CN1269966C

CN1269966C - 用基于转录的扩增来扩增和检测hbvdna的方法

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Publication number: CN1269966C
Application number: CNB028073894A
Authority: CN
Inventors: B·A·L·M·戴曼; I·M·弗兰岑; A·M·W·斯特里杰普
Original assignee: Biomerieux BV
Current assignee: Biomerieux BV
Priority date: 2001-03-07
Filing date: 2002-03-06
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2022-03-06
Also published as: KR20030087636A; WO2002072881A2; HK1065338A1; BR0207893A; JP2004525632A; BRPI0207893B1; US20060051740A1; EP1383915A2; US7723078B2; KR100948020B1; CN1501983A; BRPI0207893B8; EP1383915B1; AU2002235940A1; US20080241891A1; WO2002072881A3

Abstract

本发明提供基于转录的扩增目标HBV核酸序列的方法，该方法从可选存在于样品中的HBV DNA开始，其包括下列步骤：-在扩增缓冲液中温育怀疑含有HBV的样品，该温育体系中含有一种或多种能够在选择出的限制位点切割HBV DNA的限制性内切酶，该限制性内切酶形成指定的此HBV DNA链的3′末端；该温育体系中含有启动子引物，该启动子引物具有包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列的5′区域和与指定的DNA链的3′末端互补的3′区域；该温育体系中含有第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有该目标序列的5′末端；且在HBV ssDNA作为目标序列的情况下，该温育体系中含有限制性引物；-将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性内切酶的消化；-将如此获得的样品以一定的温度和时间进行加热处理，该温度和时间足以失活限制性内切酶和/或至少部分地导致双链的单链化；-向样品中加入下列试剂，具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶、具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶、具有RNA酶H活性的酶、具有RNA聚合酶活性的酶；和-将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。

Description

用基于转录的扩增来扩增和检测HBV DNA的方法

本发明涉及用于扩增HBV DNA的基于转录的扩增方法。

核酸扩增方法应用于分子生物学和重组DNA技术领域。这些方法用于增加特异核酸序列的拷贝数，这些特异核酸序列少量存在并常常存在于同时也存在有多种其他核酸序列(包括RNA和DNA)的环境中。使用核酸扩增方法尤其有助于核酸的检测和定量，其对于诊断例如传染病、遗传病和各种类型的癌症是重要的。核酸扩增方法也应用于其他领域，在这些领域中研究其中可能微量存在核酸的样品，例如法医学、考古学或者确定亲权。

已知几种核酸扩增技术基于不同的作用机制。在欧洲专利申请EP200362和EP 201148中描述了一种核酸扩增的方法，其称为“聚合酶链反应”(PCR)。

本发明涉及一种不同类别的核酸扩增方法，即“基于转录的扩增技术”。采用这些方法可以从含有可被RNA聚合酶识别的功能启动子的DNA模板获得多重RNA拷贝。将这些RNA拷贝作为目标，从中可以获得新的DNA模板等等。Gingeras等人在WO88/10315中和Burg等人在WO89/1050中描述了这些方法。Davey等人在EP 323822(涉及NASBA方法)中，Gingeras等人在EP 373960中和Kacian等人在EP 408295中描述了基于等温转录的扩增技术。基于转录的扩增反应也可以用热稳定的酶来进行。基于转录的扩增通常在大约41摄氏度的温度进行。热稳定的酶使得反应能够在更高的温度进行。在以ToyoBoseki KK的名义申请的EP 682121中描述了这种热稳定方法。

EP 323822、EP 373960和EP 408295中描述的方法是等温连续方法。采用这些方法需要四种酶活性来完成扩增：依赖RNA的DNA聚合酶活性、依赖DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶(H)活性和RNA聚合酶活性。这些活性中的一些可以联合在一种酶中，所以通常只有2或3种酶是必需的。逆转录酶如AMV(禽成肌细胞瘤病毒)或MMLV(莫洛尼鼠白血病病毒)逆转录酶具有依赖RNA和DNA的DNA聚合酶活性以及固有的RNA酶H活性。另外，也可以向基于转录的扩增反应的反应混合物中加入RNA酶，例如大肠杆菌(E.coli)RNA酶H。

依赖DNA的RNA聚合酶从含有可被RNA聚合酶识别的启动子的DNA模板合成多重RNA拷贝。RNA聚合酶的例子为来自大肠杆菌和噬菌体T7、T3和SP6的聚合酶。通常与基于转录的扩增方法一起使用的RNA聚合酶的例子为T7聚合酶。因此，结合入用于产生RNA多重拷贝的模板中的启动子为T7-启动子。含有启动子的模板通常必须从含有目标序列的核酸开始来产生。该核酸可能存在于用作扩增反应输入的起始材料中。在起始材料中存在的核酸通常含有目标序列，该目标序列作为长得多的序列的一部分。额外的核酸序列可以存在于目标序列的3′和5′末端。可以通过将下列物质放在一起来开始扩增反应：来自起始材料的该核酸；适当的酶，这些酶一起提供上述的活性；和至少一种(但通常为两种)寡核苷酸。这些寡核苷酸中至少一种应当含有RNA聚合酶启动子的序列。虽然单链或双链DNA同样可用作输入材料，但是如果输入材料为单链RNA，则基于转录的扩增方法就特别有用。当基于转录的扩增方法应用于含有单链RNA(附加序列位于目标序列的3′末端和5′末端)的样品时，适宜用于现有技术中所描述的方法的寡核苷酸对由下列组成：

-第一寡核苷酸(通常称为“启动子-引物”或“正向-引物”)，其能够与目标序列的3′末端杂交，并具有连接到其5′末端上的启动子序列(优选的为T7启动子)(该寡核苷酸的杂交部分具有与用作输入材料的目标RNA相反的极性)。

