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CN113795581A - 具有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子 - Google Patents

具有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子 Download PDF

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CN113795581A CN202080032477.1A CN202080032477A CN113795581A CN 113795581 A CN113795581 A CN 113795581A CN 202080032477 A CN202080032477 A CN 202080032477A CN 113795581 A CN113795581 A CN 113795581A
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Abstract

本文提供了具有带茎环结构的缩短的有义链以及反义链的双链核酸抑制剂分子。还提供了用于降低靶基因表达的方法和组合物以及用于治疗感兴趣的疾病的方法和组合物。

Description

具有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年5月3日提交的美国临时专利申请号62/842,908的权益并依赖于其申请日。将本段落中提及的每一个相关申请的全部内容通过援引以其整体并入本文。
背景技术
寡核苷酸是核苷酸(RNA、DNA及其类似物)的聚合序列。核酸抑制剂分子是调节细胞内RNA水平的寡核苷酸，并且已经在癌症、病毒感染和遗传病症的治疗中显示出早期前景。核酸抑制剂分子可以通过多套机制调节RNA表达，这些机制包括RNA干扰(RNAi)。
RNAi是在大多数真核生物中发现的保守途径，其中双链RNA分子(dsRNA)抑制具有与dsRNA互补序列的靶基因的表达。在典型的RNAi途径中，较长的dsRNA被Dicer酶切割成较短的RNA双链体，称为小干扰RNA(“siRNA”)。siRNA已显示与Dicer、反式激活应答RNA结合蛋白(TRBP)和Argonaute 2(“Ago2”)结合形成复合物，有时称为RNA诱导的沉默复合物(“RISC”)。Ago2是一种使用siRNA的反义链(也称为引导链)切割靶mRNA以引导序列特异性的靶mRNA切割的内切核酸酶。
这些年来，已经开发出多种双链RNAi抑制剂分子结构。例如，RNAi抑制剂分子的早期工作集中在模拟天然siRNA的双链核酸分子上，每条链的大小为19-25个核苷酸，具有至少一个1到5个核苷酸的3′-突出端(参见，例如，美国专利号8,372,968)。随后，开发了更长的双链RNAi抑制剂分子，其在体内被Dicer酶加工成活性RNAi抑制剂分子(参见，例如，美国专利号8,883,996)。后来的工作开发了延伸的双链核酸抑制剂分子，其中至少一条链的至少一个末端延伸到分子的双链靶向区域之外，包括其中一条链包含热力学稳定四环结构的结构(参见，例如，美国专利号8,513,207、美国专利号8,927,705、WO 2010/033225和WO2016/100401，其各自通过引用以整体并入本文)。
在某些情况下，已将化学修饰的核苷酸引入核酸抑制剂分子以引入在特定条件(例如在体内施用后经历的条件)下可能需要的特性。此类化学修饰的核苷酸包括被设计成例如稳定对抗降解或干扰寡核苷酸的结构或活性的核酸酶或其他酶、增加寡核苷酸的细胞摄取或改善寡核苷酸的药代动力学特性的那些核苷酸。
然而，开发新的双链核酸抑制剂分子结构和/或掺入化学修饰的核苷酸来赋予此类核酸抑制剂分子期望特性的愿望必须与竞争的需求相平衡，以使结构和/或化学修饰的核苷酸可能对核酸抑制剂分子活性的任何负面影响最小化(例如，使靶基因敲低的效力或持续时间的任何降低最小化)。
发明内容
本申请涉及具有带茎环结构的有义链以及分离的反义链的双链核酸抑制剂分子，其中有义链在其5′-端具有减少的长度，导致在反义链的3′-端具有更长的单链突出端。所述双链核酸抑制剂分子含有：1)在所述有义链(S)的第一区域(R1)和所述反义链(AS)之间的第一双链体(D1)；2)所述有义链的第二区域(R2)中对应于所述茎环结构的所述茎的第二双链体(D2)；及3)连接R2的第一子区域(S1)和第二子区域(S2)的环。参见图1A-D。另外，茎环结构通常含有四环或三环并且位于有义链的5′-或3′-端。令人惊讶的是，发现有义链的5′-端可以显著缩短而不降低双链核酸抑制剂分子的效力。参见例如实施例1-4。
此外，如先前在美国临时申请号62/657,428和62/778,759中所证明的，将增加Tm的核苷酸(例如，双环核苷酸)并入含有四环或三环的双链核酸抑制剂分子的茎双链体(D2)中可以赋予所述双链核酸抑制剂分子增加的稳定性，这部分地通过体内靶mRNA敲低的持续时间延长来证明。本文进一步公开了将额外的增加Tm的核苷酸并入本文公开的双链核酸抑制剂分子的缩短的有义链的第一区域(R1)中，例如在核苷酸1、7、8、9或10中的一个或多个处并入，可以赋予所述缩短的有义链核酸抑制剂分子增加的稳定性。参见，例如，实施例2和3。
一方面涉及双链核酸抑制剂分子，其包含：
有义链，所述有义链包含15-43个核苷酸并且具有第一区域(R1)和第二区域(R2)；
反义链，所述反义链包含18-35个核苷酸和5′-与3′-端，其中所述反义链在3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端，并且其中所述有义链和所述反义链是分开的链；
由所述有义链的所述第一区域和所述反义链形成的第一双链体(D1)，其中所述第一双链体具有8-29个碱基对的长度；
其中所述有义链的所述第二区域包含第一子区域(S1)、第二子区域(S2)以及接合所述第一子区域与所述第二子区域的单链环，其中所述第一子区域和所述第二子区域形成第二双链体(D2)；并且
其中所述第二双链体具有6个碱基对的长度并且不包含增加Tm的核苷酸或具有1-5个碱基对的长度并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有15-30个核苷酸；反义链具有20个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有10-14个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有16-31个核苷酸；反义链具有21个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有11-15个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有17-32个核苷酸；反义链具有22个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有12-16个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有18-33个核苷酸；反义链具有23个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有13-17个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有19-34个核苷酸；反义链具有24个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有14-18个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有20-35个核苷酸；反义链具有25个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有15-19个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有21-36个核苷酸；反义链具有26个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有16-20个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有22-37个核苷酸；反义链具有27个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有17-21个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有23-38个核苷酸；反义链具有28个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有18-22个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有24-39个核苷酸；反义链具有29个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有19-23个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有25-40个核苷酸；反义链具有30个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有20-24个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有26-41个核苷酸；反义链具有31个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有21-25个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有27-42个核苷酸；反义链具有32个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有22-26个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有28-43个核苷酸；反义链具有33个核苷酸，包括3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且第一双链体具有23-27个碱基对的长度。
在某些实施方案中，反义链具有20-24、21-23或22个核苷酸。在某些实施方案中，反义链在其3′-端具有7-9个核苷酸的单链突出端。
在某些实施方案中，第一双链体(D1)具有12-16个碱基对的长度。
在某些实施方案中，环是四环或三环。
在某些实施方案中，一种双链核酸抑制剂分子，包含：
