CN113862207B

CN113862207B - 一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品

Info

Publication number: CN113862207B
Application number: CN202111267670.6A
Authority: CN
Inventors: 刘智; 李蓓; 罗亚楠
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2041-10-29
Also published as: CN113862207A

Abstract

本发明公开了一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品。所述改造菌具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列。本发明提供的改造菌株，通过益生菌定植于肠道环境中，持续表达色氨酸羟化酶，进而持续催化产生5羟色胺，从而稳定持续的促进肠动力，提供稳定可靠的缓解便秘的效果，可用于制备促肠动力制剂，缓解便秘制剂。

Description

一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品。

背景技术

目前发现一些物质可以作用于肠神经，引起平滑肌收缩、增加肠道动力、缩短肠道运输时间、减少粪便内水分的回收，具有缓解便秘的功效，即促肠动力制剂。

现有的促肠动力制剂，主要有小分子药物类，例如莫沙比利：作用于肠神经的五羟色胺受体，促进胃肠道动力；伊托比利通过抗多巴胺受体和抑制胆碱酯酶的作用促进胃肠道动力；普鲁卡比利：五羟色胺受体激动剂，激动五羟色胺受体，引起肠道高幅推进性收缩，加快结肠传输。一些益生菌亦可作为促肠动力制剂，常用的促肠动力益生菌主要包括乳酸杆菌、双歧杆菌及乳球菌、粪链球菌、酿酒酵母菌等部分革兰阳性球菌等，其作用机制可能与益生菌代谢产生有机酸，降低肠内pH值，从而调节胃肠功能及改变患者的肠道菌群有关。

小分子药物类促肠动力制剂，副作用明显，不能长期反复给药，不适合长期、反复便秘发作的患者。而益生菌类促肠动力制剂，由于机理不明确，其缓解便秘的效果不稳定，往往因人而异。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品，其目的在于，通过改造菌株定植于肠道，稳定可控的表达色氨酸羟化酶，持续、高效的产生五羟色胺，持续促进肠道动力，由此解决现有的小分子药物类促肠动力制剂负作用明显，益生菌类促肠动力制剂效果不稳定的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种改造菌株，其具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列。

优选地，所述改造菌株，其所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为人来源的色氨酸羟化酶TPH1表达序列。

优选地，所述改造菌株，其色氨酸羟化酶TPH1蛋白质序列为SEQ ID NO:1；所述优选色氨酸羟化酶TPH1表达序列为：SEQ ID NO:2。

优选地，所述改造菌株，其表达载体的表达区还包括所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件。

优选地，所述改造菌株，其色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件为阿拉伯糖操纵子调控蛋白基因序列。

优选地，所述改造菌株，其表达载体的表达区还包括筛选标记基因序列。

优选地，所述改造菌株，其筛选标记基因为抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

优选地，所述改造菌株，其表达载体改造自pBAD24载体，所述改造菌株为EcN pTPH菌株。

按照本发明的另一个方面，提供了一种所述的改造菌株的应用，其应用于制备促进肠动力制剂。

按照本发明的另一个方面，提供了一种促进肠动力制剂，其包括本发明提供的改造菌株；优选还包括阿拉伯糖。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：

本发明提供的改造菌株，通过益生菌定植于肠道环境中，持续表达色氨酸羟化酶，进而持续催化产生5羟色胺，从而稳定持续的促进肠动力，提供稳定可靠的缓解便秘的效果，可用于制备促肠动力制剂，缓解便秘制剂。

优选方案，配合表达调控元件和筛选基因，能使得色氨酸羟化酶的表达量可控，可精准的控制给药，减轻过度给药带来的副作用。

附图说明

图1是pBAD-hTPH1表达载体结构示意图；

图2是表达载体凝胶电泳结果图；

图3本发明实施例3-5的流程示意图；

图4是实施例3粪便水含量测试结果图；

图5是实施例4实验终点小鼠胃肠道传输速率测试结果图；

图6是实施例5排便时长测试结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

一种改造菌株，具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列，优选还包括所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件、以及筛选标记基因序列；