-第二寡核苷酸(通常称为“反向引物”)，其含有目标序列的5′末端(该寡核苷酸具有与目标RNA相同的极性)。

当将这样的寡核苷酸对、同具有适当活性的所有的酶和足够量的必需的核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸一起构成一个反应混合物，并在适当的条件下(即在适当的缓冲条件下和于适当的温度下)保持足够的时间时，等温连续扩增反应就将开始。上述主题的许多变体已经在现有技术中进行了描述。基于转录的扩增反应包括从模板合成单链RNA转录物，该模板含有可被RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)识别的启动子(例如T7启动子)。含有启动子序列的正向引物可作为引物来起始与目标RNA互补的DNA链的合成。

引物通过依赖RNA的DNA聚合酶活性进行延伸。所形成的RNA-cDNA杂化物通过RNA酶H来降解。这使得特异的反向引物与cDNA杂交。该引物通过依赖RNA的DNA聚合酶进行延伸直至cDNA的5′末端，结果导致双链启动子序列的形成，由此作为正向引物一部分的启动子序列被用作模板。然后通过依赖DNA的RNA聚合酶将该双链启动子用于产生许多新的RNA分子，这些RNA分子与目标RNA互补。在该起始阶段之后，扩增进入循环阶段。

实际上，从样品中的单链RNA开始，一旦将所有的成分放在一起，并将混合物置于适当的温度以让酶都有活性，整个一系列事件就会发生。该方法的操作者不需要通过干预来完成这些步骤中的任何一个。

正如上面所解释的，基于转录的扩增方法对于从单链RNA开始的扩增特别有用。含有将要扩增的核酸的起始材料可以不含有以指定长度的RNA的形式存在的目标核酸。当对于含有目标序列(只以双链DNA的形式存在，环状或线性)的起始材料施行基于转录的扩增方法时，必须将DNA转变成单链核酸。这可以通过在应用升高的温度(直至100摄氏度)的条件而分离双链DNA的链来完成。然后可以将在扩增中用作引物的第一寡核苷酸与单链中的一条进行退火。在通常的基于转录的扩增方法中使用的酶不能耐受如此的高温，因此其只能在分离DNA链之后加入。当一个寡核苷酸与单链DNA进行退火并进行延伸时，就再次形成双链DNA，然后必须将反应混合物经历升高的温度，该温度足够高以将双链DNA再次分解成其分离的链。酶将会再次失活，在实施加热步骤之后要加入新的酶。现在可以加入第二寡核苷酸，并与从在第一步中延伸的第一寡核苷酸所形成的链进行退火。由于一个寡核苷酸含有依赖DNA的RNA聚合酶的5′启动子序列(见上)，所以获得含有双链功能启动子的双链DNA模板，从中可以发生RNA产生的第一步。结果产生的RNA转录物可以进入扩增的循环阶段，并且该过程进一步将等温进行。

从上述中明显的是，从双链DNA开始基于转录的扩增方法会是一个繁琐的过程。其要求操作者进行几个特殊的操作，样品必须反复加热和冷却，以及酶必须在每次加热步骤之后进行补充。

一些研究已经进入开发能够从dsDNA开始的基于转录的扩增方法，而避免上述的将dsDNA转变成ssRNA的繁琐的程序，ssRNA可以用作循环等温的基于转录的扩增的输入。

在WO9925868中公开了相当简单的用于dsDNA的基于转录的扩增方法。

根据WO9925868所描述的方法，样品中的dsDNA可以直接采用基于转录的扩增方案来扩增，而根本不需任何的加热处理步骤[超过90℃]，或者在一个优选的实施方案中只需一个起始的加热步骤。相对短的dsDNA在该方法中优选。实际上，该方法并没有根本上不同于用来扩增ssRNA的常规的基于转录的扩增方案。

作为另一种选择，起始材料中的双链DNA可以在扩增开始之前转录成RNA。这一额外的步骤可以依靠酶来进行，例如大肠杆菌RNA聚合酶，该酶可在无启动子序列(也称为聚合酶结合位点)存在的情况下将双链DNA转录成RNA。这一具有额外步骤的方法有助于通过基于转录的扩增方法来扩增双链DNA，其已在PCT专利申请no.WO9602668中进行了描述。在该程序中所描述额外步骤不仅包括额外的处理步骤和处理时间，而且包括附加成分即大肠杆菌RNA聚合酶的使用。

在EP 397269中描述了制备用于基于转录的扩增方法的合适模板的另一种方法。

在该专利中描述了一种方法，由此dsDNA用限制性内切酶进行预处理。在用限制性内切酶处理之后，只需一个加热分离步骤就可形成单链DNA(ssDNA)。在该方法中使用正向引物(启动子-引物)，其3′部分含有与DNA单链中的一条的准确3′末端互补的序列，以及5′末端含有可被RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)识别的启动子序列。当启动子-引物与DNA单链的3′末端杂交时，就形成了双链复合物，其中正向引物的5′启动子序列可以作为用于从DNA链3′末端开始延伸反应的模板。因此，通过依赖DNA的DNA聚合酶可形成双链启动子，结果产生的复合物可以作为对于依赖DNA的RNA聚合酶的模板从而合成RNA的多重拷贝。

在WO9104340中也公开了几个对于单链DNA开始基于转录的扩增反应的方法。可以再次用限制性内切酶在DNA上形成适当的3′末端，其能够与启动子引物的3′序列杂交。

在WO9104340中公开了怎样可以用切割ssDNA的限制性内切酶形成ssDNA上指定的3′末端。在同样方法的另一个实施方案中，切割dsDNA的限制性内切酶和能够与目标ssDNA杂交的限制性寡核苷酸一起使用，因此形成双链DNA片段，其可用限制性内切酶进行切割从而形成适当的3′末端。在这种方法中，限制性内切酶切割双链复合物之后会剩下小片段的限制性寡核苷酸。可是，根据WO9104340的公开内容，显然以这样的方式挑选限制性寡核苷酸，使其在消化之后剩下的片段太小而不能保持与ssDNA 3′末端的杂交，因此将掉下去而为启动子寡核苷酸让出空间。可是，虽然用现有技术方法中所使用的限制性内切酶进行预处理可以导致灵敏的基于转录的测定，但是其需要许多额外的处理步骤和处理时间。

