CN113811295A - 高浓度细胞包装和运送 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包装和运送用于细胞疗法之治疗性细胞的方法及产品。

Description

高浓度细胞包装和运送

相关申请之交叉引用

本申请要求2019年5月15日提交的第62/848,230号美国专利临时申请的优先权。该申请案之全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及用于包装和运送用于细胞疗法的治疗性细胞的方法及产品。

背景技术

细胞疗法应用于治疗各种病症，其涉及向患者施用例如干细胞或多能细胞(pluripotent cells)的细胞。干细胞或多能细胞是具有通过有丝细胞分裂并分化为范围广泛的特定细胞类型以能够实现自我更新的细胞类型。据此，此类细胞具有用于治疗多种疾病及损伤的潜能，该疾病及损伤包括神经系统创伤、恶性肿瘤、遗传性疾病、血红蛋白病以及免疫缺陷疾病。

但是，研究显示如果干细胞(例如，胎盘血细胞或脐带血细胞)在取出冷冻之后未迅速处理，将出现功能性祖细胞的损失(Ivanovic等.,Transfusion,2011Sep；51(9):2044-5)。据此，后勤问题经常阻碍此等细胞之应用。举例而言，干细胞(如脐带血细胞)经采集后被常规冷冻保藏于储存设备(例如细胞库)中，且于需要时，从该设备运输至医院。这种冷冻保藏过程是通过冷却至低于零下之温度(通常为77K或-196℃，液氮之沸点)以保藏细胞或组织，故存在一定风险。举例而言，所保存之细胞可能由于在降温过程时冷冻或回温至室温的过程中而受到损伤。这些风险对于干细胞或多能细胞尤其严重，是因为此类细胞移植中一个最为重要的方面是移植时活的干细胞/多能细胞的数量及其发育潜力。出于这一考虑，干细胞/多能细胞是在尽可能短的时间内以常规冷冻方式保藏运送。事实上，于干冰上或液氮运送器中过夜运送是工业标准且必须格外小心地监控温度。但是，该操作仍无法消除这种风险。

此外，对于冷冻保藏(cryopreservation)，将细胞与冷冻保护剂混合至终浓度为每毫升10⁶至10⁷个存活细胞是一个标准方案(protocol)，因为以较低或较高细胞浓度冷冻，细胞往往倾向于具有较低的存活率(Kielberg等.,Cryopreservation of MammalianCells–Protocols,Tech Note No.14,2010Thermo Fisher Scientific Inc.,https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/Application-Notes/D19575.pdf)。然而，这些细胞的治疗性应用往往需要更大数量以及高于10⁷细胞/ml之浓度。因此，临床医师必须进一步处理这些细胞以增加浓度，从而产生额外的后勤问题和合规性问题。

因此，长途运输干细胞(例如，跨洲)的成本极为昂贵且不实用。因此对于以高浓度于室温/环境温度下运送干细胞的流程或方法存在着需求。

发明内容

本发明从多个方面解决上文述及的需求。

第一个方面，本发明提供了一种治疗性组合物，所述组合物包含(i)约1×10⁷至1×10⁹/ml(例如，2×10⁷至1×10⁹/ml、5×10⁷至1×10⁹/ml、1×10⁸/ml、2×10⁸/ml、3×10⁸/ml、4×10⁸/ml、5×10⁸/ml)个治疗性细胞以及(ii)药物学上可接受的载体溶液。所述药物学上可接受的载体溶液(a)含有约25至30mM(例如，26至28mM及27mM)之醋酸盐以及约20至25mM(例如，21至24mM及23mM)之葡萄糖酸盐以及(b)具有约270至320mOsmol/L(例如，280至310、280至300、290至300及约294至295mOsmol/L)的重量渗透摩尔浓度。该药物学上可接受的载体溶液可具有126至154mEq/L的钠。

在一些具体实施方案中，所述药物学上可接受的载体溶液可含有以下之一种或多种：约120至160mM(例如，130至150及140mM)的Na⁺、约3至7mM(例如，4至6及5mM)的K⁺、约1.0至2.0mM(例如，1.2至1.8及1.5mM)的Mg²⁺、以及约90至110mM(例如，95至100及98mM)的Cl^-。在一些具体实施方案中，所述药物学上可接受的载体溶液不含Ca²⁺或乳酸盐或两者都不含。

在一个实施例中，所述药物学上可接受的载体溶液含有：约140mM的Na⁺、约5mM的K⁺、约1.5mM的Mg²⁺、约98mM的Cl^-、约27mM的醋酸盐、以及约23mM的葡萄糖酸盐。在此情况下，所述药物学上可接受的载体溶液可含有约90mM的氯化钠(NaCl)、约5mM的氯化钾(KCl)、约1.5mM的氯化镁(MgCl₂·6H₂O)、约27mM的三水合醋酸钠(C₂H₃NaO₂·3H₂O)、以及约23mM的葡萄糖酸钠(C₆H₁₁NaO₇)。

该治疗性组合物或该药物学上可接受之载体溶液可具有约4.0至8.0(例如，约5.5至约8.0、约6.0至约7.5、约6.0及约7.4)的pH。该治疗性组合物不含DMSO或含有微量之DMSO(亦即，0.5％或更低)。上述治疗性组合物可含有约0.5％至约5％(例如，约1％至约5％、约1％至3％、约1％至2.5％或约1％)的血清或血清白蛋白。实施例包括人类血清或人类血清白蛋白(HSA)。该治疗性组合物可具有约1至10℃、约2至8℃或约3至5℃之范围内的温度。优选地，该组合物具有约4℃的温度。

该治疗性细胞的实施例包括单核细胞、脐带血细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胚胎干细胞、外周血细胞、骨髓细胞或胎盘血细胞。在一些具体实施方案中，该治疗性组合物或细胞包含CD13⁺、CD34⁺或CD134⁺细胞。在一个具体实施方案中，上述细胞可以是被冷冻及解冻的细胞，例如，从血库获得的细胞。在此情况下，该组合物可含有约10至100U/ml，例如，10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100U/ml的DNAse(例如，人类DNAse)。可选择地，可从供体新鲜地获得该细胞且未经冷冻，在此情况下，DNAse是非必需的，且该组合物可不含DNAse。

第二个方面，本发明提供了一种包装产品，所述包装产品包含放置于含有一种基材的容器中的上述的组合物；该基材具有聚合物。在一些实施例中，该聚合物可为是具有低摩擦或无粘性特性的聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基聚合物(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯或聚氯乙烯(PVC)。该聚合物也可以是适用于生物学的其它聚合物，例如，超低密度聚乙烯、低密度聚乙烯(LDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、同轴定向聚丙烯(COPP)、双轴定向聚丙烯(BOPP)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、诸如尼龙、乙烯-乙烯醇聚合物(EVOH)的聚酰亚胺树脂，以及它们的金属化形式。