所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为人来源的色氨酸羟化酶TPH1表达序列；优选所述色氨酸羟化酶TPH1蛋白质序列为SEQ ID NO:1；所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为：SEQID NO:2。所述色氨酸羟化酶TPH1的表达序列插入载体表达区6×His组氨酸标签后。在优选pBAD24表达载体6×His处插入所述优选色氨酸羟化酶TPH1序列，便于对蛋白进行纯化和抗体结合，利于后期纯化蛋白、体外验证效果。

所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件，优选为阿拉伯糖操纵子调控蛋白基因序列，所述阿拉伯糖操纵子调控蛋白为araC蛋白，其可编码一种在大肠杆菌中调控araBAD启动子的蛋白质。在没有L-阿拉伯糖或葡萄糖存在的情况下，araC蛋白抑制araBAD启动子的表达，在有L-阿拉伯糖的情况下激活其调控的基因进行转录。

所述筛选标记基因为抗生素抗性基因，优选为氨苄青霉素抗性基因(Amp抗性基因)。

所述表达载体优选改造自pBAD24载体；pBAD24载体中复制子pBR322ori能够在EcN菌株中发挥作用，能够实现所述pBAD-hTPH1表达载体在EcN菌株中重组表达效果。

所述改造菌株为EcN pTPH菌株，将所述表达载体pBAD-hTPH1电转入大肠杆菌Nissle 1917感受态细胞中，获得改造菌株EcN pTPH菌株。

前期体外实验证明所述色氨酸羟化酶TPH1的转化效率最高，利于重组载体的构建，一方面通过密码子优化使其在EcN pTPH菌株具有稳定可控的表达效率，实现可控表达，具有良好的安全性；另一方面根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选，经过优化的基因序列能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。

所述改造菌株内的pBAD-hTPH1表达载体能够通过口服阿拉伯糖诱导表达蛋白，实现体外诱导调控，调控重组载体表达产物色氨酸羟化酶TPH1的表达量，控制给药剂量，避免过度表达可能导致其他的副作用；其抗性基因表达的氨苄青霉素是临床经常使用的一种抗生素，这种抗生素安全性比较高。而重组表达载体中的复制子pBR322 ori能够在EcN菌株中发挥作用，即本发明提供的改造菌株可以实现所述pBAD-hTPH1重组载体在菌株内的表达，小剂量菌种补充，即可实现长效、可控的给药效果，适合便秘长期、反复发作的特点。

5-HTP是由色氨酸经过色氨酸羟化酶TPH催化后的产物，是5-HT的前体物质，即5-HTP的产生能够促进5-HT的产生。5-HT通过调节胃肠蠕动和分泌，对胃动力具有促进作用。然而5-HTP的半衰期过短，仅为2小时，而色氨酸羟化酶在肠道内无法固定在小肠绒毛上，制备成本高且催化效率低，难以达到促进胃肠动力、缓解便秘的作用。本发明提供改造菌株，通过基因表达持续稳定产生色氨酸羟化酶TPH，实验证实该改造菌株定植于肠道微环境中，有效的催化色氨酸，可使宿主持续稳定产生5-HTP，进而产生更多5-HT促进胃肠蠕动和分泌。实验证实本发明提供的改造菌株可提高实验小鼠胃肠道传输速率，对便秘症状有缓解的效果，说明本发明提供的改造菌株具有促肠动力的作用，能应用于制备促进肠动力制剂。

以下为实施例：

实施例1表达载体构建

所述pBAD-hTPH1表达载体，按照以下方法构建：

S1获取目的基因片段：根据优选的色氨酸羟化酶TPH1表达序列通过人工合成方式获得目的基因片段。

S2获取目的载体片段：采用限制性内切酶ApaLI和EcoRI，对质粒pBAD24进行双酶切，酶切反应体系为：10μLCutsmart、2μLApaLI、2μLEcoRI、2μg plasmid，ddH₂O不至50μL；反应结束后1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示，用AxyprepDNA Gel Extraction kit 50-prep凝胶回收试剂盒回收大片段目的载体片段。