乙型肝炎病毒(HBV)感染在人类中很普遍。该引起乙型肝炎的病毒看来似乎只感染人和黑猩猩。

肝炎感染通过三种一般机制传播：(1)通过肠胃外接种受感染的血液或体液，其可以大量如输血或者以微量如通过偶然的皮肤刺破发生；(2)通过亲密的家庭或性接触；和(3)通过一些母亲，她们将病毒传播给她们的新生儿。在自然条件下，HBV并非高传染性。通过吸入传播即使有也很少发生。通过受到污染的血液或血液制品的传播途径是对于人类健康的主要威胁。

HBV的感染常常导致亚临床的或急性自限的肝脏疾病，或者可以导致慢性长期感染。慢性HBV感染引发多种疾病实体，其从最严重形式的慢性活动性肝炎，至严重性稍小的慢性迁延性肝炎，至无症状的带毒者状态。最近已经开发出多种诊断测定来帮助临床医生区分乙型肝炎病毒感染和其他形式的病毒性肝炎(即甲型肝炎、丙型肝炎或戊型肝炎)。可是，区别急性乙型肝炎感染和有症状的慢性乙型肝炎感染的能力仍然存在问题。由于慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎患者常常表现出肝炎的循环模式，因此这就尤其是真实的问题，该循环模式以肝损伤的急性恶化和正常肝功能的交替出现为特征。

在HBV感染之后，血清中存在大量的病毒和相关颗粒。在有症状的感染阶段，急性和慢性HBV患者都具有升高的肝酶水平，在他们的血清中具有乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，并产生对于核衣壳抗原(HBcAg)的抗体。没有检测到对于HBsAg或乙型肝炎e抗原(HBeAg)特异的抗体。通常观察不到对于HBsAg的抗体的出现，直至大约循环的HBsAg消失之后两个月。已知存在于血清中的病毒颗粒脱去它们的表面包被从而暴露出核衣壳，其称为核心抗原(HBcAg)。HBcAg的抗体产生出现在HBV感染的急性阶段期间的早期，并能够持续许多年，且慢性感染的患者能够产生高滴度的抗HBc抗体。

HBsAg确定为急性或慢性乙型肝炎感染的最重要的标记，其能够在受感染的个体的血清中检测到。供体血液的HBsAg筛选例如对于避免乙型肝炎的传播是必需的。很清楚的是，在诊断性HBV测定中其灵敏度具有最大的重要性。

HBV是已知最小的DNA病毒；其基因组显示出高度紧凑的组织。在HBV复制循环中独特的方面为，前基因组mRNA作为第一条病毒DNA链合成的模板。HBV DNA聚合酶的RNA酶H活性随后切除mRNA，然后合成互补的DNA链，从而产生部分双链的DNA分子以装入病毒体。在病毒成功进入之后，部分双链的DNA分子转变成完全双链的DNA分子。

在受感染的宿主的血液中可检测到HBV DNA，这些宿主在超过90％情况中是HBsAg和HBeAg阳性。当前测量感染颗粒数量的技术方法为通过测量血清或血浆中病毒DNA的数量，因为其最可靠地反映出复制的病毒的数量。有几种测定法可用于此目的，例如分枝DNA(bDNA)测定法(Hendricks DA，Stowe BJ，Hoo BS，Kolberg J，IrvineBD，Neuwald PD，Urdea MS，Perrillo RP，1995.用分枝DNA(bDNA)信号扩增测定法定量人血清中的HBV DNA(Quantitation of HBVDNA in human serum using a branched DNA(bDNA)signalamplification assay).Am J Clin Pathol 104：537-546)、DNA杂交测定法和定量PCR(Pawlotsky JM，Bastie A，Lonjon I，Remire J，DarthuyF，Soussy CJ，Dhumeaux D，1997.对于临床样品中HBV DNA的常规检测和定量应当使用什么技术呢？(What technique should be usedfor routine detection and quantification of HBV DNA in clinicalsamples？)Journal of Virological Methods 65：245-253；Zaaijer HL，terBorg F，Cuypers HT，Hermus MC，Lelie PN，1994.用于检测乙型肝炎病毒DNA的方法的比较(Comparison of methods for detection ofhepatitis B virus DNA).J Clin Microbiol 32：2088-2091).可是这些测定法中的大部分只有有限的灵敏度。

本发明涉及包括限制性内切酶消化的基于转录的扩增方法。该方法使得能够进行乙型肝炎病毒DNA的灵敏和特异的扩增(以及随后的检测)。使用本发明的方法，HBV DNA能够以比使用现有技术的基于转录的扩增方法更有效的方式进行扩增和检测。与现有技术方法相比较，使用限制性内切酶不会使本发明方法中所用的程序变得复杂。

本发明提供基于转录的扩增目标HBV核酸序列的方法，该方法从可选存在于样品中的HBV DNA开始，其包括下列步骤：

-在扩增缓冲液中温育怀疑含有HBV的样品，该温育体系中含有

一种或多种能够在所选限制位点切割DNA的限制性内切酶，该限制性内切酶在DNA链中的一条上形成指定的3′末端，和

启动子引物，该启动子引物具有包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列的5′区域和与指定的DNA链的3′末端互补的3′区域，

