CN1251610A - 新型小鼠cxc趋化因子受体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种DNA,它编码包括序列表中序列号17记载的全部或部分氨基酸序列的多肽,或包括该多肽的多肽,其中任一种多肽具有能与小鼠PBSF/SDF－1结合的受体活性;由该DNA所编码的、具有能与小鼠PBSF/SDF－1结合的受体活性的多肽;表达该多肽和人CD4蛋白质的细胞;以及以应用该细胞为特征的筛选AIDS发病抑制剂和HIV－1感染抑制剂的方法。由此本发明提供对研究AIDS的治疗药和HIV－1感染的作用机制有用的、新型小鼠CXC趋化因子受体基因和HIV－1感染抑制剂的筛选方法等。

Description

新型小鼠CXC趋化因子受体

技术领域

本发明涉及新型小鼠CXC趋化因子受体和小鼠趋化因子受体基因。更详细地讲，涉及该基因编码的多肽、含有该基因的表达载体、转入了该表达载体的转化体、抗所述多肽的单克隆抗体。还涉及应用前面的转化体生产所述多肽的方法。还涉及趋化因子激动剂或拮抗剂的筛选方法，以及AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的筛选方法。技术背景

当因细菌或病毒引起的感染、物理性或化学性外伤、自身免疫性疾病，过敏性疾病等成为诱因而引起组织损害的时候，能诱发伴随有发红、浮肿、发热、疼痛等症状的炎症反应，在炎症局部能观察到末梢血白细胞的聚集和浸润。根据疾病的不同，在炎症部位浸润的白细胞的种类亦有所不同。普通的细菌感染、免疫复合物的沉着、外伤等急性炎症时主要引起中性粒细胞的聚集和浸润，而结核菌感染、伤寒菌感染和迟发型超敏反应主要引起单核细胞的聚集和浸润，病毒感染主要引起淋巴细胞的聚集和浸润，而嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在伴随速发型超敏反应或寄生虫感染时浸润(Baggioloni，M.等，今日免疫，15，127-133(1994))。近年来发现对游走的白细胞具有某种程度的选择性的多肽趋化因子，它具有4个特征性的半胱氨酸残基。因为它们是氨基酸序列具有同源性、生物活性也彼此相关的一个家族，因此命名为趋化因子(Chemokine；具有化学吸引性和细胞因子活性)(Lindley.I.J.D.等，今日免疫，14-24(1993))。

趋化因子的4个半胱氨酸残基分别在第1和第3个残基间以及第2和第4个残基间连接成二硫键。因为在第1和第2个半胱氨酸残基间无论包含其它的氨基酸与否均能在生物活性上发现其特征，因此分别将其亚家族称作CXC趋化因子和CC趋化因子，以进行区别(Baggioloni，M.等，免疫学进展，55，97-179(1994))。

到目前为止已发现的CXC趋化因子为PBSF/SDF-1、IL-8(Yoshimura T.等，美国国家科学院院刊，84，9233-9237(1987))，NAP-2(Walz.A.等，生物化学生物物理研究通讯，159，969-975(1989))，NAP-4，GROα(Richmondo，A.等，细胞生物化学杂志，36，185-198(1988))，GROβ(Haskill，S.等，美国国家科学院院刊，87，77732-7736(1990))，GROγ(Haskill，S.等，(1990)如前)，GCP-2(Proost，P.等，免疫学杂志，150，1000-1010(1993)，ENA-78(Wayz，A.等，实验医学杂志，174，1355-1362(1991))，PF-4(Deuel，T.F.等，美国国家科学院院刊，74，2256-2258(1977))，人CXCR4/fusin/HUMSTSR(Feng，Y.等，科学，272，872-877(1996)和IP-10(Dewald.B.等，Immunol.Lett，32，81-84(1992))。

CC趋化因子为MCP-1(Yoshimura.T.等，免疫学杂志，142，1956-1962(1989)，MCP-2(Chang，H.C.等，国际免疫学，1，388-397(1989))，MCP-3(Van Damme，J.等，实验医学杂志176，59-65(1992))，MIP-1α(Obaku，K.等，生化杂志，99，885-894(1986))，MIP-1β(Lipes，M.A.等，美国国家科学院院刊，85，9704-9708(1988))，RANTES(Schall，T.等，免疫学杂志，141，1018-1025(1988)，I-309(Miller，M.D.等，免疫学杂志，143，2907-2916(1989))和eotaxin(Jose，P.等，实验医学杂志，，179，881-887(1994))。

几乎所有的CXC趋化因子对中性粒细胞具有趋化活性但对单核细胞无趋化活性。另外，几乎所有的CC趋化因子对单核细胞有趋化活性但对中性粒细胞无趋化活性。另有报道，一些CXC和CC趋化因子对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞等其它白细胞具有趋化活性。虽然发现CC趋化因子中的RANTES、MIP-1α、MCP-1和CXC趋化因子IL-8对淋巴细胞具有趋化活性，但是它们均不是淋巴细胞特异的趋化因子。

小鼠PBSF/SDF-1是原本由小鼠骨髓间质细胞株PA6分泌的作为小鼠B前体细胞的增殖促进因子而鉴定出的CXC趋化因子，并报道了其氨基酸序列(图1)(Nagasawa，T.等，美国国家科学院院刊，91，2305-2309(1994))。此外，最近又阐明对人T淋巴细胞亦有强的趋化活性(Bleul，C.等，实验医学杂志184，1101-1110)。

对趋化因子的受体也进行了多种研究，有报道IL-8RA为IL-8特异的受体，IL-8RB为IL-8和其它CXC趋化因子的受体，CC CKRI为MIP-1α和RANTES特异的受体，CC CKR2A为MCP-1特异的受体，CC CKR2B为MCP-1和MCP-3特异的受体，etotaxin、MCP-3、PANTES特异的受体为CC CKR3(Combadiere，C.等，生物学杂志，270，16491-16494(1995)，还有CC CKR5为MIP-1α、MIP-1β、RANTES特异的受体。另外，最近CXR4/Fusin/HUMSTSR作为人CXC趋化因子SDF-1的受体被鉴定出来。

另外，阐明上述趋化因子受体中的CC CKR5，CC CKR2B，CC CKR3和CXCR4/fusin/HUMSTSR与存在于细胞膜上的蛋白质CD4协同作用具有HIV-1受体的作用，并且各个受体的配体能抑制借助这些受体的HIV-1感染。

2种性质不同的HIV-1与AIDS的致病病毒-HIV-1的感染和AIDS的发病相关。主要感染单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞的亲单核细胞性HIV-1参与感染和潜伏感染期中人体内病毒的增殖，主要感染T淋巴细胞的亲T细胞性HIV-1与T淋巴细胞数目的减少和AIDS的发病相关。2种受体对于上述2种HIV-1感染细胞是必要的。一种是细胞膜蛋白质之一的CD4蛋白质，它是上述2种HIV-1的共同受体。另一种是叫做coreceptor的蛋白质，与CD4蛋白质协同作用具有受体的活性，它是上述2种HIV-1各自特异的受体。

最近证实亲单核细胞性HIV-1的主要coreceptor是CC趋化因子受体CC CKR5，亲T细胞性HIV-1的coreceptor是CXC趋化因子受体人CXCR4/fusin/HUMSTSR，此外证实，CC CKR5的配体MIP-1α、MIP-1β、RANTES能抑制亲单核细胞性HIV-1的感染，人CXCR4/fusin/HUMSTSR的配体人PBSF/SDF-1能抑制亲T细胞性HIV-1的感染，这表明上述趋化因子受体可成为HIV-1感染抑制剂的目标。

另一方面，人CXCR4/fusin/HUMSTSR的哪一个功能区对亲T细胞系性HIV-1的感染是必要的，到目前为止尚未鉴定出来。CXC趋化因子受体-人CXCR4/fusin/HUMSTSR是有7个跨膜区的受体，认为由4个细胞外功能区构成的立体结构对与配体或HIV-1的结合是重要的。制作保持作为受体的立体结构的CXCR4/fusin/HUMSTSR变异体对于鉴定人CXCR4/fusin/HUMSTSR的功能区是必要的。鉴定人CXCR4/fusin/HUMSTSR的功能区对于HIV-1感染抑制剂的开发是极为有用的。

此外，与阐明病毒感染时所需要的细胞内因子相同，阐明引起HIV-1种特异性的机制对于开发HIV-1感染的模型动物很重要。尽管小鼠是容易处理，消费低，特性被详细阐明的很好的实验动物，但未有感染HIV-1的报道。

小鼠细胞中存在几个与HIV-1病毒感染相关的屏障。最初的屏障存在于病毒结合到小鼠细胞的阶段。人CD4结合HIV-1，而小鼠CD4不结合到HIV-1。但是，从目前的研究可以阐明，在体外，当包括T细胞株的小鼠细胞株的细胞表达人CD4时，能引起HIV向细胞的吸附但不能引起进入。该结果表明，表达人CD4的小鼠细胞不支持病毒的进入，这暗示除CD4以外还存在膜融合(病毒进入时发生)所必要的且人特异性的受体，其分子在小鼠细胞上不存在。

可以看到HIV-1因株不同而对CD4阳性细胞的感染能力有所差异。有些株因为感染单核细胞而归类于亲单核细胞或巨噬细胞性株(M-tropic)，其它株因感染T细胞株而归类于亲T细胞株性株(T-tropic)。

随着HIV-1感染的进行，在感染初期常看到的亲单核细胞性病毒被亲T细胞株性病毒所取代。1996年报道，7个跨膜区的G蛋白结合性受体-CXCR4/fusin对亲T细胞性HIV-1进入CD4阳性细胞是必须的。该结果促使本发明人检测与作为病毒进入的受体功能相关的CXCR4是否具有种特异性。发明公开

本发明人分离了作为CXC趋化因子之一的小鼠PBSF/SDF-1的受体小鼠CXCR4，阐明它与人CXCR4的氨基酸序列90％一致。本发明人建立了用人CD4和小鼠CXCR4转染的细胞，检测了HIV-1的受体-人CXCR4是否作为存在于小鼠细胞阻止HIV-1进入的屏障分子。

因此本发明的目的是提供对AIDS的治疗药物和HIV-1感染的作用机制等研究有用的、新型小鼠CXC趋化因子受体基因，该基因所编码的多肽，该基因的表达载体，含有该表达载体的转化体，抗该多肽的单克隆抗体，该多肽的生产方法，以及该多肽的激动剂或拮抗剂、及HIV-1感染抑制剂的筛选方法。

具体来说，本发明者们为了解决前述的问题进行了深入细致地研究，结果从小鼠PBSF/SDF-1依赖性增殖加强的小鼠B前体细胞株DW34成功地克隆了新型小鼠趋化因子受体基因。还发现表达小鼠CXCR4和人CD4的细胞与表达来源于亲T细胞株性HIV-1的env蛋白质的细胞进行融合，这些细胞感染亲T细胞株性HIV-1株。从这些结果可得出这样的结论：CXCR4不是存在于小鼠细胞的对亲T细胞性HIV-1的进入具有种特异性的屏障。另外由env区域或V3区域由亲单核细胞性HIV-1的区域所取代的亲T细胞株HIV-1的嵌合病毒克隆不感染表达小鼠CXCR4和人CD4的细胞这一事实，表明HIV-1被膜蛋白的V3环对小鼠CXCR4介导的HIV-1的进入是必要的。基于这些发现完成了本发明。

