CN1298840C - 肠出血性大肠杆菌o157基因缺失疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肠出血性大肠杆菌疫苗，特别是涉及消除了致病能力但保留其特异免疫原性的ler/stx双基因缺失突变的肠出血性大肠杆菌O157：H7菌株。本发明进一步涉及基于所说的基因突变菌株的肠出血性大肠杆菌O157疫苗、其生产方法及其在免疫接种人以预防人肠出血性大肠杆菌O157感染和免疫接种反刍动物以预防肠出血性大肠杆菌O157在反刍动物消化道的定居和繁殖中的应用。

Description

肠出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗

发明所属领域

本发明涉及肠出血性大肠杆菌O157减毒疫苗，特别是涉及失去了致病能力但保留其特异免疫原性的ler/stx双基因缺失突变的肠出血性大肠杆菌O157疫苗菌株。本发明进一步涉及基于所说的减毒菌株的肠出血大肠杆菌疫苗、其生产方法及其在预防人的肠出血性大肠杆菌O157感染以及预防肠出血性大肠杆菌O157在反刍动物消化道中定居和繁殖中的应用。

发明的技术背景

肠出血性大肠杆菌(EHEC)是世界范围内流行的一类重要的食物源性病原菌，其主要是通过被污染的食物进入体内，导致被感染者发生出血性或非出血性腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿路综合症(Riley，LW.et al，The New EnglandJournal of Medicine，308(12)：681-685，1983；Levine，MM.，Journal ofInfectious Diseases，155：377-389，1987)。EHEC有多个血清型，其中最典型的是能够引起人肠上皮细胞粘附和脱落(A/E)损伤的O157:H7血清型菌株。大肠杆菌O157:H7菌株具有很强的感染力，大约100-200个细菌即可通过胃酸屏障，在肠道内大量繁殖并引发肠道感染(Rowe PC et al.，J.Pediatr.，124：21-26，1994)。

近年来，对EHEC O157:H7的全基因组、毒力和致病基因及其调控的研究不断深入并取得新的进展(例如参见美国专利5,798,260；6,365,723；Science，277：1453-1462，1997)。目前已经知道，编码A/E损伤的所有必要基因均位于细菌染色体上一个称为肠细胞脱落位点(LEE)的编码毒力相关基因的特殊区域——致病岛内。可引起A/E损伤的大肠杆菌都含有LEE致病岛或其同源序列(McDamidl，TK et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92：1664-1668，1995)。LEE致病岛可分为四个多顺反子，其中多顺反子LEE1内的第一个开放阅读框是编码LEE致病岛转录活化因子并正调控LEE致病岛表达的ler(LEE-encodingregulator)基因(Elliott，SJ et al.，Infect.Immun.67：4260-4263，1999)。

肠出血性大肠杆菌O157:H7的另一个重要毒力因子是插入到染色体内的原噬菌体编码的志贺毒素(Stx)(O’Brien，AD et al.，J.Infect.Dis.146：763-769，1982；Perna，NT et al.，Infect.Immun.66(8)：3810-3817，1998)。由A和B两个亚基组成的志贺毒素可在肠道中杀伤上皮细胞，导致以血性痢疾或无血性腹泻为临床特征的肠道炎性损伤。毒素被吸收入血后，可损伤肾小球内皮细胞，造成溶血性尿路综合症并进而导致肾衰竭。

为了治疗肠出血性大肠杆菌O157:H7感染，目前主要还是使用大剂量抗生素。然而，由于抗生素治疗可导致严重的肠道菌群失调和耐药菌株的发生，而且某些抗生素会裂解细菌菌体而引起毒素释放，所以临床上大多不主张使用抗生素治疗，希望尽早找到一种能够有效地预防和治疗EHEC O157感染的细菌疫苗。

美国专利5,354,661号描述了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7和大肠杆菌O26:H11的单克隆抗体。美国专利6,410,024号描述了大肠杆菌O157:H7志贺样毒素的抗原决定基、抗这种毒素的抗体及其作为治疗和诊断剂的应用。美国专利6,365,723号公开了基于大肠杆菌脂多糖O-侧链抗原决定基的抗体及口服疫苗。美国专利6,291,435号公开了含有单糖或多糖的复合物及其在降低EHEC毒力和治疗EHEC感染中的应用。美国专利6,485,902号公开了使用噬菌体(例如V5)减低肠道内大肠杆菌O157水平的方法。美国专利6,383,496号描述了具有RpoS+表型和多基因突变的减毒伤寒沙门氏杆菌、其生产方法及其在疫苗中作为基因递送载体的应用。然而，迄今尚未见有关成功地制备EHEC O157细菌疫苗的报道。

发明的目的

本发明的一个目的是提供活的肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒菌株，所说的菌株缺失了部分致病基因并保留有足够的免疫原性。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的部分致病基因是细菌染色体中的部分ler基因和stx基因。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的细菌菌株是以遗传工程方法由亲代细菌细胞产生的。

根据本发明的一个优选实施方案，所说的亲代细菌细胞是野生型肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株的细胞。

本发明的另一个目的是提供生产如上限定的菌株的方法，该方法包括：

(1)扩增得到肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的部分缺失的ler基因及其旁侧序列DNA片段并将其克隆到适当的载体中；

(2)用步骤(1)得到的重组载体转化适当的宿主细胞；

(3)使步骤(2)的含重组载体的宿主细胞与野生型出血性大肠杆菌O157:H7细胞接触并发生DNA转移；

(4)传代培养步骤(3)得到的肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞并筛选得到细菌染色体中缺失了部分ler基因和str基因的突变细胞株。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞是野生型肠出血大肠杆菌O157:H7菌株。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的部分缺失的ler基因片段是缺失了中间部分279个碱基的ler基因片段及其部分旁侧序列。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的载体是自杀性质粒pCVD442。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的宿主细胞是大肠杆菌SM10λpir。