第二引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有目标序列的5′末端，和

在HBV ssDNA的情况下，含有限制性引物；

-将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性内切酶的消化；

-将样品以一定的温度和时间进行加热处理，该温度和时间足以失活限制性内切酶和/或至少部分地导致双链的单链化；

-向样品中加入下列试剂，

具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶

具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶

具有RNA酶H活性的酶

具有RNA聚合酶活性的酶；和

-将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。

[对于充分的扩增]必需的(适当的)三磷酸核苷可以在用限制性内切酶温育步骤期间就已经存在，例如作为该扩增缓冲液的一部分。可是，它们也可以在该程序中的稍后阶段加入，例如在加热处理之后与酶一起加入。

本领域的技术人员知道用于基于转录的扩增方法的酶和实行基于转录的扩增方法的条件，并且知道所有可以作出的优化基于转录的扩增反应的通常修饰。例如，正向引物即启动子引物可以在位于引物5′末端的启动子序列和位于引物3′末端的杂交序列之间含有嘌呤区域。

引物的序列主要由所选择的限制位点的位置来决定。正向引物的3′末端应当与紧接着限制位点的目标序列进行退火。引物的长度可以变化，只要其长足够能在扩增反应所使用的条件下进行杂交。引物的杂交部分一般由大约10至大约35个核苷酸组成。

如果目标为HBV ssDNA，在根据本发明的方法中所使用的限制性引物就要求：它们所显示的与正向引物的重叠区为最小；并且以使限制性内切酶可以真正有效地切割DNA的方式结合入限制位点序列。

限制性内切酶是能够在所选位点(即被该酶识别的特异的核苷酸序列)切割dsDNA的酶。在为本发明的方法选择适当的限制性内切酶时，应当注意挑选在HBV DNA的所有变体中都存在的限制位点(例如，如果进行扩增是为了检测样品中所有的病毒HBV DNA，则应挑选在乙型肝炎病毒的所有基因型中都存在的限制位点)。限制位点应当不存在于所使用的正向和反向引物之间的DNA序列之内。

限制性内切酶的添加导致指定的DNA目标链的3′末端的形成，其对于和启动子引物的杂交部分的结合是有用的。另外的方面是，由于消化，DNA那部分的变性将会得到改善，因此有助于引物的结合。含有T7-启动子序列的启动子寡核苷酸应当以这样的方式进行设计，即杂交部分与正位于限制位点上游的模板相互作用。具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶(通常为逆转录酶，如MMLV-RT或AMV-RT)能够用引物作为模板来延伸由限制性内切酶消化所形成的DNA目标链的3′末端。将会形成双链T7-启动子序列，从而能够开始生产扩增子RNA。

令人惊奇的是，已经发现限制性内切酶能够在适宜于和适合于基于转录的HBV DNA扩增程序的环境中有效地作用。换言之，已经发现使用限制性内切酶来切割用作基于转录的扩增的输入材料的HBVDNA，不会导致复杂的和附加的样品处理。将限制性内切酶的使用合并入那些通常已经是基于转录的DNA扩增流程的一部分的步骤之中从而成为其中的一部分。

所有的现有技术方法都描述了限制性内切酶在制备用于基于转录的扩增的DNA模板中的用途，其以真正的基于转录的扩增之前的分离的预处理形式进行。因此，现有技术在制备DNA模板中使用限制性内切酶导致样品的附加处理，如分离的限制性内切酶失活步骤和分离的DNA纯化步骤。其使得整个扩增程序变得复杂，尤其对于自动化的过程，并增加了污染的风险。

虽然在WO9104340中已经公开了与限制性内切酶一起添加限制性寡核苷酸，但是其没有先于本发明公开怎样能够将限制性内切酶(和寡核苷酸)的使用与基于转录的扩增有效地联合在一起。

在现有技术中没有公开以何种方式能够将限制性内切酶的使用与基于转录的扩增联合在一起而不需附加的样品处理和试剂添加步骤。

本发明的方法提供了这种联合而没有使现有技术的基于转录的DNA扩增过程变得复杂。

本发明的方法几乎没有不同于一般的基于转录的扩增方法。所采取的仅有的附加步骤为将用限制性内切酶对样品进行“内置温育(builtin incubation)”，这表示以这种方式使用限制性内切酶，即实际的样品处理不会不同于常规的/现有技术的基于转录的DNA扩增过程。

在本发明方法中所优选使用的限制性内切酶当然是在将其添加到含有扩增缓冲液(含有相对较高浓度的盐)的反应混合物中的条件下仍相对稳定和保持高活性的酶。

在添加限制性内切酶之后，需要将样品在适当的条件下进行温育并保持合适的时间以使酶起作用。可以将样品和限制性内切酶进行温育相对较短的时间，优选温育大约10-20分钟，更优选于大约35至大约45℃且特别是大约37-41℃温育大约15分钟，这显然依赖于所使用的限制性内切酶的特性。事实上，与常规的基于转录的DNA扩增方法相比较，这是要采取的仅有的附加措施。

本发明的方法包括在用限制性内切酶温育之后加热样品的步骤。在该加热期间，使得限制性内切酶失活和导致双链DNA[至少部分地]变成单链。该加热步骤已经是进行基于转录的扩增方法的流程中的一部分。这些方法包括在引物添加之后样品的加热处理，从而形成对于引物退火最佳的环境(核酸伸展开来，核酸的链或内环分离开，和在冷却期间便于引物和模板的杂交)。

用酶温育之后的加热步骤可以在大约50℃或更高的较低温度进行，但优选在超过90℃(优选95+/-3℃)的温度下通过短时间的温育(大约5-10分钟)来进行。

此后，可以将样品冷却至对于进行基于转录的扩增反应适当的温度(通常为大约41℃)。

由于加热，至少导致一部分的双链DNA变成单链。当引物(尤其是启动子寡核苷酸)在样品加热之前已经存在时，加热处理也可以有助于引物与DNA的退火。

因此，在样品经过限制性内切酶的处理之后不需从样品中纯化出DNA。在加热处理中可简单地将酶失活，该加热处理已经成为基于转录的扩增程序的一部分。用本发明的方法已经证明这足够消除限制性内切酶干扰实际的基于转录的扩增方法的风险。

