CN1274752A - 细胞灌注培养过程中的细胞截留分离方法及其装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞灌注培养过程中的细胞截留分离方法及其装置。本发明将含有细胞的培养液由倾斜式细胞重力沉降器的上端口进入,绝大部分活细胞和少部分死细胞返回反应器,部分死细胞和少量活细胞随上清液流出,从根本上解决了沉积细胞逆流滑动受阻的问题,保证了操作的连续性,降低了设备制造成本和操作复杂程度,并具有较大的操作弹性。
Description
本发明涉及一种细胞灌注培养方法及其装置，尤其涉及一种细胞灌注培养过程中细胞截留方法以及一种倾斜式细胞重力沉降器。
动物细胞的培养一般分为批培养和连续灌注培养两种方法，而连续灌注培养更有利于悬浮细胞的连续化生产。在连续灌注培养过程中，活细胞和死细胞的截留分离是一个十分重要的环节。目前，已有许多专利披露了灌注培养过程中细胞的截留分离方法和装置，如：美国专利5817505公开了一种倾斜式沉降器，用于细胞的截留分离，该沉降器为一倾斜式封闭长方体槽，来自反应器含有细胞的培养液由下端流入，大部分细胞在重力作用下沉降在下表面上。含有少量细胞的上清液由上端流出。沉降在下表面的细胞则滑向下端出口，返回反应器。该专利主要存在的问题和缺点如下：
(1)操作连续性不好。使用该装置时，含有细胞的培养液由下端向上端流动，沉降在下底板上的细胞自上向下滑动以返回反应器，细胞的沉降和液流运动方向相反，液流方向与细胞返回运动方向相反，增加了细胞在沉降器中的滞留时间。该装置发明者提供了两种解决方法，一是定期关闭向沉降器下端进口输液的蠕动泵，沉降器中的液体停止流动，让集聚在下板的细胞自然滑到下端的细胞收集装置，使其返回反应器。二是沉降器上下两端的蠕动泵定期同时反转，使沉降器中的液体自上端向下端流动，液体流向和细胞滑动方向一致，促进细胞快速回收。这两种方法都是以破坏细胞在沉降器中的连续性沉降运动为代价的，都打破了系统进程的平衡。而经过一段时间的沉降集聚，底板已经沉积了较多细胞，再让其自由下滑，滑动速度是相当缓慢的。即便采用反冲的方法，效果也不是很大。细胞在沉降器中滞留时间过长必然导致细胞活性和产物表达能力下降，代谢废物积累增多，恶化反应器中的培养环境。
(2)由于间隔一段时间要关闭或者反转输送液体的蠕动泵，必然要装配时间控制装置进行自动控制。时间控制装置的装配一方面增加了设计及操作的复杂性，另一方面也增加了设备的制造成本。
(3)沉降器操作弹性小。在培养过程中，要根据细胞生长情况适当调整灌注速率，因而要求沉降器有较好的工作弹性，即在一定的范围内，改变沉降器的液体流量后，沉降器的处理效果要稳定。该沉降器在大幅度改变灌注速率后必然影响其工作稳定性，沉降效果和分离效果不稳定。
(4)在活细胞截留的同时也截留了死细胞。死细胞在反应器中的大量积累，严重恶化了活细胞培养环境。
文献Selective Recycle of Viable Animal Cells by Coupling ofAirlift Reactor and Cell Settler.Biotechnology and Bioengineering.1992，Vol.39，442-446.报道了一种重力沉降器，含有细胞的培养液由沉降器上部进入，细胞沉降在斜面上后由下端口返回反应器，上清液由上部另一出口抽走。该沉降器除了具有上述专利中所具有的一些问题和缺点外，最主要的一个缺陷是沉降面积与沉降器体积比大大低于倾斜式沉降器。由此带来的问题是，为完成同样的沉降任务，沉降器体积同细胞培养反应器体积比大大提高。相对大量的培养液和细胞滞留在反应器外的沉降器中，这对细胞的正常生长和产物表达非常不利，同时它分离死细胞的效率更低。这种沉降器的效果低于上述专利中描述的倾斜式沉降器。文献Inclined Sedimentationfor Selective Retention of Viable Hybridomas in a ContinuousSuspension Bioreactor.Biotechnol.Prog.1990，6，458-464.和ViableCell Recycle with an Inclined Settler in the Perfusion Culture ofSuspended Recombinant Chinese Hamster Ovary Cells.Biotechnol.Prog.1994，10，198-208.所报道的操作方法及沉降器也存在与上述现有技术相同的缺陷。