也就是说本发明的主要宗旨是：

[1]编码多肽的DNA，该多肽是由全部或部分序列表的序列号17中记载的氨基酸序列组成的多肽，或者是含有上面所述多肽的多肽，其中任一种多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1可能结合的受体活性；

[2]编码多肽的DNA，该多肽是序列表的序列号17中记载的氨基酸的全部或者一部分氨基酸序列中1个或多个的氨基酸缺失、添加、插入或取代至少一种发生，且具有与小鼠PBSF/SDF-1结合可能的受体活性；

[3]一种DNA，它是包含由序列表的序列号1中记载的碱基序列的全部或其部分序列，或包含上述DNA的DNA，其中任一种DNAs编码的多肽具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性；

[4]一种DNA，它是序列表的序列号1中记载的碱基序列的全部或一部分的DNA，或者是包含该DNA的DNA，这些DNA中1个或多个的碱基缺失、添加、插入或取代至少有一种情况发生，其中任一种DNAs编码的多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合可能的受体活性；

[5]一种DNA，它在严格条件下能与上述[1]～[4]任一项中记载的DNA进行杂交的DNA，且能编码具有与小鼠PBSF/SDF-1结合可能的受体活性的多肽；

[6]一种由上述[1]～[5]任一项中记载的DNA所编码的多肽，其中任一种多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性；

[7]一种多肽，它包含由序列表的序列号17中记载的全部或部分氨基酸序列，或者包含该多肽的多肽，其中任一种多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性；

[8]一种多肽，它来源于序列表的序列号17中记载的全部或部分氨基酸序列中1个以上的氨基酸残基缺失、添加、插入或取代中至少发生一种，其中所述的多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性；

[9]上述[6]～[8]任一项中的多肽，它来源于小鼠B前体细胞株DW34；

[10]包含上述[1]～[5]任一项中的DNA的表达载体；

[11]将上面[10]中的表达载体转入宿主而得的转化体；

[12]上述[11]中的转化体，其中宿主为哺乳类细胞株；

[13]一种生产具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性的多肽的方法，其特征在于在上述[10]中的表达载体可能表达的条件下培养上述[11]或[12]中的转化体；

[14]抗上述[6]～[8]任一项中的多肽的单克隆抗体；

[15]一种药用组合物，它含有小鼠PBSF/SDF-1，可用作AIDS发病的抑制剂或作为HIV-1感染抑制剂；

[16]表达上述[6]～[9]任一项中的多肽和人CD4蛋白质的细胞；

[17]一种筛选AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的方法，其特征在于包含下述的步骤：

(a)将表达上述[6]～[9]中任一项记载的多肽的细胞或上述[16]记载的细胞，人T细胞指向性HIV-1，和作为筛选对象的物质混合、然后温育得到的混合物，及

(b)分析HIV-1在该细胞中定位；

[18]上述[17]的方法，其中分析HIV-1定位的步骤用与抗亲人T细胞株HIV-1的单克隆抗体进行；

[19]AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的筛选方法，其特征在于包含下述的步骤：

(a)将表达上述[6]～[9]任一项中所述多肽的细胞或者上述[16]记载的细胞，表达HIV-1被膜蛋白的细胞；和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物，及

(b)测定表达HIV-1被膜蛋白质的细胞与该细胞的融合性的水平；

[20]AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂，或者该PBSF/SDF-1的激动剂或拮抗剂的筛选方法，其特征在于：

(a)将表达上述[6]～[8]任一项中记载的多肽的细胞或上述[16]记载的细胞，小鼠或人PBSF/SDF-1，和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物，及

(b)测定该细胞内的钙离子浓度，和/或测定表达的多肽与该小鼠或人PBSF/SDF-1的结合活性；

[21]上面[20]所述的方法，其中该拮抗剂为造血干细胞的释放剂；

[22]一种试剂盒，它包含表达上述[6]～[9]任一项中多肽的细胞或上述[16]所讲的细胞，用于检测AIDS发病或HIV-1感染；

[23]检测AIDS发病或HIV-1感染的方法，其特征在于包含：

(a)将表达上述[6]～[9]任一项中记载的多肽的细胞或上述[16]中记载的细胞，以及怀疑感染了HIV-1的患者血清，血细胞或血液混合，然后温育得到的混合物，及

(b)分析该细胞中HIV-1的分布，或检测HIV-1感染细胞与该细胞的融合性的水平。附图简述

图1示小鼠PBSF/SDF-1的cDNA碱基序列，和该碱基序列所编码的小鼠PBSF/SDF-1的氨基酸序列图。

图2表示实施例2中用Northern印迹法进行电泳的结果图，A是小鼠组织的mRNA的结果，B是小鼠胚胎的mRNA的结果。

图3是显示实施例6的结果的图。图中，横轴表示经过的时间，纵轴表示荧光强度的比值[(340nm的荧光强度)/(380nm的荧光强度)]。使用的细胞是不表达趋化因子受体的CHO细胞。

图4表示实施例6的结果。图中，横轴表示时间的经过，纵轴表示荧光强度的比[(340nm的荧光强度)/(380nm的荧光强度)]。使用的细胞是表达人趋化因子受体CC CKR2B的CHO细胞。

图5表示实施例6的结果。图中，横轴表示时间经过，纵轴表示荧光强度的比值[(340nm的荧光强度)/(380nm的荧光强度)]。所使用的细胞是表达小鼠趋化因子(PBSF/SDF-1)受体(小鼠CXCR4)的CHO细胞。

图6是表示实施例6结果的图。图中，横轴表示时间的经过，纵轴表示荧光强度的比[(340nm的荧光强度)/(380nm的荧光强度)]。使用的细胞是表达人趋化因子受体CXCR4/fusin/HUMSTSR的CHO细胞。

图7是表示实施例6结果的图。图中横轴表示经过的时间，纵轴表示荧光强度的比[(340nm的荧光强度)/(380nm的荧光强度)]。使用的细胞是表达小鼠CXCR4的CHO细胞。

图8是表示小鼠CXCR4通过亲人T细胞株HIV-1的env蛋白质支持膜融合的图。用表达人CD4、T7聚合酶、β-(gal)半乳糖的ω亚单位的重组牛痘病毒感染靶细胞NIH3T3。感染后用小鼠CXCR4、人CXCR4、人CCR5转染这些细胞。用表达来源于NL432或SF162的env蛋白质和β-半乳糖α亚单位的重组牛痘病毒感染效应细胞HeLaS3。将这些细胞进行细胞融合后，得到的融合产物用于β-gal分析。

图9表示小鼠CXCR4支持亲人T细胞株HIV-1病毒的感染。用人CD4和每一种趋化因子受体(小鼠CXCR4、人CXCR4、人CCR5、人CCR2b)转染SW480(A)细胞，分别感染HIV-1的NL432株、IIIB株、SF162株后，其细胞溶解物用于β-gal分析。

图10显示小鼠CXCR4支持亲人T细胞株HIV-1病毒的感染。用人CD4和每一种趋化因子受体(小鼠CXCR4、人CXCR4、人CCR5和人CCR2b)感染HOS细胞(B)。受到的转染细胞分别用HIV-1的NL432株、IIIB株和SF162株感染。然后，每种得到的感染细胞的细胞裂解物进行β-gal分析。

图11是表示小鼠CXCR4支持亲人T细胞株HIV-1病毒感染的图。用人CD4和每一种趋化因子受体(小鼠CXCR4、人CXCR4、人CCR5、人CCR2b)转染U87MG细胞(C)，得到的转染细胞分别感染HHIV-1的NL432株、III B株、SF162株后其细胞裂解物用于β-gal分析。

图12是表示嵌合前病毒克隆结构的模式图。将SF162的env或V3环整合到亲人T细胞株HIV-1 NL432的前病毒DNA中(E：EcoRI，Ba：BarmHI，St：StuI，Nh：NheI)。

图13表示被膜蛋白gp120的V3环对通过小鼠CXCR4的HIV-1进入是必须的。用HIV-1的NL432株、SF162株及嵌合前病毒-NL432env-162、NL432 V3-162感染表达人CD4和图中所示受体的SW480细胞。发明的最佳实施方案1.本发明的DNA

本发明的DNA只要是编码小鼠新型CXC趋化因子受体-小鼠PBSF/SDF-1的受体(小鼠CXCR4)的DNA，没有特定的限制，具体而言，如以下DNA所示。

1)编码多肽的DNA，该多肽包含由全部或部分序列表中序列号17所记载的氨基酸序列，或者是包含该多肽的多肽，其中任一种多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

2)编码多肽的DNA，该多肽是序列表的序列号17中记载的氨基酸序列的全部或其部分氨基酸序列中1个或多个的氨基酸残基缺失、添加、插入或取代的情况至少有一种发生，其中任一种多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

3)一种DNA，它是由序列表的序列号1中记载的全部或部分碱基序列构成的DNA，或者是含有该DNA的DNA，其中任一种DNAs编码的多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

4)一种DNA，它是序列表的序列号1中记载的全部或部分碱基序列的DNA，或是含有该DNA的DNA，其中1个以上的碱基缺失、添加、插入或取代的情况至少有一种发生，其中任一种DNA编码的多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

5)一种DNA，它是在严格条件下能与上述1)～4)任一项中的DNA进行杂交的DNA，编码具有与小鼠PBSF/SDF-1结合可能的受体活性的多肽。

另外，2)中所讲的“1个或多个的氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代”没有特定的限制，例如指1个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代。这里所讲的“几个”，指，如10个以下的个数。再有，4)中本发明的DNA碱基缺失、添加、插入或取代的程度为1个或多个碱基，优选1～数个。这里所说的“几个”指，如10以下的个数。另外，如果表达的多肽的功能或活性基本上在同一水平，那么也包括发生化学或生化学改变的，或者非天然或衍生的氨基酸残基和碱基。

本发明DNA的分离可这样进行：通过PCR扩增已知的趋化因子受体间有同源性的碱基序列，以该扩增片段作探针来筛选小鼠的cDNA文库等。

能在本发明中应用的实验方法为一般的分子生物学实验方法(DNA电泳，从胶中回收通过电泳分离出的DNA，连结，宿主的转化，重组宿主的培养，质粒DNA的制备，DNA限制性酶的酶切，DNA的放射线性标记等)，例如采用象分子克隆第2版(Maniatis等，冷泉港实验室，纽约(1989))所记载的方法、这些方法本领域内的技术人员众所周知的。

PCR中所应用的引物是在已报道的趋化因子受体中保守的氨基酸序列的基础上形成的，例如，在编码第2个跨膜区域的氨基酸序列的DNA序列的凝缩正向引物的5′端加入适宜的限制性酶位点，以及在编码第7个跨膜区氨基酸序列的DNA序列的凝缩反向引物的5′端加入适宜的限制性酶位点。这些引物可用DNA合成仪进行合成。

cDNA克隆所应用的小鼠mRNA，可用市售的mRNA纯化用试剂盒从小鼠B前体细胞株DW34(由京都大学的西川教授提供)等细胞中纯化得到。

另外，应用来源于小鼠CXCR4的cDNA的DNA片段可进行小鼠基因组DNA的克隆。

将所得cDNA的碱基序列和基因组DNA的碱基序列进行核酸同源性检索，如参照GenBank/EMBL/DDBJ DNA序列数据库，由此可推断所得cDNA是否编码趋化因子受体。所得cDNA的碱基序列在序列表的序列号1中表示。另外，由于序列表的序列号1中第120位～第1196位的碱基序列为最长的开放读码框架，因此应用针对GenBank、EMBL、DDBJ等数据库的DNA SIS(日立)、BLAST(Altschul.F.等，分子生物学杂志，215，403-410)等程序，对在该开放读码框架的碱基序列的基础上推定的氨基酸序列(序列表的序列号17)进行同源性检索，对本发明的DNA编码的多肽可进行进一步的检测。