在加热处理之后，以通常的方式加入用于基于转录的扩增的其他扩增试剂，然后基于转录的扩增可以技术人员已知的通常方式来进行。

扩增酶只是在加热处理之后加入以防止在加热处理期间酶的降解(当然除非使用热稳定的酶)。

本发明方法的主要优点为，尽管使用了额外的试剂(例如限制性内切酶)，但这不会导致要进行额外的(分离的)反应步骤或操作。

不需额外的样品处理的事实尤其重要，因为每个额外的样品处理都会增加污染风险，这是无论如何都要避免的，尤其是在扩增反应中。此外，如果需要额外的样品处理，这将会使得方法的自动化操作复杂化。

本发明的方法也可用于单链DNA。当DNA是单链时，限制性寡核苷酸或限制性引物含有与包括目标DNA的限制位点的区域互补的序列，将其和限制性内切酶一起添加。

限制性寡核苷酸[限制性引物]与单链DNA杂交，并形成能够被限制性内切酶切割的双链复合物。又一试剂的添加(限制性寡核苷酸)不会使得实践者进行额外的步骤。限制性寡核苷酸可以简单地和限制性内切酶及其他对于扩增所必需的寡核苷酸一起添加。因此，不需打开扩增系统来再次添加试剂。

在本发明的优选实施方案中，限制性寡核苷酸的功能可以合并入也含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列的寡核苷酸(联合型启动子和限制性引物)。采用这种方式，对于扩增只需两种寡核苷酸，即启动子[或正向]引物，其合并有与包含限制位点的目标区域互补的序列，和第二[或反向]引物。包含该优选[联合型启动子和限制性]引物的限制位点的序列应当优选地以这种方式配置，即：

-在消化之后，引物的剩余部分会在加热期间从目标上变性，

-目标杂交序列的剩余部分足够长以用于结合新的联合型启动子和限制性引物，

-如果对于限制性内切酶的活性是必需的，那么限制位点周围的额外核苷酸包括在杂交之内。

因此，联合型启动子和限制性引物的一部分现在将作为限制性寡核苷酸；其将与目标DNA进行退火，从而导致含有可被限制性内切酶识别的限制位点的dsDNA。随后限制性内切酶将切割该dsDNA，从而提供出指定的DNA上的3′末端。

优选，相对于目标DNA的存在数量，应当存在至少1000倍过量的联合型启动子和限制性引物，这对于基于转录的扩增反应中的常规启动子引物也已是通常水平。

本发明的方法提供了在怀疑含有乙型肝炎病毒(HBV)的样品中有效和灵敏地扩增和检测病毒DNA的方法，尤其是用此处所描述的HBV引物和HBV探针。所以，这些HBV引物和HBV探针代表了本发明的另一个实施方案。

在本发明方法中所选的限制位点优选为在HBV的不同基因型中保守的限制位点。

如果目标序列和限制位点位于HBV基因组中编码表面抗原的那部分内，就可获得好结果。

在本发明的方法中特别有用的位于HBsAg编码区域内的保守限制位点(与切割这些位点的限制性内切酶一起)为位于根据EcoRI位点的核苷酸247-252上的XbaI位点、位于根据EcoRI位点的核苷酸253-258上的BssSI位点和位于根据Ec0RI位点的核苷酸178-183上的AvrII位点。

当然，引物的寡核苷酸序列主要由所选择的限制位点的位置来决定。引物的长度可以变化，只要其长足以能在扩增反应所使用的条件下进行杂交即可。引物的杂交部分一般由大约10至大约35个核苷酸组成，更优选由大约15至大约30个核苷酸组成。

正向引物的5′末端应当与紧接着限制位点的目标序列进行退火。

反向引物的位置的关键性稍小，其应当优选具有保守区域部分的序列，该保守区域离正向引物足够远，从而让探针能够在正向和反向引物区域之间的区域内与扩增出的目标序列杂交。

优选的限制性引物为与正向引物有着最小重叠的寡核苷酸，其以使限制性内切酶能够真正切割如此形成的dsDNA的方式包含限制位点的序列并且其长足以能够以充分的方式与HBV DNA杂交。

在与XbaI、AvrII和/或BssSI限制性内切酶联合中特别有用的寡核苷酸正向引物是本发明的优选实施方案。特别地，含有下列部分中至少10个和优选多于15个核苷酸[从切割位点算起]的寡核苷酸序列是优选的：与限制性内切酶XbaI联合时，SEQ ID No 1的HBV杂交部分[该杂交部分照此为SEQ ID No 10]；与限制性内切酶BssSI联合时，SEQ ID No 2的HBV杂交部分[该杂交部分照此为SEQ ID No 11]；和/或与限制性内切酶AvrII联合时，SEQ ID No 3的杂交部分[该杂交部分照此为SEQ ID No 12]。

能够用作限制性引物的寡核苷酸包含在相关HBV DNA限制位点两侧的至少10个和优选多于15个核苷酸，尤其是在下列位点两侧的核苷酸，即位于根据EcoRI位点的核苷酸247-252的XbaI位点、位于根据EcoRI位点的核苷酸253-258的BssSI位点和位于根据EcoRI位点的核苷酸178-183上的AvrII位点。

特别合适的限制性引物具有SEQ ID No 8和SEQ ID No 9中所描绘的寡核苷酸序列。

用于检测所扩增的HBV目标的合适探针含有10至大约35个且更优选大约15至大约30个与所扩增的HBV目标杂交的核苷酸，以及含有SEQ ID No 6和SEQ ID No 7的HBV杂交部分中的至少10个且优选多于15个核苷酸。(这些序列的HBV杂交部分出示在表1中，并分别标明为SEQ ID No 13和SEQ ID No 14。进一步提供了显示于表1中的探针，在其两个末端具有非HBV的核苷酸，这些非HBV的核苷酸完全地或者有时与少许HBV核苷酸一起形成探针的“主干”；该主干为所选择的检测系统的一部分。)