有义链，所述有义链包含21-32个核苷酸并且具有第一区域(R1)和第二区域(R2)；
反义链，所述反义链包含22个核苷酸和5′-与3′-端，其中所述反义链在3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端，并且其中所述有义链和所述反义链是分开的链；
由所述有义链的所述第一区域和所述反义链形成的第一双链体(D1)，其中所述第一双链体具有12-16个碱基对的长度；
其中所述有义链的所述第二区域包含第一子区域(S1)、第二子区域(S2)以及接合所述第一子区域与所述第二子区域的单链三环或四环，其中所述第一子区域和所述第二子区域形成第二双链体(D2)；并且
其中所述第二双链体具有6个碱基对的长度并且不包含增加Tm的核苷酸或具有3-5个碱基对的长度并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，反义链中的至少一个核苷酸被2′-F修饰并且侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，反义链包含的至少两个核苷酸被2′-F修饰并且侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，反义链的核苷酸14被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到反义链的核苷酸13和15。在某些实施方案中，反义链的核苷酸2被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到反义链的核苷酸1和3。在某些实施方案中，反义链的核苷酸2和14被2′-F修饰并且核苷酸14两侧的侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，含磷的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，有义链的区域1包含至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，有义链的核苷酸1是双环核苷酸。在某些实施方案中，有义链的区域1包含至多三个增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，与反义链的核苷酸6碱基配对的有义链的区域1中的核苷酸是增加Tm的核苷酸和/或与反义链的核苷酸5碱基配对的有义链的区域1中的核苷酸是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，与反义链的核苷酸1-4碱基配对的有义链的区域1中的核苷酸中无一是增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，第二双链体具有1-3个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体含有2-10个增加Tm的核苷酸并且具有1-5个碱基对的长度或第二双链体含有2-6个增加Tm的核苷酸并且具有1-3个碱基对的长度。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链的长度在16-33个核苷酸之间，反义链的长度在21-23个核苷酸之间，第一双链体具有12-17个碱基对的长度，并且第二双链体具有1-3个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链的第一区域的长度为12-16个核苷酸，并且有义链的第二区域的长度为5-10个核苷酸并且含有三环或四环；
其中由所述有义链的所述第一区域和所述反义链形成的所述第一双链体具有12-16个碱基对的长度；
其中由所述有义链的所述第二区域的所述第一核酸和所述第二核酸形成的所述第二双链体具有3个碱基对、2个碱基对或1个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸；并且
其中反义链的长度为22个核苷酸，包含在3′-端的6-10个核苷酸的单链突出端。
在某些实施方案中，有义链的第二区域的长度为五或六个核苷酸，并且第二双链体(D2)具有1个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)包含至少两个增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，环是四环，并且所述四环为选自UNCG、GNRA、CUUG、A/UGNN、GGUG、RNYA、AGNN的RNA四环或选自d(GNAB)、d(CNNG)或d(TNCG)的DNA四环。在某些实施方案中，四环具有序列GAAA。
在某些实施方案中，环是四环。在某些实施方案中，三环具有序列GAA。
在本文所述的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，增加Tm的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹及其类似物、己糖醇核苷酸和修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸在糖部分的2′-碳处未用2′-F或2′-OMe修饰。在某些实施方案中，该修饰的核苷酸为5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-丙炔基-修饰的嘧啶、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿苷、5Me-硫代尿苷或假尿苷。
在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸包含第一环和桥，其中该第一环为呋喃糖基，该桥连接呋喃糖基的2′-碳和4′-碳以形成第二环。
在某些实施方案中，连接呋喃糖基的2’-碳和4’-碳的桥选自由以下组成的组：
a)4′-CH2-O-N(R)-2′和4′-CH2-N(R)-O-2′，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团，包括例如4′-CH2-NH-O-2′(也称为BNANC)或4′-CH2-N(CH3)-O-2′(也称为BNANC[NMe])；
b)4′-CH2-2′；4′-(CH2)2-2′；4′-(CH2)3-2′；4′-(CH2)-O-2′(也称为LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4′-(CH2)2-O-2′(也称为ENA)；4′-CH(CH3)-O-2′(也称为cEt)；和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(也称为cMOE)，及其类似物；
c)4′-C(CH3)(CH3)-O-2′及其类似物；
d)4′-CH2-N(OCH3)-2′及其类似物；
e)4′-CH2-O-N(CH3)-2′及其类似物；
f)4′-CH2-C(H)(CH3)-2′及其类似物；和
g)4′-CH2-C(＝CH2)-2′及其类似物。
在某些实施方案中，四环或三环包含至少一个配体缀合的核苷酸。在某些实施方案中，四环包含两个、三个或四个配体缀合的核苷酸或三环包含两个或三个缀合的核苷酸。在某些实施方案中，配体为GalNAc。在某些实施方案中，GalNAc在糖部分的2′位处与核苷酸缀合。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂还包含在有义链和/或反义链的5′-端处的5′-磷酸模拟物。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子与脂质纳米颗粒一起配制。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含核心脂质和包膜脂质，其中该核心脂质包含第一阳离子脂质和第一聚乙二醇化脂质，并且其中该包膜脂质包含第二阳离子脂质、中性脂质、固醇和第二聚乙二醇化脂质。在某些实施方案中，第一阳离子脂质为DL-048，第一聚乙二醇化脂质为DSG-mPEG，第二阳离子脂质为DL-103，中性脂质为DSPC，固醇为胆固醇，并且第二聚乙二醇化脂质为DSPE-mPEG。
另一方面涉及包含治疗有效量的如本文所述的缩短的有义链双链核酸抑制剂分子和赋形剂的组合物。在某些实施方案中，组合物是药物组合物并且赋形剂是药学上可接受的赋形剂。
另一个方面涉及用于降低受试者中靶基因表达的方法，该方法包括以足以降低靶基因表达的量向有需要的受试者施用双链核酸抑制剂分子或药物组合物。在某些实施方案中，靶基因是结构基因、管家基因、编码转录因子的基因、编码运动因子的基因、编码细胞周期因子的基因、编码细胞周期抑制剂的基因、编码酶的基因、编码生长因子的基因、编码细胞因子的基因或编码肿瘤抑制因子的基因。在某些实施方案中，施用步骤包括静脉内、肌内或皮下施用。在某些实施方案中，受试者为人。
附图说明
并入本说明书并且构成本说明书的一部分的附图示出了某些实施方案，并且连同书面描述一起用来解释本公开的组合物和方法的某些原理。
图1A示出了具有反义链(“AS”)和有义链(“S”)的示例性双链核酸抑制剂分子的示意图，其中有义链含有茎环结构并且其中环是三环。如图所示，AS和S链是分开的链，每条链都有5′-端和3′-端。
图1B示出了与图1A相同的示例性示意图。在图1B中，有义链进一步分为与反义链(AS)形成双链体的第一区域(R1)和包括接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的环(L)的第二区域(R2)，其中S1和S2彼此充分互补以形成双链体，在本文中还称为“茎”或“茎双链体”。
图1C示意性地示出了与图1A和图1B相同的示例性示意图。图1C的示意图描绘了核酸抑制剂分子中的第一双链体(D1)和第二双链体(D2)。第一双链体(D1)在有义链的第一区域(R1)和反义链(AS)之间形成。第二双链体(D2)或“茎”在有义链的第二区域(R2)的第一子区域(S1)和第二子区域(S2)之间形成。
图1D示意性地示出了示例性双链核酸抑制剂分子的示意图，其中第二双链体(D2)比图1C所示的第二双链体短并且包含六个增加Tm的核苷酸(阴影圆圈)。
图2A示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性对照双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体1”)，该构建体不包含缩短的有义链。构建体1的有义链包含29个核苷酸。构建体1的反义链的3′-端包含两个核苷酸的突出端。
