CN1287169A - 新的人g蛋白亚基及其编码序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供了新的编码人G蛋白γ12亚基(human γ12 subunit of G protein,hG－γ12)的cDNA序列;该cDNA编码的蛋白是牛G蛋白γ12亚基的同系物。本发明还提供了由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。

Description

新的人G蛋白亚基及其编码序列

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人G蛋白γ12亚基(humanγ12 subunit of G protein，hG-γ12)的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白是牛G蛋白γ12亚基的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。

G蛋白(鸟苷酸结合调节蛋白)参与许多信号传导途径，把细胞表面受体接受的胞外信号传导给胞内效应物。G蛋白由三个亚基组成，分别称为Gα、Gβ和Gγ。当三者形成异源三聚体Gαβγ时处于非活性状态，配基激活的受体与这个异源三聚体偶合后，引起Gα的构型变化，释放鸟苷二磷酸(GDP)，结合鸟苷三磷酸(GTP)。然后Gβ和Gγ以紧密结合复合物的形式(Gβγ)与结合GTP的Gα发生解离。游离的Gβγ复合物和激活的Gα-GTP都能独立、协同、或拮抗地作用于特定的效应物分子，从而改变第二信使的浓度，导致特定的细胞过程发生变化。结合于Gα的GTP水解为GDP，并释放磷酸，导致Gα失活，Gβγ重新与Gα结合，最后异源三聚体与受体再次偶合。以上就是G蛋白传导信号的机制(Neer，E.J.1995，Cell 80：249-257；Gilman，A.G.1995，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.34：1406-1419；Dolman，H.G.et al．1991，Annu.Rev.Biochem.60：653-688；Casey，P.J.et al．1994 Curr.Opin.Cell.Biol.6：219-225)。

G蛋白的三个亚基都有很多异构体。迄今为止，在哺乳动物中已发现的β亚基有5种(β1、β2、β3、β4、β5)，γ亚基有11种(γ1、γ2、γ3、γ4、γ5、γ7、γ8、γ10、γ11、γ12、γc)。氨基酸顺序比较表明，根据相似程度的大小，β亚基和γ亚基可分为亚家族，其中γ亚基的差异性更显著(Gautam，N.et al．1998，Cell Signal 10：447-455)。牛γ12亚基的蛋白一级结构通过蛋白水解测序得到，其cDNA序列也相应从脾脏中得到。γ12组织分布广泛，在成纤维细胞和光滑肌细胞中含量丰富(Morishila，R.et al．1995，J.Biol.Chem.270：29469-26475)。

实验表明βγ复合物对于G蛋白与受体的结合是必需的，而且是直接起作用的。在某些条件下，βγ复合物能与受体结合，且视紫红质(一种受体)C端的肽段能阻碍其相互作用，这提示βγ与受体有直接作用。若G蛋白含有不同的γ亚基，则与视紫红质的偶合效率不同，表明γ亚基直接影响与受体的结合。从γ1中鉴定出与视紫红质直接结合的结构域，还发现了与受体结合所必需的特定残基(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10：447-455)。

βγ复合物除了对受体有调节作用外，对效应物也有作用。在发现βγ复合物能激活K⁺通道后，其它受βγ复合物调节的效应物有：腺嘌呤环化酶、磷脂酶Cβ、电压门控的Ca⁺通道、脑Na⁺通道，这些效应物都与βγ复合物直接作用。其它与βγ复合物直接作用的蛋白有：钙调蛋白、β肾上腺素能受体激酶、动力蛋白、phosducin、phosducin-like protein，以上这些反应会间接的使细胞产生变化(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10：447-455)。

已表明，G蛋白及其亚基与某些疾病相关。因此，为了治疗目的而研究和开发人G蛋白γ亚基及其激动剂/抑制剂有重要意义。

本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸被命名为人G蛋白γ12亚基(human γ12 subunit of Gprotein，简称为“hG-γ12”)基因。

本发明的另一个目的是提供一种新的人hG-γ12蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人的hG-γ12多肽的方法。

本发明还提供了这种人的hG-γ12核酸序列和多肽的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的人hG-γ12蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。

在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。

在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hG-γ12蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hG-γ12蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人hG-γ12蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人hG-γ12蛋白活性的多肽。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为278个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于50-268位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“人hG-γ12蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中50-268位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框50-268位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中50-268位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少98％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人hG-γ12相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5和/或3端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明的编码序列可以是DNA或RNA，可以是单链或双链。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“人hG-γ12蛋白多肽”指具有人hG-γ12蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人hG-γ12相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人hG-γ12蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人hG-γ12 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hG-γ12多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人hG-γ12多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人hG-γ12多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hG-γ12多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约60个连续氨基酸，最佳地至少约70个连续氨基酸。