S3获取重组载体：采用GoldenGate克隆方法，反应体系：ApaLI-HF0.75ul、EcoRI-HF 0.75ul、10×CutSmart^TMBuffer 1ul、ATP(10mM)1ul、T7 DNA ligase0.25 ul、步骤S1获得的目的基因片段1ul(20ng/ul)、步骤S2获得的目的载体片段1ul(100ng/ul)、ddH₂O补至10ul；反应程序：37℃、5min，20℃、5min，12-16个循环，80℃、20min，12℃、forever，获得酶连产物，即重组载体。

S4重组载体验证：将酶连产物转化至VB UltraStable感受态细胞中，转化方法按照电转化进行，电转化电压为2.4kV，电转后加入新鲜的LB液体培养基，37℃、180rpm振荡复苏1h，离心浓缩获得菌体。将菌体涂布于氨苄抗生素(100ng/mL)平板上，培养24h，挑取单克隆，提取质粒，PCR测序鉴定，验证构建成功。

实施例2获得改造菌株EcN pTPH菌株

S1重组载体构建：同实施例1。

S2提取重组载体：在4mL含氨苄抗生素(100ng/mL)的LB培养液中接种验证成功的、含有重组质粒的VB UltraStable菌株，37℃、180rpm培养24h。使用诺唯赞质粒小提试剂盒提取质粒。

S3获取改造菌株：将S2获得的重组质粒电转化至EcN感受态细胞，转化方法按照电转化进行，电转化电压为2.4kV，电转化后加入1mL新鲜的LB液体培养基于37℃、180rpm振荡复苏1h后，离心浓缩获得菌体。将菌体涂布于氨苄抗生素(100ng/mL)平板上，培养24h，获得阳性菌株，即为改造菌株。

以下实施例3-5，流程示意图如图2所示，均按照如下实验流程进行：

每天早晚各一次对小鼠进行洛哌丁胺腹腔注射，持续一周，建立便秘模型。之后将饮用水换为混合抗生素水，喂养3天，以减少肠道中的菌。之后将饮用水换成10g/L的L-阿拉伯糖水，并进行隔天灌胃1×109CFU菌株，一周后进行便秘指标检测，包括粪便含水量、小鼠胃肠道传输速率、第一次排便时间，并安乐死小鼠。

实验组1：正常对照组；实验组2：便秘模型组；实验组3：EcN野生型菌株；实验组4：改造菌株EcN pTPH菌株

实施例3粪便水含量测试

灌胃结束后，将小鼠单只放入垫有吸水纸的笼中，收集3只小鼠粪便，称重即为湿重，冻干后，即为干重，按照以下公式：

粪便含水量＝粪便含水量(％)＝(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100，计算粪便含水量，取平均值。

结果如图3表1所示所示：

表1粪便水含量测试结果

正常组(％)	模型组(％)	EcN野生型(％)	EcNpTPH(％)
				66.86909	50.26911	57.54977	59.33918
68.03653	53.16117	55.73154	61.59484
				66.5937	54.73606	54	61.87923

显示：正常组、模型组、EcN野生型菌组、EcN pTPH菌组粪便含水量分别为：67.15％、52.72％、55.76％、60.94％

由结果可知，正常组粪便含水量高，模型组粪便含水量显著降低，EcN野生型干预后症状没有缓解，改造菌株干预后含水量显著增高。

实施例4实验终点小鼠胃肠道传输速率测试

测试步骤：

各组小鼠禁食不禁水过夜。第2天灌胃墨汁，30分钟后处死小鼠，剖开腹腔，剪取上端自幽门，下端至盲肠，测量小肠全长为“小肠总长度”，从幽门到墨汁前沿为“墨汁推进长度”，按照公式2：

胃肠道传输速率＝胃肠道传输速率(％)＝墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100，计算胃肠道传输速率。

结果如图4、表2所示：

表2小鼠胃肠道传输速率测试结果

正常组(％)	模型组(％)	EcN野生型(％)	EcNpTPH(％)
				1	0.6837838	0.7682119	0.8967742
0.8912467	0.6478873	0.7382119	0.8198434
				0.9554974	0.7682119	0.6578873	0.9023809
	0.7267904	0.7078873