结果推断具有序列表中序列号17所记载的氨基酸序列的多肽是包含趋化因子受体特征性的7个跨膜区的三聚体G蛋白耦合受体。另外，与已知的CXC趋化因子受体的氨基酸序列进行比较的结果证明人CXCR4/fusin/HUMSTSR为最类似的(同源率90％)。

另外，因为表达本发明的DNA的细胞具有趋化因子(小鼠PBSF/SDF-1)的受体活性和细胞内钙浓度上升的活性，所以可以明了本发明的DNA编码新型的小鼠转化因子受体，将该DNA所编码的蛋白质命名为小鼠CXCR4。

所谓“趋化因子”指如前所述白细胞对炎症反应局部显示趋化活性的诱因物质中，对游走的白细胞具有某种程度的选择性和具有特征性的4个半胱氨酸残基的多肽的家族。它们的氨基酸序列和生物活性存在相关性。趋化因子的4个半胱氨酸残基分别在第1和第3个残基间以及第2和第4个残基间以二硫键结合。第1和第2个半胱氨酸残基间含有1个其它氨基酸的为“CXC趋化因子”以区别于不含有其它氨基酸的趋化因子“CC趋化因子”。已知在一般情况下CC趋化因子趋化单核细胞不趋化中性粒细胞，CXC趋化因子趋化中性粒细胞而不趋化单核细胞。

“趋化因子受体”是指与上述趋化因子特异性结合的细胞膜蛋白质家族。趋化因子受体有氨基酸序列和结构上的相关性。趋化因子受体均有视紫红质家族特征性的7个跨膜结构域和与三聚体G蛋白质的结合结构域。根据对配体的特异性可将趋化因子受体分为2个亚组。与上述趋化因子中的CXC趋化因子特异性结合的为“CXC趋化因子受体”，与CC趋化因子特异性结合的为“CC趋化因子受体”以示区别。一般情况下，趋化因子受体与各自的配体结合的时候，有升高细胞内钙浓度的作用。最近阐明趋化因子受体不仅具有作为趋化因子受体的活性，而且具有与存在于细胞膜上的叫做CD4的分子协同作用的作为HIV-1受体的活性。

本说明书中，可测定针对小鼠PBSF/SDF-1的受体活性，比如如下测定。

用125I标记，例如应用BOLTON-HUNTER的试剂，或用碱性磷酸酶等酶标记小鼠CXCR4的配体PBSF/SDF-1多肽。将标记的PBSF/SDF-1肽加入到表达具有受体活性多肽的细胞悬液中，在一定的温度下培养。洗净后，通过测定标记量来确定与细胞结合的PBSF/SDF-1肽的量、因此测定受体活性。这里所应用的细胞有，例如小鼠B前体细胞株DW34，人胎儿肾细胞株293细胞，或者来源于中国仓鼠卵巢的、进行过表达小鼠CXCR4处理的CHO细胞等。

另外，本发明的多肽优选具有与配体结合时能升高细胞内钙离子浓度活性的。所讲活性，比如可如下测定。

用缓冲液洗净表达上述活性测定对象多肽的细胞后，悬浮到合适的缓冲液(例如，HBSS(20mM Hepes，pH7.4中包含125mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl₂、0.5mM葡萄糖和0.1％BSA)等)中。再加入受细胞内钙离子浓度影响的荧光试剂进行培养，得到标记细胞。用缓冲液洗净标记的细胞后，悬浮到适当的缓冲液中，通过加入成为配体的趋化因子时荧光强度的变化，可测定活性。

例如应用荧光试剂fura-PE3AM(德克萨斯荧光实验室)的时候，在激发波长为340nm和380nm，荧光波长为510nm，反应为0.5秒的条件下进行测定。然后求“激发波长340nm的荧光强度”与“激发波长380nm的荧光强度”的比值。因趋化因子的加入而使测定对象的细胞中细胞内钙离子浓度上升的时候，可看到该荧光强度的比值上升。另外通过加入不同种类的趋化因子可确认受体对配体的特异性。

另外，确认小鼠CXCR4的mRNA的存在，应用通常的特异的mRNA检测法进行。例如，应用反义RNA或cDNA作探针，通过Northern印迹分析或原位杂交的方法可检测mRNA。或者，用逆转录酶将mRNA转变为cDNA后，通过适当的引物组合进行PCR可检测出mRNA。2.本发明的多肽

本发明的多肽包括，例如如下：

1)由本发明的DNA所编码的多肽，具有与小鼠PBSF/SDF-1结合可能的受体活性的多肽。

2)一种多肽，它是由序列表的序列号17中的全部或部分氨基酸序列构成的多肽，或者是包含该多肽的多肽，其中任一种多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

3)一种多肽，它是序列表的序列号17的氨基酸序列的全部或部分氨基酸序列中，1个或多个的氨基酸残基缺失、添加、插入或取代至少有一种发生，其中所述的多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

4)上述1)～3)任一项中的多肽，它来源于小鼠B前体细胞株DW34。

在实施方案3)中，本发明的多肽中氨基酸残基的缺失、添加、插入或取代的程度为1个或多个，只要是有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性，突变的个数无限制。例如，1～几个突变。这里所讲的“几个”指，例如10以下的个数。另外，若多肽的功能或活性基本上在同一水平，那么也包括发生化学或生化改变的、或者非自然发生或衍生的氨基酸残基。

另外，本发明的多肽优选来自小鼠B前体细胞株DW34的。

本发明的多肽的存在可应用常规的特异蛋白质的检测方法进行确认。例如，应用小鼠CXCR4特异的抗体。通过常规的免疫沉降法或Western印迹法、FACS进行分析，由此进行确认。3.本发明的表达载体和转化体

本发明的表达载体，例如可通过将本发明的DNA接入pEFBOS、pCAGGStkNeo、pMX等众所周知的载体而得到。

另外，本发明的转化体可通过将本发明的表达载体导入所期望的宿主而得到。作为宿主没有特别的限定，但优选哺乳类细胞株。哺乳类细胞株，如小鼠B前体细胞株、人胎儿肾细胞株、来源于中国仓鼠卵巢的细胞株等，优选来源于仓鼠卵巢的细胞株。将表达载体导入宿主的方法，如可应用磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、电穿孔法等众所周知的方法。

另外，在上述表达载体可能表达的条件下培养上述的转化体，由此可生产具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性的多肽。如此生产的多肽可通过常规的色谱法或应用本发明的抗体进行亲和层析等方法很容易地进行纯化。4.本发明的单克隆抗体

本发明的单克隆抗体为针对本发明的小鼠CXCR4多肽的抗体和针对该多肽与人CXCR4/fusin/HUMSTSR的融合蛋白质的抗体。

这样的单克隆抗体可如下制备。

应用在本发明多肽的一部分氨基酸序列的基础上，由通常的肽合成仪合成的合成肽作为免疫原，或者应用表达小鼠CXCR4的载体转化的细菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞等所产生的小鼠CXCR4，以细胞的形式或用常规的蛋白质化学方法纯化所得的蛋白质作为免疫原。用这些免疫原免疫小鼠、大鼠、仓鼠、兔子等动物，从脾脏或淋巴结中取出细胞，与骨髓瘤细胞进行融合，依照koehler和Milstein等的方法(自然，256，495-497(1975)或其改良的Ueda等的方法(美国国家医学院院刊，79，4386-4390(1982)制作杂交瘤。所得杂交瘤能生产单克隆抗体。

更具体地讲，例如可通过以下步骤得到小鼠CXCR4的单克隆抗体。

(a)用小鼠CXCR4蛋白质免疫小鼠；

(b)摘取免疫小鼠的脾脏分离脾脏细胞；

(c)在融合促进剂(如，聚乙二醇)存在的条件下，按照上述koehler等记载的方法，将分离的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合；

(d)用非融合骨髓瘤细胞不能生长的选择培养基培养所得杂交瘤；

(e)用ELISA法和免疫电转移法选择所期望的生产抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释法进行克隆细胞；和

(f)回收抗小鼠鼠CXCR4的单克隆抗体。

另外，针对小鼠CXCR4和人CXCR4/fusin/HUMSTSR的融合蛋白质的单克隆抗体也包含在本发明中。

这样的单克隆抗体可这样得到：得到小鼠CXCR4和人CXCR4/fusin/HUMSTSR的融合蛋白质，以该蛋白质和其肽作免疫原，通过上述的方法得到。5.本发明的药用组合物和细胞

本发明的药用组合物含有小鼠PBSF/SDF-1，能用作AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂。

本发明的药用组合物可口服或非须口施用。也就是说可应用通常的施用方式，如可用片剂、囊剂、颗粒剂、散剂等口服施用的方式，或水剂、乳剂、悬浮剂、脂质体等用于肌内注射或皮下注射的方式，或者也可作为栓剂用于直肠。这些剂型可通过将本发明的有效成分与药用允许的常规载体、赋形剂、结合剂、稳定剂、缓冲剂、溶解辅助剂、等张剂等配合而进行制造。

施用量、施用次数随患者的症状、病史、年龄、体重、施用方式而有所差异，例如成人口服的时候，通常每天5-500mg，优选在10-100mg的范围内进行适当调整。可1次或分数次施用。

另外，本发明的细胞是表达上述本发明多肽的细胞，或者是该多肽和人CD4蛋白质二者均表达的细胞。

上述的细胞可如下得到。即，获得整合了编码小鼠CXCR4的多肽的载体。可使用pEFBOS、pCAGGS、pMX等众知的载体。然后将整合了上述多肽的载体导入表达用的细胞中，从而得到本发明的细胞。可例举来源于中国仓鼠卵巢的细胞株、CHO细胞、人类结肠癌细胞株、SW480细胞、人成骨细胞肉瘤细胞株、HOS细胞、人成胶质细胞株、U87MG细胞等作为表达用细胞。另外，可例举磷酸钙法和应用Lipofectin(GibcoBRL公司)、Lipofectamine(GibcoBRL公司)的方法作为载体的导入方法。

因为已经发现小鼠CXCR4为HIV-1的coreceptor所以本发明的细胞可用于AIDS发病抑制剂和HIV-1感染抑制剂、PBSF/SDF-1的激动剂和拮抗剂的筛选和AIDS发病或HIV-1感染的检测。6.本发明的筛选方法

本发明的筛选方法有AIDS发病抑制剂、HIV-1感染抑制剂、和小鼠或人PBSF/SDF-1的激动剂和拮抗剂的筛选方法。具体如下：

1)AIDS抑制剂或HIV-1感染抑制剂的筛选方法，其特征在于它包含这样的步骤：

(a)将上述记载的本发明的细胞，亲人T细胞株HIV-1，和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物；及