合适的反向引物含有HBV保守区域中的大约10至大约35个且更优选大约15至大约30个核苷酸。优选的反向引物含有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5中的至少10个且优选多于15个核苷酸。

本发明的另一个实施方案为适合根据本发明进行HBV DNA的基于转录的扩增和检测的测试试剂盒，其含有：

-此处所描述的限制性内切酶，

-如此处所说明的，与所选限制性内切酶的切割位点相应的正向引物，其和启动子序列一起提供，

-进行基于转录的扩增反应的其他试剂，

-检测所扩增的HBV DNA的方法，和

-使用说明书。

附图简述

图1：包括限制性内切酶消化的DNA NASBA的图解显示。限制性内切酶(箭头)只是在NASBA的起始阶段有活性。在消化之后，正向引物与模板杂交。AMV RT将会用正向引物来延伸包含T7启动子序列(暗灰色)作为模板的DNA目标链(黑色)的3′末端。T7 DdRp会识别出双链T7启动子序列，于是开始产生RNA扩增子(浅灰色)。RNA扩增子序列与目标DNA链互补。在循环阶段期间，可用分子信标技术来扩增和检测RNA扩增子。只是在循环阶段期间需要RNA酶H和反向引物。

图2：有和没有XbaI消化的HBV DNA联合正向引物S-p3.8的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.8可用作目标DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信标S-WT2用作探针。没有模板的样品(NT)作为负对照。

图3：有和没有BssSI消化的HBV DNA联合正向引物S-p3.10的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.10可用作目标DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信标S-WT2用作探针。没有模板的样品(NT)作为负对照。

图4：有和没有XbaI消化的HBV DNA联合正向引物S-p3.10的NASBA。在用XbaI消化之后，S-p3.10不可用作目标DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信标S-WT2用作探针。没有模板的样品(NT)作为负对照。

图5：有和没有BssSI消化的HBV DNA联合正向引物S-p3.8的NASBA。在用BssSI消化之后，S-p3.8可作用作目标DNA延伸的模板。引物S-p4.5用作反向引物而分子信标S-WT2用作探针。没有模板的样品(NT)作为负对照。

图6：有和没有AvrII消化的HBV DNA联合正向引物S-p3.5的NASBA。在用AvrII消化之后，S-p3.5可用作目标DNA延伸的模板。引物S-p4.4用作反向引物而分子信标S-WT4用作探针。没有模板的样品(NT)作为负对照。

本发明通过下面的实施例进行进一步的举例说明。

实施例1：HBV DNA的扩增

两个保守的限制性位点(XbaI和BssSI)编码于HBV DNA的S-gen的保守区域(根据EcoRI位点的nt 244-285)内。当S-区域的这部分能够成为负极性的单链DNA时，加入与包含限制位点序列的区域互补的寡核苷酸(“限制性引物”(RP))，从而为所有存在的基因组DNA形成双链限制位点。用Nuclisens Extractor(Organon Teknika)从被3×10⁹geq/ml的HBV基因型A感染的血浆的一系列稀释液中分离出HBV DNA。按照所述对于分离RNA的标准程序(Operator ManualExtractor，41001-9，rev A，1999)可获得50μl的提取液。每次测定用5μl的提取液。限制性内切酶消化在下列条件下进行：NASBA缓冲液(40mM Tris-HCl pH8.5，12mM MgCl₂，70mM KCl，15％v/v DMSO，5mM DTT，1mM的各种dNTP，2mM ATP，2mM CTP，2mM UTP，1.5mM GTP，0.5mM ITP，0.2μM正向引物(对于XbaI为S-p3.8，对于BssSI为S-p3.10，表1)，0.2μM反向引物(S-p4.5，表1)，0.1μM分子信标探针(S-WT2，表1)，0.17μM限制性引物(RP-3，表1))和0.2单位的限制性内切酶BssSI(New England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)或3.0单位的限制性内切酶XbaI(NeW England BioLabs，Inc.，Beverly，MA，USA)。在于41℃温育15分钟之后，加热失活限制性内切酶，并将DNA模板于95℃变性5分钟。将反应混合物冷却至41℃并保持3分钟，在此期间发生引物的杂交。随后加入NASBA酶(2.1μg BSA，0.08单位的RNA酶H，32单位的T7 RNA聚合酶和6.4单位的AMV逆转录酶)，并通过轻轻地敲打和短时间的离心将反应混合物混和，然后开始扩增和实时检测。将反应混合物在NucliSensEasyQ Analyzer(Organon Teknika)中于41℃温育120分钟，并每分钟进行荧光监测。反应物于485nm激发，于518nm测量到发射信号。

实施例1.1：包括XbaI消化的HBV DNA的扩增

进行有和没有使用限制性内切酶XbaI处理的NASBA测定。在NASBA条件下的最佳XbaI浓度这样确定：即能够消化10⁹拷贝的含有HBV DNA的扩增子区域的PCR片段，且结果显示为3个单位。S-p3.8用作正向引物，并能够在XbaI消化之后被AMV RT用作模板来延伸模板DNA。没有消化时获得3×10⁶geq/ml的灵敏度，而消化之后灵敏度为3×10³geq/ml，这表明灵敏度增加了1000倍(图2)。另外，没有消化时到达阳性的时间(TTP)为大约16分钟，而在XbaI消化之后其为大约6分钟，这表明TTP减少了大约10分钟(图2)。这两者都是扩增反应改善的指标。