图2B示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体2”)。构建体2的有义链包含25个核苷酸。构建体2的反义链的3′-端包含6个核苷酸的突出端。
图2C示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体3”)。构建体3的有义链包含24个核苷酸。构建体3的反义链的3′-端包含7个核苷酸的突出端。
图2D示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体4”)。构建体4的有义链包含23个核苷酸。构建体4的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图2E示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体5”)。构建体5的有义链包含22个核苷酸。构建体5的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图2F示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体6”)。构建体6的有义链包含21个核苷酸。构建体6的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图2G示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体7”)。构建体7的有义链包含20个核苷酸。构建体7的反义链的3′-端包含11个核苷酸的突出端。
图2H示意性地示出了如实施例1中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体8”)。构建体8的有义链包含19个核苷酸。构建体8的反义链的3′-端包含12个核苷酸的突出端。
图3示出了如实施例1中所述的，在向CD-1小鼠施用构建体1(参见图2A)和构建体2-8(参见图2B-H)后4天剩余的靶基因mRNA的百分比。构建体2和3(在反义链中分别具有6个和7个核苷酸的3′-端突出端)与构建体1(在反义链中具有2个核苷酸的3′-端突出端)相比保持了基因敲低的效力。与对照PBS相比，构建体4和5(在反义链中分别具有8个和9个核苷酸的3′-端突出端)降低了靶mRNA的表达。构建体6-8(在反义链中分别包含10、11和12个核苷酸的3′-端突出端)没有显著降低靶mRNA的表达。
图4A示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性对照双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体1”)，该构建体不包含缩短的有义链。构建体1的有义链包含29个核苷酸。构建体1的反义链的3′-端包含2个核苷酸的突出端。
图4B示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体9”)。构建体9的有义链包含25个核苷酸，包括在核苷酸1处的LNA。构建体9的反义链的3′-端包含6个核苷酸的突出端。
图4C示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体10”)。构建体10的有义链包含24个核苷酸，包括在核苷酸1处的LNA。构建体10的反义链的3′-端包含7个核苷酸的突出端。
图4D示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体11”)。构建体11的有义链包含23个核苷酸，包括在核苷酸1处的LNA。构建体11的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图4E示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体12”)。构建体12的有义链包含22个核苷酸，包括在核苷酸1处的LNA。构建体12的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图4F示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体13”)。构建体13的有义链包含21个核苷酸，包括在核苷酸1处的LNA。构建体13的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图4G示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体14”)。构建体14的有义链包含20个核苷酸，包括在核苷酸1处的LNA。构建体14的反义链的3′-端包含11个核苷酸的突出端。
图4H示意性地示出了如实施例2中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体15”)。构建体15的有义链包含19个核苷酸，包括在核苷酸1处的LNA。构建体15的反义链的3′-端包含12个核苷酸的突出端。
图5示出了如实施例2中所述的，在向CD-1小鼠施用构建体1(参见图4A)和构建体9-15(参见图4B-H)后4天剩余的靶基因mRNA的百分比。构建体9-12(具有在有义链的5′-端的LNA和在反义链中的分别6-9个核苷酸的3′-端突出端)与构建体1相比保持了基因敲低的效力。与对照PBS相比，构建体13(具有在有义链的5′-端的LNA和在反义链中的10个核苷酸的3′-端突出端)降低了靶mRNA的表达。构建体14和15(包含在有义链的5′-端的LNA和在反义链中的分别11和12个核苷酸的3′-端突出端)没有显著降低靶mRNA的表达。
图6A示意性地示出了如实施例3中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性对照双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体1”)，该构建体不包含缩短的有义链。构建体1的有义链包含29个核苷酸。构建体1的反义链的3′-端包含2个核苷酸的突出端。
图6B示意性地示出了如实施例3中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体4”)。构建体4的有义链包含23个核苷酸。构建体4的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图6C示意性地示出了如实施例3中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体16”)。构建体16的有义链包含23个核苷酸，包括在核苷酸1和9处的LNA。构建体16的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图6D示意性地示出了如实施例3中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体5”)。构建体5的有义链包含22个核苷酸。构建体5的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图6E示意性地示出了如实施例3中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体17”)。构建体17的有义链包含22个核苷酸，包括在核苷酸1和8处的LNA。构建体17的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图6F示意性地示出了如实施例3中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体6”)。构建体6的有义链包含21个核苷酸。构建体6的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图6G示意性地示出了如实施例3中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体18”)。构建体18的有义链包含21个核苷酸，包括在核苷酸1和7处的LNA。构建体18的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图7示出了如实施例3中所述的，在向CD-1小鼠施用构建体1(参见图6A)和构建体4-6和16-18(参见图6B-G)后4天剩余的靶基因mRNA的百分比。构建体16、17和18(分别具有在有义链的核苷酸1和核苷酸9、8和7处的LNA，以及在反义链中的分别8、9和10个核苷酸的3′-端突出端)将靶基因表达降低了超过50％。与构建体4-6(在有义链的第一区域中没有LNA)相比，构建体16-18的基因敲低的效力降低。
图8示出了如实施例2和3中所述的，在向CD-1小鼠施用构建体1(参见图2A)和构建体11-13(参见图4D-F)和16-18(参见图6C、6E和6G)后4天剩余的靶基因mRNA的百分比。构建体16、17和18(分别具有在有义链的核苷酸1和核苷酸9、8和7处的LNA，以及在反义链中的分别8、9和10个核苷酸的3′-端突出端)与构建体11-13(在有义链的核苷酸1处具有LNA)相比保持了基因敲低的效力。除了在有义链的核苷酸7处有额外的LNA外与构建体13相同的构建体18(反义链3′-端有10个核苷酸的突出端)与构建体13相比降低了靶基因的表达。
图9A示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体4”)。构建体4的有义链包含23个核苷酸，其中在有义链的第一区域中没有LNA。构建体4的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图9B示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体16”)。构建体16的有义链包含23个核苷酸，包括在核苷酸1和9处的LNA。构建体16的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图9C示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体19”)。构建体19的有义链包含23个核苷酸，包括在核苷酸1、9和10处的LNA。构建体16的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图9D示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体22”)。构建体22的有义链包含23个核苷酸，包括在核苷酸1、9、10、12和13处的LNA。构建体16的反义链的3′-端包含8个核苷酸的突出端。