发明还提供人hG-γ12蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人hG-γ12多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人hG-γ12保守性变异多肽”指与SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据

表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还包括人hG-γ12多肽编码序列及其片段的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人hG-γ12的表达。

本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有人hG-γ12多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人hG-γ12的核酸分子。

本发明还包括检测人hG-γ12核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人hG-γ12多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对人hG-γ12 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人hG-γ12基因产物或片段。较佳地，指那些能与人hG-γ12基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人hG-γ12蛋白的分子，也包括那些并不影响人hG-γ12蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人hG-γ12基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4，946，778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人hG-γ12基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人hG-γ12或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人hG-γ12功能的抗体以及不影响人hG-γ12功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人hG-γ12基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人hG-γ12基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E..Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的人hG-γ12核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明蛋白的片段，除了用重组法产生之外，还可用固相技术通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的43lA型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本发明蛋白的编码序列还可用于基因定位。例如，通过荧光原位杂交技术(FISH)，将cDNA克隆与分裂中期的染色体进行杂交，可以准确地进行染色体定位。该技术可以使用短至约500bp的cDNA；也可以使用长至约2000bp或者更长的cDNA。对于该技术，可参见Verma等人，Human Chromosomes：A Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列被定位于染色体上的某个精确位置，将可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据相关联。这些遗传图谱数据是可以获得的，例如通过孟德尔(Mendelian)人遗传数据库(可通过Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在网上获得)。然后，通过连锁分析来鉴定基因与已定位于同一染色体区域的疾病之间的相关性。

接着，有必要确定患病个体和健康个体之间的cDNA或基因组序列方面的差异。如果某一突变存在于部分或全部患病个体但不存在于正常个体，那么该突变可能就是该疾病的致病因素。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与hG-γ12发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。

以本发明的人hG-γ12蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人hG-γ12蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

当本发明的人hG-γ12蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

在本发明的一个实例中，人hG-γ12的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人肾λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A：5′-TTGGACCACACAAAGTCTTACTG-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B：5＇-CTCTATTCCACTATAAGATGATGC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、62℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断约为300bp的目的片段。

对βγ复合物的研究发现，βγ复合物对于受体、效应物都有作用。βγ复合物与受体直接作用，受βγ复合物调节的效应物有：K⁺通道、腺嘌呤环化酶、磷脂酶Cβ、电压门控的Ca⁺通道、脑Na⁺通道。还有一些与βγ复合物直接作用的蛋白：钙调蛋白、β肾上腺素能受体激酶、动力蛋白、phosducin、phosducin-likeprotein，以上这些反应会间接的使细胞产生变化(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10：447-455)。

实验表明γ12性质不同于其它γ亚基：能被蛋白激酶C磷酸化，磷酸化的βγ12与Gα结合更紧密(Morishila，R.et al.1995，J.Biol.Chem.270：29469-26475)。γ12还能引起成纤维细胞运动性增加(Ueda，H.et al.1999，J.Biol.Chem.274：12124-12128)。

由于本发明的人hG-γ12具有源自人的天然氨基酸序列，因此，与来源于其他物种的同族蛋白相比，预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。

在附图中，

图1为本发明的人hG-γ12与牛G蛋白γ12亚基(bG-γ12)和大鼠G蛋白γ12亚基(rG-γ12)亚基等3种蛋白的氨基酸序列同源比较图。其中，相同的氨基酸在序列下方用“*”标出，相似的氨基酸用“.”标出。相似的氨基酸是：A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人hG-γ12的cDNA序列的克隆和测定

1.引物扩增

以人肾λgtllcDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用-对寡核苷酸为引物--A：5＇-TTGGACCACACAAAGTCTTACTG-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸B：5′-CTCTATTCCACTATAAGATGATGC-3′(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、62℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断约300bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将上述PCR扩增产物AB与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用SequiTherm EXCEL^TMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对插入片段进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共278bp，详细序列见SEQ ID NO：3，其中开放读框位于50-268位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出人hG-γ12的氨基酸序列，共72个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO：4。