根据本发明的一个优选实施方案，其中步骤(2)的宿主细胞内重组载体向肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞中转移是通过细胞接合转导方式实现的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的染色体中缺失部分ler基因是通过重组载体中部分缺失的ler基因及其旁侧序列DNA与染色体中相应DNA区段发生同源重组交换实现的。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的传代的次数为大约10-15次。

根据本发明的一个优选实施方案，其中传代导致携带stx基因的原噬菌体的丢失。

本发明的再一个目的是提供用于免疫接种人以预防肠出血性大肠杆菌O157感染的疫苗组合物，或免疫接种反刍动物以防止肠出血性大肠杆菌O157在其肠道定居繁殖而污染肉制品和外界环境的疫苗组合物，所说的疫苗组合物含有如上限定的活的肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的活的肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株是细菌染色体上缺失了部分ler基因和完整stx基因的突变细胞株。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的疫苗组合物还可含有一种或多种免疫增强剂、免疫佐剂或免疫调节剂。

本发明的再一个目的是提供预防人的EHEC O157感染或反刍动物的EHECO157带菌状态的方法，该方法包括给所说的人或反刍动物投用预防有效量如上限定的疫苗组合物。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的反刍动物指牛、羊、骆驼和鹿。

附图简要说明

图1显示重组自杀质粒pCVD442∷Δler的构建流程。

图2显示重组自杀质粒pCVD442∷Δler的酶切产物和PCR扩增产物的琼脂糖凝胶(1％)电泳图谱。其中泳道1是分子量标记物；泳道2是重组质粒的SacI/Xba I双酶切片段；泳道3是引物f和引物i的PCR扩增产物；泳道4是引物d和Bord 751的PCR扩增产物。

图3显示本发明的EHEC O157:H7(Δler)菌株和对照菌株的DNA扩增产物的琼脂糖凝胶(1％)电泳图谱。其中泳道1是菌株EHEC O157:H7(Δler)；泳道2是菌株EHEC O157:H7(pCVD442∷Δler)；泳道3是萘啶酮酸抗性的野生型菌株EHEC O157:H7(Nal^R)；泳道4是野生型菌株EHEC O157:H7；泳道5是分子量标记物。

图4显示基因突变的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)的DNA和EHEC O157:H7原噬菌体DNA的PCR鉴定的琼脂糖凝胶(1％)电泳图谱。其中泳道1是分子量标记物；泳道2和3分别是使用引物FSZ7/FSZ8扩增的本发明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株DNA和野生型EHEC O157:H7菌株DNA；泳道4和5分别是使用引物FSZ5/FSZ7扩增的本发明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株DNA和野生型EHEC O157:H7菌株DNA；泳道6和7分别是使用引物FSZ5/FSZ6扩增的本发明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株DNA和野生型EHEC O157:H7菌株DNA。

图5A和5B分别显示与野生型野生型EHEC O157:H7或本发明减毒突变的EHECO157:H7(Δler/Δstx)细菌细胞培养物上清共保温的Vero靶细胞的形态和生长状况。

图6A和6B分别显示接种野生型EHEC O157:H7细胞(A)或本发明突变的EHEC O-157:H7(Δler/Δstx)细胞(B)后，模型小鼠的组织病理学改变。图中显示的组织从左到右依次是肺组织、肝组织和肠组织。

发明的详细描述

本发明提供肠出血性大肠杆菌减毒活疫苗，特别是提供失去了致病能力但保留有特异免疫原性的ler/stx双基因缺失突变的肠出血大肠杆菌O157:H7菌株。本发明进一步提供基于所说的突变菌株的肠出血大肠杆菌减毒疫苗、其生产方法及其在预防人的肠出血性大肠杆菌O157感染和预防反刍动物的EHEC O157带菌状态中的应用。

肠出血大肠杆菌(EHEC)最重要的毒性是能够对被感染的人肠上皮细胞造成粘附与脱落(A/E)损伤，并且所说的损伤与肠致病性大肠杆菌(EPEC)和兔致病性大肠杆菌(RDEC-1)引起的肠细胞损伤基本相同。

现在已经知道，编码A/E损伤相关蛋白质的所有基因均位于细菌染色体上的一个特定区域——LEE致病岛内。对EHEC的代表性菌株O157:H7的LEE致病岛全基因序列的分析研究显示，致病岛内包括有41个开放阅读框架(ORF)(Perna，NT et al.，Infect.Immun.，66(8)：3810-17，1998)。

LEE致病岛中的第一个开放阅读框架是ler(LEE-encoded regulator)基因。ler基因的表达产物Ler作为转录活化因子，其表达可激活LEE致病岛内其他相关基因的转录和表达。肠上皮细胞表面A/E损伤的发生是LEE致病岛内所有致病相关基因在特定条件下协同表达的结果。已知Ler蛋白是组氨酸样非结构蛋白质(H-NS)调节因子家族的成员(Arankel，G et al.，Mol.Microbiol.，30：911-21，1999)。后者在各种致病性肠细菌之间具有很高的保守性，并且在结构和功能上均属于DNA结合蛋白(Bertin，P et al.，Mol.Microbiol.，31：319-29，1998)。H-NS蛋白质结构上包括位于N-末端的聚合区和位于C-末端的DNA结合区。两个区域通过一个环状结构(Loop 1)相连，并且其中N-末端区域又包括两个亚区。研究证实，EHEC的A/E损伤相关基因和某些A/E损伤无关基因的表达受控于同样存在于LEE致病岛内的ler基因，即ler基因对LEE致病岛内的致病(特别是致A/E损伤)基因和某些损伤无关基因起正调节作用(参见Elliott，J et al.，Infect.Immun.，68(11)，6615-26，2000；Arankel，Get al.，Mol.Microbiol.，30：911-21，1998)。研究还发现，EHEC与EPEC和RDEC-1在LEE致病岛基因结构上具有大约95％的同源性。

引起肠上皮细胞A/E损伤的另一个主要基因是作为LEE致病岛第22个开放阅读框架的eae基因。在EHEC O157:H7 EDL933菌株中，eae基因(2802bp)编码包括933个氨基酸残基的细菌细胞粘附相关蛋白质。eae基因在EHEC和EPEC之间也有很高的同源性。