图9E示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体5”)。构建体5的有义链包含22个核苷酸，并且在有义链的第一区域中不含任何LNA。构建体5的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图9F示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体17”)。构建体17的有义链包含22个核苷酸，包括在核苷酸1和8处的LNA。构建体17的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图9G示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体20”)。构建体20的有义链包含22个核苷酸，包括在核苷酸1、8和9处的LNA。构建体20的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图9H示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体23”)。构建体23的有义链包含22个核苷酸，包括在核苷酸1、8、9、11和12处的LNA。构建体23的反义链的3′-端包含9个核苷酸的突出端。
图9I示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体6”)。构建体6的有义链包含21个核苷酸。构建体6的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图9J示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体18”)。构建体18的有义链包含21个核苷酸，包括在核苷酸1和7处的LNA。构建体18的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图9K示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体21”)。构建体21的有义链包含21个核苷酸，包括在核苷酸1、7和8处的LNA。构建体21的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图9L示意性地示出了如实施例4中所讨论的靶向感兴趣的基因序列的示例性双链核酸抑制剂分子的结构(“构建体24”)。构建体24的有义链包含21个核苷酸，包括在核苷酸1、7、8、10和11处的LNA。构建体24的反义链的3′-端包含10个核苷酸的突出端。
图10示出了如实施例4中所述的，在向CD-1小鼠施用构建体1(参见图2A)和构建体4-6(参见图9A、9E和9I)和16-24(参见图9B-D、9F-H和9J-L)后4天剩余的靶基因mRNA的百分比。构建体16-24(在有义链的第一区域中具有至少一个LNA)与构建体4-6(在有义链的第一区域中不具有任何LNA)相比显示了增加的基因敲低。构建体19(具有有义链的LNA核苷酸1、9和10)与构建体1一样有效，具有全长有义链，在反义链的3′-端具有2个核苷酸突出端。然而，构建体22-24(在核苷酸1和有义链的第一区域中的四个额外位置处具有LNA，包括与反义链的核苷酸2和3碱基配对的核苷酸)不如构建体16-21(在核苷酸1和有义链的第一区域中的一个或两个额外位置处具有LNA)一样有效。
图11示出了可用于配制双链核酸抑制剂分子的脂质纳米颗粒(LNP)的一个非限制性实施方案。LNP包括以下核心脂质：DL-048(阳离子脂质)和DSG-mPEG(聚乙二醇化脂质)，以及下列包膜脂质：DL-103(阳离子脂质)、DSPC、胆固醇和DSPE-mPEG(聚乙二醇化脂质)。
定义
为了更容易理解本公开，下面首先定义了某些术语。可以通过说明书阐述以下术语和其他术语的附加定义。如果下文阐述的术语的定义与通过引用并入的申请或专利中的定义不一致，则应使用本申请中阐述的定义来理解该术语的含义。
如本说明书和所附权利要求中所使用，除非另外明确指示，否则单数形式“一种/一个”和“所述/该”包括多个指示物。因此，例如对“一种方法”的引用包括一种或多种方法、和/或本文所描述的类型的步骤，在阅读完本公开等之后，这对本领域技术人员而言将变得显而易见。
施用：如本文所用，向受试者“施用”组合物是指给予、施用组合物或使组合物与受试者接触。施用可以通过多种途径中的任何一种来完成，包括例如通过局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内、鞘内和皮内。
酰基：如本文所用，术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基和芳基羰基部分。
烷氧基：如本文所用，术语“烷氧基”是指通过氧原子与分子部分附接的烷基基团。
烯基：如本文所用，术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键并且具有约2至约20个碳原子的直链或支链烃基基团。“取代的烯基”是指进一步携带一个或多个取代基的烯基基团。如本文所用，“低级烯基”是指具有2至约6个碳原子的烯基部分。
烷基：如本文所用，术语“烷基”是指具有1至约20个碳原子的直链或支链烃基基团。无论何时在本文中出现，数值范围诸如“C1-C6烷基”是指烷基基团可仅包含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，至多并包括6个碳原子，尽管术语“烷基”也包括未指定碳原子的数值范围的情况。例如，术语“烷基”可指C1-C10之间的子范围(例如C1-C6)。“取代的烷基”是指携带取代基的烷基部分。如本文所用，“低级烷基”是指具有1至约6个碳原子的烷基部分。
炔基：如本文所用，“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键并且具有约2至约20个碳原子的直链或支链烃基基团。“取代的炔基”是指进一步携带一个或多个取代基的炔基基团。如本文所用，“低级炔基”是指具有约2至约6个碳原子的炔基部分。
反义链：双链核酸抑制剂分子包含两条寡核苷酸链：反义链和有义链。反义链或其区域与靶核酸的对应区域部分、基本上或完全互补。另外，双链核酸抑制剂分子的反义链或其区域与双链核酸抑制剂分子的有义链或其区域部分、基本上或完全互补。在某些实施方案中，反义链还可含有与靶核酸序列不互补的核苷酸。非互补核苷酸可位于互补序列的任一侧或可在互补序列的两侧。在某些实施方案中，当反义链或其区域与有义链或其区域部分或基本上互补时，非互补核苷酸可位于一个或多个互补区域之间(例如，一个或多个错配)。双链核酸抑制剂分子的反义链也称为引导链。反义链中核苷酸的位置可以通过对从反义链5′-端开始的核苷酸进行计数来识别，例如，对于反义链中的每个核苷酸，第一个核苷酸被识别为“核苷酸1”或“G1”，第二个核苷酸被识别为“核苷酸2”或“G2”，第三个核苷酸识别为“核苷酸3”或“G3”，依此类推。
大约：如本文所用，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个感兴趣的值时，是指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另外说明或以其他方式从上下文显而易见(除了此类数值将超过可能值的100％)，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落入所述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围。
芳基：如本文所用，术语“芳基”是指具有5至19个碳原子的芳族单环或多环基团。“取代的芳基”是指进一步携带一个或多个取代基的芳基基团。
双环核苷酸：如本文所用，术语“双环核苷酸”是指包含双环糖部分的核苷酸。
双环糖部分：如本文所使用，“双环糖部分”是指包含4至7元环(包括但不限于呋喃糖基)的修饰的糖部分，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二环的桥，从而产生双环结构。通常，4至7元环为糖。在一些实施方案中，4至7元环为呋喃糖基。在某些实施方案中，桥连接呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。
互补：如本文所用，术语“互补”是指两个核苷酸之间的结构关系(例如，在两个相对的核酸上或在单个核酸链的相对区域上)，其允许这两个核苷酸彼此形成碱基对。例如，一个核酸的嘌呤核苷酸与相对核酸的嘧啶核苷酸互补，可通过彼此形成氢键而碱基配对在一起。在一些实施方案中，互补核苷酸可以沃森-克里克方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。“完全互补”或100％互补性是指其中第一寡核苷酸链或第一寡核苷酸链的片段的每个核苷酸单体可与第二寡核苷酸链或第二寡核苷酸链的片段的每个核苷酸单体形成碱基对的情况。小于100％互补性是指其中两条寡核苷酸链(或两条寡核苷酸链的两个片段)的一些但不是全部的核苷酸单体可彼此形成碱基对的情况。“基本互补性”是指两条寡核苷酸链(或两条寡核苷酸链的片段)彼此表现出90％或更高的互补性。“充分互补”是指靶mRNA和核酸抑制剂分子之间的互补性，使得靶mRNA编码的蛋白质的量减少。
互补链：如本文所用，术语“互补链”是指与另一条链部分、基本上或完全互补的双链核酸抑制剂分子的链。
环烷基：如本文所用，术语“环烷基”是指含有3至12个碳(例如3至8个碳和例如3至6个碳)的环状(即，含环)烃基基团。“取代的环烷基”是指进一步携带一个或多个取代基的环烷基基团。
脱氧呋喃核糖基：如本文所用，术语“脱氧呋喃核糖基”是指存在于天然存在的DNA中并且在2′-碳处具有氢基团的呋喃糖基，如下所示：
Figure BDA0003328219490000211
脱氧核糖核苷酸：如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指在糖部分的2′-位具有氢基团的天然核苷酸(如本文所定义)或修饰的核苷酸(如本文所定义)。
dsRNAi抑制剂分子：如本文所用，术语“dsRNAi抑制剂分子”是指具有有义链(过客链)和反义链(引导链)的双链核酸抑制剂分子，其中Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶在靶mRNA的切割中使用反义链或反义链的一部分。
双链体：如本文所用，术语“双链体”在提及核酸(例如，寡核苷酸)时，是指通过两个反向平行的核苷酸序列的互补碱基配对而形成的结构。
赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可包含在组合物中例如以提供或有助于期望的稠度或稳定作用的非治疗剂。