(b)分析HIV-1在细胞中的定位。

2)AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的筛选方法，其特征在于它包含：

(a)将上述记载的本发明的细胞，表达HIV-1被膜蛋白质的细胞，和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物；及

(b)测定表达HIV-1被膜蛋白质的细胞与该细胞的融合性。

3)AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂，或者该PBSF/SDF-1的激动剂或拮抗剂的筛选方法，其特征在于：

(a)将上述记载的本发明的细胞，小鼠或人的PBSF/SDF-1，和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物；及

(b)测定该细胞内的钙离子浓度，和/或测定表达的多肽与该小鼠或人PBSF/SDF-1的结合活性。

另外，可例举HIV-1 IIIB株(由熊本大学的原田教授提供)和HIV-1NL432株(由德岛大学的足立教授提供)作为亲人T细胞HIV-1。实施方案1)

更优选应用针对亲人T细胞株HIV-1的单克隆抗体来进行分析HIV-1区域性的步骤。

应用所讲单克隆抗体的分析方法没有特定的限制，可应用通常的任何一种公知的方法。

另外，作为分析HIV-1分布的方法也可应用如下所述的酶法。

即，该方法中应用的“本发明的细胞”为优选应用在HIV-1基因表达启动子LTR的下游导入了酶(例如：β-半乳糖苷酶，虫荧光素酶、CAT等)。表达人CD4蛋白质和共受体的细胞(例如SW480，U87MG、HOS等)。HIV-1感染上述细胞的时候，细胞表达一种病毒蛋白质-tat蛋白质，它能激活LTR。因此通过测定细胞溶解物中所包含的酶活性可确定感染量。实施方案2)

表达HIV-1被膜蛋白质的细胞可例举向HeLaS3导入了HIV-1被膜蛋白质基因的细胞，而再导入了β-半乳糖苷酶亚基(α或ω中的任一个)基因的则更优选应用。另外，“本发明的细胞”为，例如优选NIH3T3中导入了人CD4蛋白质和co-receptor、又导入了如β-半乳糖苷酶亚基(α或ω中任一个，与导入表达HIV-1被膜蛋白的细胞中的不同)基因的细胞。当表达HIV-1被膜蛋白质的细胞与本发明的细胞进行细胞融合的时候，β半乳糖苷酶的α亚基和ω亚基联合，成为有活性的β-半乳糖苷酶。因此将两细胞混合培养后，通过测定细胞溶解物中所含半乳糖苷酶活性，可测定细胞融合量。实施方案3)

(a)步骤中进行培养的结果，发现升高细胞内钙离子浓度活性的时候，对象物质有为激动剂的可能性。看不到升高细胞内钙离子浓度活性而能看到对象物质与受体结合的时候，对象物质有为拮抗剂的可能性。另外，小鼠PBSF/SDF-1的升高细胞内钙离子浓度的活性和/或与受体结合的活性受到影响的时候，即抑制活性的时候，对象物质有为拮抗剂的可能性。此外，该释放剂以造血干细胞为例。7.检测试剂盒及检测方法

本发明的用于检测AIDS发病或HIV-1感染的试剂盒，以包含本发明的细胞为特征。

应用所讲的试剂盒可简便地检测AIDS发病或HIV-1感染。本发明的试剂盒是利用以下所示的本发明的检测方法而进行检测的。

另外，本发明的检测AIDS发病或HIV-1感染的方法，其特征在于，它包括

(a)将上述的本发明的细胞、和怀疑感染了HIV-1患者的血清、血细胞或血液混合，然后温育得到的混合物，和

(b)分析该细胞中HIV-1的分布，或者测定HIV-1感染细胞与该细胞融合性的水平。

这里可例举AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂中应用的方法作为分析HIV-1分布的方法。另外，可例举应用于AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的方法作为测定HIV-1感染细胞和该细胞融合性的方法。再者，(b)中的“HIV-1感染细胞”为HIV-1感染的疑为感染了HIV-1的患者的血细胞。8.本发明的实用性

本发明的小鼠CXCR4和人CXCR4/fusin/HUMSTSR共同与小鼠PBSF/SDF-1进行反应。因为小鼠和人PBSF/SDF-1的71个氨基酸中只有一个氨基酸有差异，所以期待小鼠CXCR4也与人PBSF/SDF-1结合。因为人PBSF/SDF-1能抑制通过CXCR4/fusin/HUMSTSR介导的亲T细胞株HIV-1的感染，所以与本发明的抗小鼠CXCR4蛋白质的抗体，以及小鼠CXCR4与抗人CXCR4/fusin/HUMSTSR的细胞外功能区相互替换而得到的具有T细胞株指向性HIV-1结合部位的嵌合蛋白质的抗体可作为HIV-1的感染抑制剂，即作为AIDS的治疗药物应用。

另外，通过应用本发明所提供的筛选小鼠CXCR4蛋白质以及小鼠CXCR4与人CXCR4/fusin/HUMSTSR的细胞外功能区相互取代而得到的嵌合蛋白质的激动剂、拮抗剂的筛选方法而得到的激动剂、拮抗剂可作为HIV-1的感染抑制剂，即作为AIDS的治疗药物应用。

以下通过实施例对本发明进行更详细地说明，但本发明丝毫不受实施例限制。实施例1  小鼠CXCR4 cDNA的克隆(1)引物的合成

在已知的趋化因子受体氨基酸序列的基础上，用DNA合成仪(Cyclone Plus，Nippon Millipore)合成与编码第2个跨膜区域氨基酸序列的DNA序列相对应的浓缩正向引物-C2F2-2(序列表中序列号5)，与编码第7个跨膜区氨基酸序列的DNA序列相对应的浓缩反向引物CAR1(序列表中序列号6)。(2)从小鼠B前体细胞株DW34纯化mRNA

将小鼠B前体细胞株悬浮到RPMI 1640培养基中，培养一周后，用Dulbecco PBS(-)(Nissui)洗净，用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)纯化mRNA.(3)小鼠CXCR4的cDNA片段的克隆

用Ready-To-Go T-Primed First-Strand kit(Pharmacia)从200ng由小鼠B前体细胞株DW34纯化的mRNA合成单链cDNA。以该单链cDNA作模板，应用引物C2F2-2和C4R1、耐热性Taq DNA聚合酶进行PCR反应(94℃ 0.5分钟，55℃ 0.5分钟，72℃ 1分钟的条件下30个循环)。用低融点琼脂糖凝胶电泳分离所得的反应液，切出目的大小(约690bp)的DNA带，用Wizard PCR Preps DNA纯化系统(Promega)纯化DNA片段。用DNA连接试剂盒(Takara)将所得DNA片段插入到pT7Blue载体中。用PRISM Ready Reaction序列试剂盒(Applied Biosystems)和DNA测序仪(Applied Biosystems)测定所插入DNA的碱基序列。所得小鼠CXCR4的cDNA序列如序列表中序列号2所示。在如上所得的小鼠CXCR4 cDNA序列的基础上合成序列表中序列号7和序列号8所示的引物，应用Marathon cDNA扩增试剂盒(Clontech)，以如上所得的DW34细胞的cDNA作模板获得含有5′末端的cDNA克隆。所得小鼠CXCR4的cDNA序列如序列表中序列号3所示。实施例2 小鼠CXCR4在各组织中的表达(1)探针的制作

为了检测小鼠CXCR4在小鼠各组织中的表达，首先如下制作探针。在小鼠CXCR4基因碱基序列的基础上，合成与第2个跨膜区域部分相对应的正向DNA序列(序列表中序列号15)和与第7个跨膜区部分相对应的反向DNA序列(序列表中序列号16)作为引物，然后用于PCR。以上述实施例1(3)中得到的碱基序列的cDNA作模板，用Taq聚合酶，在94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟的条件下进行30个循环的PCR反应。用琼脂糖凝胶电泳分离PCR反应产物，切出目的大小(690bp)的DNA带，用Wizard PCR Preps DNA纯化系统来纯化DNA。用Prime-ItII随机引物标记(Stratagene)³²P标记所得的DNA片段50ng，用作探针。(2)小鼠组织和小鼠胚胎的Northern印迹分析

用电泳分离各种小鼠组织的mRNA和胚胎形成后第7天、第11天、第15天、第17天的小鼠胚胎的mRNA，应用转移了的膜和上述(1)中所得的探针进行杂交。将膜浸入含有0.05％ SDS的2×SSC中，室温15分钟洗涤2次后，再浸入含0.1％SDS的0.1×SSC中，50℃ 20分钟洗2次。通过放射自显影检测膜的放射线。结果如图2的A(小鼠组织)和B(小鼠胚胎)所示。从带的强度可以明了，在胸腺淋巴结、脾脏中得到强信号，在脑、小肠、胃、肾脏得到弱信号。另外在小鼠胚胎中全部得到强信号。实施例3 小鼠CXCR4的基因组DNA的克隆(A)探针的制作

在上述实施例1(3)中所得的CXCR4的cDNA碱基序列的基础上，合成合适的正向和反向引物，然后用于PCR。从上述实施例1(3)中得到的cDNA得到双链DNA，以该双链DNA为模板，用Taq聚合酶进行PCR反应，用琼脂糖电泳进行分离反应产物，切出目的大小(约690bp)的DNA带，纯化DNA片段。用Prime-ItII随机引物标记试剂盒(Stratagene)以³²P标记所得的DNA片段50ng，用作探针。(B)小鼠基因组文库的克隆

首先，用整合到噬菌体载体λFIXII中的129/svJ小鼠肝脏基因组文库感染大肠杆菌，作为首次筛选是这样的：接种到平皿形成噬斑后，转移到尼龙膜上(DuPont)。将尼龙膜浸入到预杂交液(5×SSPE(0.9MNaCl、0.05M磷酸钠pH7.7、0.005M Na₂EDTA)、50％甲酰胺、5×Denhardt’s液，50μg/ml鲑精DNA、0.1％SDS)进行预杂交后，与上述(A)中所得的探针浸入到杂交液(5×SSPE、50％甲酰胺、1×Denhardt’s液、10％葡聚糖硫酸二钠、50μg/ml鲑精DNA、0.1％SDS)中42℃杂交15小时。洗净膜后，检测放射活性，筛选产生信号的阳性克隆，逐步稀释进行第二次和第三次筛选，筛选出2个信号克隆。

用各种限制性酶酶切克隆的噬菌体DNA，用琼脂糖凝胶电泳进行分离，带的图型相同的为同一克隆，重复进行同样的杂交，可得到尽可能小的阳性带，用限制性酶进行酶切。将选择的阳性DNA片段插入到pBluescripts KSII载体中，通过双脱氧法测定碱基序列。所得小鼠CXCR4基因的DNA序列如序列表中序列号4所示。另外从序列表中序列号3所示的碱基序列和序列表中序列号4所示的碱基序列发现包含最长的开放阅读框架的碱基序列，该碱基序列如序列表中序列号1所示。于是用GenBank/EMBL/DDBJ DNA序列数据库对序列表中序列号1所示的碱基序列进行核酸同源性的检索。检索结果表明所得克隆为编码新型小鼠趋化因子受体的DNA，将之命名为小鼠CXCR4。实施例4 小鼠CXCR4氨基酸序列的同源性分析