肠出血大肠杆菌O157:H7的再一个毒力因子是由插入到细菌染色体上的原噬菌体编码的志贺毒素(Stx)。Stx家族主要包括Stx 1和Stx 2两种类型。Stx1的编码序列具有高度保守性，而Stx 2的编码序列则又分为几个亚型。志贺毒素家族成员的基本结构均包括A和B两个亚基。在A和B亚基的协同作用下，Stx进入细胞并发挥糖苷酶活性，干扰真核宿主细胞的蛋白质合成，进而导致细胞死亡(Tech，VL and O’brien，AD，Mol.Microbiol.，51：206-20，1997；Sears，CL and Kaper，JB，Microbiol.Rev.，60：167-215，1996)。在肠道中，Stx杀伤肠上皮细胞，导致广泛的炎性组织损伤，致使宿主出现血性痢疾或无血性腹泻等症状。如果毒素被吸收入血，还可引起溶血性尿路综合症等严重病症。另外，编码志贺毒素的原噬菌体一个重要特点是在传代过程中有丢失的可能性。肠出血大肠杆菌O157:H7毒力因子的上述这些特征，为构建本发明的疫苗株提供了依据。

作为一种活的减毒细菌疫苗株，应该在减毒和免疫原性这两种性质间保持平衡。也就是说，这样的疫苗株不应在正常宿主体内引发任何疾病或损伤，同时被接种后能够刺激相关淋巴组织或细胞发挥其免疫原活性。然而在本发明之前，这种理想的平衡一直没有实现。推测这可能是由于(1)没有找到特别适于被删除的毒力基因；(2)自然条件下EHEC O157:H7对任何实验动物都不感染，因而难以评价细菌的致病性和免疫原性。

本发明人现已成功地构建了保持这种平衡的肠出血大肠杆菌O157:H7减毒细胞株。本发明的细胞株是部分缺失了ler基因和整个stx基因的双基因缺失突变细胞株。我们的实验研究进一步证实，本发明的基因工程细胞株失去了对Vero细胞和活体动物模型的致病性，并且具有预防继后野生型EHEC O157:H7感染的免疫原性。

为了得到本发明的减毒细胞株，本发明人在以前成功地构建了部分ler基因缺失的兔致病大肠杆菌疫苗菌株，并深入研究了该菌株的生长状态、致病性和免疫原性的基础上，在制备本发明的肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株的实践中，确定以ler基因作为首先被部分缺失的靶基因，然后再以传代培养方法造成另一个毒力基因——stx基因的丢失，从而得到失去了致病性但保留有足够免疫原性的肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株。

简单地说，为本发明的目的，首先利用肠出血大肠杆菌O157:H7菌株作为起始材料，以聚合酶链反应(PCR)方法由该起始菌株的染色体DNA扩增得到缺失了279bp的片段，将所说的片段克隆到携带氨苄青霉素抗性基因的自杀质粒pCVD442(CVD，University of Maryland)中，得到携带部分缺失的ler基因(Δler)的重组质粒pCVD442∷Δler(参见图1)。用所说的重组质粒转化大肠杆菌SM10λpir宿主细胞，并借助接合转导方法将重组自杀质粒pCVD442∷Δler从SM10λpir转到EHEC O157:H7中。然后筛选对氨苄青霉素敏感的突变菌株并用PCR方法鉴定之。继而通过细菌对氨苄青霉素敏感性、萘啶酮酸(Nal)抗性以及对蔗糖的耐受力筛选和PCR鉴定技术，以获得EHEC O157 ler基因缺失菌株。鉴于携带stx基因的原噬菌体的不稳定性，对如上得到的细菌细胞进行传代培养，使含有Δler基因的重组菌株进一步消除了携带stx基因的原噬菌体，最终得到ler/stx双基因缺失的肠出血性大肠杆菌突变菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)。

因此，本发明的方法包括以下步骤：

(1)扩增得到肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞的部分缺失的ler基因片段并将其克隆到适当的载体中；

(2)用步骤(1)得到的重组载体转化适当的宿主细胞；

(3)将步骤(2)的宿主细胞内的重组载体转到肠出血大肠杆菌O157:H7细胞中；

(4)传代培养步骤(3)得到的肠出血大肠杆菌O157:H7细胞并筛选得到细菌染色体缺失了部分ler基因和全部stx基因的突变细胞株。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞是野生型肠出血性大肠杆菌O157:H7菌株。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的部分缺失的ler基因片段是缺失了中间部分279个碱基的ler基因片段及其部分旁侧序列DNA。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的载体是自杀质粒pCVD442。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的宿主细胞是大肠杆菌SM10λpir。

根据本发明的优选实施方案，其中步骤(2)的宿主细胞内重组载体向肠出血性大肠杆菌O157:H7细胞中转移是以细胞接合转导方式实现的。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的传代的次数为大约10-15次。

根据本发明的优选实施方案，其中传代导致编码stx基因的原噬菌体的丢失。

更具体地说，首先根据已报道的EHEC O157:H7染色体上调节基因ler及其两旁侧DNA序列设计并合成彼此互补的两对引物，以聚合酶链反应(PCR)方法从EHEC O157:H7菌株染色体DNA扩增ler基因的两旁侧序列，然后连接所得到的两个片段(片段1和2)，得到缺失了中间部分279bp(相当于基因组第4619825-4620103位碱基)的Δler基因片段。然后再将所说的片段与pGEM-T载体(Promega公司)连接并用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。扩增后提取质粒并进行Δler片段鉴定。

另一方面，用适当的核酸内切酶消化携带氨苄青霉素抗性基因的自杀载体pCVD442，并将消化产物与用同样内切酶消化得到的Δler基因片段连接，得到重组自杀载体pCVD442∷Δler(参见图1)。然后，用此连接产物转化大肠杆菌SM10λpir感受态细胞，得到大肠杆菌SM10λpir(pCVD442∷Δler)(见图2)。