呋喃糖基：如本文所用，术语“呋喃糖基”是指包含具有四个碳原子和一个氧原子的5元环的结构。
卤代基：如本文所用，“卤代基”和“卤素”可互换使用并且是指选自氟、氯、溴和碘的原子。
杂环：如本文所用，术语“杂环”或“杂环的”是指含有一个或多个杂原子(例如，N、O、S等)作为环结构的一部分并且具有在3个至14个范围内的碳原子的非芳族环(即，含有环)基团。“取代的杂环的”或“取代的杂环”是指进一步携带一个或多个取代基的杂环基团。
在某些实施方案中：如本文所用，术语“在某些实施方案中”是指本公开的所有方面的实施方案，除非上下文另有明确指示。
核苷酸间连接基团：如本文所用，术语“核苷酸间连接基团”或“核苷酸间键”是指能够共价连接两个核苷部分的化学基团。通常，化学基团是含磷酸或亚磷酸酯基团的含磷键基团。磷酸键基团意在包括磷酸二酯键、二硫代磷酸酯键、硫代磷酸酯键、磷酸三酯键、硫代烷基膦酸酯键、亚硫代烷基磷酸三酯键、亚磷酰胺键、膦酸酯键和/或硼酸磷酸酯键。许多含磷键是本领域熟知的，如例如以下专利中所公开的：美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,194,599、5,565,555、5,527,899、5,721,218、5,672,697和5,625,050。在其他实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个不含磷原子的核苷酸间连接基团，例如短链烷基或环烷基核苷酸间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间键，包括但不限于具有硅氧烷骨架的那些；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰和硫甲乙酰骨架；亚甲基甲乙酰和硫甲乙酰骨架；核糖乙酰骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；和酰胺骨架。非含磷键是本领域熟知的，如例如以下专利中所公开的：美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、5,792,608、5,646,269和5,677,439。
环：如本文所用，术语“环”是指由核酸的单链形成的结构，其中特定单链核苷酸区域侧翼的互补区域以如下方式杂交，即互补区域之间的单链核苷酸区域被排除在双链体形成或沃森-克里克碱基配对之外。环是任何长度的单链核苷酸区域。环的示例包括存在于诸如发夹和四环的结构中的未配对核苷酸。
解链温度：如本文所用，“解链温度”或“Tm”是指双链核酸的两条链分开的温度。Tm通常用作双链稳定性或两条互补核酸链或其部分的结合亲和力的量度。可通过使用UV光谱确定杂交的形成和分解(解链)来测量Tm。杂交过程中发生的碱基堆积伴随着UV吸收的减少(减色性)。因此，UV吸收的降低指示较高的Tm。
修饰的核碱基：如本文所用，术语“修饰的核碱基”是指不是天然核碱基或通用核碱基的任何核碱基。合适的修饰的核碱基包括二氨基嘌呤及其衍生物、烷基化的嘌呤或嘧啶、酰化的嘌呤或嘧啶、硫醇化的嘌呤或嘧啶等。其他合适的修饰的核碱基包括嘌呤和嘧啶的类似物。合适的类似物包括但不限于1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊基腺嘌呤、2-甲硫基-N6-异戊基腺嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-乙基胞嘧啶、4-乙酰胞嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶，5-溴-尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、5-甲氧尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-(甲基氨基甲基)尿嘧啶、5-(羧甲基氨基甲基)尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-(2-溴乙烯基)尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、假尿嘧啶、1-甲基尿嘧啶、Q核苷(queosine)、次黄嘌呤、黄嘌呤、2-氨基嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、硝基吡咯基、硝基吲哚基和二氟甲苯基、6-硫嘌呤和2，6-二氨基嘌呤硝基吡咯基、硝基吲哚基和二氟甲苯基。通常，核碱基含有含氮碱基。在某些实施方案中，核碱基不含氮原子。参见例如，公布的美国专利申请号20080274462。
修饰的核苷：如本文所用，术语“修饰的核苷”是指与糖(例如脱氧核糖或核糖或其类似物)的N-糖苷键中的杂环含氮碱基，所述糖不与磷酸基团或修饰的磷酸基团(如本文所定义)连接，并且含有修饰的核碱基(如本文所定义)、通用核碱基(如本文所定义)或修饰的糖部分(如本文所定义)中的一种或多种。修饰或通用的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)通常位于核苷糖部分的1′-位处，并且是指在1′-位处的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核碱基。在某些实施方案中，修饰或通用的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含氮原子。参见例如，公布的美国专利申请号20080274462。在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含核碱基(脱碱基)。本文描述了本公开的上下文中合适的修饰或通用的核碱基或修饰的糖。
修饰的核苷酸：如本文所用，术语“修饰的核苷酸”是指与糖(例如核糖或脱氧核糖或其类似物)的N-糖苷键中的杂环含氮碱基，所述糖与磷酸基团或修饰的磷酸基团(如本文所定义)连接，并含有修饰的核碱基(如本文所定义)、通用核碱基(如本文所定义)或修饰的糖部分(如本文所定义)中的一种或多种。修饰或通用的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)通常位于核苷糖部分的1′-位处，并且是指在1′-位处的除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核碱基。在某些实施方案中，修饰或通用的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含氮原子。参见例如，公布的美国专利申请号20080274462。在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含核碱基(脱碱基)。本文描述了本公开的上下文中合适的修饰或通用的核碱基、修饰的糖部分或修饰的磷酸基团。
修饰的磷酸基团：如本文所用，术语“修饰的磷酸基团”是指不存在于天然核苷酸中的磷酸基团的修饰并且包括如本文所述的非天然存在的磷酸模拟物，包括包含磷原子的磷酸模拟物和不包括磷酸的阴离子磷酸模拟物(例如乙酸盐)。修饰的磷酸基团还包括非天然存在的核苷酸间连接基团，包括含磷的核苷酸间连接基团(包括例如硫代磷酸酯)和非含磷连接基团两者，如本文所述。
修饰的糖部分：如本文所用，“修饰的糖部分”是指取代的糖部分(如本文所定义)或糖类似物(如本文所定义)。
天然核碱基：如本文所用，术语“天然核碱基”是指RNA和DNA的五种主要的天然存在的杂环核碱基，即嘌呤碱基：腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基：胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
天然核苷：如本文所用，术语“天然核苷”是指与未连接到磷酸基团的天然糖部分(如本文所定义)的N-糖苷键中的天然核碱基(如本文所定义)。
天然核苷酸：如本文所用，术语“天然核苷酸”是指与连接到磷酸基团的天然糖部分(如本文所定义)的N-糖苷键中的天然核碱基(如本文所定义)。
天然糖部分：如本文所用，术语“天然糖部分”是指呋喃核糖基(如本文所定义)或脱氧呋喃核糖基(如本文所定义)。
核酸抑制剂分子：如本文所用，术语“核酸抑制剂分子”是指降低或消除靶基因表达的寡核苷酸分子，其中所述寡核苷酸分子包含特异性靶向靶基因mRNA中的序列的区域。通常，核酸抑制剂分子的靶向区域包含与靶基因mRNA上的序列充分互补的序列，以将核酸抑制剂分子的作用引导至特定靶基因。核酸抑制剂分子可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。靶基因可以是任何感兴趣的基因。
核碱基：如本文所用，术语“核碱基”是指天然核碱基(如本文所定义)、修饰的核碱基(如本文所定义)或通用核碱基(如本文所定义)。
核苷：如本文所用，术语“核苷”是指天然核苷(如本文所定义)或修饰的核苷(如本文所定义)。
核苷酸：如本文所用，术语“核苷酸”是指天然核苷酸(如本文所定义)或修饰的核苷酸(如本文所定义)。
突出端：如本文所用，术语“突出端”是指在双链核酸抑制剂分子的任一链的任一端的末端非碱基配对核苷酸。在某些实施方案中，突出端由延伸超过互补链的末端的一条链或区域产生，其中所述第一链或区域与所述互补链形成双链体。可通过碱基对的氢键形成双链体的两个寡核苷酸区域中的一个或两个可具有延伸超过两个多核苷酸或区域共有的互补性的3′-和/或5′-端的5′-和/或3′-端。延伸超过双链体的3′-和/或5′-端的单链区域称为突出端。
药物组合物：如本文所用，术语“药物组合物”包含药理学有效量的双链核酸抑制剂分子和药学上可接受的赋形剂(如本文所定义)。
药学上可可接受的赋形剂：如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”意指适合用于人和/或动物而无过度不良副作用(诸如毒性、刺激和过敏反应)的与合理的益处/风险比相称的赋形剂。
磷酸模拟物：如本文所用，术语“磷酸模拟物”是指在寡核苷酸的5′-末端处的模拟磷酸基团的静电和空间特性的化学部分。已经开发了许多可附接到寡核苷酸的5′-端的磷酸模拟物(参见，例如，美国专利号8,927,513；Prakash等人，Nucleic Acids Res.，2015，43(6)：2993-3011)。通常，这些5′-磷酸模拟物含有磷酸酶抗性键。合适的磷酸模拟物包括5′-膦酸酯，诸如5′-亚甲基膦酸酯(5′-MP)和5′-(E)-乙烯基膦酸酯(5′-VP)以及与寡核苷酸的5′-末端核苷酸的糖部分(例如，核糖或脱氧核糖或其类似物)的4′-碳结合的4′-磷酸酯类似物，诸如4′-氧甲基膦酸酯、4′-硫代甲基膦酸酯或4′-氨基甲基膦酸酯，如国际公布号WO2018/045317中所述，该专利通过引用以整体并入本文。在某些实施方案中，4′-氧甲基膦酸酯由式-O-CH2-PO(OH)2或-O-CH2-PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基或保护基团。在某些实施方案中，烷基基团为CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。对于寡核苷酸的5′-端，已开发了其他修饰(参见例如，WO 2011/133871)。