该包装产品可为任意合适的形状，包括但不限于，袋、注射器或用于注射器之小瓶。在一个实施例中，该产品被预先填充用于临床用途的多能细胞。该多能细胞可以是诸如造血干细胞或间叶干细胞的干细胞。该组合物可含有外周血细胞、脐带血细胞或骨髓细胞。

本发明提供了一种用于制造上述包装产品的方法。该方法包括以下步骤：(a)提供含有细胞(例如，多能细胞)的组合物；(b)提供含有一种基材的容器，其中，该基材包含聚合物；(c)放置该组合物于该容器内；以及(d)密封该容器。

第三个方面，本发明提供了一种用于储存或运送诸如多能细胞或单核细胞的治疗性细胞的方法。所述方法包含(i)提供上述治疗性组合物；以及(ii)以1至10℃之范围内的温度储存或运送该组合物约24至96小时，例如，约24至约72小时。在一些具体实施例中，该方法包括提供上述包装产品及递送该包装产品至接收者，例如，运输者、代理人或接收医院的人员的步骤。

在该递送的步骤中，温度可为1至10℃之范围内，例如，1至7℃、2至6℃、3至5℃或约4℃。使用该方法，该细胞可在12至96小时内递送，例如，至少24、36、38、60、72、84或96小时内。在一个实施例中，该治疗性组合物被储存或运送约72小时。

在递送时，该多能细胞或单核细胞可具有超过40％(例如，45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％及95％)的总有核细胞数(TNC)回收率。此外，在递送时，该多能细胞可具有超过60％(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％及95％)的存活率(由本文中所公开的AO/PI方法测定)。

在一个具体实施方案中，在递送时，该多能细胞或单核细胞可具有至少0.25％的CD34⁺CD45⁺细胞(例如，0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1.0％、1.1％、1.15％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5.％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9.％或2.0％)。

在另一个具体实施方案中，在递送时，该多能细胞或单核细胞可具有至少0.10％的CD133⁺细胞(例如，0.10％、0.25、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1.0％、1.1％、1.15％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5.％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9.％或2.0％)。

在又一个具体实施方案中，在递送时，该多能细胞或单核细胞能够在形成大量的集落形成单位(colony forming unit,CFU)集落每平板。举例而言，如图1中所示，在约2至约8℃储存或运送超过72小时之后，每3×10⁴细胞接种平板，该细胞能够形成至少30(例如，40、50、60、70、80、90、95、100或110)CFU集落的细胞。

上述的数值可根据本领域已知的方法或者下述实施例中描述的方法测定。

本发明的一个或多个具体实施方案的细节在下述的具体实施方式中详述。本发明之其它特征、目标及优点将通过说明书和权利要求书而明显可见。

附图说明

图1A、1B、1C及1D为一组示意图，显示细胞在盐水中或在本发明之组合物中以室温或4℃下储存或运输之后的稳定性研究之结果。

具体实施方式

本发明涉及在诸如室温或环境温度(亦即，1至25℃)之条件下以高浓度长时间(例如，12至72小时)包装和/或运送干细胞/多能细胞(例如，脐带血)或包含此类细胞的制剂。如此被包装和运送的干细胞/多能细胞和制剂出乎意料地具有令人满意的存活率和用于临床应用的发展潜能。

如上所述，如本领域所周知的，如果干细胞(例如，胎盘血细胞或脐带血细胞)在取出冷冻之后未迅速处理将出现功能性祖细胞的损失(Ivanovic等.,Transfusion,2011Sep；51(9):2044-5)。然而，在很多情况下，尤其是在采集、扩增、浓缩或处理脐带血细胞的地点(例如，医院或产科诊所)与该等细胞用于治疗患者的地点距离很远时，难以在24小时内实施治疗。此外，无论何种制造方法的治疗性细胞组合物皆需要满足严格的法规准则。举例而言，治疗性细胞组合物应具有足够高的细胞浓度(例如，1×10⁷/ml、1×10⁸/ml)。为此，传统之干细胞/多能细胞包装和运送无法以如此高之细胞浓度运送细胞。为了获得具有如此高细胞浓度的治疗性组合物，临床医师必须进一步处理细胞以增加细胞数量和/或浓度。

但是，由于细胞之扩增或浓缩不被视为是极小操作(minimal manipulation)，故相较于简单从供体获得并仅仅通过极小操作就给予受体而言，经扩增或浓缩的细胞受到更严格的规范。在美国，治疗性细胞的制备方式必须符合美国食品药物管理局(FDA)实施的药品生产质量管理规范(cGMP)的规定。由于治疗中心可能符合或不符合cGMP，传统之干细胞/多能细胞包装和运送限制了这些细胞的应用。

本发明可于环境温度下长时间以足够高的浓度保存及运送干细胞/多能细胞，同时维持至少该干细胞及造血祖细胞的存活率和功能。因此，本发明解决了以高浓度在室温/环境温度下运送干细胞的流程或方法需求。

治疗性组合物

本发明在一个方面涉及治疗性细胞组合物。该组合物包含(i)约1×10⁷至1×10⁹个/ml的治疗性细胞以及(ii)药物学上可接受的载体溶液。该药物学上可接受的载体溶液(a)含有约25至30mM(例如，26至28mM及27mM)的醋酸盐以及约20至25mM(例如，21至24mM及23mM)的葡萄糖酸盐以及(b)具有约270至320mOsmol/L(例如，280至310、290至300及约294或295mOsmol/L的重量渗透摩尔浓度。

治疗性细胞

各种干细胞或多能细胞可用于本发明的实施。该等细胞的实施例包括脐带血细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、骨髓干细胞、外周血干细胞、胎盘血及其它可分化为如神经细胞或神经胶细胞的功能性细胞的干细胞。本发明所述的治疗性细胞可从骨髓、脐带血、脐带、脐带华通氏凝胶(Wharton's jelly)、外周血、淋巴组织、子宫内膜、衍生于滋胚层(trophoblast-derived)的组织、胎盘、羊水、脂肪组织、肌肉、肝脏、软骨、神经组织、心脏组织、牙髓组织、脱落之牙齿(exfoliated teeth)、胚胎源干细胞(ES)或诱导性多能干细胞(iPS)的细胞，或者它们中任意间的组合。

术语“干细胞”是指能够分化为许多分化至最终的特定细胞类型的任何细胞。干细胞来自所有胚层(亦即，外胚层、中胚层及内胚层)。干细胞之典型来源包括胚胎、骨髓、外周血、脐带血、胎盘血、肌肉组织及脂肪组织。