实施例1.2：包括BssSI消化的HBV DNA的扩增

用同样的HBV DNA提取物和与上述同等的反应条件来进行有和没有使用限制性内切酶BssSI处理的NASBA反应。在NASBA条件下的最佳BssSI浓度这样确定：即能够消化10⁹拷贝的含有HBV DNA的扩增子区域的PCR片段，结果显示为0.2个单位。S-p3.10用作正向引物，并能够在BssSI消化之后被AMV RT用作模板来延伸模板DNA。用限制性内切酶BssSI处理的结果再次获得了显著的测试改善(图3)。没有消化时只获得3×10⁷geq/ml的灵敏度，而消化之后灵敏度为3×10⁴geq/ml，这再次表明作为消化的结果灵敏度增加了1000倍(图3)。另外，没有消化时到达阳性的时间(TTP)为大约21分钟，而在BssSI消化之后其为大约11分钟，这再次表明TTP减少了大约10分钟(图3)。这些结果证明在NASBA反应之前用限制性内切酶消化HBV DNA能够在相当程度上改善HBV DNA的扩增并因此改善HBV DNA的检测。

实施例1.3：包括XbaI消化的HBV DNA的扩增-2

为了测试由其本身消化还是限制性内切酶与所选引物的联合是改善的测定结果的基本原因，用引物S-p3.10代替S-p3.8再次进行包括XbaI消化的测定。在XbaI消化之后，AMV RT不能用S-p3.10作为模板来延伸目标序列。正如能够在图4中所见的，在联合S-p3.10的XbaI消化之后只获得了灵敏度的轻微增加(10倍)和TTP的少量减少(大约5分钟，从21至16分钟)。这表明在NASBA起始期间模板的延伸是获得改善的结果的原因，这些改善的结果可用XbaI与引物S-p3.8和用BssSI与引物S-p3.10来获得。

实施例1.4：包括BssSI消化的HBV DNA的扩增-2

为了测试目标的延伸是否的确为测定结果改善的基本原因，用引物S-p3.8代替S-p3.10再次进行包括BssSI消化的测定。在BssSI消化之后，AMV RT能够用S-p3.8作为模板来延伸目标序列。可是，在BssSI消化之后只有17个核苷酸参与了引物和目标序列的杂交，而其通常为大约20个核苷酸。尽管有这些差异，但是在BssSI消化之后再次获得了明显的测试改善(图5)。可以使用引物S-p3.8与S-p4.5、限制性引物RT-3和分子信标S-WT2，用NASBA中包括的XbaI和BssSI来进行双消化，这与单消化NASBA测定相比并没有降低扩增效率。

实施例1.5：包括AvrII消化的HBV DNA的扩增

限制位点(AvrII)编码于HBV DNA的S-gen的另一个保守区域(根据EcoRI位点的nt 177-192)内。如在NASBA中一样使用正向引物S-p3.5、反向引物S-p4.4、分子信标S-WT4和限制性引物RT-1(表1)。在AvrII消化之后，AMV RT能够用S-p3.5作为模板来延伸HBV DNA的目标链。使用与上述同样的反应条件。使用与上述同样的HBV DNA提取物来进行有和没有使用限制性内切酶AvrII处理的NASBA反应，每个反应使用2单位的AvrII。没有消化时获得＞10⁸geq/ml的灵敏度，而消化之后灵敏度为1×10⁵geq/ml，这表明作为消化的结果灵敏度增加了＞10³倍(图6)。这些结果再次证明在NASBA反应中包括的HBV DNA的限制性内切酶消化能够在相当程度上改善HBV DNA的扩增。

表1引物和探针序列

^*T7-启动子序列用斜体表示，嘌呤序列用小写字母表示，探针的主干序列用加下划线的斜体表示，并标明了限制位点。

序列表

<110>Akzo Nobel NV

<120>用基于转录的扩增来扩增和检测HBV DNA的方法

<130>2001.633

<160>14

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

aattctaata cgactcacta tagggagact cgtggtggac ttctctca 48

<210>2

<211>50

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

aattctaata cgactcacta tagggagaag gtggacttct ctcaattttc 50

<210>3

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

aattctaata cgactcacta tagggagagg acccctgctc gtgttacagg c 51

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gaaccaacaa gaagatgagg ca 22

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

gggactgcga attttggcca 20

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>6

cgatcgaggg actgcgaatt ttggccgatc g 31

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(10)

<223>n＝肌苷

<400>7

ggatccctng aaaattgaga gaagtccacc acggga 39

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

aataccgcag agtctagact cgtgg 25

<210>9

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

catcaggayt cctagga 17

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

gactcgtggt ggacttctct ca 22

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

ggtggacttc tctcaatttt c 21

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

ggacccctgc tcgtgttaca ggc 23

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<400>13

agggactgcg aattttggcc 20

<210>14

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>探针

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(5)

<223>n＝肌苷

<400>14

cctngaaaat tgagagaagt ccaccacg 28

Claims

1.基于转录的扩增目标HBV核酸序列的方法，该方法从存在于样品中的HBV DNA开始，其包括下列步骤：

-在扩增缓冲液中将疑似含有HBV的样品与下述成分一起温育：

一或多种能够在所选限制位点切割该HBV DNA的限制性内切酶，该限制性内切酶在该HBV DNA链上形成指定的3′末端；

启动子引物或正向引物，其中具有包含DNA依赖性的RNA聚合酶所识别的启动子序列的5′区域以及与该DNA链的指定3′末端互补的3′区域；

第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有该目标序列的5′末端；以及

在HBV ssDNA作为目标序列的情况下，还含有限制性引物；

-将如此获得的样品以足以失活限制性内切酶和/或至少部分地导致双链发生单链化的温度和时间进行加热处理；

-向样品中加入下列试剂，

具有RNA依赖性的DNA聚合酶活性的酶

具有DNA依赖性的DNA聚合酶活性的酶

具有RNA酶H活性的酶

具有RNA聚合酶活性的酶；和

2.根据权利要求1的方法，其中该DNA为双链HBV DNA。

3.根据权利要求1的方法，其中该DNA为单链，并且使用联合型启动子和限制性引物，从而联合了启动子引物的功能和限制性引物的功能，该联合型启动子和限制性引物含有与包括目标ssDNA的限制位点的区域互补的序列和可被DNA依赖性RNA聚合酶识别的启动子序列。