保护基团：如本文所用，术语“保护基团”在常规化学意义上用作在所需反应的某些条件下可逆地使官能团失去反应性的基团。在所需的反应之后，可除去保护基团以使受保护的官能团脱保护。所有保护基团应在不降解大部分合成分子的条件下可除去。
降低：如本文所用，术语“降低”(“reduce”或“reduces”)是指其本领域通常接受的含义。关于核酸抑制剂分子，该术语通常指将基因的表达、或编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等同RNA分子的水平、或一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性降低至低于在不存在核酸抑制剂分子的情况下观察到的水平。
呋喃核糖基：如本文所用，术语“呋喃核糖基”是指存在于天然RNA中并且在2′-碳处具有羟基基团的呋喃糖基，如下所示：
Figure BDA0003328219490000271
核糖核苷酸：如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指在糖部分的2′-位具有羟基基团的天然核苷酸(如本文所定义)或修饰的核苷酸(如本文所定义)。
有义链：双链核酸抑制剂分子包含两条寡核苷酸链：反义链和有义链。有义链或其区域与双链核酸抑制剂分子的反义链或其区域部分、基本上或完全互补。在某些实施方案中，有义链还可含有与反义链不互补的核苷酸。非互补核苷酸可位于互补序列的任一侧或可在互补序列的两侧。在某些实施方案中，当有义链或其区域与反义链或其区域部分或基本上互补时，非互补核苷酸可位于一个或多个互补区域之间(例如，一个或多个错配)。有义链也被称为过客链。有义链中核苷酸的位置可以通过对从有义链5′-端开始的核苷酸进行计数来识别，例如，对于有义链中的每个核苷酸，第一个核苷酸被识别为“核苷酸1”或“P1”，第二个核苷酸被识别为“核苷酸2”或“P2”，第三个核苷酸识别为“核苷酸3”或“P3”，依此类推。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括小鼠、兔和人。在一个实施方案中，受试者是人。术语“个体”或“患者”旨在与“受试者”互换使用。
取代基或取代的：如本文所用，术语“取代基”或“取代的”是指给定结构中的氢基团被取代基的基团替代。除非另外指明，否则当在给定结构中超过一个位置可被超过一个取代基取代时，在每个位置处的取代基可相同或不同。如本文所用，设想术语“取代的”包括与有机化合物相容的所有可允许的取代基。可允许的取代基包括有机化合物的无环和环状、支链和非支链、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。本公开不旨在以任何方式受有机化合物的可允许的取代基的限制。
取代的糖部分：如本文所用，“取代的糖部分”包括含有一个或多个修饰的呋喃糖基。通常，修饰发生在糖的2′-、3′-、4′-或5′-碳位处。在某些实施方案中，取代的糖部分为包含连接呋喃糖基的2′-碳和4-碳的桥的双环糖部分。
糖类似物：如本文所用，术语“糖类似物”是指这样的一种结构，其不包含呋喃糖基并且能够替代核苷酸的天然存在的糖部分以使得所得的核苷酸能够(1)掺入到寡核苷酸中并且(2)与互补核苷酸杂交。此类结构通常包括呋喃糖基的相对简单的变化，诸如包含不同数量原子的环(例如，4、6或7元环)；呋喃糖基的氧被非氧原子(例如碳、硫或氮)替代；或者原子数量和氧替代两者的变化。此类结构还可包含与对取代的糖部分描述的那些相对应的取代。糖类似物还包括更复杂的糖代替物(例如，肽核酸的非环系统)。糖类似物包括但不限于吗啉代、环已烯基和环己六醇。
糖部分：如本文所用，术语“糖部分”是指核苷酸或核苷的天然糖部分或修饰的糖部分。
靶位点：如本文所用，术语“靶位点”、“靶序列”、“靶核酸”、“靶区域”、“靶基因”可互换使用，是指“靶向”的RNA或DNA序列，例如，对于由RNAi抑制剂分子介导的切割，在其引导/反义区内含有与该靶序列部分、基本上或完全或充分互补的序列。
四环：如本文所用，术语“四环”是指形成稳定的二级结构的环(单链区域)，所述二级结构有助于相邻沃森-克里克杂交的核苷酸的稳定性。不受理论的限制，四环可以通过堆叠相互作用稳定相邻的沃森-克里克碱基对。此外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非沃森-克里克碱基配对、堆叠相互作用、氢键和接触相互作用(Cheong等人，Nature1990；346(6285)：680-2；Heus和Pardi，Science 1991；253(5016)：191-4)。四环使相邻双链体的解链温度(Tm)增加，高于由随机碱基组成的简单模型环序列的预期。例如，四环可在10mM NaHPO4中赋予包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹至少50℃、至少55℃、至少56℃、至少58℃、至少60℃、至少65℃或至少75℃的解链温度。四环可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。在某些实施方案中，四环由四个核苷酸组成。在某些实施方案中，四环由五个核苷酸组成。
RNA四环的实施例包括UNCG四环家族(例如UUCG)、GNRA四环家族(例如GAAA)和CUYG四环家族(包括CUUG四环)。(Woese等人，PNAS，1990，87(21)：8467-71；Antao等人，Nucleic Acids Res.，1991，19(21)：5901-5)。RNA四环的其他实施例包括GANC、A/UGNN和UUUM四环家族(Thapar等人，Wiley Interdiscip Rev RNA，2014，5(1)：1-28)和GGUG、RNYA和AGNN四环家族(Bottaro等人，Biophys J.，2017，113：257-67)。DNA四环的实施例包括d(GNNA)四环家族(例如，d(GTTA)、d(GNRA))四环家族、d(GNAB)四环家族、d(CNNG)四环家族、以及d(TNCG)四环家族(例如d(TTCG))。(Nakano等人Biochemistry，2002，41(48)：14281-14292。Shinji等人，Nippon Kagakkai Koen Yokoshu，2000，78(2)：731)。
三环：如本文所用，术语“三环”是指形成稳定的二级结构并且由三个核苷酸组成的环(单链区域)，所述二级结构有助于相邻沃森-克里克杂交的核苷酸的稳定性。不受理论的限制，三环可以通过三环内核苷酸的非沃森-克里克碱基配对和碱基堆积相互作用来稳定。(Yoshizawa等人，Biochemistry 1997；36，4761-4767)。三环还可以使相邻双链体的解链温度(Tm)增加，高于由随机碱基组成的简单模型环序列的预期。三环可包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。三环的实施例包括GNA三环家族(例如GAA、GTA、GCA和GGA)。(Yoshizawa 1997)。
治疗有效量：如本文所用，“治疗有效量”或“药理学有效量”是指有效产生预期的药理、治疗或预防结果的双链核酸抑制剂分子的量。
增加Tm的核苷酸：如本文所用，术语“增加Tm的核苷酸”是指与没有增加Tm的核苷酸的寡核苷酸双链体相比增加寡核苷酸双链体的解链温度(Tm)的核苷酸。增加Tm的核苷酸包括但不限于双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹及其类似物以及己糖醇核苷酸。具有修饰的糖部分或修饰的核碱基的某些修饰的核苷酸也可用于增加寡核苷酸双链体的Tm。如本文所用，术语“增加Tm的核苷酸”具体地排除在糖部分的2′-位处用2′-OMe或2′-F修饰的核苷酸。
通用核碱基：如本文所用，“通用核碱基”是指可与天然存在的核酸中通常存在的超过一个碱基配对的碱基，并且因此可在双链体中替代此类天然存在的碱基。该碱基不需要能够与每个天然存在的碱基配对。例如，某些碱基仅或选择性地与嘌呤配对，或仅或选择性地与嘧啶配对。通用核碱基可通过经由沃森-克里克或非沃森-克里克相互作用(例如，Hoogsteen相互作用)形成氢键而碱基配对。代表性的通用核碱基包括肌苷及其衍生物。
发明详述
本申请提供具有带茎环结构的有义链以及反义链的双链核酸抑制剂分子，其中有义链在其5′-端具有减少的长度，导致在反义链的3′-端具有更长的单链突出端。如实施例所示，具有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子可用于降低体内靶基因mRNA表达。在有义链的区域1(R1)中的某些位置和/或在反义链中的修饰的核苷酸间键处引入增加Tm的核苷酸可有助于稳定具有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子。通过这种方式，可以缩短有义链而不降低效力。使用较短的有义链在制造过程中具有优势，从而同时降低时间和成本。由于降低了分子量，可施用以摩尔计的更多的双链核酸抑制剂分子，因此降低有义链的长度在给药方面也具有优势。
还提供了使用具有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子和包含其的组合物在体外或体内降低靶基因水平或表达的方法，包括用于治疗疾病的方法和组合物。
双链核酸抑制剂分子
本申请公开了具有缩短的有义链和反义链的双链核酸抑制剂分子，该有义链具有茎环结构，其中有义链和反义链为各自具有5′-和3′-端的分开的链，因此不形成连续的寡核苷酸。典型的含茎/环的双链核酸抑制剂分子示于图1A中，其中突出显示了有义链(“S”)和反义链(“AS”)。