本发明的目的之一在于提供一种用于动物细胞连续灌注培养过程中的活细胞截留和死细胞去除的方法；
本发明的目的之二在于提供一种用于动物细胞连续灌注培养过程中的活细胞截留和死细胞去除的装置。
本发明的构思是这样的：
由于活死动物细胞大小的不同，两者在重力场中的沉降速度亦不同，因此，可以将含有细胞的培养液由倾斜式细胞重力沉降器的上端口进入，并通过调节上端口的位置和倾斜角度，使不同灌注速率下培养液中的细胞得到最佳的截留和分离，绝大部分活细胞和少部分死细胞返回反应器，部分死细胞和少量活细胞随上清液流出。
根据上述构思，发明人通过大量实验，提出实现本发明目的的技术方案，具体如下所述：
由细胞培养反应器来的含有细胞的培养液从上端具有多个入口的倾斜式细胞重力沉降器的上端口进入，在沉降器中，由于活细胞的沉降速度较大，绝大部分活细胞和部分死细胞首先沉降在沉降器下表面上，随主体液流滑向底端，通过活细胞出口流出沉降器；而部分未完成沉降的死细胞则由死细胞出口流出沉降器，从而达到活、死细胞的截留和分离，含有高浓度活细胞的培养液由沉降器下部的活细胞出口流出，由蠕动泵打回细胞培养反应器，死细胞流则由下端出口流入上清液收集容器。
灌注速率为0.2-10/天；“1/天”表示每天灌注相当于1个反应器工作体积的新鲜培养液，0.2/天即为每天灌注0.2个反应器工作体积的新鲜培养液。
含有细胞的培养液进入倾斜式细胞重力沉降器的位置将随灌注速率而变化，流量越大，位置越高，一般而言，灌注速率增加一倍，进口位置距底端活细胞出口的距离也增加一倍。
所说的细胞为一般的悬浮动物细胞，如杂交瘤细胞；
所说的培养液为适宜于动物细胞悬浮培养的有血清或无血清培养基，如GIBCO公司的Hybridoma-SFM(1X)(杂交瘤细胞培养用无血清培养基)，商品序号为12045-035。
该截留分离过程可在常温下进行。
上述的方法是在如下的倾斜式细胞重力沉降器中完成的：
所说的沉降器为一倾斜长方体槽，其上部设有多个培养液入口，下部设有活细胞出口和死细胞出口，所说的活细胞出口位于死细胞出口的上侧，两者之间的间距为1--10厘米；
倾斜度α为30--60度，具有入口部分的长度为总长度的1/10-9/10，长方体的当量直径与长度之比为1/20-1/2，横截面高宽比为1/10-1/2，当量直径可用下式进行定义：当量直径＝∏/π，∏为四边形周长，π为圆周率；
所说的细胞重力沉降器是这样操作的：
含有细胞的培养液由沉降器的上端的某一入口进入沉降器，在沉降器中，由于活细胞的沉降速度较大，绝大部分活细胞首先沉降在沉降器的下表面上，通过活细胞出口流出沉降器；而分离出的死细胞则由死细胞出口流出沉降器，从而达到活、死细胞的截留和分离。
图1为细胞重力沉降器的结构示意图。
由图1可见，所说的沉降器为一倾斜长方体槽，其上部设有多个培养液入口1，两个入口1之间的间距为1-10厘米，下部设有活细胞出口2和死细胞出口3，所说的活细胞出口2位于死细胞出口3的上侧，活细胞出口2与死细胞出口3的间距以1-10厘米为好。
倾斜度α为30--60度，具有入口部分的长度L1为总长度L的1/10-9/10，横截面高宽比为1/10-1/2，长方体的当量直径与长度之比为1/20-1/2。
含有细胞的培养液由沉降器的上端的某一入口1进入沉降器，在沉降器中，活细胞首先沉降在沉降器的下表面上，通过活细胞出口2流出沉降器；分离出的死细胞则由死细胞出口3流出沉降器，从而达到活、死细胞的截留和分离。
本发明所说的细胞重力沉降器具有十分显著的优点：
(1).含有细胞的培养液由倾斜式沉降器的上端进入，它从根本上解决了沉积细胞逆流滑动受阻的问题，由于沉降器内液流方向和沉积细胞滑动方向一致，可以促进细胞快速离开沉降器，从而保证了操作的连续性。
(2).由于无须定期停止或反转蠕动泵，降低了设备制造成本和操作复杂程度。
(3).沉降器上设有多个培养液进口，因此除了可以通过调整倾角来适应变化外，还可以通过选择众多的培养液进口中的一个作为进液通道来改变沉降面积，因此本沉降器具有较大的操作弹性。
