CN1360054A - 一种利用基因芯片技术将核酸应用于仿伪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的将核酸应用于防伪的方法,将核酸制成防伪标记并利用基因芯片技术检测出真伪。本发明还公开了以此技术制作防伪标记的方法。本发明还公开了这种新方法的用途。

Description

一种利用基因芯片技术将核酸应用于仿伪的方法

本发明是把核酸密码分析应用在商品或其他物件的隐形防伪标记上，属于密码术方法的技术领域。

传统的防伪标记大多是物理或化学性质的制品，如激光全息、光学变色膜、图象扰频、热变油墨、磁条、软件等。目前国际上开始出现用生物技术制作的防伪产品，这些产品主要采用抗原抗体反应原理，比一般的防伪产品和方法准确、灵敏。但抗原抗体是蛋白质，稳定性较差，尤其在高温环境中容易失活，从而降低防伪的灵敏度和可靠性。此外，抗原抗体反应变化少，一旦知道其中一种成分，就容易被仿制。

本发明的目的就是在防伪的技术领域克服已有标记容易被仿制的缺陷，设计出利用基因芯片技术将核酸应用于防伪的隐形标记方法。

本发明是基于基因工作原理，提出全新的隐形防伪设计和技术，其核心是生物大分子—核酸。人们知道，一切生命的遗传物质(基因)都是核酸，也就是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)核酸是由四种碱基交互排列组成，其排列组合的差异，形成地球上生命类型的多种多样。一条仅仅1000碱基对(1kb)的DNA即可能有10⁶⁰³种排列组合方式。现在自然界的生物种类(动植物和微生物)在一百万种以上，因此可以利用作防伪的天然生物基因多不胜数。每个物种基因级的长度一般均大于10⁴至10⁶kb。假若设定用1kb长度的核酸作防伪标记，则可供选择的核酸密码就有10⁵x(10⁴--10⁶)＝10¹⁰--10¹²之多。因此生物多样性为防伪技术提供了取之不尽的来源。利用DNA这样巨大的信息量可以有数以亿万计的密码可用于防伪设计。

本发明是将预先选定的某种核酸片段(主要是DNA片段，因其非常稳定)，由于核酸序列带有氨基侧链而芯片上基质薄膜带有醛基，故两者在适当条件下(如紫外光照射)会以共价键形成交联，从而将核酸序列固定在载体上。基因芯片上的核酸序列可以人工合成，或直接用天然核酸片段，并根据之设计带荧光标记的寡核苷酸片段作为探针。

固相载体可以是各种各样的材料，如各种天然或人造纤维制成的纸张或薄膜、多孔颗粒或粉末，天然或合成的皮革、塑料或各种有机或无机多聚体和树脂、固体石腊、天然或合成的无机物质如陶瓷、玻璃、水晶、金属、硅藻土等。各种油墨和涂料也可作为防伪核酸的载体。也可以溶液形式加入制品中或封桨附在制品的包装上。为了保护固相载体上作为防伪标志的核酸片段，在含有核酸片段的载体表面加上保护层。例如可用塑料薄膜，海藻糖等制成的这种核酸隐形防伪标记可固定在商品或物件上或其包装物及附属物上。当需要检验时，将防伪标记取下，揭去保护层，用缓冲液溶解附着在载体上的核酸片段。检测人员已知检测商品或物件上核酸防伪标记的种类，就可用针对芯片上核酸片段制备的寡核酸片段作为探针进行杂交。通过检测基因芯片，如能显出荧光信号，即能判定检测商品或物件为真品，否则为假冒的伪品或赝品。利用核酸密码作隐形防伪标记有如下优点：

1.不可仿制性：首先核酸密码无色，肉眼难以看到，其次，密码来自自然界庞大的基因库，即使知道是基因的密码但不知是哪一种，仿冒者也无法破译和仿造。而对检验人员来说，只要以专用的分析方法测试，

真伪则一目了然。

2.可靠性：根据核酸杂交原理，只有当探针碱基序列和芯片上核酸的碱基对完全互补时，才能杂交。所以只有按预定的核酸密码设计的探针进行检验，才有可能探测出密码的存在与密码的种类。所以核酸密码具有极高的专一性。

3.多样性：可以很容易设计，合成千万种核酸密码作为防伪标记，或直接用天然核酸片段，互不通用。所以核酸密码可为多种多样的商品和物件分别提供独特的防伪标记体系。

4.稳定性：DNA密码稳定，特别是干燥的DNA存放经久，不易分解，适于一些长期保存物件的防伪。

5.广泛的适用性：核酸密码只需极微量(10^-8--10^-10克)存在于商品或物件中即可探测出来，因此适用于种类贵重的商品和物件。如科学仪器和家用电器；高档服装、家具及文体、文娱用品；高级烟酒、食品及营养品；农业和园艺的珍奇或重要种子；重要的证件和文件；经鉴定的珍贵文物和艺术品等等，几乎所有固态的物件上都可适用。