有义链可进一步分为与反义链(AS)形成第一双链体(D1)的第一区域(R1)和包括接合第一子区域(S1)与第二子区域(S2)的环(L)的第二区域(R2)，如图1B和图1C示出的。S1和S2彼此充分互补以形成第二双链体(D2)，也称为茎或茎双链体。参见例如图1C和1D。在某些实施方案中，环是四环，并且在某些实施方案中，环是三环。在某些实施方案中，双链核酸分子为dsRNAi抑制剂分子。在某些实施方案中，双链核酸分子在有义链的R1或D2中含有一个或多个增加Tm的核苷酸。通常，增加Tm的核苷酸为双环核苷酸。然而，在本文所述的所有双链核酸抑制剂分子中，如本文所定义的任何增加Tm的核苷酸均可取代双环核苷酸。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链包含含有环的茎双链体(D2)并且长度为15-43个核苷酸。在某些实施方案中，茎双链体的长度为1-6个碱基对。在某些实施方案中，茎双链体的长度为1-3个碱基对并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，茎双链体的长度为3-6个碱基对。在某些实施方案中，反义链的长度为18-33个核苷酸并且在其3′-端处具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，环的长度为3-20个核苷酸。在某些实施方案中，环的长度为3-8个核苷酸。通常，该环为四环或三环。在某些实施方案中，有义链的含有茎双链体(D2)和环的延伸部分在该链的3′-端。在某些其他实施方案中，有义链的含有茎(D2)和环的延伸部分在该链的5′-端。
在某些实施方案中，有义链含有茎双链体(D2)和四环或三环并且长度为15-43个核苷酸，并且反义链的长度为18-33个核苷酸并且在其3′-端处具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，反义链的长度为18-25个核苷酸并且在其3′-端处具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，有义链的长度为15-30个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为16-31个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为17-32个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为18-33个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为19-34个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为20-35个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为21-36个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为22-37个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为23-38个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为24-39个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为25-40个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为26-41个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为27-42个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为28-43个核苷酸。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是分开的链并形成8-29个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链包含第二双链体(D2)和四环或三环并且长度为15-43个核苷酸，并且其中反义链的长度为18-35个核苷酸并且在其3′-端处具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，有义链的长度为15-26、19-26、15-24或19-24个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为15-25个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为19-25个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为15-23个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为21-23个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为15个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为16个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为17个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为18个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为19个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为20个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为21个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为22个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为23个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为24个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为24个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为25个核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为26个核苷酸。
在某些实施方案中，第一双链体具有8-29个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有10-25个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有8-12个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有9-13个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有10-14个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有11-15个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有12-16个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有13-17个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有14-18个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有15-19个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有16-20个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有17-21个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有18-22个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有19-23个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有20-24个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有21-25个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有22-26个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有23-27个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有24-28个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有25-29个碱基对的长度。
在某些实施方案中，第一双链体具有8个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有9个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有10个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有11个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有12个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有13个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有14个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有15个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有16个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有17个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有18个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有19个碱基对的长度。在某些实施方案中，第一双链体具有20个碱基对的长度。第一双链体还可具有通过选择8-18个碱基对范围内的任意两个数字(例如，8-12、12-14、12-15、13-14、13-15等等)确定的碱基对长度范围。