在小鼠CXCR4碱基序列的基础上推断的氨基酸序列(序列表中序列号17)推断为含有趋化因子受体特征性的7个跨膜结构域的三聚体G蛋白质耦合型受体。将其氨基酸序列与已知的CXC趋化因子受体的序列相比较(用GenBank、EMBL、DDBJ作数据库，用BLAST进行分析)。结果与人CXCR4/Fusin/HUMSTSR最相似(同源率90％)，与猴CXCR4，牛CXCR4的同源率分别为89％、86％、与大鼠IL-8RB、兔子IL-8RA、兔子IL-8RB的同源率分别为49％、47％和45％。实施例5 小鼠CXCR4以及人CXCR4/Fusin/HUMSTSR的表达(1)制作小鼠CXCR4、人CCCKR2B和人CXCR4/Fusin/HUMSTSR的表达载体

为了克隆已报道的人趋化因子受体CC CKR2B的基因和CXCR4/Fusin/HUMSTSR的基因，应用人单核细胞株THP-1的cDNA进行如下的PCR反应。用THP-1细胞的cDNA 500ng作模板，用序列表中序列号11和12所示的引物来扩增人CXCR4/Fusin/HUMSTSR，序列表中序列号9和10中所示的引物用于扩增CC CKR2B，每种引物的量分别用500ng。用Taq聚合酶(宝酒造)作为进行反应的酶。反应在94℃3分钟进行1个循环后，在94℃ 1分钟、55℃ 2分钟、72℃ 3分钟的条件下进行35个循环，再在37℃反应3分钟。将该反应中得到的人CXCR4/Fusin/HUMSTSR和CC CKR2B的基因片段分别整合到pCRII(Invitrogen)的TA克隆部位。将如此得到的质粒分别命名为pCRII CXCR4和pCRII CC CKR2B。然后，分别用NotI和XboI(均为宝酒造公司)消化所得的pCRII CXCR4和pCRII CC CKR2B质粒之后，整合到pCAGGStkNeo的NotI/XboI部位。将如此得到的质粒分别命名为pCAN CXCR4和pCANCC CKR2B。

为了克隆小鼠CXCR4的基因，以上述实施例1(3)中所得到的序列表中序列号3所示的小鼠B前体细胞株DW34的单链cDNA作模板进行PCR。用100ng cDNA作模板，用序列表中序列号13和14中所示的引物。进行反应的酶用ExTaq(宝酒造)。反应在94℃ 3分钟进行1个循环后，在94℃ 1分钟，55℃ 1分钟、72℃ 2分钟的条件下进行20个循环，再在72℃进行5分钟的反应。用NotI和XhoI(宝酒造)消化所得的小鼠CXCR4基因片段，之后，整合到pCAGGStkNeo的NotI/XboI部位。将如此得到的质粒命名为pCANmPBSFR。(2)小鼠CXCR4、人CXCR4/Fusin/HUMSTSR、人CC CKR2B在CHO细胞中的表达

在直径10cm的细菌培养用皮氏平皿(岩城硝子社)中、37℃、10％CO₂存在的条件下将CHO细胞培养1天。分别将30μg在上面(1)中得到的3种趋化因子受体的表达载体(pCANmPBSPR、pCANCXCR4和pCANCC CKR2B)的DNA溶解到25μl蒸馏水中，然后加入500μl的250mM氯化钙(nacalaitesque)。向DNA和氯化钙的混合液中加入500μl的2×BBS溶液(50mM BES(SIGMA)，280mM氯化钠(nacalaitesque)和1.5mM磷酸氢二钠(nacalaitesque)后，室温静置25分钟。将如此配制的DNA溶液滴入培养CHO细胞的平皿中，37℃、3％CO₂存在的条件下培养20小时，DNA导入细胞中。用3ml PBS(+)洗涤导入了DNA的细胞，洗2次之后，加入10ml含10％FCS的α-MEM(GIBCO)，37℃、5％CO₂存在的条件下培养1天。

然后将细胞悬浮引向含有10％FCS的α-MEM(GIBCO)培养基中加入了2mg/ml GENETICIN(和光纯药工业社)的培养基中，以5×10³个/平皿分到直径10cm的细胞培养用平氏培养皿中(岩城硝子)。在37℃10％CO₂存在的条件下继续培养，耐GENETICIN的细胞用于作为表达小鼠CXCR4，人CXCR4/Fusin/HUMSTSR和CC CKR2B的CHO细胞的细胞内钙浓度的测定。如下面的实施例6所示，由于CC CKR2B因加入特异配体MCP-1而具有使细胞内钙浓度上升的活性，所以可以证实受体的表达，另外，因为应用了与CC CKR2B相同的细胞株进行了同样的转化和培养，所以认为小鼠CXCR4和人CXCR4/Fusin/HUMSTSR同样地表达。实施例6(小鼠CXCR4的生物活性)

Dulbecco PBS(-)洗净上述实施例5(2)中得到的表达小鼠CXCR4和人趋化因子受体(CXCR4/Fusin/HUMSTSR和CC CKR2B)的CHO细胞后，以5×10⁶个/ml悬浮到HBSS缓冲液(20mM Hepes，pH7.4中含有125mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl₂，0.5mM葡萄糖和0.1％BSA)中，由加入浓度达2.5μM的Fura-PE3AM(德克萨斯荧光实验室)，37℃温育30分钟。用HBSS缓冲液洗净后，将每种趋化因子受体的表达细胞再以5×10⁸个/ml悬浮到同种缓冲液中。向所得趋化因子受体表达细胞的悬浮液各500μl中加入趋化因子(小鼠PBSF/SDF-1或人MCP-1)，当分别达到100nM的时候，测定荧光强度的变化，用荧光分光光度计(LS50B，PERKINELMER)，在激发波长为340nm和380nm，荧光波长为510nm，反应0.5秒的条件下进行测定。其结果为随时间的经过340nm和380nm荧光强度的比值，如图3-6所示。

在小鼠PBSF/SDF-1刺激下可看到在小鼠CXCR4和人CXCR4/Fusin/HUMSTSR的表达细胞中荧光强度的比值上升，在CC趋化因子受体CC CKR2B的表达细胞中未发现荧光强度的比值升高。另外，用受体的阳性克隆MCP-1肽进行刺激的时候，发现CC CKR2B表达细胞中荧光强度的比值上升。因此，可以明确小鼠PBSF/SDF-1具有对本发明的小鼠CXCR4和人CXCR4/Fusin/HUMSTSR的表达细胞CHO细胞特异的升高细胞内钙离子浓度的活性。另外，如图7中所示在小鼠CXCR4表达细胞中发现随着小鼠PBSF/SDF-1的连续增添荧光强度的比值不发生变化的脱敏作用。脱敏作用在添加阴性对照人MCP-1时未发现。该结果证实，本发明的受体为小鼠PBSF/SDF-1的受体。实施例7材料与方法

细胞系：小鼠NIH3T3细胞，来源于人小肠上皮的SW480细胞，来源于人神经胶质细胞的U87MG，在含有10％FCS的DMEM中培养。人的HeLaS3细胞在含有10％FCS的RPMI 1640培养基中培养。来源于人成骨细胞的HOS细胞在含有1％非必需氨基酸(Gibco)和10％FCS的Eagle MEM中培养。

病毒：HIV-1的NL432株由足立教授(德岛大学)提供。IIIB株由原田教授(熊本大学)提供。SF162株由J.A.Levy教授(加州旧金山大学)提供。HIV-1的嵌合病毒克隆、NL432env-162和NL432V3-162由井阪(盐野义制药)提供。基因重组牛痘病毒Vac.Env(NL432 env)、Vac.Env162(SF162 env)、Vac T4(CD4)由盐田教授(东京大学)提供。L0-T7(T7聚合酶)由M.Kohara(都立临床研)提供。

细胞的转染：以每孔5×10⁴个细胞的细胞密度在24孔板中将NIH3T3细胞培养过夜，用Lipofectamine(Gibco)转染整合到pBluescript的趋化因子受体基因。转染开始后第4个小时，用PBS洗涤细胞，添加培养液后在37℃培养过夜，用于融合分析。在6cm平皿中的以5×10⁵细胞的细胞密度将SW 480细胞和HOS细胞培养过夜。通过改良的磷酸钙法，用整入pEF-BOS的受体基因5μg、表达CD4的载体T4-Neo 7.5μg、LTR(EcoRV)-β-Gal-Neo 2.5μg的质粒混合物转染SW480细胞。用同样的方法将15μg整合到pEF-BOS的受体基因转染到恒定表达人CD4和LTR-Gal的HOS细胞中。在3％CO₂存在的条件下于35℃将细胞培养过夜，用PBS(-)洗净后，用含有0.5mM EDTA的PBS回收，之后接种到12孔板上，37℃培养过夜用于感染分析。

细胞融合分析：为了对细胞融合进行定量，我们使用了利用β-半乳糖苷酶(β-gal)的α-互补作用的改良型细胞融合分析法(志田等，稿件准备中)。

通过基因重组牛痘病毒将β-gal的α-亚基和env蛋白质导入效应细胞HeLaS3细胞(24孔板，1×10⁵细胞/孔)。

通过基因重组的牛痘病毒将人CD4、β-gal的ω-亚基，T7DNA聚合酶导入靶细胞NIH3T3细胞(24孔板，5×10⁴细胞/孔)，用Lipofectamine将趋化因子受体转染靶细胞。转染后第16小时，在含有0.5mM CaCl₂的PBS中洗涤效应细胞和靶细胞，为了抑制由牛痘病毒引起的非特异性细胞融合，用抗牛痘病毒的抗体2D5进行处理。将效应细胞悬浮到含有3mM CaCl₂的Hanks缓冲液(pH7.6)中，铺到24孔板中的靶细胞上，之后1000rpm离心5分钟以开始融合。

离心后在5％CO₂存在下，37℃将细胞培养12小时。发生细胞融合的时候，融合细胞的细胞质中所包含的β-gal的α亚基与ω-亚基联合，通过α-互补作用成为活化的β-gal酶。所以除去培养液后，每孔加入200μl的包含8mM的β-gal的  底物氯酚红-b-D-半乳糖吡喃糖苷(Boehringer Mannheim)、45mM的2-巯基乙醇、1mMMgCl₂、100mM Hepes pH8.0、0.5％NP40、DNAase I 0.1mg/ml的溶液，37℃反应30分钟后，每孔加入200μl的2％SDS以终止反应。在波长590nm处测定吸光度以对反应液中β-gal的活性进行定量。

感染分析：在12孔板中培养表达人CD4和受体的人SW480或HOS细胞。各孔中加入含有HIV-1病毒的培养液(逆转录酶(RT)的活性为：SF162：2×10⁶RT/mL；NL432env162、NL432V3-162、IIIB：5×10⁶RT/mL；NL432：3×10⁶RT/mL)，5％CO₂存在的条件下、37℃培养2小时后，每孔添加2.5ml的培养液。感染后第4日每孔加入400μl的报道基因裂解缓冲液(Promega)，-80℃冻融。将融解的标本移入Eppendorf管中，4℃12000rpm离心5分钟后，用发光性β-gal检测试剂盒(Clontech)测定上清中包含的β-gal活性。结果