干细胞可为全能的或多能的(pluripotent)。全能干细胞通常具有发育为任何细胞类型的能力。全能干细胞可分衍生于胚胎干细胞及非衍生于胚胎干细胞两种。多能细胞通常能够分化为几种不同的，分化至最终的细胞类型的细胞。举例而言，多能干细胞可产生神经系统细胞、皮肤细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、血液细胞、肌肉细胞、骨骼细胞等。多能干细胞的实施例包括但不限于，脐带血干细胞、神经干细胞、造血干细胞、脂肪源干细胞、间叶干细胞、胎盘源干细胞、落齿源干细胞以及毛囊干细胞。相较于此，多潜能(multipotent)干细胞或成体干细胞通常产生有限的细胞类型。除非另有说明，本文所用之术语干细胞包括祖细胞。单能干细胞仅可产生一种细胞类型，但是其具有不同于非干细胞的自我更新的特性。此等干细胞可源自各种组织或器官系统，包括但不限于，血液、神经、肌肉、皮肤、肠、骨骼、肾脏、肝脏、胰脏、胸腺等。根据本发明，干细胞可源自成体或新生组织或器官。

本发明所描述的细胞可为实质性纯化的。术语“实质性纯化的(substantiallypure)”当用于涉及干细胞或源自干细胞的细胞(例如，分化细胞)时，是指所指定的细胞构成制剂中细胞的实质性部分或大部分(亦即，超过20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％)。举例而言，实质性纯化的细胞群构成制剂中细胞的至少约70％，通常为制剂中细胞的约80％，尤其是制剂中细胞的至少约90％(例如，95％、97％、99％或100％)。

在一个优选的实施方案中，使用脐带血细胞。此等细胞可根据下文之实施例部分中所述的内容或者依据本发明所属技术领域中已知之方法获得，并且随后由标准技术测试。为证实该等细胞的分化能力，可由本发明所属技术领域中已知之方法对其实施诱导以形成，例如，各种集落形成单位。被确证的细胞可在非分化培养基中被进一步繁殖超过10次、20次、50次或100次群落倍增，而不会显示自发分化、衰老、形态改变、生长速率增加，或分化为神经元能力的变化。该等细胞在使用之前可通过标准方法储存。

造血干细胞

造血干细胞为多能干细胞，并且最终产生所有类型的末端分化血细胞。造血干细胞可自我更新，或可分化为更定型的(committed)祖细胞，该等祖细胞被不可逆地确定为仅少数类型之血细胞的祖先。例如，造血干细胞可分化为(i)骨髓祖细胞，该等骨髓祖细胞最终产生单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、巨核细胞/血小板、树突状细胞，或(ii)淋巴祖细胞，该等淋巴祖细胞最终产生T细胞、B细胞及称为自然杀伤细胞(NK细胞)的淋巴细胞样细胞。一旦干细胞分化为骨髓祖细胞，其后裔不能产生淋巴样谱系之细胞，同样，淋巴祖细胞不能产生骨髓样谱系之细胞。对于造血作用及造血干细胞分化的一般讨论，参见阿尔伯茨(Alberts)等人1989年之《细胞分子生物学(第二版)》(Molecular Biology of the Cell,2nd Ed.,Garland Publishing,New York,N.Y.)第17章《分化细胞及组织的维持》(Differentiated Cells and the Maintenance ofTissues)；美国卫生与人群服务部2006年8月《再生医学》(Regenerative Medicine)第2章；以及美国卫生与人群服务部，干细胞信息，2009年《造血干细胞》第5章。

开发体外及体内分析以对造血干细胞进行特征分析，例如，在免疫缺陷小鼠体内进行脾脏集落落形成(CFU-S)分析以及重构分析。再者，通过经单克隆抗体识别定义的细胞表面蛋白标记物的存在与否用于识别和分离造血干细胞。此类标记物包括CD34、CD38、CD43、CD45RO、CD45RA、CD59、CD90、CD109、CD117、CD133、CD166和HLADR，以及它们之间的组合。参见，美国卫生与人群服务部2006年8月《再生医学》(Regenerative Medicine)第2章及其引用的参考文献。

脐带血细胞

人类脐带血和/或人类胎盘血是脐带血干细胞之来源。此类血液可通过本发明所属技术领域中已知之任意方法获得。使用脐带血或胎盘血作为干细胞来源具有大量优点，包括可容易地获得脐带血及胎盘血并且不对供体造成创伤。参见，例如，美国专利第5,004,681号和美国专利第7,147,626号。采集应在无菌条件下进行。采集之后，可立刻将脐带血或胎盘血与抗凝剂混合。此类抗凝剂可为本发明所属技术领域中任意已知的抗凝剂，包括CPD(柠檬酸盐-磷酸盐-葡萄糖)、ACD(酸性柠檬酸盐-葡萄糖)、Alsever氏溶液(Alsever等.,1941,N.Y.St.J.Med.41:126)、De Gowin氏溶液(De Gowin,等.,1940,J.Am.Med.Ass.114:850)、Edglugate-Mg(Smith,等.,1959,J.Thorac.Cardiovasc.Surg.38:573)、Rous-Turner氏溶液(Rous和Turner,1916,J.Exp.Med.23:219)、其它葡萄糖混合物、肝素、双香豆乙酸乙酯(ethyl biscoumacetate)等。参见，例如，Hurn,1968,Storage of Blood,AcademicPress,New York,pp.26-160)。脐带血可通过直接从脐带引流和/或通过在所递送之胎盘根部及扩张静脉进行细针穿刺而获得。通常参见美国专利第5,004,681号。

在一些特定的实施方案中，可对采集的血液样本实施以下常规地或临床指示性的测试，：(i)细菌培养，以确保不存在微生物污染，可使用已有的分析方法，例如，在有氧条件及无氧条件下对细菌进行常规医院培养；以及(ii)对病原体微生物的诊断性筛选，以保证不存在特定病原体微生物，可采用各种诊断性测试。可通过标准流程对可经血液传播的多种病原体中任一者进行诊断性筛选。作为一个实施例，可使用基于检测病毒颗粒、病毒编码蛋白质、HIV特异性核酸、抗HIV蛋白质抗体等的多种检测系统中任一者对所采集之血液样本进行诊断性筛选，以检测是否存在人类免疫缺乏病毒1或2(HIV-1或HIV-2)。亦可对所采集之血液进行其它感染性疾病的检测，包括人类嗜T细胞淋巴球病毒I和II(HTLV-I和HTLV-II)、B型肝炎、C型肝炎、巨细胞病毒、梅毒、西尼罗病毒及其它诸如美国食品药物管理局的相关监管机构指定的感染因子。

优选地，在采集脐带血之前确定母体的健康史，以鉴定该脐带血细胞可能传播的遗传或感染疾病的风险，例如癌症、白血病、免疫疾病、神经系统疾病、肝炎或AIDS。可对所采集的脐带血样本进行下述一种或多种测试：细胞存活率、HLA分型、ABO/Rh血型测试、CD34⁺细胞计数，以及总有核细胞数计数。