4.根据权利要求1的方法，其中于加热处理前向起始的温育混合物中加入适当的三磷酸核苷。

5.根据权利要求1的方法，其中具有RNA依赖性的DNA聚合酶活性的酶和具有DNA依赖性的DNA聚合酶活性的酶合并在一种逆转录酶中，将具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶与具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶的活性联合在一起。

6.根据权利要求1的方法，其中使用本身具有RNA酶H活性的逆转录酶，从而代替以下3种酶，即具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶、具有DNA依赖性DNA聚合酶活性的酶以及具有RNA酶H活性的酶。

7.根据权利要求1的方法，其中温育温度为35℃至45℃。

8.根据权利要求7的方法，其中温育温度为37-41℃。

9.根据权利要求1的方法，其中加热步骤在92-98℃的温度进行。

10.根据权利要求9的方法，其中加热步骤在95℃的温度进行。

11.根据权利要求1的方法，其中使用在HBV不同基因型中保守的位点切割HBV DNA的限制性酶。

12.根据权利要求1的方法，其中限制位点位于HBV基因组中编码表面抗原的部分内。

13.根据权利要求12的方法，其中限制位点为位于根据EcoRI位点的核苷酸247-252处的XbaI位点、位于根据EcoRI位点的核苷酸253-258处的BssSI位点或位于根据EcoRI位点的核苷酸178-183处的AvrII位点，并且所使用的限制性内切酶分别为XbaI、BssSI或AvrII限制性内切酶。

14.根据权利要求1的方法，其中限制性引物为含有10至35个核苷酸的寡核苷酸，这些核苷酸与HBV目标杂交，并含有在下列位点侧翼的至少10个核苷酸：位于根据EcoRI位点的核苷酸247-252处的XbaI位点、位于根据EcoRI位点的核苷酸253-258处的BssSI位点或位于根据EcoRI位点的核苷酸178-183处的AvrII位点。

15.根据权利要求14的方法，其中限制性引物为含有15-30个核苷酸的寡核苷酸。

16根据权利要求14或15的方法，其中限制性引物含有在下列位点侧翼的至少15个核苷酸：位于根据EcoRI位点的核苷酸247-252处的XbaI位点、位于根据EcoRI位点的核苷酸253-258处的BssSI位点或位于根据EcoRI位点的核苷酸178-183处的AvrII位点。

17.根据权利要求14的方法，其中限制性引物具有SEQ ID No 8和SEQ ID No 9中所描绘的寡核苷酸序列。

18.根据权利要求1的方法，其中启动子或正向引物为包含与HBV目标杂交的10至35个核苷酸以及含有下列序列中从切割位点算起的至少10个核苷酸的寡核苷酸：与限制性内切酶XbaI联合时，为SEQID No 10；或与BssSI联合时，为SEQ ID No 11；或与AvrII联合时，为SEQ ID No 12；该寡核苷酸连接于启动子序列。

19.根据权利要求18的方法，其中启动子或正向引物为包含与HBV目标杂交的15至30个核苷酸的寡核苷酸。

20.根据权利要求18或19的方法，其中启动子或正向引物为含有下列序列中从切割位点算起的至少15个核苷酸的寡核苷酸：与限制性内切酶XbaI联合时，为SEQ ID No 10；或与BssSI联合时，为SEQID No 11；或与AvrII联合时，为SEQ ID No 12；该寡核苷酸连接于启动子序列。

21.根据权利要求18的方法，其中启动子寡核苷酸具有SEQ IDNo 1、SEQ ID No 2或SEQ ID No 3中所分别描述的核苷酸序列。

22.根据权利要求1的方法，其中用杂交探针另外检测所扩增出的HBV核酸，该杂交探针含有包含10至35个核苷酸的寡核苷酸序列，这些核苷酸可与所扩增出的HBV目标杂交并含有SEQ ID No 13和SEQ ID No 14中的至少10个核苷酸。

23.根据权利要求22的方法，其中所述杂交探针含有包含15至30个核苷酸的寡核苷酸序列。

24.根据权利要求22或23的方法，这些核苷酸可与所扩增出的HBV目标杂交并含有SEQ ID No 13和SEQ ID No 14中的至少15个核苷酸。

25.根据权利要求22的方法，其中探针具有SEQ ID No 6和SEQID No 7的寡核苷酸序列。

26.根据权利要求1的方法，其中第二或反向引物为包含10至35个核苷酸并含有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5中的至少10个核苷酸的寡核苷酸。

27.根据权利要求26的方法，其中第二或反向引物为包含15-30个核苷酸的寡核苷酸。

28.根据权利要求26或27的方法，其中第二或反向引物为含有SEQ ID No 4和SEQ ID No 5中的至少15个核苷酸的寡核苷酸。

29.具有选自从SEQ ID No 1中直至并包括SEQ ID No 14的核苷酸序列的寡核苷酸。

30.适合用于根据权利要求1扩增HBV核酸的整套寡核苷酸引物，其含有根据权利要求18的启动子引物和根据权利要求26的反向引物。

31.适合实施权利要求1的对HBV DNA进行基于转录的扩增和检测的测试试剂盒，其含有：能够在选定位点切割dsDNA的限制性内切酶；与所选的限制性内切酶的切割位点相应的正向引物，其和启动子序列、用于进行基于转录的扩增反应的其他试剂、用于检测所扩增出的HBV DNA的手段和使用说明书一起提供，该启动子序列是正向引物的一部分，被用作模板以产生双链启动子，其再被DNA依赖性RNA聚合酶用来产生与目标RNA互补的许多新RNA分子。