本发明中使用的自杀质粒pCVD442携带有氨苄青霉素抗性基因、sacB基因和RP4基因，因此(1)可借助氨苄青霉素抗性标志筛选成功地发生了质粒转导的菌株；(2)R6K是依赖于pir基因编码的π蛋白的复制起始位点，因此携带该基因的自杀质粒pCVD442只能在含有pir基因的菌株(包括本发明中使用的大肠杆菌SM10λpir)内复制；(3)sacB基因编码果聚糖蔗糖酶，而表达sacB的革兰氏阴性菌(包括本发明中使用的携带自杀质粒的细菌)不能在含5％蔗糖的培养基上生长，因此自杀质粒pCVD442的这一特征可为菌株筛选提供了一种有用的手段；(4)RP4能够诱导细菌接合并促使质粒在细菌间直接转移。

在本发明中，我们将缺失突变的ler基因插入到pCVD442的多克隆位点内，然后再将所得到的质粒pCVD442∷Δler转化到受体菌SM10λpir中，由于宿主菌SM10λpir能够编码π蛋白，因此带有R6K质粒复制起始位点的质粒pCVD442∷Δler可稳定地存在于受体菌SM10λpir内并在其中复制。

本发明采用接合转导方法将质粒pCVD442∷Δler转入受体菌。在宿主菌EHEC O157:H7内，质粒上部分缺失的ler基因与染色体上的完整ler基因经同源重组发生基因交换，用PCR的方法即可筛选并鉴定出所需的ler基因缺失的突变菌株。

为此，分别培养作为受体菌的肠出血大肠杆菌O157:H7细胞(该菌株具有萘啶酮酸抗性)，和如上得到的作为供体菌的大肠杆菌SM10λpir(pCVD442∷Δler)。按适当比例混合两种细菌的培养物并在不含抗生素的培养基上培养过夜。然后基于两种细菌接合转导后所获得的抗性，在含有氨苄青霉素和萘啶酮酸的琼脂培养基上培养并筛选因发生了质粒转导而获得具有两种抗性的菌株。由于EHEC O157:H7受体细菌染色体上的ler基因与质粒上的Δler基因发生了同源重组，而且DNA交换后EHEC O157:H7细菌丢失了自杀载体，因此重组菌株EHECO157:H7(Δler)只含有缺失了279bp的单倍体Δler基因。经PCR扩增后，ler基因在琼脂糖凝胶电泳中只呈现一条缺失了279bp的较短的特异带。然后用菌株EHEC O157:H7(Δler)的染色体作为模板，以PCR扩增ler基因片段。分离、纯化、测序和序列比较表明，菌株O157:H7(Δler)基因组中缺失了ler基因中间部分的279个碱基(参见图3)。

基因敲除是基于DNA同源重组技术发展起来的在分子水平上剔除或取代某个特定基因，然后通过研究基因敲除后个体的表型性状变化来推测被敲除之基因的功能的一项技术。一般说来，由于外源DNA与宿主细胞DNA自然发生同源重组的机率非常低，因此对成功地进行了基因敲除的宿主细胞的筛选是一件非常困难的工作。而新发展的自杀质粒pCVD442技术是最为有效的基因定点敲除方法。

本发明中利用自杀质粒pCVD442作为重组基因载体，借助同源重组敲除野生型EHEC O157:H7菌株的ler基因。为此，首先将中间缺失了279bp的ler基因片段插入到pCVD442中，并用所得到的重组质粒pCVD442∷Δler转导受体菌EHECO157:H7。自杀质粒pCVD442∷Δler在EHEC O157:H7细胞中可能有三种前途：(1)无论是否发生同源重组，质粒都将存在于宿主菌中并形成ler基因二倍体菌株；(2)未发生同源重组并且宿主菌丢失了质粒DNA，即宿主菌未发生任何变化；(3)发生了同源重组并且宿主菌丢失了质粒DNA，宿主菌EHEC O157基因组发生ler基因缺失突变。在第一种情况下，即使发生了同源重组(即染色体上的ler基因交换到了质粒上)，但因携带完整ler基因的质粒依然存在于宿主菌中而不能将其用作本发明的减毒菌株。第二种情况下，因为没有发生同源重组并直接丢失了质粒，所以宿主菌染色体并未发生任何变化(即仍然带有完整的ler基因)。只有在第三种情况下，由于发生了同源重组(即质粒上的ler缺失基因被交换到了宿主菌染色体上)，而且质粒也已丢失，所以宿主菌内没有完整的ler基因(参见图3)。这就是我们期望得到的目的菌株，该菌株与起始菌株的区别在于其ler基因缺失了中间部分279bp。

然后在适当的LB培养基中对如上筛选的缺失了部分ler基因序列的重组EHEC O157:H7细胞进行常规传代培养。传至第10-15代后收集细胞并分离染色体DNA。根据已报道的EHEC O157:H7菌株原噬菌体及其旁侧DNA序列，设计另外两对引物并以PCR方法分别扩增如上得到的突变菌株EHEC O157:H7(Δler)和野生型EHEC O157:H7的原噬菌体及其旁侧DNA序列，然后进行序列比较。结果表明，EHEC O157:H7(Δler)经系列传代后，进一步消除了stx基因(参见图4)。将经过如此基因工程改造的肠出血大肠杆菌定名为EHEC O157:H7(Δler/Δstx)。根据用于专利程序微生物保藏布达佩斯条约的规定，该菌株已保藏在中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)。