一旦在一个人出生时采集到了脐带血和或胎盘血，可对该脐带血和或胎盘血进行处理以产生富集的造血干细胞群或富集的造血干细胞与祖细胞群，从而形成脐带血干细胞群。相对于其它类型的造血细胞，对于存在于造血干细胞或造血干细胞与祖细胞上的某一特定标志物表达水平增高，则判定造血干细胞，或造血干细胞与祖细胞为阳性。举例而言，此类标记物可为CD34、CD43、CD45RO、CD45RA、CD59、CD90、CD109、CD117、CD133、CD166、HLADR，或它们之间的组合。相对于其它类型的造血细胞，该等造血干细胞或者造血干细胞与祖细胞对于某一特定标记物亦可为阴性。举例而言，Lin是用作阴性标记物的谱系特异性抗体的组合。CD38亦提供了阴性标记物的实施例。优选地，这些造血干细胞，或者造血干细胞与祖细胞，为CD34+细胞。

可选择地，在富集单核细胞(MNC)、造血干细胞或者造血干细胞与祖细胞之前，可分离脐带血之红细胞(RBC)与白细胞(WBC)。一旦分离了红细胞与白细胞，则可丢弃红细胞部分，并且可用上述的磁性细胞分离器中处理白细胞部分。白细胞部分与红细胞部分的分离可使用本发明所属技术领域中任意已知的方法实施，该方法包括离心技术。可使用的其它分离方法包括使用市售产品FICOLL或FICOLL-PAQUE或PERCOLL(GE Healthcare,Piscataway,N.J.)。FICOLL-PAQUE通常放置于锥形管之底部，而全血在其上分层。离心之后，可于锥形管内从上至下看到以下各层：血浆及其它成分，被称为棕黄层(buffy coat)的含有外周血单核细胞(白细胞)的MNC层，FICOLL-PAQUE，以及应以球珠状形式存在的红细胞和粒细胞。这一分离技术使得外周血单核细胞易于收获。

可选择地，在选择CD34+细胞之前，可检查等量的新鲜脐带血单位之总有核细胞数计数和/或CD34+含量。在一个具体的实施方案中，在选择CD34+细胞之后，回收CD34+(“CB干细胞”)部分和CD34-细胞部分。可选择地，可从CD34细胞部分的样本中提取DNA用于初步的HLA分型测定以及未来的嵌合研究，即使还没有完成与患者的HLA配型。可在扩增之前可继续处理经富集的CD34+干细胞部分，例如，可将该干细胞悬浮于适宜之细胞培养基中进行运输或储存。

在一个具体的实施方案中，脐带血和/或胎盘血样本中的红细胞被排空，对被排空红细胞的部分中的CD34+细胞进行计数。

药物学上可接受之载体

本文所描述的治疗性组合物包括药物学上可接受的载体或保存溶液，其含有约25至30mM(例如，26至28mM及27mM)之醋酸盐以及约20至25mM(例如，21至24mM及23mM)之葡萄糖酸盐以及(b)具有约270至320mOsmol/L的重量渗透摩尔浓度(例如，约280至310、280至300、290至300、294或295mOsmol/L)。

在一些实施方案中，该载体/保存溶液包括电解质溶液或细胞或组织保存溶液。在一些特定的实施方案中，该载体/保存溶液不是细胞生长培养基。换言之，该溶液缺乏细胞生长所必需之一种或多种营养物(诸如作为氨基酸及氮的来源或者碳源)。举例而言，该保存溶液可仅包含电解质溶液。该电解质溶液可包括，例如，钠离子、钾离子、钙离子、氯离子、锌离子、铁离子和/或镁离子。

优选地，药物学上可接受之载体或保存溶液是等张、无菌、无热原之溶液，其不含抑菌剂或抗微生物剂或附加的缓冲剂。在这种情况下，实施例包括具有多种不同配方的生理平衡的晶体溶液，只要其电解质含量、重量渗透摩尔浓度及pH值方面高度模拟人类血浆。此等溶液亦具有额外的缓冲能力，并且含有可转化为碳酸氢根的例如醋酸根、葡萄糖酸根、甚至乳酸根的阴离子、CO₂及水。正常的生理等张范围大约280至310mOsmol/升。举例而言，此电解质溶液可以是具有约294或295mOsmol/升的容量渗透摩尔浓度的PLASMA-LYTE A或PLASMA-LYTE 148。PLASMA-LYTE A或PLASMA-LYTE 148含有约90mM的NaCl、约5mM的KCl、约1.5mM的MgCl₂、约27mM的三水合醋酸钠，以及约23mM的葡萄糖酸钠。PLASMA-LYTE A具有约7.4的pH值，而PLASMA-LYTE 148具有约6.0之pH值。

作为一种变型，该载体/保存溶液亦可包含缓冲液和/或一种或多种抗氧化剂。举例而言，该缓冲剂可选自于生理缓冲液(硫酸盐、磷酸盐，或碳酸盐)或合成缓冲液(HEPES)。抗氧化剂的实施例包括自由基捕捉剂；诸如去铁胺(deferoxamine)的铁螯合剂；维生素E、维生素C或异抗坏血酸钠；以及硫醇化之衍生物，例如N-乙酰基半胱胺酸、谷胱甘肽或还原型谷胱甘肽。

本文所公开的组合物可在环境温度下长时间保存及运送干细胞/多能细胞，同时维持至少该干细胞及造血祖细胞的存活率和功能性。具体地，组合物可具有足以用于临床用途的细胞浓度。

如本文中所公开的，在一些实施例中，在运送或储存约72小时(3天)之后，和摘除后在胎盘血液单元中即时存活的CD34+细胞数量相比，该组合物可给出至少80％，具体地至少90％，甚至更具体地接近100％的CD34+造血干细胞的含量。在储存/运送约3天之后，和摘除后在胎盘血液单元中即时存活的祖细胞数量相比，该储存/运送方法可给出至少75％，具体地至少80％，甚至更具体地至少90％的存活CD34+祖细胞的含量。

包装产品

在本发明的另一方面，本发明涉及在诸如室温或环境温度的条件下以高浓度长时间包装和/或运送上述的治疗性干细胞或制剂。对于临床应用而言，被包装和运送的细胞或制剂出乎意料地具有令人满意的存活率和发育潜能。

在一个实施例中，脐带血可于医院现场采集或从脐带血库(例如，由STEMCYTE公司维持的脐带血库)获得。尽管可使用任何本发明所属技术领域中认可的采集和储存流程，但优选的流程描述于下述实施例中及WO2012112572中。

通常，应当对多种感染标记物进行无菌检测。此外，在为冷冻保藏的冷冻之前，应测定并记录总细胞数、CD34+细胞数及单元体积。经冷冻保藏的所采集血液中含有RBC，其倾向于在冷冻和解冻过程中破裂。在这种情况下，一旦RBC溶解，则RBC的DNA增加所采集脐带血细胞的粘度并对脐带血细胞用于临床用途的进一步处理造成阻碍。为了防止这一点，可在冷冻保藏之前添加DNAse至所采集之细胞中，以令DNA破裂。这么做可降低细胞的粘性和凝集，从而在渗透梯度(例如，FICOLL)中更好地分离细胞。可使用多种市售DNAse。实施例包括由GENENTECH销售的