探测检验手段用来辨别物件的真伪是核酸密码防伪方法不可分割的技术内容。已如前述，本发明采用一种基因芯片技术核酸应用于防伪的方法。

本发明提供一张附图：图1为用基因芯片技术将核酸应用于防伪的芯片表达谱图，按左右两张图中的相应位点杂交信号强弱可分辨其真伪。

实施例：本实施例采用基因芯片技术核酸应用于防伪的方法验证DNA片段专一性。按照博道公司的BD-CHIP512芯片标记杂交系统进行，具体步骤如下：

1.预杂交：

a.芯片置95℃双蒸水浴中2min，取出后立即置无水乙醇中30sec，取出室温晾干；

b.取杂交试剂1，2各6ul，置0.5ml的Eppendoff管中，置95℃双蒸水浴中2min，立即使用；

c.将上述试剂根据定位框加到芯片上，盖上盖玻片(注意枪头不能碰到芯片，不能留有气泡)，置杂交舱中42℃，5hr。以下在暗室中进行(2)-(4)

2.标记：

a.取针对芯片上的核酸片段制备的两种寡核苷酸片段的探针3ug，

b.将上述两观管中分别转移到染料A和染料B管中，分别加入标记试剂1∶4ul，混匀，65℃水浴10min后加入标记试剂2∶4ul，混匀。

C.合并上述两管中的液体，记录标记试剂3∶15ul，加250ul无水乙醇，混匀，置-20℃，2hr；

D.12000rpm，4℃离心10min，沉淀用300ul 75％乙醇洗涤后晾干备用。

3.杂交

a.向沉淀管中加入杂交试剂1∶6ul，振荡摇匀，加杂交试剂2∶6ul，混匀后95℃水浴2min取出迅速置于冰上

b.经预杂交的芯片用双蒸水冲洗以移去盖玻片，95℃水浴2min，取出至无水乙醇中30sec，晾干；

d.将探针加到芯片上点样区的中心位置，盖上盖玻片，手指轻压使杂交液均匀分布且玻片和芯片间无气泡，置杂交舱中，于42℃杂交15hrs-29hrs。

3.洗片

a.将洗片剂1∶2.5ml在50ml的烧杯中稀释到49ml，加入1ml洗片试剂2，烧杯置60℃水浴中预热；

b.将洗片剂3∶2.5ml在50ml烧杯中稀释到50ml，烧杯60℃水浴中预热；

c.将洗片试剂1∶1ml在洗瓶中稀释到200ml，杂交后的芯片用该溶液冲洗以移去盖玻片；

d.芯片插入预热至60℃的洗片试剂1，2稀释液的烧杯中10min，再移入预热至60℃的洗片试剂3稀释液的烧杯中10min；

e.取出，以洗片步骤3的溶液充分冲洗芯片，两干备扫描

Claims (6)

1.一种采用基因芯片技术将核酸应用于防伪的方法，其特征主要是把脱氧核糖核酸(DNA)片段溶于溶液中并使其附着在固相载体上用来作为隐形防伪标记，并利用基因芯片技术检测出真伪。基因芯片上的核酸序列可以人工合成，或直接用天然核酸片段，根据它设计带荧光标记的核酸片段作为探针，并将核酸制成防伪标记。

2.根据权利要求1所述的防伪密码的方法，其特征在于核酸片段的固相载体可以是天然或人造纤维、纸张、薄膜、皮革、塑料、多孔颗粒、粉末、树脂、固体石腊、陶瓷、玻璃等有机或无机的固态材料。

3.根据根据权利要求1或2所述的防伪密码的方法，其特征在于附着在固相载体上的隐形防伪标记可直接固定在任何固态的商品、物件或其包装物及附属物上。

4.根据权利要求1所述的防伪密码的方法，其特征在于含有核酸片段的载体表面可以加覆塑料薄膜或海藻糖等保护层。

5.根据权利要求1所述的防伪密码的方法，其特征在于防伪标记辨别的探测检验方法可以采用核酸分子杂交。根据核酸杂交原理，只有当探针碱基序列和芯片上核酸的碱基对完全互补时，才能杂交。当两者结合后，可通过芯片上荧光来判断芯片上核酸序列的特异性是否正确。其步骤依次是：预杂交，标记，杂交，洗片，扫描。

6.根据权利要求1或5所述的防伪密码的方法，其特征在于核酸分子杂交所用的探针可以用cy3，cy5染料标记。