首先，第一步，为了检测小鼠CXCR4是否支持env介导的HIV-1的膜融合，我们通过表达env蛋白质的效应细胞(HeLaS3细胞)和表达人CD4和受体的靶细胞(NIH3T3细胞)的融合，应用上述能引起β-gal活化的分析系统进行了实验。该分析方法中，效应细胞HeLaS3细胞感染基因重组的牛痘疫苗以表达β-Gal的α-亚基和HIV-1的env蛋白质，靶细胞NIH3T3细胞感染基因重组的牛痘疫苗以表达β-Gal的ω-亚基、T7聚合酶和人CD4。感染病毒后再将包含人CXCR4、人CCR5或小鼠CXCR4的质粒转染NIH3T3细胞。培养过夜后，将效应细胞和靶细胞混合培养。发生细胞融合的时候融合细胞的细胞质中包含的β-Gal的α亚基和ω亚基联合，β-Gal活化。如图8所示，表达来源于亲T细胞HIV-1 NL432的env蛋白质的HeLaS3细胞与表达人CXCR4和人CD4的NIH3T3细胞融合，但与表达人CCR5和人CD4的NIH3T3细胞不融合。

奇怪的是表达来源于NL432的env蛋白质的HeLaS3细胞同样与表达小鼠CXCR4和人CD4的细胞发生融合。表达来源于亲单核细胞HIV-1 SF162的env蛋白质的HeLaS3细胞与表达人CCR5和人CD4的NIH3T3细胞融合，但不与表达人或小鼠CXCR4和人CD4的NIH3T3细胞发生融合。

第二我们探讨了表达小鼠CXCR4的细胞是否能被病毒感染。由于表达人CXCR4和CD4的小鼠细胞NIH3T3细胞中HIV-I的复制效率低，所以应用来源于人小肠上皮细胞的SW480细胞。来源于成骨细胞的HOS细胞和来源于神经胶质细胞的U87MG细胞3种人细胞株作为病毒感染的靶细胞。用以HIV-1的LTR作启动子的报告基因(lacZ)转染这些细胞。细胞感染了病毒时就表达来源于HIV-1的转录活化因子Tat蛋白，该蛋白作用于LTR诱导LacZ的表达。再将人CD4和趋化因子受体转染这些细胞后，细胞感染亲T细胞株病毒株(NL432、IIIB)或者感染亲单核细胞病毒株(SF162)。如图9所示，NL432和IIIB同样既感染表达小鼠CXCR4和人CD4的SW480，又感染表达人CXCR4和人CD4的SW480。该结果与上述融合分析的结果一致。但是，当表达人CCR2b和CCR5而非CXCR4时这些病毒不感染这些细胞。

另一方面，SF162感染表达人CCR5和人CD4的SW480，但不感染表达小鼠CXCR4和人CD4的细胞和表达人CXCR4和人CD4的细胞。另外，当HOS细胞和U87MG细胞取代SW480细胞时得到同样的结果(图10和图11)。也就是说，这暗示了小鼠CXCR4支持亲T细胞株HIV-1进入靶细胞，而在人细胞中不影响原病毒的DNA合成、整合到基因组DNA、病毒的表达。

可是，证明人CXCR4介导的HIV-1进入被抗env蛋白的V3环的单抗抑制。于是，为了证实小鼠CXCR4的功能是否与人CXCR4的相同，我们探讨了(亲T细胞病毒株的)env蛋白(gp120)的V3环是否对小鼠CXCR4介导的HIV-1进入也必要。为此我们让表达人CD4和趋化因子受体的SW480细胞感染NL432和SF162的嵌合病毒克隆-NL432env-162或NL432V3162。如图12所示，NL432env-162为亲T细胞病毒株NL432的env区被亲单核细胞HIV-1 SF162的所替代的原病毒，NL432V3-162为NL432的env的V3环被SF162的所替代的原病毒。NL432感染表达小鼠CXCR4和人CD4的SW480，而NL432env-162和NL432V3-162不感染这些细胞(图13)。

另一方面，NL432env-162和NL432V3-162感染表达人CCR5和人CD4的SW480细胞(图13)，这些结果表明与人CXCR4的情况相同，在小鼠CXCR4的情况下NL432的env的V3环对病毒的进入是必要的。讨论

从以上的研究可以证明，小鼠CXCR4支持亲T细胞株HIV-1的env介导的细胞膜融合和亲T细胞株HIV-1的感染。这些结果提示小鼠CXCR4对HIV-1的感染并非种特异性的屏障。目前的研究中阐明表达人CD4的NIH3T3和T细胞克隆3DT等小鼠淋巴细胞或非淋巴细胞株，引起HIV-1的吸附但不起引起其进入。对于该结果的一种解释是表达人CD4的小鼠细胞表示未表达CXCR4。事实上，小鼠PBSF/SDF-1的刺激未诱导NIH3T3细胞的细胞内钙浓度的变化。但是小鼠CXCR4表达于CD4和CD8共阳性的胸腺细胞和CD4或CD8单阳性的胸腺细胞上。因此确定实验用的3DT细胞是否表达CXCR4是很重要的(验证上述的解释是否正确)。

最近的研究表明亲单核细胞HIV-1受体人CCR5的小鼠同源体(小鼠CCR5)并不支持HIV-1的进入。该结果提示亲单核细胞HIV-1相对的受体与亲T细胞株HIV-1相对的受体间种特异性不同。与含有CCR5的其它趋化因子受体相比较，CXCR4的氨基酸序列在种间高度保守，也许这就是造成差异的原因。小鼠CXCR4的氨基酸序列和人CXCR4的90％一致，但CCR5和CCR2在小鼠和人中的一致性分别只有82％、71％CXCR4的种间高度保守反映了这样一个事实：当与CCR5的配体MIP-1α、MIP-β、RANTES等其它趋化因子相比较时，CXCR4的配体PBSF/SDF-1具有独特的功能与认为PBSF/SDF-1以外的趋化因子与炎症中白细胞的游走相关相对，PBSF/SDF-1具有对造血和心脏形成等生物体发育所必须的功能。

从目前的研究和这样一事实：表达人CD4和趋化因子受体的小鼠细胞株NIH3T3支持HIV-1的进入，但与人细胞相比较，病毒颗粒的产生效率低，考虑到小鼠细胞中缺少HIV-1复制所必需的细胞内分子。但是通过制作导入能引起种特异性屏障的分子-人基因的转基因小鼠，可以开发HIV-1感染的模型小鼠。我们的结果表明将人CXCR4基因导入HIV-1感染的模型小鼠中是不必要的。另外，CXCR4的生理性表达适于研究引起AIDS发病的由亲单核细胞HIV-1向亲T细胞株HIV-1移行的启动和进程，所以对于开发能模拟HIV-1感染全过程的动物模型提供了有益的信息。产业上的利用可能性

本发明可提供对AIDS的治疗药和HIV-1感染的作用机制的研究有用的新型小鼠CXC趋化因子受体基因，该基因编码的多肽，该多肽的表达载体，导入了该表达载体的转化体，抗前述的多肽的单克隆抗体，还有用前述的转化体生产前述的多肽的方法，再者，提供前述受体的激动剂或拮抗剂的筛选方法，以及HIV-1感染抑制剂的筛选方法。

                       序列表SEQ ID NO：1

序列长度：1877

序列类型：核酸

链型：双链

拓扑结构：线性

分子类型：cDNA→mRNA

原始来源

生物：小鼠

序列描述：CCATCCTAAT ACGACTCACT ATA  23GGGCTCGAGC GGCCGCCCGG GCAGGTGCAG GTAGCAGTGA CCCTCTGA  71GGCGTTTGGTGCTCCGGTAACCACCACGGCTGTAGAGCGAGTGTTGCC 119ATGGAACCGATCAGTGTGAGTATATACACTTCTGATAACTACTCTGAA 167MetGluProIleSerValSerIleTyrThrSerAspAsnTyrSerGlu1           5             10             15GAAGTGGGGTCTGGAGACTATGACTCCAACAAGGAACCCTGCTTCCGG 215GluValGlySerGlyAspTyrAspSerAsnLysGluProCysPheArg

      20             25             30GATGAAAACGTCCATTTCAATAGGATCTTCCTGCCCACCATCTACTTC 263AspGluAsnValHisPheAsnArgIlePheLeuProThrIleTyrPhe

   35             40             45ATCATCTTCTTGACTGGCATAGTCGGCAATGGATTGGTGATCCTGGTC 311IleIlePheLeuThrGlyIleValGlyAsnGlyLeuValIleLeuVal

50             55             60ATGGGTTACCAGAAGAAGCTAAGGAGCATGACGGACAAGTACCGGCTG 359MetGlyTyrGlnLysLysLeuArgSerMetThrAspLysTyrArgLeu65             70             75             80CACCTGTCAGTGGCTGACCTCCTCTTTGTCATCACACTCCCCTTCTGG  407HisLeuSerValAlaAspLeuLeuPheValIleThrLeuProPheTrp

         85             90             95GCAGTTGATGCCATGGCTGACTGGTACTTTGGGAAATTTTTGTGTAAG  455AlaValAspAlaMetAlaAspTrpTyrPheGlyLysPheLeuCysLys

     100            105            110GCTGTCCATATCATCTACACTGTCAACCTCTACAGCAGCGTTCTCATC  503AlaValHisIleIleTyrThrValAsnLeuTyrSerSerValLeuIle

  115            120            125CTGGCCTTCATCAGCCTGGACCGGTACCTCGCCATTGTCCACGCCACC  551LeuAlaPheIleSerLeuAspArgTyrLeuAlaIleValHisAlaThr130            135            140AACAGTCAAAGGCCAAGGAAACTGCTGGCTGAAAAGGCAGTCTATGTG  599AsnSerGlnArgProArgLysLeuLeuAlaGluLysAlaValTyrVal145            150            155            160GGCGTCTGGATCCCAGCCCTCCTCCTGACTATACCTGACTTCATCTTT  647GlyValTrpIleProAlaLeuLeuLeuThrIleProAspPheIlePhe

        165            170            175GCCGACGTCAGCCAGGGGGACATCAGTCAGGGGGATGACAGGTACATC  697AlaAspValSerGlnGlyAspIleSerGlnGlyAspAspArgTyrIle

     180            185            190TGTGACCGCCTTTACCCCGATAGCCTGTGGATGGTGGTGTTTCAATTC  743CysAspArgLeuTyrProAspSerLeuTrpMetValValPheGlnPhe

  195            200            205CAGCATATAATGGTGGGTCTCATCCTGCCCGGCATCGTCATCCTCTCC  791GlnHisIleMetValGlyLeuIleLeuProGlyIleValIleLeuSer210            215            220TGTTACTGCATCATCATCTCTAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAG  839CysTyrCysIleIleIleSerLysLeuSerHisSerLysGlyHisGln225            230            235            240AAGCGCAAGGCCCTCAAGACGACAGTCATCCTCATCCTAGCTTTCTTT  887LysArgLysAlaLeuLysThrThrValIleLeuIleLeuAlaPhePhe

        245            250            255GCCTGCTGGCTGCCATATTATGTGGGGATCAGCATCGACTCCTTCATC  935AlaCysTrpLeuProTyrTyrValGlyIleSerIleAspSerPheIle

     260            265            270CTTTTGGGAGTCATCAAGCAAGGATGTGACTTCGAGAGCATTGTGCAC  983LeuLeuGlyValIleLysGlnGlyCysAspPheGluSerIleValHis