可选择地，该脐带血可经处理以移除红细胞，以基本上排空红细胞。若需要，可通过渗透梯度(例如，FICOLL)或以下述实施例1中描述的方式分离脐带血为多个可用单元(例如，总单核细胞(TMN)、白细胞、淋巴细胞、CD34+细胞、CD133+细胞、巨噬细胞，及其它细胞)。另外，如上文所述，待运输之脐带血细胞可从供体新鲜获得且尚未被冷冻。在这种途径中，在包装和/或运送此类新鲜单元的过程中无需DNAse。此外，可根据本发明所属技术领域中已知方法排空血浆，例如，美国申请案20080166324中描述了该内容，该内容通过全文引用而并入本文。

随后，于医院现场或现场外(例如上文所述的血库)的处理设施内包装和准备运送所采集细胞。若细胞已经被冷冻保藏，则可以WO2012112572描述的方式进行解冻。可再度对多种感染标记物进行无菌检测并且应测定并记录总细胞数、CD34+细胞数、浓度及单元体积。随后，这些细胞被置于上述的容器中以形成经指定载具运输的包装。

如上文所描述的，尽管可使用多种药物学上可接受之载体或保存溶液，但优选诸如Plasma-Lyte A的等张或生理平衡盐溶液。此等溶液可以非常高的浓度保存细胞，并获得更好的细胞存活率。此外，此等溶液能够在无大气CO₂(0.04％)下维持长期pH稳定性。如此包装和运送的细胞可不经任何进一步处理(例如，进一步浓缩)而直接作为药物组合物给药至有此需要的受试者。

如本文所公开的，该容器之材料可以是任何合适的材料，并且优选为获得临床应用的批准。通常，该材料可以是对于细胞为低摩擦或无粘性，且对于细胞无毒性或对干细胞接收者无害的聚合物。合适的聚合物的实施例包括但不限于，聚四氟乙烯(PTFE)、全氟烷氧基聚合物(PFA)、氟化乙烯丙烯(FEP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚乙烯、聚氯乙烯(PVC)、超低密度聚乙烯、低密度聚乙烯(LDPE)、线性低密度聚乙烯(LLDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、同轴定向聚丙烯(COPP)、双轴定向聚丙烯(BOPP)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、诸如尼龙的聚酰亚胺树脂、乙烯-乙烯醇聚合物(EVOH)，及其它们的金属化形式。如果其它聚合物的摩擦系数(相对于经抛光之钢)与上文述及的聚合物相当或低于后者，亦可使用该等其它聚合物。上述聚合物的摩擦系数是本发明所属技术领域中公知内容，并且通过引用并入本文。举例而言，摩擦系数可低于0.5，诸如0.4、0.3、0.2或0.1。在一个优选的实施方案中，可使用由杜邦公司(DUPONT)以商标TEFLON销售的PTFE、PFA、PEP或PVDF的容器、基于HYCLONE’S聚乙烯的容器或基于TERUMO的PVC的容器。

该容器的基材可形成任何适宜于接收并容纳细胞的形状。这些形状的实施例包括但不限于，袋、管、注射器或用于注射器的小瓶。在一些具体的实施方案中，该基材形成为适用于培养的形状或适用于在诸如CNS的各种组织中移植或植入干细胞之位点的形状。实施例包括带、膜、线、载玻片、微球、微粒、细胞培养板、多孔板及生物反应器，它们全部都可接收细胞。

如本文中所描述的，在运送过程中，包装内的细胞不必保持在较低温度下(如冷冻保藏)或连夜递送。反之，细胞可在相当广泛的温度范围内(包括室温)运送非常长的时间(例如，1至8天)。尽管这些较不严格的条件，但更为优选地在保温容器中运送该包装和/或使用温度探针监控，以在需要时向运送者或接纳者提供讯息。由于条件较不严格，因而省却了与运送冷冻保藏细胞相关的成本。此外，由于运送时间可长达1至8天，如跨洲之长距离运送变为实际可行。因此，远离特定干细胞供源的患者(例如，具有罕见、HLA配型者)将能受益于干细胞移植。

一旦从运输者处收到细胞之后，可以下述实施例中所描述的方式处理该等细胞并对用于移植的适宜性进行测试。为此，可使用以下四种标准以确定所运送的单核细胞是否适用于移植。

细胞计数

对于移植和分析而言必须有足够多的活细胞。优选地，移植(例如，至脊髓中)所需细胞数目优选为至少两倍，以便剩余有足量细胞用于分析细胞。如果运送所含细胞较少，则该运送应不适用于移植。

存活率

制剂中应避免过多死亡细胞。为此，可使用台盼蓝拒染法(Trypan BlueExclusion,TBE)进行手动计数作为存活率的标准。以百分比表示，细胞悬浮液的TBE表示未染成蓝色之细胞除以染色与未染色细胞之总数的数值。对于指定用于移植的细胞，TBE应至少为70％。一般而言，如下文实施例中所描述的洗涤步骤会清除死亡细胞，并且在移植之前的细胞悬浮液的TBE通常大于90％。

污染

有关污染的任何迹象或风险都应该报告。举例而言，其包括运送袋中有流体的任何泄露、细胞悬浮液中的异常浊度、显微镜下可见细菌或真菌，或先前污染的报告。如本文中所公开的，应小心排除母体乙型肝炎核心抗原阳性的脐带血单元，以及通常会将脐带血单元从国家骨髓捐赠者项目(National Marrow Donor Program,NMDP)登记项中排除的所有其他的感染因子阳性的脐带血单元。

单核细胞

最终制剂应具有95％或更多的单核细胞。如果细胞的存活率计数显示其它细胞超过5％，如红细胞或嗜中性粒细胞，则不应将该等细胞用于移植。应注意的是，脐带血中可能存在一些不成熟的有核红细胞。

在上文描述的步骤中，可将抗生素加入细胞制剂中。举例而言，可在开始处理细胞时加入庆大霉素(gentamycin)以降低处理和运送过程中污染的风险。庆大霉素可抑制细菌生长，即使既往多次培养基填充测试显示无污染介入。

在上文描述的步骤中，可使用诸如美国申请案20100189696、20100323920、20080227197及20080166324中描述的方法进一步处理脐带血干细胞以扩增干细胞池，亦即，体外扩增，上述文献通过引用全文并入本文。术语“体外扩增”系指于实验室内培养干细胞。此类细胞可从哺乳动物提取，并于适宜环境中，例如在含有锂盐之培养基中，培育更多数量的细胞。若可能，建立稳定之细胞系以允许细胞持续繁殖。