显示：正常组、模型组、EcN野生型菌组、EcN pTPH菌组胃肠道传输速率分别为：0.93％、0.71％、0.72％、0.87％。

正常组胃肠道传输速率很快，模型组粪便胃肠道传输速率显著减慢，EcN野生型干预后症状没有缓解，改造菌株干预后胃肠道传输速率显著加快。

实施例5排便时长测试

测试步骤：

各组小鼠禁食不禁水过夜。第2天灌胃墨汁，并开始计时，记录每一只小鼠排首粒黑便的时间。

测试结果，如图6、表3所示：

表3排便时长测试结果

正常组(min)	模型组(min)	EcN野生型(min)	EcNpTPH(min)
				71	115	108	73
74	138	105	85
				68	110	129	92

结果如图显示：正常组、模型组、EcN野生型菌组、EcN pTPH菌组第一次排便时间分别为71min、121min、114min、83min

正常组排首粒黑便的时间很短，模型组首粒黑便的时间显著延长，EcN野生型干预后症状没有缓解，改造菌株干预后首粒黑便的时间显著缩短。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学

<120> 一种改造菌株、其在制备促肠动力制剂中的应用及产品

<130> 无

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> Human

<400> 1

Met Ile Glu Asp Asn Lys Glu Asn Lys Asp His Ser Leu Glu Arg Gly

1 5 10 15

Arg Ala Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Asn Glu Val Gly Gly Leu Ile

20 25 30

Lys Ala Leu Lys Ile Phe Gln Glu Lys His Val Asn Leu Leu His Ile

35 40 45

Glu Ser Arg Lys Ser Lys Arg Arg Asn Ser Glu Phe Glu Ile Phe Val

50 55 60

Asp Cys Asp Ile Asn Arg Glu Gln Leu Asn Asp Ile Phe His Leu Leu

65 70 75 80

Lys Ser His Thr Asn Val Leu Ser Val Asn Leu Pro Asp Asn Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Glu Asp Gly Met Glu Thr Val Pro Trp Phe Pro Lys Lys Ile

100 105 110

Ser Asp Leu Asp His Cys Ala Asn Arg Val Leu Met Tyr Gly Ser Glu

115 120 125

Leu Asp Ala Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Asn Val Tyr Arg Lys Arg

130 135 140

Arg Lys Tyr Phe Ala Asp Leu Ala Met Asn Tyr Lys His Gly Asp Pro

145 150 155 160

Ile Pro Lys Val Glu Phe Thr Glu Glu Glu Ile Lys Thr Trp Gly Thr

165 170 175

Val Phe Gln Glu Leu Asn Lys Leu Tyr Pro Thr His Ala Cys Arg Glu

180 185 190

Tyr Leu Lys Asn Leu Pro Leu Leu Ser Lys Tyr Cys Gly Tyr Arg Glu

195 200 205

Asp Asn Ile Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Asn Phe Leu Lys Glu Arg

210 215 220

Thr Gly Phe Ser Ile Arg Pro Val Ala Gly Tyr Leu Ser Pro Arg Asp

225 230 235 240

Phe Leu Ser Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Val

245 250 255

Arg His Ser Ser Asp Pro Phe Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Thr Cys His

260 265 270

Glu Leu Leu Gly His Val Pro Leu Leu Ala Glu Pro Ser Phe Ala Gln

275 280 285

Phe Ser Gln Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Ser Glu Glu Ala

290 295 300

Val Gln Lys Leu Ala Thr Cys Tyr Phe Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu

305 310 315 320

Cys Lys Gln Asp Gly Gln Leu Arg Val Phe Gly Ala Gly Leu Leu Ser

325 330 335

Ser Ile Ser Glu Leu Lys His Ala Leu Ser Gly His Ala Lys Val Lys

340 345 350

Pro Phe Asp Pro Lys Ile Thr Cys Lys Gln Glu Cys Leu Ile Thr Thr

355 360 365

Phe Gln Asp Val Tyr Phe Val Ser Glu Ser Phe Glu Asp Ala Lys Glu

370 375 380

Lys Met Arg Glu Phe Thr Lys Thr Ile Lys Arg Pro Phe Gly Val Lys

385 390 395 400

Tyr Asn Pro Tyr Thr Arg Ser Ile Gln Ile Leu Lys Asp Thr Lys Ser

405 410 415

Ile Thr Ser Ala Met Asn Glu Leu Gln His Asp Leu Asp Val Val Ser

420 425 430

Asp Ala Leu Ala Lys Val Ser Arg Lys Pro Ser Ile

435 440

<210> 2

<211> 5305

<212> DNA

<213> Human

<400> 2

aaaccaattg tccatattgc atcagacatt gccgtcactg cgtcttttac tggctcttct 60

cgctaaccaa accggtaacc ccgcttatta aaagcattct gtaacaaagc gggaccaaag 120

ccatgacaaa aacgcgtaac aaaagtgtct ataatcacgg cagaaaagtc cacattgatt 180

atttgcacgg cgtcacactt tgctatgcca tagcattttt atccataaga ttagcggatc 240

ctacctgacg ctttttatcg caactctcta ctgtttctcc atacccgttt tttgggctaa 300

caggaggaat taaccatgca tcaccatcac catcacatga ttgaggataa caaggagaac 360

aaagatcatt cattggagcg tgggcgtgct tccctgatct tttcgctgaa aaatgaggta 420

ggtgggctta tcaaagcgtt gaagattttt caggagaaac acgtaaatct gttgcatatt 480

gagagccgta aaagcaagcg ccgtaacagt gaattcgaaa tcttcgtcga ttgcgatatt 540

aatcgtgagc agcttaacga catttttcat ctgttaaaaa gccatacgaa cgtacttagt 600

gtaaatttgc cagacaactt cactcttaaa gaggacggta tggagactgt tccttggttc 660

ccgaaaaaaa tctcagactt ggaccactgc gccaaccgtg tcttaatgta tggctcagaa 720

ttagatgcgg atcaccctgg gtttaaggac aacgtctatc gtaaacgtcg taaatatttt 780

gcagaccttg caatgaacta taagcacggg gatcctatcc ccaaggtgga gtttacagaa 840

gaggaaatta agacctgggg gactgtgttc caggaactta acaagttata tcctacgcac 900

gcgtgccgtg agtatttgaa gaatctgcct cttttaagca aatattgcgg ataccgtgag 960

gataatatcc cccaactgga ggacgtgagc aattttctta aagagcgtac aggtttcagt 1020

attcgccctg tagcagggta tttgagccct cgtgatttct tatcgggatt agcatttcgc 1080

gtgtttcatt gcacgcagta tgtccgccat agttcggatc ccttctacac ccccgaaccc 1140

gacacatgtc acgaattgtt gggacatgtg ccactgctgg ccgagccgag ctttgcccag 1200

ttttcacagg agatcggact tgctagttta ggtgcatcag aagaagcggt tcagaagttg 1260

gctacttgtt atttctttac agtagaattc ggactttgca aacaggacgg tcagcttcgt 1320

gtattcggcg ctgggctgtt gtcctcgatt tctgagttaa agcatgcact ttcagggcat 1380

gcaaaagtta aaccattcga tcctaagatc acatgcaagc aggagtgctt gatcacgaca 1440

ttccaggacg tgtactttgt ttccgagtct ttcgaggatg ccaaggagaa aatgcgcgaa 1500

tttacgaaga ctattaaacg cccgttcggc gtgaaatata atccctacac tcgctcgatc 1560

cagattttga aagacacaaa aagcattacc agcgcaatga acgagttaca gcacgactta 1620

gatgttgtga gtgacgccct tgccaaggtt tcgcgtaagc caagcatcta agctgttttg 1680

gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc agaacgcaga agcggtctga 1740

taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc acctgacccc atgccgaact 1800

cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc tccccatgcg agagtaggga 1860

actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 1920

tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccgggagc ggatttgaac 1980

gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc cgccataaac tgccaggcat 2040

caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg cgtttctaca aactcttttg 2100