  275            280            285AAGTGGATCTCCATCACAGAGGCCCTCGCCTTCTTCCACTGTTGCCTG  1031LysTrpIleSerIleThrGluAlaLeuAlaPhePheHisCysCysLeu290            295            300AACCCCATCCTCTATGCCTTCCTCGGGGCCAAGTTCAAAAGCTCTGCC  1079AsnProIleLeuTyrAlaPheLeuGlyAlaLysPheLysSerSerAla305            310            315            320CAGCATGCACTCAACTCCATGAGCAGAGGCTCCAGCCTCAAGATCCTT  1127GlnHisAlaLeuAsnSerMetSerArgGlySerSerLeuLysIleLeu

        325            330            335TCCAAAGGAAAGCGGGGTGGACACTCTTCCGTCTCCACGGAGTCAGAA  1175SerLysGlyLysArgGlyGlyHisSerSerValSerThrGluSerGlu

     340            345            350TCCTCCAGTTTTCACTCCAGCTAACCCTTATGCAAAGACTTATATAAT  1223SerSerSerPheHisSerSer

  355         359ATATATATATATATGATAAAGAACTTTTTTATGTTACACATTTTCCAG  1271ATATAAGAGACTGACCAGTCTTGTACAGTTTTTTTTTTTTTTTAATTG  1319ACTGTTGGGAGTTTATGTTCCTCTAGTTTTTGTGAGGTTTGACTTAAT  1367TTATATAAATATTGTTTTTTGTTTGTTTCATGTGAATGAGCGTCTAGG  1415CAGGACCTGTGGCCAAGTTCTTAGTAGCTGTTTATCTGTGTGTAGGAC  1463TGTAGAACTGTAGAGGAAGAAACTGAACATTCCAGAATGTGTGGTAAA  1511TTGAATAAAGCTAGCCGTGATCCTCAGCTGTTGCTGCATAATCTCTTC  1559ATTCCGAGGAGCACCCCACCCCCACCCCCACCCCCACCCCATTCTTAA  1607ATTGTTTGGTTATGCTGTGTGATGGTTTGTTTGGTTTTTTTTTGTTGT  1655TGTTGTTGTTTTTTTTTTCTGTAAAAGATGGCACTTAAAACCAAAGCC  1703TGAAATGGTGGTAGAAATGCTGGGGTTTTTTTTGTTTGTTTGTTTTTT  1751CAGTTTTCAAGAGTAGATTGACTTCAGTCCCTACAAATGTACAGTCTT  1799GTATTACATTGTTAATAAAAGTCAATGATAAACTTAAAAAAAAAAAAA  1847AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA                    1877SEQ ID NO：2序列长度：690序列类型：核酸链型：双链拓扑结构：线性分子类型：cDNA→mRNA原始来源

生物：小鼠序列描述：CTG                                                  3Leu1CACCTGTCAGTGGCTGACCTCCTCTTTGTCATCACACTCCCCTTCTGG    51HisLeuSerValAlaAspLeuLeuPheValIleThrLeuProPheTrp

       5             10             15GCAGTTGATGCCATGGCTGACTGGTACTTTGGGAAATTTTTGTGTAAG    99AlaValAspAlaMetAlaAspTrpTyrPheGlyLysPheLeuCysLys

   20             25             30GCTGTCCATATCATCTACACTGTCAACCTCTACAGCAGCGTTCTCATC   147AlaValHisIleIleTyrThrValAsnLeuTyrSerSerValLeuIle

35             40             45CTGGCCTTCATCAGCCTGGACCGGTACCTCGCCATTGTCCACGCCACC   195LeuAlaPheIleSerLeuAspArgTyrLeuAlaIleValHisAlaThr50             55             60             65AACAGTCAAAGGCCAAGGAAACTGCTGGCTGAAAAGGCAGTCTATGTG   243AsnSerGlnArgProArgLysLeuLeuAlaGluLysAlaValTyrVal

         70             75             80GGCGTCTGGATCCCAGCCCTCCTCCTGACTATACCTGACTTCATCTTT   291GlyValTrpIleProAlaLeuLeuLeuThrIleProAspPheIlePhe

      85             90             95GCCGACGTCAGCCAGGGGGACATCAGTCAGGGGGATGACAGGTACATC   339AlaAspValSerGlnGlyAspIleSerGlnGlyAspAspArgTyrIle

  100            105            110TGTGACCGCCTTTACCCCGATAGCCTGTGGATGGTGGTGTTTCAATTC   387CysAspArgLeuTyrProAspSerLeuTrpMetValValPheGlnPhe115            120            125CAGCATATAATGGTGGGTCTCATCCTGCCCGGCATCGTCATCCTCTCC   435GlnHisIleMetValGlyLeuIleLeuProGlyIleValIleLeuSer130            135            140            145TGTTACTGCATCATCATCTCTAAGCTGTCACACTCCAAGGGCCACCAG   483CysTyrCysIleIleIleSerLysLeuSerHisSerLysGlyHisGln

        150            155            160AAGCGCAAGGCCCTCAAGACGACAGTCATCCTCATCCTAGCTTTCTTT   531LysArgLysAlaLeuLysThrThrValIleLeuIleLeuAlaPhePhe

     165            170            175GCCTGCTGGCTGCCATATTATGTGGGGATCAGCATCGACTCCTTCATC   579AlaCysTrpLeuProTyrTyrValGlyIleSerIleAspSerPheIle

  180            185            190CTTTTGGGAGTCATCAAGCAAGGATGTGACTTCGAGAGCATTGTGCAC   627LeuLeuGlyValIleLysGlnGlyCysAspPheGluSerIleValHis195            200            205AAGTGGATCTCCATCACAGAGGCCCTCGCCTTCTTCCACTGTTGCCTG   675LysTrpIleSerIleThrGluAlaLeuAlaPhePheHisCysCysLeu210            215            220            225AACCCCATCCTCTAT                                    690AsnProIleLeuTyr

        230SEQ ID NO：3序列长度：685序列类型：核酸链型：双链拓扑结构：线性分子类型：cDNA→mRNA原始来源

生物：小鼠序列描述：CCATCCTAATACGACTCACTATA                           23GGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTGCAGGTAGCAGTGACCCTCTGA  71GGCGTTTGGTGCTCCGGTAACCACCACGGCTGTAGAGCGAGTGTTGCC  119ATGGAACCGATCAGTGTGAGTATATACACTTCTGATAACTACTCTGAA  167MetGluProIleSerValSerIleTyrThrSerAspAsnTyrSerGlu1           5             10             15GAAGTGGGGTCTGGAGACTATGACTCCAACAAGGAACCCTGCTTCCGG  215GluValGlySerGlyAspTyrAspSerAsnLysGluProCysPheArg

      20             25             30GATGAAAACGTCCATTTCAATAGGATCTTCCTGCCCACCATCTACTTC  263AspGluAsnValHisPheAsnArgIlePheLeuProThrIleTyrPhe

   35             40             45ATCATCTTCTTGACTGGCATAGTCGGCAATGGATTGGTGATCCTGGTC  311IleIlePheLeuThrGlyIleValGlyAsnGlyLeuValIleLeuVal

50             55             60ATGGGTTACCAGAAGAAGCTAAGGAGCATGACGGACAAGTACCGGCTG  359MetClyTyrGlnLysLysLeuArgSerMetThrAspLysTyrArgLeu65             70             75             80CACCTGTCAGTGGCTGACCTCCTCTTTGTCATCACACTCCCCTTCTGG  407HisLeuSerValAlaAspLeuLeuPheValIleThrLeuProPheTrp

         85             90             95GCAGTTGATGCCATGGCTGACTGGTACTTTGGGAAATTTTTGTGTAAG  455AlaValAspAlaMetAlaAspTrpTyrPheGlyLysPheLeuCysLys

     100            105            110GCTGTCCATATCATCTACACTGTCAACCTCTACAGCAGCGTTCTCATC  503AlaValHisIleIleTyrThrValAsnLeuTyrSerSerValLeuIle

  115            120            125CTGGCCTTCATCAGCCTGGACCGGTACCTCGCCATTGTCCACGCCACC  551LeuAlaPheIleSerLeuAspArgTyrLeuAlaIleValHisAlaThr130            135            140AACAGTCAAAGGCCAAGGAAACTGCTGGCTGAAAAGGCAGTCTATGTG  599AsnSerGlnArgProArgLysLeuLeuAlaGluLysAlaValTyrVal145            150            155            160GGCGTCTGGATCCCAGCCCTCCTCCTGACTATACCTGACTTCATCTTT  647GlyValTrpIleProAlaLeuLeuLeuThrIleProAspPheIlePhe

        165            170            175GCCGACGTCAGCCAGGGGGACATCAGTCAGGGGGATGA            685AlaAspValSerGlnGlyAspIleSerGlnGlyAsp

     180            185SEQ ID NO：4序列长度：1694序列类型：核酸链型：双链拓扑结构：线性分子类型：基因组DNA原始来源生物：小鼠序列描述：ATATACACTTCTGATAACTACTCTGAA                        27IleTyrThrSerAspAsnTyrSerGlu1           5GAAGTGGGGTCTGGAGACTATGACTCCAACAAGGAACCCTGCTTCCGG   75GluValGlySerGlyAspTyrAspSerAsnLysGluProCysPheArg10             15             20             25GATGAAAACGTCCATTTCAATAGGATCTTCCTGCCCACCATCTACTTC   123AspGluAsnValHisPheAsnArgIlePheLeuProThrIleTyrPhe

         30             35             40ATCATCTTCTTGACTGGCATAGTCGGCAATGGATTGGTGATCCTGGTC   171IleIlePheLeuThrGlyIleValGlyAsnGlyLeuValIleLeuVal

      45             50             55ATGGGTTACCAGAAGAAGCTAAGGAGCATGACGGACAAGTACCGGCTG   219MetGlyTyrGlnLysLysLeuArgSerMetThrAspLysTyrArgLeu

   60             65             70CACCTGTCAGTGGCTGACCTCCTCTTTGTCATCACACTCCCCTTCTGG   267HisLeuSerValAlaAspLeuLeuPheValIleThrLeuProPheTrp

75             80             85GCAGTTGATGCCATGGCTGACTGGTACTTTGGGAAATTTTTGTGTAAG   315AlaValAspAlaMetAlaAspTrpTyrPheGlyLysPheLeuCysLys90             95            100            105GCTGTCCATATCATCTACACTGTCAACCTCTACAGCAGCGTTCTCATC   363AlaValHisIleIleTyrThrValAsnLeuTyrSerSerValLeuIle

        110            115            120CTGGCCTTCATCAGCCTGGACCGGTACCTCGCCATTGTCCACGCCACC   411LeuAlaPheIleSerLeuAspArgTyrLeuAlaIleValHisAlaThr

     125            130            135AACAGTCAAAGGCCAAGGAAACTGCTGGCTGAAAAGGCAGTCTATGTG   459AsnSerGlnArgProArgLysLeuLeuAlaGluLysAlaValTyrVal

  140            145            150GGCGTCTGGATCCCAGCCCTCCTCCTGACTATACCTGACTTCATCTTT   507GlyValTrpIleProAlaLeuLeuLeuThrIleProAspPheIlePhe155            160            165GCCGACGTCAGCCAGGGGGACATCAGTCAGGGGGATGACAGGTACATC   555AlaAspValSerGlnGlyAspIleSerGlnGlyAspAspArgTyrIle170            175            180            185TGTGACCGCCTTTACCCCGATAGCCTGTGGATGGTGGTGTTTCAATTC   603CysAspArgLeuTyrProAspSerLeuTrpMetValValPheGlnPhe