用途

本发明的实施方案涉及在美国FDA或美国以外国家的同等监管机构执行的cGMP规则下可能的制造、储存或运送治疗性细胞的商业化供应。该等治疗性细胞和组合物可用于治疗多种疾病及病变。所述病变的实施例包括但不限于，退行性疾病、缺血性病症(例如，肢体缺血、充血性心脏衰竭、心脏缺血、肾缺血和ESRD、中风及眼部缺血)、需要器官或组织再生之疾病(例如，肝脏、胰脏、肺、唾液腺、血管、骨骼、皮肤、软骨、肌腱、韧带、脑、毛发、肾、肌肉、心肌、神经及肢体的再生)、炎性疾病(例如，心脏病、糖尿病、脊髓损伤、类风湿性关节炎、骨关节炎、由于髋关节置换或翻修所致之炎症、克罗恩病(Crohn's)，及移植物抗宿主病)、自体免疫疾病(例如，1型糖尿病、牛皮癣、系统性红斑狼疮，及多发性硬化症)、先天性疾病，诸如贫血、嗜中性粒细胞减少症、血小板增多症的血液性疾病，或者诸如白血病和淋巴瘤的血液肿瘤及癌症。

定义

如本文中所使用的，“治疗性细胞”系指减轻患者之病症、疾病和/或损伤的细胞群体。治疗性细胞可为自体的(亦即，源自该患者)、同种异体的(亦即，源自与该患者同一物种但不同于该患者的个体)或异种的(亦即，源自与该患者不同之物种)。治疗性细胞可为均质的(亦即，由单一细胞类型组成)或异质的(亦即，由多种细胞类型组成)。术语“治疗性细胞”包括治疗活性细胞以及能够分化为治疗活性细胞的祖细胞两者。

“生长培养基”系指设计为支持微生物或细胞生长的固体、液体或半固体。生长培养基包含集落或细胞生长可能所需的至少最低营养物质，诸如碳源(可能为糖，如葡萄糖，或能量较不丰富之来源，诸如琥珀酸盐)、各种盐类(可提供如镁、氮、磷及硫之必要元素)，以及水。

如本文所使用的，“生理平衡”盐溶液系指调节盐和其他组分之浓度以等张于人类细胞之溶液或介质，其容量渗透摩尔浓度大约为280至310mOsmol/L，并且处于生理pH值，大约pH 7.3至7.4。生理平衡之盐溶液的实施例包括但不限于，Hank氏碱性盐溶液、α最低必要培养基(aMEM)、Dulbecco氏最低必要培养基(DMEM)、Iscove氏修饰之Dulbecco氏培养基(IMDM)以及如Plasma-Lyte A的Plasma-Lyte溶液。

如本文所使用的，“高张”、“等张”及“低张”为相对性术语，例如，关于两个腔室(诸如血浆与细胞内流体(ICF))之间的渗透压差或梯度的生理性的重量渗透摩尔浓度。因此，“等张”溶液系指与生理性的重量渗透摩尔浓度等张之任何生理和/或药物学上可接受的溶液。

为了确定药学制剂相对于血液是否为等张、高张或低张，计算包括稀释剂在内的溶液的全部化学组分的容量渗透摩尔浓度。可计算液体及溶解或稀释之药物的张度，其可以每公升液体毫摩尔(milliosmoles)的数值(mOsm/L)或每公斤溶剂毫摩尔的数值(mOsm/kg)表示。此等两个值亦分别称为容量渗透摩尔浓度(osmolarity)及重量渗透摩尔浓度(osmolality)。血液的容量渗透摩尔浓度介于285与310mOsm/L间之范围，而血液的重量渗透摩尔浓度介于275与299mOsm/kg间之范围。

溶液的容量渗透摩尔浓度的概念是一部分基于渗透作用及渗透压。渗透作用为溶质(溶解之颗粒)扩散或流体通过例如血管或细胞膜的半透膜的转移。相较于如血液或血浆的生物液体，以渗透浓度(osmolar concentration)表示的渗透压可促进分子跨膜运输，且通常称为低渗透(低张)、等渗透(等张)或高渗透(高张)。术语“张度”与“渗透压力”通常视为同义词。

渗透压力是指为阻止水因应“渗透梯度”(亦即，位于膜两侧的不同的颗粒浓度)通过半透膜而所需的流体静水压力(或液压)。血清的重量渗透摩尔浓度可使用渗透压计测量，也可以该溶液中存在的溶质浓度总和计算。

如本文所用，张度及渗透压应视为同义词，且应广义地理解。张度可表示有效的重量渗透摩尔浓度，且等于溶液中有跨膜(包括细胞膜)渗透能力的溶质的浓度总和。在严格意义上，重量渗透摩尔浓度系特定溶液之特性，且与任何膜不相关。张度是溶液在涉及具体膜时的特性。但是，本发明是相对于诸如血液或血浆的生物溶液而言溶液是等张、高张或低张的，并且该所指应包括下述意义：该特定溶液是相对于血液或血浆或其它生物溶液中之细胞的细胞膜而言而与血液或血浆呈等张、高张或低张的。

张度之操作定义可用以解释该术语。这可基于添加测试溶液至全血中并观察结果的实验。如果全血中之RBC溶胀并破裂，则称该测试溶液与正常血浆相比为低张。如果全血中之RBC收缩并变为锯齿状，则称该测试溶液与正常血浆相比为高张。如果RBC保持原状，则称该溶液为与血浆等张。RBC细胞膜可作为参考膜。例如，置于生理盐水(亦即，0.9％之氯化钠)中之全血将不会溶胀，因此，生理盐水被视为等张。

术语“繁殖(proliferation)”和“扩增(expansion)”在本文中指向细胞时可互换使用，其是指相同类型之细胞的数量通过分裂而增加。术语“分化”是指细胞特化具有特定功能的发育过程，例如，细胞获得一种或多种不同于初始细胞类型的形态特征和/或功能。脐带血干细胞扩增方法为本发明所属技术领域中已知方法。此类扩增技术包括美国专利第7,399,633号；WO/2013/086436；WO/2013/179633；US20180353541；Delaney等.,2010,Nature Med.16(2):232-236；Zhang等.,2008,Blood 111:3415-3423；及Himburg等.,2010,Nature Med.16,475-482中的所描述的内容。

术语“分化”包括谱系定向进程及终末分化进程两者。举例而言，分化可通过使用免疫组织化学或本发明所属技术领域其它公知技术监测谱系标记物存在与否对分化进行评价。源自祖细胞的分化后代细胞可以关联到与干细胞来源组织具有相同的胚层或组织(但不必然)。例如，神经祖细胞及肌肉祖细胞可分化为造血细胞谱系。

术语“谱系定向”和“特化(specification)”在本文中述及干细胞所经历的产生祖细胞的过程时可互换使用，所述祖细胞能够定向形成特定谱系范围的分化细胞类型。

术语“终末分化”是指细胞成为成熟细胞的最终分化。举例而言，造血祖细胞及肌肉祖细胞可分化为神经或神经胶质细胞谱系，其终末分化产生成熟神经元或神经胶质细胞。终末分化通常与退出细胞周期并停止增殖相关。