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 2160

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 2220

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 2280

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 2340

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 2400

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 2460

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 2520

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 2580

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 2640

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 2700

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 2760

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 2820

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 2880

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 2940

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 3000

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 3060

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 3120

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 3180

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 3240

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 3300

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 3360

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 3420

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 3480

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 3540

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 3600

acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 3660

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 3720

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 3780

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 3840

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 3900

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 3960

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 4020

tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 4080

atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga 4140

cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 4200

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aaacgcgcga ggcagcagat caattcgcgc gcgaaggcga agcggcatgc ataatgtgcc 4320

tgtcaaatgg acgaagcagg gattctgcaa accctatgct actccgtcaa gccgtcaatt 4380

gtctgattcg ttaccaatta tgacaacttg acggctacat cattcacttt ttcttcacaa 4440

ccggcacgga actcgctcgg gctggccccg gtgcattttt taaatacccg cgagaaatag 4500

agttgatcgt caaaaccaac attgcgaccg acggtggcga taggcatccg ggtggtgctc 4560

aaaagcagct tcgcctggct gatacgttgg tcctcgcgcc agcttaagac gctaatccct 4620

aactgctggc ggaaaagatg tgacagacgc gacggcgaca agcaaacatg ctgtgcgacg 4680

ctggcgatat caaaattgct gtctgccagg tgatcgctga tgtactgaca agcctcgcgt 4740

acccgattat ccatcggtgg atggagcgac tcgttaatcg cttccatgcg ccgcagtaac 4800

aattgctcaa gcagatttat cgccagcagc tccgaatagc gcccttcccc ttgcccggcg 4860

ttaatgattt gcccaaacag gtcgctgaaa tgcggctggt gcgcttcatc cgggcgaaag 4920

aaccccgtat tggcaaatat tgacggccag ttaagccatt catgccagta ggcgcgcgga 4980

cgaaagtaaa cccactggtg ataccattcg cgagcctccg gatgacgacc gtagtgatga 5040

atctctcctg gcgggaacag caaaatatca cccggtcggc aaacaaattc tcgtccctga 5100

tttttcacca ccccctgacc gcgaatggtg agattgagaa tataaccttt cattcccagc 5160

ggtcggtcga taaaaaaatc gagataaccg ttggcctcaa tcggcgttaa acccgccacc 5220

agatgggcat taaacgagta tcccggcagc aggggatcat tttgcgcttc agccatactt 5280

ttcatactcc cgccattcag agaag 5305

Claims

1.一种改造菌株，其特征在于，具有表达载体，所述表达载体的表达区包括色氨酸羟化酶TPH1表达序列，将所述表达载体电转入大肠杆菌Nissle 1917感受态细胞中，获得改造菌株；

所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为人来源的色氨酸羟化酶TPH1表达序列，所述人源化色氨酸羟化酶TPH1蛋白质序列为SEQ ID NO:1；所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列为：SEQ IDNO:2。

2.如权利要求1所述的改造菌株，其特征在于，所述表达载体的表达区还包括所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件。

3.如权利要求2所述的改造菌株，其特征在于，所述色氨酸羟化酶TPH1表达序列的表达调控元件为阿拉伯糖操纵子调控蛋白基因序列。

4.如权利要求1所述的改造菌株，其特征在于，所述表达载体的表达区还包括筛选标记基因序列。

5.如权利要求4所述的改造菌株，其特征在于，所述筛选标记基因为抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

6.如权利要求1所述的改造菌株，其特征在于，所述表达载体改造自pBAD24载体，所述改造菌株为EcN pTPH菌株。

7.一种如权利要求1至6任意一项所述的改造菌株的应用，其特征在于，应用于制备促进肠动力制剂。

8.一种促进肠动力制剂，其特征在于，包括如权利要求1至6任意一项所述的改造菌株，还包括阿拉伯糖。