCTACTACTGCTGAAAATATCACTCAAACTGATGGTTTTTCTTCTGCTTGGACTGTTCCA

TTCGCTTCCAGAATGTACGTTGAAATGATGCAATGTCAATCTGAACAAGAACCATTGGTTAGAGTTTTGGTT

AATGATAGAGTTGTTCCATTGCATGGTTGTCCAGTTGATGCTTTGGGTAGATGTACTAGAGATTCTTTTGTT

AGAGGTTTGTCTTTTGCTAGATCCGGTGGTGATTGGGCTGAATGCTTTGCTAAGGACGAATTGTAA

植酸酶结构基因组成部分，全部采用酵母偏爱密码。

(3)序列SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：430AA

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑结构：线形

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：SEQ NO：2

(补入氨基酸序列)

E T S H L W G Q Y A P F F S L A N Q S A I S P D

V P A G C K V T F A Q V L S R H G A R Y P T D T

K G K K Y S A L I E E I Q Q N A T T F E E K Y A

F L K T Y N Y S L G A D D L T P F G E Q E L V N

S G V K F Y Q R Y E S L T R N I V P F I R S S G

S S R V I A S G N K F I E A Y Q S T K L K D P R

A Q P G H S S P K I D V V I S E A S T S N N T V

D P G T C T V S E D N E L A D D F E A N F T A T

F V P S I R Q S L E N N L S G V A L T D T E V T

Y L M D L C S F D T I S T S T V D T K L S P F C

D L F T H E K W I N Y D Y L Q S L N K Y Y G H G

A G N P L G P T Q G V C Y A N E L I S R L T H S

P V H D Y T S S N H I L D S S Q D T F P L N S T

L Y A D F S L N N G I I S I L F A W G L N K G T

K P L S S T T A E N I T Q T D G F S S A W T V P

F A S R M Y V E M M Q C Q S E Q E P L V R V L V

N D R V V P L H G C P V D A L G R C T R D S F V

R G L S F A R S G G D W A E C F A K D E L -

植酸酶氨基酸序列，构成耐高温高比活植酸酶的一级结构，多肽分子大小为50kD。该氨基酸序列与原始基因编码的氨基酸序列存在12个氨基酸差异。分子之间含有6个糖基化位点，一般在酵母中表达出79kD糖基化分子。经糖基化的植酸酶分子形成特定的高级结构，含有植酸的结合和催化位点。