Stx毒素(又称为Vero毒素)是由整合到细菌染色体上的溶原性噬菌体编码的，是EHEC O157:H7的重要毒力因子。本发明中，我们在筛选ler基因缺失突变株的同时还鉴定了目的菌株的stx基因。结果发现，通过细菌传代培养(传至第10-15代)，ler基因缺失突变株被消除了携带Stx毒素编码序列的原噬菌体DNA。我们用野生型EHEC O157:H7细菌的染色体作为模板，以PCR的方法鉴定了ler基因缺失突变株的原噬菌体DNA。因为基于原噬菌体DNA插入位点两旁侧DNA序列设计的引物只能从菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)的DNA扩增得到原噬菌体旁侧序列，而不能从中间保留有原噬菌体DNA的模板扩增得到同样的电泳带，所以可用此方法证实所构建的菌株是否丢失了编码Stx毒素的原噬菌体DNA序列。由图6所示的结果可以看出，使用基于原噬菌体插入位点两旁侧序列设计的引物只能扩增得到重组菌染色体上原噬菌体DNA的旁侧序列，而用野生型EHECO157:H7细菌的染色体作为模板则不能扩增得到相应的序列。经DNA序列分析进一步证实，本发明的突变菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)确实已缺失了编码Stx毒素的原噬菌体DNA序列(相当于细菌基因组中第1246019-1308726位碱基)。

为了评价本发明基因工程改造的肠出血大肠杆菌O157:H7减毒细胞株的致病性和免疫原活性，我们分别观察了本发明的细胞株对靶细胞(HEp-2)的体外细胞粘附活性，对Vero细胞的毒性作用以及对活体动物(小鼠)的致病性。实验中，使用野生型肠出血大肠杆菌O157:H7细胞作为对照。

野生型EHEC O157:H7细菌对人喉癌上皮细胞株表现有显著的局灶性细胞粘附活性，而本发明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)突变细胞株则因缺失了ler基因对LEE致病岛中其他基因的转录活化作用，致使细胞不能表达足够的紧密素(由LEE致病岛中的eae基因编码)和相关粘附因子，从而降低了对靶细胞的粘附活性。

Stx是细菌合成并分泌到细胞外的一种外毒素。在另一项体外细胞学实验中，将Vero细胞(作为靶细胞)分别与不同浓度的野生型或本发明的EHEC O157:H7细菌细胞培养物上清共保温后，可见野生型细菌培养物上清作用的靶细胞呈圆形改变并有细胞脱落现象，而减毒细菌培养物上清作用的靶细胞则保持正常形态和生长状态(参见图5)。

因为通常的实验动物对野生型EHEC O157:H7缺乏敏感性，所以为了完成体内生物学活性实验，必须首先建立EHEC O157:H7细菌感染模型。为此，我们预先用丝裂霉素C和萘啶酮酸处理断奶不久的小鼠。其中投用丝裂霉素旨在降低动物的机体抵抗力，而投用萘啶酮酸的目的则是为了抑制动物肠道内的正常菌群，以利于继后接种的对萘啶酮酸具有抗性的野生型EHEC O157:H7或突变的EHECO157:H7(Δler/Δstx)细菌在动物肠道中的大量繁殖。实验结果可见，预先用丝裂霉素C和萘啶酮酸处理的小鼠在接种EHEC O157:H7后体重明显减轻，并于4-6日内全部死亡；病理学检查发现，动物的肝、肾、肺和肠等器官均出现明显的病理学损伤。相反，接种本发明的EHEC O157(Δler/Δstx)细菌的小鼠则生长正常，并且各主要脏器均未见明显病理学改变(参见图6)。这些结果表明，本发明的基因缺失突变菌株EHEC O157(Δler/Δstx)具有良好的安全性。

为进行基因缺失突变菌株EHEC O157(Δler/Δstx)的免疫原性评价，进行了主动免疫攻毒实验和被动免疫攻毒实验。在主动免疫攻毒实验中，将20只乳鼠随机平分为两组，一组为免疫组，另一组为对照组(不免疫)。免疫组每只免疫接种5×10⁹CFU的EHEC O157(Δler/Δstx)。14天后两组小鼠分别以7.2×10⁸CFU的EHEC O157强毒株攻毒。结果未进行免疫接种的对照组10只小鼠4天内全部死亡，而免疫组10只小鼠有6只小鼠存活，证实EHEC O157(Δler/Δstx)菌株具有较好的免疫原性。

在被动免疫实验中，2只3月龄的母鼠分别以10×10¹⁰CFU的EHEC O157(Δler/Δstx)口服免疫接种，7天后以同样的剂量加强免疫。而对照组的母鼠不免疫。免疫的母鼠所生的19只乳鼠和对照的母鼠所生的10只乳鼠，在7日龄以每只6×10⁸CFU的EHEC O157强毒株经消化道攻毒。结果未进行免疫母鼠所生的乳鼠全部死亡，而免疫母鼠所生的乳鼠全部存活。证实EHEC O157(Δler/Δstx)菌株免疫接种可提供完全的被动免疫保护作用。

这些实验结果充分证实，所构建的EHEC O157(Δler/Δstx)基因缺失突变疫苗候选株具有良好的安全性和免疫原性，可提供良好的免疫保护作用。本发明的减毒突变菌株保留了其亲代野生型菌株的固有免疫原性，因此有可能作为活的减毒细胞株，用于制备预防肠出血大肠杆菌O157感染的疫苗制剂。

在自然条件下任何实验动物均不被EHEC O157细菌感染，因而难以获得相应的动物模型。鉴于致病大肠杆菌的代表性菌株REPEC O103和RDEC-1与出血性大肠杆菌O157:H7具有相似的主要毒力基因群和致病机理，并可导致相似的特征性A/E病变，因此研究REPEC O103和RDEC-1主要毒力基因与细菌致病性和免疫原性的关系，也可以为EHEC O157疫苗的研制提供有价值的参考数据。

在使用REPEC O103和RDEC-1 ler基因缺失突变株完成的安全性实验中，给家兔接种REPEC O103 ler基因缺失突变株和RDEC-1 ler基因缺失突变株后，未发现被接种动物产生任何临床症状和组织病理学变化。相反，接种相应野生型强毒性细胞株的对照组家兔则产生了典型的组织病理改变甚至最终导致死亡。在免疫保护性实验中，接种ler基因缺失突变的REPEC O103细胞株14天后，被试动物足可耐受继后野生型REPEC O103强毒细胞株的攻毒。