实施例2

同源比较

用本发明的人hG-γ12的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用BLAST程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，在核苷酸水平和蛋白水平上与牛G-γ12(gb｜U37561)、大鼠G-γ12(gb｜AF022091)都有较高同源性。在核苷酸水平hG-γ12与牛、大鼠G-γ12的同一性达分别达到90％、86％。在蛋白水平上hG-γ12推导蛋白与牛、大鼠G-γ12蛋白的同一性达都到94％，相似性达97％、98％(hG-γ12与牛、大鼠三者的同源比较见图1)。

根据结构决定功能，结构相似功能相关的生物学原理，可以根据已知的不同物种中的基因及其编码蛋白的功能来推测本发明hG-γ12的生物学功能。

γ亚基有一共同特征：翻译后被脂质基团-法呢基或牻牛尔牻牛尔基修饰(Fukada，Y.et al.1990，Nature 346：658-660)，这一类异戊二烯基团连接于离C末端四个氨基酸的半胱氨酸残基上，然后γ亚基的最后三个残基被水解，羧基被甲基化。这一修饰的脂质可能有把蛋白定位于膜上的功能，稳定βγ复合物与α亚基、受体、效应物的互相作用。本发明hG-γ12离C末端四个氨基酸的残基是半胱氨酸，提示存在类异戊二烯基团的翻译后修饰以及这一修饰的稳定蛋白作用的功能。

βγ复合物的功能是多方面的，对于信号传导中的受体和效应物都有作用。在某些条件下，βγ复合物能与受体结合，且视紫红质(一种受体)C端的肽段能阻碍其相互作用，提示βγ与受体有直接作用。若G蛋白含有不同的γ亚基，则与视紫红质的偶合效率不同，表明γ亚基直接影响与受体的结合。从γ1中鉴定出与视紫红质直接结合的结构域，还发现了与受体结合所必需的特定残基(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10：447-455)。

βγ复合物除了对受体有调节作用外，对效应物也有作用。在发现βγ复合物能激活K⁺通道后，其它受βγ复合物调节的效应物有：腺嘌呤环化酶、磷脂酶Cβ、电压门控的Ca⁺通道、脑Na⁺通道，这些效应物都与βγ复合物直接作用。其它与βγ复合物直接作用的蛋白有：钙调蛋白、β肾上腺素能受体激酶、动力蛋白、phosducin、phosducin-like protein，以上这些反应会间接的使细胞产生变化(Phe64，Leu67，法呢基部分)(Gautam，N.et al.1998，Cell Signal 10：447-455)。

β亚基和γ亚基种类多，顺序上相似，且βγ复合物功能多样，这提示各种γ亚基的功能基本相似但又稍有不同。

对牛γ12亚基的研究表明其性质不同于其它γ亚基：能被蛋白激酶C磷酸化，磷酸化位点为Ser2。磷酸化的βγ12与Gα结合更紧密(Morishila，R.et al.1995，J.Biol.Chem.270：29469-26475)，但减弱了βγ12激活Ⅱ型腺苷酸环化酶的活性(Yasuda，H.et al．1998，J.Biol.Chem.273：21958-21965)。γ12的另一个特点是：能与F-肌动蛋白结合(Ucda，H.et al．1997，J.Cell Sci.110：1503-1511)。虽然不同的α亚基、β亚基、以及参与信号传导的酶也与细胞骨架有作用，但其重要性还不甚清楚。Ueda等人的实验表明，γ12的表达能引起成纤维细胞显著的变化：细胞变圆，运动性增加。γ12的这一作用通过βγ12复合物发挥，而且磷酸化也是必须的，因为γ12磷酸化位点的缺失(Ser2被替换)导致上述效应消失。(Ueda，H.et al.1999，J.Biol.Chem.274：12124-12128)。

hG-γ12蛋白的第二位氨基酸为Ser，与牛γ12一致，提示hG-γ12具有蛋白激酶C的磷酸化位点，是蛋白激酶C的底物。

本发明的人hG-γ12除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人hG-γ12还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人hG-γ12的N端与大鼠G-γ12的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。

针对本发明人hG-γ12的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。

此外，本发明人hG-γ12核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人hG-γ12的表达水平或者抑制人hG-γ12的过度表达。本发明的人hG-γ12蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人hG-γ12缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。

实施例3

人hG-γ12在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人hG-γ12的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.5和6)进行扩增，获得人hG-γ12 cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5-CAAGGTCGACATGTCCAGCAAAACAGCAAG-3′(SEQ ID NO.5)，

该引物含有SalⅠ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人hG-γ12编码序列的20个核苷酸；