(4)有效解决了死细胞从细胞培养反应器中不断积累的问题。通过调节倾角和改变进口位置，可以找到适宜的操作点，在保证截留活细胞的前提下，最大限度的不断除去死细胞。
本沉降器可以通过增加沉降面的面积、多单体并联或多单元组合为一体的方式实现放大，用于大体积细胞培养反应器的细胞截留和死细胞分离。
本沉降器是根据液体中微小颗粒运动规律和倾斜式沉降器的操作理论公式为理论基础设计的，故其截留和分离效果不仅仅限于动物细胞培养系统。它可以被应用于其它与含有动物细胞的培养液相类似的体系，用于从液固混合物中分离固体颗粒，并且可以将大小不同的颗粒分开。
以下将通过实施例对本发明的内容作进一步的说明，但实施例仅为技术方案的补充说明，并不限制本发明的保护范围，有关技术人员完全可以根据本发明公开的构思和技术方案，举一反三地用于各种类型地悬浮细胞的截留和分离。
实施例1
本沉降器与1.5升搅拌式细胞培养反应器组合用于杂交瘤细胞的灌注培养。
沉降器结构参数：
沉降器长度：30厘米，宽度4厘米，高度3厘米，具有12个进口，各进口间距为2厘米；
细胞：细胞株为杂交瘤细胞HB-58，该细胞株保藏在ATCC(美国组织细胞库)，保藏号为Hybridoma Cell Line 187.1(ATCC HB58)。细胞在100ml方瓶中维持培养，方瓶置于37℃含5％CO2培养箱中，一般每两天传代一次。在对数培养期接种到反应器中。
培养基为GIBCO公司的Hybridoma-SFM(1X)(杂交瘤细胞培养用无血清培养基)，商品序号为12045-035。
连续灌注培养50天。使用未经浓缩的常规培养基，在灌注速率为1.5/天时，最大细胞浓度达到2.5×107cells/ml，活细胞截留率为99％，死细胞截留率为68％，反应器内细胞活性为90％。
细胞密度检测方法：通过血球计数器和台盘蓝染色法计算活细胞密度和细胞活性。实验中每隔12小时检测一次细胞培养反应器中和由死细胞流出口流出的上清液中细胞密度和活性。
Claims (9)
1.一种细胞灌注培养过程中的细胞截留分离方法，其特征在于：
①含有细胞的培养液从倾斜式细胞重力沉降器的上端口
(1)进入，绝大部分活细胞和部分死细胞沉降在沉降
器的下表面上，通过活细胞出口(2)流出沉降器，送
回细胞培养反应器；部分死细胞和少量活细胞则由死细
胞出口(3)流出沉降器；
②所说的倾斜式细胞重力沉降器为一倾斜长方体槽，其上
部设有多个培养液入口(1)，下部设有活细胞出口(2)
和死细胞出口(3)，所说的活细胞出口(2)位于死细
胞出口(3)的上侧。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，灌注速率为0.2-10/天。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，含有细胞的培养液灌注速率越大，培养液进入倾斜式细胞重力沉降器的入口位置越高。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的细胞为悬浮动物细胞，所说的培养液为适宜于动物细胞悬浮培养的有血清或无血清培养基。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所说的细胞为杂交瘤细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所说的细胞为杂交瘤细胞HB-58。
7.一种细胞灌注培养过程中的细胞截留装置，其特征在于，所说的装置为一倾斜长方体槽，其上部设有多个培养液入口(1)，下部设有活细胞出口(2)和死细胞出口(3)，所说的活细胞出口(2)位于死细胞出口(3)的上侧。
8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，具有入口部分的长度为总长度的1/10-9/10，两个入口(1)的间距为1-10厘米，倾斜度α为30-60度，长方体的当量直径与长度之比为1/20-1/2。
9.如权利要求9所述的装置，其特征在于，横截面高宽比为1/10-1/2。
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