鉴于EHEC O157与兔致病大肠杆菌REPEC O103和RDEC-1在基因结构以及致病机理上的相似性，由兔致病大肠杆菌REPEC O103和RDEC-1的ler基因缺失突变株的研究结果也可以推断，本发明的EHEC O157(Δler/Δstx)基因缺失突变株也应具有良好的免疫原性，并且完全有可能作为一种减毒疫苗细胞株，用于生产针对EHEC O157感染的免疫预防制剂。

因此，本发明进一步提供了免疫接种人或反刍动物以预防肠出血性大肠杆菌O157感染的疫苗组合物，所说的疫苗组合物含有如上限定的活的肠出血大肠杆菌O157:H7细胞，以及一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂

根据本发明的优选实施方案，其中所说的活的肠出血大肠杆菌O157:H7减毒细菌是细菌染色体上缺失了部分ler基因和完整stx基因的突变细胞。

根据本发明的优选实施方案，其中所说的疫苗组合物还可含有一种或多种包括弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂在内的免疫增强剂或免疫调节剂。

本发明的再一个目的是提供免疫接种人或反刍动物以预防肠出血性大肠杆菌O157:H7感染的方法，该方法包括给所说的人和反刍动物投用预防有效量如上限定的疫苗组合物。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的反刍动物包括牛、羊、骆驼和鹿。

本发明的疫苗组合物可通过口服或胃肠道外途径预防接种人，使之获得针对EHEC O157感染的主动免疫力。另外，也可通过口服或胃肠道外途径预防接种包括牛、羊、骆驼和鹿在内的反刍动物，以预防肠出血性大肠杆菌O157在反刍动物消化道中定居和繁殖。

可以使用疫苗生产领域已知的常规方法，将本发明的减毒细胞原液或其稀释液与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合，并根据需要制成适于口服或非口服给药的单位计量形式的疫苗组合物。适于胃肠道外给药的制剂可含有无菌水或盐水、聚乙二醇、油等常用的赋形剂。特别是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作为赋形剂，制备本发明疫苗组合物的缓释制剂。

具体地说，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纤维素等赋形剂，淀粉、海藻酸钠、羧甲基纤维素钙和结晶纤维素等崩解剂，硬脂酸镁和滑石等润滑剂，明胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素和羟丙基纤维素等黏结剂，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性剂，以及着色剂、矫味剂、香料、分散剂等辅助成分，以常规方法制备片剂或胶囊形式的疫苗组合物。

或者，可以使用水、生理盐水、植物油(如橄榄油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶剂，氯化钠和葡萄糖等等渗剂，苯酚、甲酚、对位羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐剂，抗坏血酸和焦磷酸钠等抗氧化剂，以常规方法制备可注射形式的疫苗组合物。在任何情况下，所说的可注射制剂均应是无菌和可流动并适于通过注射器注射给药的。另外，在生产、运输和储存条件下，所说的制剂还必须是稳定的。

为了改善本发明疫苗组合物的热稳定性和有效储存期限，可以将细菌细胞原液或其稀释液按适当比例与疫苗保护剂或稳定剂混合，然后以常规方法冻干，制成本发明疫苗组合物的冻干制剂。其中所说的保护剂或稳定剂例如可以由人血清白蛋白或明胶、海藻糖、谷氨酸钠、尿素以及山梨醇和/或甘露醇等成分组成。

为了提高本发明疫苗组合物的免疫接种效果，可以在组合物中加入一种或多种免疫增强剂或免疫调节剂。所说的免疫增强剂或免疫调节剂包括但不只限于完全或不完全弗氏佐剂。

下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。

实施例

实施例1：肠出血性大肠杆菌O-157:H7减毒细胞株的构建

(1)部分缺失的ler基因DNA片段的扩增和鉴定

按照图1所示流程构建携带部分缺失的ler基因(Δler)的重组质粒载体。为此，首先分别使用基于ler基因及其旁侧序列设计并合成的下列两对引物(下文中提到的所有引物均以5′-3′方向显示)：引物f(GAGCTCTTTCGCCGAATG)(SEQID NO：1)和g(CTCTATAAGCTGAATGTA)(SEQ ID NO：2)，以及引物h(TACATTCAGCTTATAGAGGACACTGAAGAAGAA)(SEQ ID NO：3)和i(TCTAGATTACGAGTAGAAC)(SEQ ID NO：4)，由肠出血大肠杆菌(EHEC)O157:H7染色体DNA(作为PCR模板)扩增得到缺失了中间部分279个碱基(bp)的ler基因的两旁侧序列。其中引物f和g扩增得到长736bp的ler基因的旁侧序列(称为片段1)，引物h和i扩增得到长745bp的ler基因的旁侧序列(称为片段2)。其中扩增反应混合物(10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，MgCl₂溶液2μl，引物各0.5μl，模板1.0μl，Taq DNA聚合酶2U)的总体积为25μl。PCR循环共进行30次。

由于引物g与引物h的5’端18个碱基互补配对，所以如上得到的片段1和片段2经琼脂糖凝胶纯化后，可互为模板经再次PCR扩增实现两片段连接，得到中间缺失了279bp的ler基因缺失片段(Δler)。

纯化并回收Δler片段后，将其连接到pGEM-T载体上，并用连接反应混合物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞。挑选(基于培养皿上的蓝白斑和氨苄青霉素抗性)并培养被转化的细胞后提取重组质粒，进行酶切鉴定和PCR鉴定以及序列分析。琼脂糖凝胶电泳和测序结果显示，所得的Δler片段具有预期大小，其中缺失的碱基片段相当于基因组第4619825-4620103位碱基的核苷酸序列。