3′端引物序列为：

5-TAGGAAGCTTCTATAAGATGATGCAAGTT-3(SEQ ID NO.6)，

该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人hG-γ12的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用SalⅠ和HindⅢ消化pQE-9载体及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacⅠ阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人hG-γ12的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O／N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1：100-1：250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacⅠ阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解培养物，收集细胞裂解液并将其稀释于6M盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人hG-γ12。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人hG-γ12。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约8kDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

实施例4

人hG-γ12在真核细胞(CHO细胞株)中的表达

在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物A/B为模板，将编码人hG-γ12的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物(SEQ ID NO.7和8)进行扩增，获得人hG-γ12cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为：

5′-CAAGAAGCTTATGTCCAGCAAAACAGCAAG-3′(SEQ ID NO.7)

该引物含有HindⅢ限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的人hG-γ12编码序列的19个核苷酸；

3′端引物序列为：

5-TAGGGGATCCCTATAAGATGATGCAAGTT-3(SEQ ID NO.8)

该引物含有BamHⅠ限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和人hG-γ12的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Neo^r)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用HindⅢ和BamHⅠ消化pcDNA3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O／N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，EcoRV酶切验证人hG-γ12的cDNA片段已正确插入了载体。

质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris· HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为8kDa。

此外，用常规方法对达蛋白的N端和C端各l0个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。

实施例5

制备抗体

将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人hG-γ12基因翻译产物的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生沉淀。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表(1)一般信息：

(ⅱ)发明名称：新的人G蛋白亚基及其编码序列

(ⅲ)序列数目：8(2)SEQ ID NO.1的信息

(ⅰ)序列特征

 (A)长度：23碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO.1：TTGGACCACA CAAAGTCTTA CTG                   23(2)SEQ ID NO.2的信息

(ⅰ)序列特征

 (A)长度：24碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO：2：CTCTATTCCA CTATAAGATG ATGC    24(2)SEQ ID NO.3的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：278bp

 (B)类型：核酸

 (C)链性：双链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO.3：1    TTGGACCACA  CAAAGTCTTA  CTGATTTCAG  GTAAAAACAA  TAATTGAAGA  TGTCCAGCAA61   AACAGCAAGC  ACCAACAATA  TAGCCCAGGC  AAGGAGAACT  GTGCAGCAGT  TAAGATTAGA121  AGCCTCCATT  GAAAGAATAA  AGGTTTCGAA  GGCATCAGCG  GACCTCATGT  CCTACTGTGA181  GGAACATGCC  AGGAGTGACC  CTTTGCTGAT  AGGAATACCA  ACTTCAGAAA  ACCCTTTCAA241  GGATAAAAAA  ACTTGCATCA  TCTTATAGTG  GAATAGAG(2)SEQ ID NO.4的信息：

(ⅰ)序列特征：

 (A)长度：72个氨基酸

 (B)类型：氨基酸

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：多肽

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO.4：1 Met Ser Ser Lys Thr Ala Ser Thr Asn Asn Ile Ala Gln Ala Arg16 Arg Thr Val Gln Gln Leu Arg Leu Glu Ala Ser Ile Glu Arg Ile31 Lys Val Ser Lys Ala Ser Ala Asp Leu Met Ser Tyr Cys Glu Glu46 His Ala Arg Ser Asp Pro Leu Leu Ile Gly Ile Pro Thr Ser Glu61 Asn Pro Phe Lys Asp Lys Lys Thr Cys Ile Ile Leu(2)SEQ ID NO.5的信息

(ⅰ)序列特征

 (A)长度：30碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO.5：CAAGGTCGAC ATGTCCAGCA AAACAGCAAG                  30(2)SEQ ID NO.6的信息

(ⅰ)序列特征

 (A)长度：29碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO.6：TAGGAAGCTT CTATAAGATG ATGCAAGTT                   29(2)SEQ ID NO.7的信息

(ⅰ)序列特征

 (A)长度：29碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO.7：CAAGAAGCTTATGTCCAGCAAAACAGCAAG                   30(2)SEQ ID NO.8的信息

(ⅰ)序列特征

 (A)长度：29碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：寡核苷酸

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO.8：TAGGGGATCC CTATAAGATG ATGCAAGTT               29

Claims (10)

1．一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列，

所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者

所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列杂交。

2．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。

3．如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列。

4．一种分离的人hG-γ12蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5．如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

6．一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

7．一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8．一种产生具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有人hG-γ12蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人hG-γ12蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸50-268位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人hG-γ12蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达人hG-γ12蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有人hG-γ12蛋白活性的多肽。

9．一种能与权利要求4所述的人hG-γ12蛋白多肽特异性结合的抗体。

10．一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。