本文所用术语“祖细胞”系指定向分化为特定细胞谱系，并通过一系列细胞分裂产生该谱系细胞的一种细胞。祖细胞的实施例包括神经元谱系、肝谱系、肾原性谱系、脂肪形成谱系、成骨谱系、破骨谱系、肺泡谱系、心脏谱系、肠谱系或内皮谱系的前体细胞。

术语“培养”系指在可增殖并避免衰老的条件下维持干细胞。举例而言，在本发明中，在含有锂盐和可选择的一种或多种生长因子(即，生长因子混合液)的培养基中培养干细胞。

术语“脐带血”系指从出生后留下的脐带之血液中获得的多能(pluripotent)及多潜能(multipotent)干细胞源。脐带血中得到的干细胞的实施例包括但不限于，间叶干细胞、造血干细胞以及祖细胞。间叶干细胞及祖细胞通常可分化为神经细胞、骨髓基质细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、腱细胞及韧带细胞。造血干细胞通常可产生淋巴样谱系细胞、骨髓样谱系细胞及红细胞样谱系细胞。采集及处理脐带血之方法的详细说明提供于下文中。

术语“脐带血单元”系指从单一供体采集的脐带血的体积。本发明方法中通常使用单一脐带血单元，但亦可使用多脐带血单元，例如双脐带血单元以增加干细胞数量。

术语“脐带血干细胞”系指源自在出生时采集的人脐带血和/或人胎盘血的富含造血干细胞的群体，或富含造血干细胞及祖细胞的群体。相较于其它类型的造血细胞，如果存在于造血干细胞或造血干细胞与祖细胞上的某一特定标志物表达水平增高，则判定造血干细胞，或造血干细胞与祖细胞为阳性。举例而言，此类标记物可为CD34、CD43、CD45RO、CD45RA、CD59、CD90、CD109、CD117、CD133、CD166、HLA DR，或它们之间的组合。此外，相对于其它类型的造血细胞，该等造血干细胞或者造血干细胞与祖细胞对于某一表达的标记物亦可为阴性。举例而言，此类标记物可为Lin、CD38或其组合。在具体的实施方案中，该等造血干细胞或者造血干细胞与祖细胞为CD34+细胞。

如本文所用，术语“实质性排空血浆”及“血浆排空”系指经处理已移除大于约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％血浆体积的脐带血单元。举例而言，可通过离心脐带血并分离细胞部分与血浆部分以实质性排空血浆。实质性排空后剩余的血浆体积通常为约0体积％至约30体积％，优选为约10体积％至约30体积％。

如本文所用，术语“非红细胞排空”及“红细胞未排空”系指经处理已移除小于约30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的红细胞体积的脐带血单元。本文所用术语“实质性排空红细胞”及“红细胞排空”系指经处理已移除大于约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的红细胞体积的脐带血单元。

“有核细胞”系指具有细胞核(亦即，包含染色体DNA的细胞器)的细胞。有核细胞包括例如白细胞和干细胞。“无核细胞”包括例如成体红细胞。

制剂内细胞的有效治疗数量可为大于10²个细胞、大于10³个细胞、大于10⁴个细胞、大于10⁵个细胞、大于10⁶个细胞、大于10⁷个细胞、大于10⁸个细胞、大于10⁹个细胞、大于10¹⁰个细胞，或大于10¹¹个细胞。在一些特定的实施方案中，制剂可经校准以在给药至受试者时提供每公斤100万至2000万个细胞。

本文所公开的制剂中，细胞通常在1公升或更小、500ml或更小、250ml或更小或者100ml或更小的体积内。因此，给药之细胞的密度通常大于10⁷个细胞/ml或10⁸个细胞/ml或更大(例如，10⁹个细胞/ml)。

本文所公开的制剂可制备为例如注射、输注、灌注或灌洗等方式给药。该制剂可进一步配制为用于骨髓、静脉内、皮内、动脉内、淋巴结内、淋巴管内、腹膜内、病灶内、前列腺内、阴道内、直肠内、局部、硬膜内、肿瘤内、肌肉内、囊泡内，和/或皮下注射。

“有效量”是指导致受试者产生理想的生理变化所需的细胞数量。“预防性治疗”包括给药于未表现出病症之迹象或症状之受试者的治疗，该治疗是出于减少、预防或降低疾病发展之风险的目的。“治疗性治疗”包括给药于表现出病症之症状或迹象之受试者的治疗，该用药是出于减轻该病症之严重性或进展之目的。治疗性治疗亦可部分地或完全地解决该疾病。

术语“治疗性组合物”或“药物组合物”系指活性因子与载体的组合物，载体是惰性或活性的，以使该组合物尤其适用于体内或体外的诊断或治疗用途。

本文所用之术语“药物学上可接受的”系指在合理的医学判断范围内，适宜于接触人类及动物之组织而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，且具有合理的效益/风险比例之化合物、材料、组合物和/或剂型。“药物学上可接受之载体”在给药至受试者后或给药至受试者时不会造成不良生理效应。该药物组合物中之载体必须为“可接受”，从某种意义上说，是指其与活性成分兼容并且能够稳定该活性成分。一种或多种增溶剂可用作递送活性化合物的药物载体。药物学上可接受之载体的实施例包括但不限于，生物兼容之媒介物、佐剂、添加剂及稀释剂，以使组合物能够作为剂型使用。其它载体的实施例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素及十二烷基硫酸钠。

术语“受试者”包括人类和非人类动物。优选的治疗受试者为人类。如本文中所使用的，术语“受试者”与“患者”可互换使用，不考虑该受试者是否已经或正在接受任何形式之治疗。如本文所用的，术语“受试者”及“多个受试者”可指任何脊椎动物，包括但不限于，哺乳动物(例如，牛、猪、骆驼、羊驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠及小鼠、非人灵长动物(例如猴，例如食蟹猕猴、黑猩猩等)，以及人类)。在一个具体实施方案中，该受试者为人类。在另一具体实施方案中，该受试者系实验性的非人动物或适宜于疾病模式的动物。

如本文所使用的，“治疗(treating或treatment)”系指将化合物或因子或组合物给药至具有病症或处于患病风险下的受试者，以出于治愈、减轻、缓解、补救、延迟发生、预防或改善该病症、该病症综合征、该病症的继发性疾病状态或罹患该病变之倾向。术语“预防(prevent、preventing或prevention)”、“预防性治疗”等类似用语系指降低受试者罹患该疾病或病症的可能性，该受试者未患，但是处于易患该疾病或病症的的风险之中。“改善”通常系指降低疾病或病症之指征或综合征的数量或严重性。

术语“给药”系指将因子、化合物或组合物递送至理想的生物作用部位的方法。此等方法包括但不限于，局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、皮内递送、肌肉内递送、鞘内递送、结肠递送、直肠递送，或腹膜内递送。