(2)pCVD442∷Δler重组自杀载体转化到大肠杆菌SM10λpir细胞中

提取自杀质粒pCVD442并用限制性内切酶SacI/XbaI消化质粒DNA，然后使用DNA纯化试剂盒(Promega公司)回收并纯化pCVD442酶切片段。同时用SacI/XbaI消化重组质粒pGEM-T∷Δler并回收Δler(SacI/XbaI)片段(1463bp)。然后，在T4 DNA连接酶存在下使如上酶切并回收的自杀质粒pCVD442与Δler片段连接，得到重组自杀质粒pCVD442∷Δler(图1)。用所得到的连接产物(5μl)转化大肠杆菌SM10λpir感受态细胞，然后筛选阳性SM10(pCVD442∷Δler)细胞并提取质粒DNA，分别进行酶切鉴定和PCR鉴定。鉴定结果表明，SM10(pCVD442∷Δler)细胞中重组自杀质粒pCVD442∷Δler所携带的Δler片段与预期的大小相同(图2)。

(3)接合转导

在含有萘啶酮酸(Nal，50μg/ml)的LB培养基中培养作为接合受体菌的EHEC O157:H7(Nal^R)，并在含有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的LB培养基中培养作为供体菌的大肠杆菌SM10(pCVD442∷Δler)。37℃培养过夜后收集菌体细胞，并用LB培养基重悬菌体细胞，并按4∶1的体积比例混合EHEC O157:H7(Nal^R)和SM10(pCVD442∷Δler)。滤膜过滤所得混合物后，将滤膜置于无抗生素的琼脂培养基上培养过夜(37℃)。收集细菌并系列稀释，然后在含有萘啶酮酸(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的琼脂平板上继续培养过夜。

培养后挑取单个菌落并提取DNA，使用引物f(GAGCTCTTTCGCCGAATG)(SEQ IDNO：5)和Boed 751(AGTTCAGTTATCGTTATCGTT)(SEQ ID NO：6)进行PCR扩增并筛选ler基因二倍体菌株。该菌株的特征是含有质粒pCVD442∷Δler。然后再以此菌株DNA为模板进行PCR扩增，结果得到两条大小不同的被扩增Δler片段的电泳带。这些结果表明，受体菌EHEC O157:H7(Nal^R)和供体菌SM10(pCVD442∷Δler)之间已成功地发生了接合转导，并致使所得到的菌株EHECO157:H7(Nal^R)携带有来自供体菌SM10(pCVD442∷Δler)的重组质粒pCVD442∷Δler，将该菌株命名为EHEC O157:H7(pCVD442∷Δler)。

(4)重组菌株EHEC O157:H7(Δler)的筛选和鉴定

将EHEC O157:H7(pCVD442∷Δler)划线接种于含萘啶酮酸(Nal，50μg/ml)和氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的LB琼脂平板上，挑取单个菌落后重新接种于5ml含萘啶酮酸(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。过夜培养物经系列稀释后分别涂于含蔗糖的LB(50μg/ml Nal，5％Sucrose，无NaCl)琼脂平板上，29℃下培养过夜。然后挑取蔗糖培养基筛选的单个菌落分别接种于只含萘啶酮酸(50μg/ml)和只含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上继续培养并进行PCR鉴定，以筛选所需的EHEC O157:H7(Δler)菌株。

由于EHEC O157:H7染色体上的ler基因与质粒上的Δler基因发生同源重组和交换，而且交换后EHEC O157:H7菌株可丢失自杀载体，所以筛选得到的基因缺失重组菌株O157:H7(Δler)只含有单倍体缺失了279bp的Δler基因，经PCR扩增后只能得到一条缺失了279bp的较短的特异带(图3)。

为了鉴定如上得到的重组菌株O157:H7(Δler)，首先以该菌株的染色体DNA为模板，使用引物Boed 751(AGTTCAGTTATCGTTATCGTT)(SEQ ID NO：6)和Primerd(TTAACTAAATGGAAA)(SEQ ID NO：7)扩增ler基因片段，纯化(1％的琼脂糖凝胶)并回收PCR产物后进行序列测定，以确定所构建菌株的ler基因缺失情况。

然后，分别对野生型EHEC O157:H7、具有萘啶酮酸抗性的野生型EHECO157:H7(Nal^R)、携带重组自杀质粒的EHECO157:H7(pCVD442∷Δler)以及本发明的EHEC O157:H7(Δler)等四个菌株的染色体DNA进行PCR扩增并比较它们的eae，stx2和fliC鞭毛基因。结果发现，本发明的EHEC O157:H7(Δler)菌株不仅缺失了部分ler基因，同时通过传代培养，消除了stx2基因，将该菌株命名为EHEC O157:H7(Δler/Δstx)。

(5)EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株原噬菌体及其旁侧序列的鉴定与序列分析

根据已报道的EHEC O157:H7菌株染色体上的原噬菌体DNA及其两旁侧序列，设计并合成如下四条引物：FSZ5(GCCGTGCCGCCTCTCTC)(SEQ ID NO：8)，FSZ6(CAGAATTACCGAAGATCGTCC)(SEQ ID NO：9)，FSZ7(TCGCAGTAACCTTAGTGC)(SEQID NO：10)和FSZ8(CGTATAGTGCGCCGGAAG)(SEQ ID NO：11)。按如下方案对本发明菌株和野生型O157:H7菌株的原噬菌体及其旁侧序列进行PCR鉴定。

然后，再用引物FSZ7和FSZ8扩增本发明构建的基因缺失突变菌株的特异片段，回收并纯化后，使用引物FSZ8进行序列分析。

从图4所示的电泳分析结果可以看出，以野生型O157:H7菌株的DNA为模板，引物用FSZ5/FSZ6和FSZ5/FSZ7能扩增出该菌株染色体上的原噬菌体DNA带。以EHEC O157:H7(Δler/Δstx)菌株的染色体DNA为模板，则不能扩增得到相应的片段。而使用基于原噬菌体旁侧序列设计并合成的引物对FSZ7/FSZ8，能扩增出菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)染色体上的原噬菌体旁侧DNA序列。以野生型EHEC O157:H7菌株的染色体DNA为模板，则因原噬菌体序列过长而不能扩增得到相应的DNA片段。此结果表明，菌株EHEC O157:H7(Δler/Δstx)已丢失了编码stx基因的原噬菌体DNA序列。