Claims

1、一种具有耐高温且高比活的编码如下的植酸酶基因PhyXH：

GAGACTTCTCATTTGTGGGGTCAATACGCTCCATTCTTCTCTTTGGCTAACAAGTCTGCTATCTCTCCAGAT

E T S H L W G Q Y A P F F S L A N Q S A I S P D

GTTCCAGCTGGTTGTAAAGTTACTTTCGCTCAAGTTTTGTCCAGACATGGTGCTAGATACCCAACTGATACT

V P A G C K V T F A Q V L S R H G A R Y P T D T

AAAGGTAAGAAATATTCTGCTTTGATTGAGGAGATTCAACAAAACGCTACTACTTTTGAGGAGAAATACGCT

K G K K Y S A L I E E I Q Q N A T T F E E K Y A

TTTTTGAAAACTTACAACTATTCTTTGGGTGCTGATGATTTGACTCCATTTGGTGAACAAGAATTGGTTAAT

F L K T Y N Y S L G A D D L T P F G E Q E L V N

TCTGGTGTTAAGTTTTACCAAAGATACGAATCTTTGACTAGAAATATTGTTCCATTTATTAGATCCTCTGGT

S G V K F Y Q R Y E S L T R N I V P F I R S S G

TCTTCCAGAGTTATTGCTTCTGGTAATAAATTCATTGAAGCTTATCAATCTACTAAATTGAAAGATCCAAGA

S S R V I A S G N K F I E A Y Q S T K L K D P R

GCCCAACCAGGTCACTCTTCTCCAAAAATTGATGTTGTTATTTCTGAGGCITCTACTTCTAATAATACTGTG

A Q P G H S S P K I D V V I S E A S T S N N T V

GACCCAGGTACTTGTACTGTTTCTGAAGATAACGAATTGGCTGATGATTTCGAAGCTAATTTTACTGCTACT

D P G T C T V S E D N E L A D D F E A N F T A T

TTTGTTCCATCTATTAGACAATCTTTGGAAAATAACTTGTCTGGTGTTGCTTTGACTGATACTGAAGTTACT

F V P S I R Q S L E N N L S G V A L T D T E V T

TACTTGATGGACTTGTGTTCTTTTGATACTATCTCTACTTCTACTGTTGATACTAAATTGTCTCCATTTTGT

Y L M D L C S F D T I S T S T V D T K L S P F C

GATTTGTTTACTCATGAAAAATGGATTAATTATGATTATTTGCAATCTTTGAACAAGTACTACGGTCATGGT

D L F T H E K W I N Y D Y L Q S L N K Y Y G H G

GCTGGTAATCCATTGGGTCCAACTCAAGGTGTTTGTTACGCTAATGAATTGATTTCCAGATTGACTCATTCT

A G N P L G P T Q G V C Y A N E L I S R L T H S

CCAGTTCATGATTACACTTCTTCTAATCATATTTTGGATTCTTCTCAAGATACTTTTCCATTGAACTCTACT

P V H D Y T S S N H I L D S S Q D T F P L N S T

TTGTACGCTGATTTCTCTCTTAACAATGGTATTATCTCTATTTTGTTTGCTTGGGGTTTGAACAAAGGTACT

L Y A D F S L N N G I I S I L F A W G L N K G T

AAACCATTGTCTTCTACTACTGCTGAAAATATCACTCAAACTGATGGTTTTTCTTCTGCTTGGACTGTTCCA

K P L S S T T A E N I T Q T D G F S S A W T V P

TTCGCTTCCAGAATGTACGTTGAAATGATGCAATGTCAATCTGAACAAGAACCATTGGTTAGAGTTTTGGTT

F A S R M Y V E M M Q C Q S E Q E P L V R V L V

AATGATAGAGTTGTTCCATTGCATGGTTGTCCAGTTGATGCTTTGGGTAGATGTACTAGAGATTCTTTTGTT

N D R V V P L H G C P V D A L G R C T R D S F V

AGAGGTTTGTCTTTTGCTAGATCCGGTGGTGATTGGGCTGAATGCTTTGCTAAGGACGAATTGTAA

R G L S F A R S G G D W A E C F A K D E L -

通过PhyXH质粒载体整合入酵母菌获得能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌。

2、根据权利要求1所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于编码的植酸酶基因中氨基酸数目与来自黑曲霉编码的Phy2A氨基酸数目相同，在11位氨基酸由Phy2A的苏氨酸突变为缬氨酸，41位氨基酸由Phy2A的赖氨酸突变为谷氨酰胺；53位氨基酸由Phy2A谷氨酰胺突变为赖氨酸；91位氨基酸由Phy2A的赖氨酸突变为谷氨酸；71位氨基酸由Phy2A的丝氨酸突变为苏氨酸；112位氨基酸由Phy2A的谷氨酸突变为苯丙氨酸；157位氨基酸由Phy2A的甘氨酸突变为丙氨酸；191位氨基酸由Phy2A的亮氨酸突变为缬氨酸。

3、根据权利要求1所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于构建的酵母表达载体pPhy XH，含有权利要求1所述的高比活耐高温植酸酶基因序列。

4、根据权利要求1所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于pPhy XH质粒载体含有由无花果植酸酶基因、大肠杆菌植酸酶基因、耐高温植酸酶基因、高比活植酸酶基因用DNA分子家族重排进行体外重组，重排植酸酶基因片段构建到原核表达载体中，电击转入大肠杆菌菌株通过筛选获得高比活耐高温的植酸酶基因。

5、根据权利要求1所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于Phy XH基因两端序列引物在基因5、端加入Xhol切点和信号态切割序列，引物为：

PHY1Z，

(5’-AACTCGAGAAAAGAGAACCTCCGGATTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCC-3’)，在基因3`端加入Not I切点，引物为PHY1F(5’-AACGCGGCCGCTTAAGCGAAGCATICAGCCCAGTCACCACCGGTAC-3’)。

6、如权利要求1所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌的制备方法，

a、采用四个具有酵母偏爱密码的植酸酶基因；

b、以上述四个植酸酶基因为模板，利用DNA分子家族重排技术，对合成基因进行体外重组，PhyIZ1、PhyIF1为引物扩增重排的植酸酶基因，回收1.4Kb重排的植酸酶基因片段，构建到原核表达载体中，电击法转入大肠杆菌菌株获得突变体表达文库，进行高比活植酸酶筛选，获得高比活且耐高温的植酸酶基因Phy XH；

c、采用筛选获得基因高比活且耐高温的植酸酶基因Phy XH两端序列设计引物，在基因5`端加入Xhol切点和信号态切割序列，引物为：PHY1Z，(5’-AACTCGAGAAAAGAGAACCTCCGGATTGGCTGTCCCAGCTTCCAGAAACCAGTCC-3’)，在基因3`端加入Not I切点，引物为PHY1F(5’-AACGCGGCCGCTTAAGCGAAGCATTCAGCCCAGTCACCACCGGTAC-3’)，扩增片段克隆后，Xho I和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体，构建成PhyXH的酵母表达载体pPhy XH；

d、植酸酶基因高表达重组酵母筛选；

e、将重组酵母菌株高密度发酵。

7、根据权利要求6所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌的制备方法，，其特征在于植酸酶基因合成的引物为Phyl Z和Phyl F扩增片段克隆后，在XhoI和Not I双酶切，定向插入pPIC9载体，构建成Phy XH的酵母表达载体pPhyXH。

8、根据权利要求6所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌的制备方法，其特征在于高活性且耐高温植酸酶筛选通过回收1.4kb的重排植酸酶基因片段，经Bam HI和SacI双酶切后构建入原核表达载体pG251启动子和t1t2终子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因，电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，进行高比活植酸酶的筛选。

9、根据权利要求6所述的能生产植酸酶的毕赤酵母工程菌的制备方法，其特征在于含有植酸酶基因表达载体pPhy XH电击转入毕赤酵母菌，挑选植酸酶重组酵母菌株进行高密度发酵。