如本文中所公开的，本发明提供了大量的数值范围。应当理解，除非上下文另外明确指明，该范围的上限值与下限值之间的，以下限值的十分之一为单位的每个中间值也都被具体公开。界于所指定范围中任何指定值或中间值与所指定范围中任何另一指定值或中间值之间的每个较小范围也被包括于本发明内。此等较小范围的上限值及下限值可独立地被包括或被排除于该范围内，而且每一个范围也被包括在本发明中，所述每一个范围或是包括两个限值，或是包括一个限值，或是两个限值都不包括，以所指定范围中任何特定排除的限值为准。若所指定之范围包括一个或两个限值，则排除了该一个或两个限值的范围亦包括于本发明中。

术语“约(about)”或“大约(approximately)”系指由本发明普通技术人员对一个特定值所确定的一个可接受的范围，其部分地取决于如何测量或确定该特定值，例如，测量系统的限制。举例而言，“约”可表示一个给定值的高至20％、优选地高至10％、更优选地高至5％，尤为优选地高至1％的一个范围。除非另作说明，术语“约”系表示特定值在可接受的误差范围之内。

实施例

实施例1

本实施例描述了包装自冷冻STEMCYTE脐带血单元(UCBU)新鲜收集或解冻的脐带血细胞的示例性步骤。简而言之，使用本发明所属技术领域中已知之标准方法采集脐带血细胞。可选择地，根据WO2012112572中描述的步骤解冻一袋或多袋冷冻的UCBC，通过引用WO2012112572而将其全文并入本文。随后，令该等细胞进行如WO2012112572中描述的血液溶解步骤或MNC分离步骤。接着，将该等细胞系与含有约1％HAS的药物学上可接受之载体/保存溶液混合。这里使用的两种药物学上可接受之载体/保存溶液为盐水及PLASMA-LYTEA，调节该等细胞的浓度至约1×10⁹/ml。被如此包装的细胞于室温或4℃下在12小时至96小时(4天)时间内运输至不同地点。

实施例2

在本实施例中，以上述实施例1中描述的方式对被包装和运送的细胞进行分析。简而言之，以WO2012112572中，描述的方式对该等细胞包装进行检查并开封。细胞存活率分析、以WO2012112572中描述的方式进行UCB-MNC之细胞计数以及CFU分析。结果显示于图1A至图1D中。

如图中所示，以PLASMA-LYTE A中包装并运送的细胞在4℃下(“P-cold”)显示高于其它条件下的存活率(通过吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色)、总CFU数、总共有核细胞数(TNC)回收率，以及表达CD34/CD45标记物的细胞，该其它条件诸如室温下PLASMA-LYTE A(“P-rt”)、室温之盐水(“S-rt”)以及2至8℃之盐水(“S-cold”)。举例而言，在运送或储存约72小时(3天)后，在2至8℃下以PLASMA-LYTE A(“P-cold”)包装和运送的细胞具有大于80％的存活率、大于80％的TNC回收率、大于90的CFU/板(每3×10⁴个接种之细胞)，以及大于0.5％的CD34⁺/CD45⁺细胞。

前述的实施例及对优选实施方案的描述应被视为示例性说明，而不应视为对由权利要求定义的本发明的限定。易于理解的是，对上述公开的各种技术特征进行大量的改变和组合依然可以在不背离由权利要求所定义的本发明的情况下实施。这样的改变不被视为脱离本发明的范围，所有这样的改变应当视为被包括在下述的权利要求的范围内。本文中所引用之全部参考文献皆以全文引用方式而并入本文中。

Claims (23)

1.一种治疗性组合物，其特征在于，所述组合物包含(i)约1×10⁷至1×10⁹/ml的治疗性细胞；以及(ii)药物学上可接受的载体溶液，所述载体溶液(a)含有约25至30mM的醋酸盐和约20至25mM的葡萄糖酸盐，以及(b)具有约270至320mOsmol/L的重量渗透摩尔浓度。

2.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其特征在于，所述药物学上可接受的载体溶液含有以下之一种或多种：约120至160Mm的Na⁺、约3至7mM的K⁺、约1.0至2.0mM的Mg²⁺，以及约90至110mM的Cl^-。

3.根据权利要求2所述的治疗性组合物，其特征在于，所述药物学上可接受的载体溶液不含Ca²⁺或乳酸盐，或两种都不含。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述药物学上可接受的载体溶液含有：约140mM的Na⁺、约5mM的K⁺、约1.5mM的Mg²⁺、约98mM的Cl^-、约27mM的醋酸盐、以及约23mM的葡萄糖酸盐。

5.根据权利要求4所述的治疗性组合物，其特征在于，所述药物学上可接受的载体溶液含有：约90mM的氯化钠(NaCl)、约5mM的氯化钾(KCl)、约1.5mM的氯化镁(MgCl₂·6H₂O)、约27mM的三水合醋酸钠(C₂H₃NaO₂·3H₂O)、以及约23mM的葡萄糖酸钠(C₆H₁₁NaO₇)。

6.根据权利要求1所述的治疗性组合物，其特征在于，所述药物学上可接受的载体溶液具有126至154mEq/L的钠。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述药物学上可接受的载体溶液具有5.5至8.0的pH。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述治疗性组合物不含DMSO或含有微量的DMSO。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述治疗性组合物含有约1×10⁸/ml治疗性细胞。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述治疗性细胞包含单核细胞。

11.根据权利要求10所述的治疗性组合物，其特征在于，所述细胞包含脐带血细胞、造血干细胞、间叶干细胞、胚胎干细胞、外周血细胞、骨髓细胞、或胎盘血细胞。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述细胞包含CD13⁺、CD34⁺、或CD134⁺细胞。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述治疗性组合物含有约0.5％至约5％的血清或血清白蛋白。

14.根据权利要求13所述的治疗性组合物，其特征在于，所述血清或血清白蛋白为人类血清或人类血清白蛋白。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的治疗性组合物，其特征在于，所述组合物具有约1至10℃、约2至8℃或约3至5℃范围内的温度。

16.根据权利要求15所述的治疗性组合物，其特征在于，所述组合物具有约4℃的温度。

17.一种包装产品，其特征在于，所述包装产品包含：

根据权利要求1至16中任一项所述的组合物，以及

容纳所述组合物且包含基材的容器，其中，所述基材包含聚合物。

18.根据权利要求17所述的包装产品，其特征在于，所述容器为袋、管、注射器、或用于注射器的小瓶。

19.根据权利要求17至18中任一项所述的包装产品，其特征在于，所述容器被密封。

20.一种用于储存或运送细胞的方法，其特征在于，所述方法包括(i)提供根据权利要求1至19中任一项所述的治疗性组合物或包装产品，以及(ii)以1至10℃之范围内的温度储存或运送所述组合物约24至96小时。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述细胞包含单核细胞。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其特征在于，在所述储存或运送之后，所述细胞于能够进行以下一者或多者：

形成超过30CFU/3×10⁴个细胞，

具有超过40％的回收率，或

具有超过40％的存活率。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其特征在于，所述治疗性组合物被储存或运送约72小时。

Images