分析引物FSZ7和FSZ8之PCR扩增产物的核苷酸序列，结果进一步证实本发明的缺失突变菌株在缺失部分ler基因的基础上，进一步缺失了编码Stx毒素的原噬菌体DNA序列，其缺失的原噬菌体序列为野生型EHEC O157基因组中第1246019-1308726位碱基的DNA，其缺失长度为62708个碱基。

实施例2：肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株的生物学鉴定

(1)Vero细胞毒性实验

于37℃和5％CO₂通气条件下，在DMEM营养液中将Vero细胞培养至细胞单层，经胰蛋白酶消化后转移到24孔细胞培养板中(1ml/孔)，继续培养至长满细胞单层。同时，37℃振荡培养EHEC O157:H7和O157:H7(Δler/Δstx)细菌细胞(16-20小时)，分别取5μl接种于5ml LB中，37℃振荡培养16-20h，然后离心并过滤收集滤液。

分别将如上得到的EHEC O157:H7或O157:H7(Δler/Δstx)细菌培养物上清液按递减容积(200，100，50，10，6，3，1和0.2μl)加到培养的Vero细胞单层上。以相应容积的LB培养基作为对照。同样在37℃和5％CO₂通气条件下培养24小时后，观察细胞形态和生长状况。

结果可见，在Vero细胞单层上加0.2μl野生型EHEC O157:H7细菌细胞培养物上清液共保温后，即可导致靶细胞的形态改变(细胞变圆)、脱落和死亡。相反，加200μl本发明EHEC O157:H7(Δler/Δstx)培养物上清液共保温的Vero细胞则未出现任何形态学和生长状况改变(图5)。

(2)细胞粘附实验

在6孔培养板的各孔中置入15×15mm的盖玻片，然后加入HEp-2细胞悬液(在DMEM营养液中)并在37℃和5％CO₂环境下培养至盖玻片上80-90％的区域长满单层细胞。换新鲜的DMEM营养液后，并在营养液中加入D-甘露糖至终浓度为0.5％。然后各孔分别加入野生型O157:H7和O157:H7(Δler/Δstx)细菌(4×10⁶个活菌/孔)，并在同样条件下培养3小时。培养后，用磷酸盐缓冲液(pH 7.0)小心清洗盖玻片5次。然后处理样品，并在扫描电子显微镜下观察细菌对细胞的粘附。观察结果电镜显示，野生型O157:H7细菌对HEp-2细胞表现有局灶性粘附作用，而本发明的EHEC O157:H7(Δler/Δstx)细菌细胞未见有这样的活性。

(3)小鼠模型安全性实验

将24只断奶小鼠(体重约10-15g)随机分为四组，每组6只。接种细菌细胞前两天，第1、2和3组动物每只腹腔内注射丝裂霉素C(2.5mg/kg)，第4组动物注射蒸馏水作为对照，并在各组动物的饮用水中加入萘啶酮酸(50μg/ml)。第3天，给第1组动物口服接种约4×10⁸个EHECO157:H7(Δler/Δstx)细菌细胞，第2组动物口服接种约4×10⁸个野生型EHEC O157:H7细菌细胞。第3组为未接种细菌细胞的阴性对照组，第4组为空白对照组。接种后每日称重并观察动物生长状况。观察结束后对实验动物进行组织病理学检查。

结果可见，预先用丝裂霉素C和萘啶酮酸处理并接种野生型细菌的所有阳性对照组动物均体重减轻并在第4-6天内死亡，而预先用丝裂霉素C和萘啶酮酸处理并接种本发明的减毒细菌的所有实验组动物均存活，并且平均体重基本接近于未接种细菌细胞的阴性和空白对照组动物。

第14天，处死尚存活的动物并对各组所有动物进行尸体解剖和大体与镜下病理学检查。结果可见阳性对照组动物的肺脏大面积淤血；肝脏颜色发暗并轻度肿胀；肾脏呈暗黄色。显微镜下则可见肺泡壁毛细血管屈曲扩张并有大量红细胞浸润；肝细胞索紊乱、肝细胞呈水疱样变性并且肝小叶结构异常；肠粘膜细胞呈卡他性炎性改变。实验组动物未见明显的组织学改变(图6)。

按照布达佩斯条约和中国专利法的规定，2003年9月24日将肠出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.1015。

                            序列表

<110>冯书章

<120>肠出血性大肠杆菌O157基因缺失疫苗

<141>

<160>11

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

GAGCTCTTTC GCCGAATG  18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

CTCTATAAGC TGAATGTA  18

<210>3

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>3

TACATTCAGC TTATAGAGGA CACTGAAGAA GAA  33

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>4

TCTAGATTAC GAGTAGAAC  19

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>5

GAGCTCTTTC GCCGAATG  18

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>6

AGTTCAGTTA TCGTTATCGT T  21

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>7

TTAACTAAAT GGAAA  15

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>8

GCCGTGCCGC CTCTCTC  17

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>9

CAGAATTACC GAAGATCGTC C  21

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>10

TCGCAGTAAC CTTAGTGC  18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>11

CGTATAGTGC GCCGGAAG  18

Claims (4)

1、肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株，所说的细胞株具有保藏登记号为CGMCC No.1015。

2、根据权利要求1的细胞株，其中所说的细胞株被删除了细菌染色体中的部分ler基因和stx基因。

3、免疫接种人以预防肠出血性大肠杆菌O157感染的疫苗组合物，所说的疫苗组合物含有如权利要求1限定的肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株，以及一种或多种医药上可接受的免疫增强剂、免疫调节剂或赋形剂。

4、免疫接种反刍动物以预防肠出血性大肠杆菌O157在消化道的定居和繁殖的疫苗组合物，所说的疫苗组合物含有如权利要求1限定的肠出血性大肠杆菌O157:H7减毒细胞株，以及一种或多种医药上可接受的免疫增强剂、免疫调节剂或赋形剂。

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