        190            195            200CAGCATATAATGGTGGGTCTCATCCTGCCCGGCATCGTCATCCTCTCC   651GlnHisIleMetValGlyLeuIleLeuProGlyIleValIleLeuSer

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  220            225            230AAGCGCAAGGCCCTCAAGACGACAGTCATCCTCATCCTAGCTTTCTTT   747LysArgLysAlaLeuLysThrThrValIleLeuIleLeuAlaPhePhe   235            240            245GCCTGCTGGCTGCCATATTATGTGGGGATCAGCATCGACTCCTTCATC   795AlaCysTrpLeuProTyrTyrValGlyIleSerIleAspSerPheIle250            255            260            265CTTTTGGGAGTCATCAAGCAAGGATGTGACTTCGAGAGCATTGTGCAC   843LeuLeuGlyValIleLysGlnGlyCysAspPheGluSerIleValHis

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     285            290            295AACCCCATCCTCTATGCCTTCCTCGGGGCCAAGTTCAAAAGCTCTGCC   939AsnProIleLeuTyrAlaPheLeuGlyAlaLysPheLysSerSerAla

  300            305            310CAGCATGCACTCAACTCCATGAGCAGAGGCTCCAGCCTCAAGATCCTT   987GlnHisAlaLeuAsnSerMetSerArgGlySerSerLeuLysIleLeu315            320            325TCCAAAGGAAAGCGGGGTGGACACTCTTCCGTCTCCACGGAGTCAGAA  1035SerLysGlyLysArgGlyGlyHisSerSerValSerThrGluSerGlu330            335            340            345TCCTCCAGTTTTCACTCCAGCTAACCCTTATGCAAAGACTTATATAAT  1083SerSerSerPheHisSerSer

        350ATATATATATATATGATAAAGAACTTTTTTATGTTACACATTTTCCAG  1131ATATAAGAGACTGACCACTCTTGTACAGTTTTTTTTTTTTTTTAATTG  1179ACTGTTGGGAGTTTATGTTCCTCTAGTTTTTGTGAGGTTTGACTTAAT  1227TTATATAAATATTGTTTTTTGTTTGTTTCATGTGAATGAGCGTCTAGG  1275CAGGACCTGTGGCCAAGTTCTTAGTAGCTGTTTATCTGTGTGTAGGAC   1323TGTAGAACTGTAGAGGAAGAAACTGAACATTCCAGAATGTGTGGTAAA   1371TTGAATAAAGCTAGCCGTGATCCTCAGCTGTTGCTGCATAATCTCTTC   1419ATTCCGAGGAGCACCCCACCCCCACCCCCACCCCCACCCCATTCTTAA   1467ATTGTTTGGTTATGCTGTGTGATGGTTTGTTTGGTTTTTTTTTGTTGT   1515TGTTGTTGTTTTTTTTTTCTGTAAAAGATGGCACTTAAAACCAAAGCC   1563TGAAATGGTGGTAGAAATGCTGGGGTTTTTTTTGTTTGTTTGTTTTTT   1611CAGTTTTCAAGAGTAGATTGACTTCAGTCCCTACAAATGTACAGTCTT   1659GTATTACATTGTTAATAAAAGTCAATGATAAACTT                1694SEQ ID NO：5序列长度：20序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)特征：13，15(次黄嘌呤核苷)序列描述：CTSMGTTTGK CMNTNKCYGA                           20SEQ ID NO：6序列长度：26序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)  特征：8、9、17(次黄嘌呤核苷)序列描述：TAGAKSANNG GRTTSANRCA RCAGTG                     26SEQ ID NO：7序列长度：25序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：TCATCCCCCT GACTGATGTC CCCCT                      25SEQ ID NO：8序列长度：27序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：CCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC                    27SEQ ID NO：9序列长度：30序列类型：核酸链型：单链  拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：CGCGTCGACC ACAACATGCT GTCCACATCA                 30SEQ ID NO：10序列长度：30序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：CGCTCTAGAT TATAAACCAG CCGAGACTTC                 30SEQ ID NO：11序列长度：29序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：CGCGTCGACG TTACCATGGA GGGGATCAG                  29SEQ ID NO：12序列长度：32序列类型：核酸  链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：CGCGCGGCCG CTTAGCTGGA GTGAAAACTT GA              32SEQ ID NO：13序列长度：27序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：TAGCGGCCGC GTTGCCATGG AACCGAT                    27SEQ ID NO：14序列长度：27序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：GCGTCGACTA AGGGTTAGCT GGAGTGA                    27SEQ ID NO：15序列长度：20  序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：CTGCACCTGT CAGTGGCTGA                            20SEQ ID NO：16序列长度：27序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：其他核酸(合成的DNA)序列描述：TAGATGAGGG GGATTGAGAC AACAGTG                    27SEQ ID NO：17序列长度：359序列类型：氨基酸拓扑结构：线性分子类型：蛋白质原始来源

生物：小鼠序列描述：MetGluProIleSerValSerIleTyrThrSerAspAsnTyrSerGlu1           5             10             15GluValGlySerGlyAspTyrAspSerAsnLysGluProCysPheArg

      20             25             30AspGluAsnValHisPheAsnArgIlePheLeuProThrIleTyrPhe

   35             40             45IleIlePheLeuThrGlyIleValGlyAsnGlyLeuValIleLeuVal

50             55             60MetGlyTyrGlnLysLysLeuArgSerMetThrAspLysTyrArgLeu65             70             75             80HisLeuSerValAlaAspLeuLeuPheValIleThrLeuProPheTrp

         85             90             95AlaValAspAlaMetAlaAspTrpTyrPheGlyLysPheLeuCysLys

     100            105            110AlaValHisIleIleTyrThrValAsnLeuTyrSerSerValLeuIle

  115            120            125LeuAlaPheIleSerLeuAspArgTyrLeuAlaIleValHisAlaThr130            135            140AsnSerGlnArgProArgLysLeuLeuAlaGluLysAlaValTyrVal145            150            155            160GlyValTrpIleProAlaLeuLeuLeuThrIleProAspPheIlePhe

        165            170            175AlaAspValSerGlnGlyAspIleSerGlnGlyAspAspArgTyrIle

     180            185            190CysAspArgLeuTyrProAspSerLeuTrpMetValValPheGlnPhe

  195            200            205GlnHisIleMetValGlyLeuIleLeuProGlyIleValIleLeuSer210            215            220CysTyrCysIleIleIleSerLysLeuSerHisSerLysGlyHisGln225            230            235            240LysArgLysAlaLeuLysThrThrValIleLeuIleLeuAlaPhePhe

        245            250            255AlaCysTrpLeuProTyrTyrValGlyIleSerIleAspSerPheIle

     260            265            270LeuLeuGlyValIleLysGlnGlyCysAspPheGluSerIleValHis

  275            280            285LysTrpIleSerIleThrGluAlaLeuAlaPhePheHisCysCysLeu290            295            300AsnProIleLeuTyrAlaPheLeuGlyAlaLysPheLysSerSerAla305            310            315            320GlnHisAlaLeuAsnSerMetSerArgGlySerSerLeuLysIleLeu

        325            330            335SerLysGlyLysArgGlyGlyHisSerSerValSerThrGluSerGlu

     340            345            350SerSerSerPheHisSerSer

  355         359

Claims (23)

1.一种DNA，它编码含有序列表中序列号17记载的全部或部分氨基酸序列的多肽，或包含该多肽的多肽，这些多肽具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

2.一种DNA，它编码序列表中序列号17记载的全部或部分氨基酸序列中，1个或多个氨基酸残基缺失、添加、插入或替换至少有一种发生的，具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性的多肽。

3.一种DNA，它是包含序列表中序列号1记载的全部或部分碱基序列的DNA，或是包含该DNA的DNA，它们编码的多肽具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

4.一种DNA，它包含序列表中序列号1记载的全部或部分碱基序列的DNA或是包含该DNA的DNA，它们至少有一种一个或多个的碱基缺失、添加、插入或替换之一的情况发生，且编码的多肽具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

5.一种DNA，它是在严格条件下能与权利要求1-4任一权项中的DNA进行杂交的DNA，且编码具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性的多肽。

6.一种多肽，它是由权利要求1-5任一权项中的DNA所编码的多肽，其中所述的多肽具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

7.一种多肽，它含有序列表中序列号17记载的全部或部分氨基酸序列的多肽，或是包含该多肽的多肽，其中任一种多肽具有与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

8.一种多肽，它是序列表中序列号17记载的全部或部分氨基酸序列中，至少有一种1个或多个的氨基酸残基缺失、添加、插入或替换之一的情况发生，其中所述的多肽具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性。

9.权利要求6-8任一权项中的多肽，它来源于小鼠B前体细胞株DW34。

10.一种表达载体，它包含权利要求1-5任一权项中的DNA。

11.一种转化体，它是将权利要求10中的表达载体导入宿主而得到。

12.权利要求11的转化体，其中宿主为哺乳类细胞株。

13.一种生产具有能与小鼠PBSF/SDF-1结合的受体活性多肽的方法，其特征在于，在权利要求10中的表达载体能够表达的条件下培养权利要求11或12中的转化体。

14.一种单克隆抗体，它是抗权利要求6-9任一权项中的多肽的。

15.含有小鼠PBSF/SDF-1，用作AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的医药组合物。

16.表达权利要求6-9任一权项中的多肽和人CD4蛋白的细胞。

17.一种筛选AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的方法，其特征在于它包含

(a)将表达权利要求6-9任一权项中多肽的细胞或权利要求16的细胞，亲人T细胞株的HIV-1，和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物；和

(b)分析HIV-1在该细胞中的定位。

18.权利要求17的方法，其中分析HIV-1定位的步骤应用与抗亲人T细胞株的HIV-1的单抗进行。

19.一种筛选AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂的方法，其特征在于它包含

(a)将表达权利要求6-9任一权项中多肽的细胞或权利要求16的细胞，表达HIV-1被膜蛋白的细胞，和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物；和

(b)测定表达HIV-1被膜蛋白质的细胞与该细胞的融合性。

20.一种筛选AIDS发病抑制剂或HIV-1感染抑制剂，或筛选该PBSF/SDF-1的激动剂或拮抗剂的方法，其特征在于

(a)将表达权利要求6-9任一权项中多肽的细胞或权利要求16的细胞，小鼠或人PBSF/SDF-1，和成为筛选对象的物质混合，然后温育得到的混合物；和

(b)测定该细胞内的钙离子浓度，和/或测定表达的多肽和该小鼠或人PBSF/SDF-1的结合活性。

21.权利要求20的方法，其中该拮抗剂为造血干细胞释放剂。

22.一种用于检测AIDS发病或HIV-1感染的试剂盒，它包括表达权利要求6-9任一权项中多肽的细胞或权利要求16的细胞。

23.一种检测AIDS发病或HIV-1感染的方法，其特征在于它包括

(a)将表达权利要求6-9任一权项中多肽的细胞或权利要求16的细胞，以及怀疑感染了HIV-1的患者的血清、血细胞或血液混合，然后温育得到的混合物；和

(b)分析HIV-1在该细胞中的定位，或者测定HIV-1感染细胞与该细胞的融合性。

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