在某些实施方案中，第二双链体(D2)具有1-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，第二双链体的长度为1-3个碱基对并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有1个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度。
反义链的3′-端具有至少3个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，反义链的3′-端具有至少6个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，反义链在其3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，反义链在其3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，在反义链的3′-端处的单链突出端由6个核苷酸组成。在某些实施方案中，在反义链的3′-端处的单链突出端由7个核苷酸组成。在某些实施方案中，在反义链的3′-端处的单链突出端由8个核苷酸组成。在某些实施方案中，在反义链的3′-端处的单链突出端由9个核苷酸组成。在某些实施方案中，在反义链的3′-端处的单链突出端由10个核苷酸组成。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是分开的链并形成12-16个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链包含第二双链体(D2)和四环或三环并且长度为17-32个核苷酸，并且其中反义链的长度为18-25个核苷酸并且在其3′-端处具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，有义链的长度为28-32个核苷酸，并且第二双链体(D2)的长度为6个碱基对并且不包含增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，有义链的长度为18-25个核苷酸，并且第二双链体(D2)的长度为1-5个碱基对并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2具有1个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有2个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有3个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有4个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有5个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2具有6个碱基对的长度。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是分开的链并形成12-16个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链具有12-16个核苷酸的第一区域(R1)和5-16个核苷酸的第二区域(R2)，该第二区域包含将第一子区域(S1)接合到第二子区域(S2)的四环或三环，其中S1和S2各自的长度为1-6个核苷酸并且彼此充分互补以形成第二双链体(D2)，并且其中反义链的长度为20-23个核苷酸并且在其3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，R2的长度为5-16个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为6-16个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为5个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为6个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为7个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为8个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为9个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为10个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为11个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为12个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为13个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为14个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为15个核苷酸。在某些实施方案中，R2的长度为16个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为1-6个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为1-3个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为3-6个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为3-5个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为1个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为2个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为3个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为4个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为5个核苷酸。在某些实施方案中，S1和S2各自的长度为6个核苷酸。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是分开的链并形成12-16个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链长度在16-33个核苷酸之间并且具有12-16个核苷酸的第一区域(R1)和5-10个核苷酸的第二区域(R2)，该第二区域包含将第一子区域(S1)接合到第二子区域(S2)的四环或三环，其中S1和S2各自的长度为1-3个核苷酸并形成1-3个碱基对的第二双链体(D2)，并且其中反义链的长度为21-23个核苷酸并且在其3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，反义链的长度为22个核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的至少一个核苷酸是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是分开的链并形成12-16个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链具有12-16个核苷酸的第一区域(R1)和6-10个核苷酸的第二区域(R2)，该第二区域包含将第一子区域(S1)接合到第二子区域(S2)的四环，其中S1和S2各自的长度为1-3个核苷酸并形成1-3个碱基对的第二双链体(D2)，并且其中反义链的长度为22个核苷酸(包括在其3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端)。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的至少一个核苷酸是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第一双链体具有12个碱基对。在某些实施方案中，第一双链体具有14个碱基对。在某些实施方案中，第一双链体具有16个碱基对。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包含有义链和反义链，其中有义链和反义链是分开的链并形成12-16个碱基对的第一双链体(D1)，其中有义链具有12-16个核苷酸的第一区域(R1)和5-9个核苷酸的第二区域(R2)，该第二区域包含将第一子区域(S1)接合到第二子区域(S2)的三环，其中S1和S2各自的长度为1-3个核苷酸并形成1-3个碱基对的第二双链体(D2)，并且其中反义链的长度为22个核苷酸并且具有在其3′-端的6-10个核苷酸的单链突出端。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的至少一个核苷酸是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体(D2)中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第一双链体具有12个碱基对。在某些实施方案中，第一双链体具有14个碱基对。在某些实施方案中，第一双链体具有16个碱基对。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有21-25个核苷酸；反义链具有22个核苷酸，包括在3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端，并且5′-末端核苷酸任选地包含磷酸模拟物；第一个双链体的长度为12-16个碱基对；有义链的第二区域包含三环并且第二双链体具有3个碱基对的长度并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸，如LNA。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有22-26个核苷酸；反义链具有22个核苷酸，包括在3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端，并且反义链的5′-末端核苷酸任选地包含磷酸模拟物；第一个双链体的长度为12-16个碱基对；有义链的第二区域包含四环并且第二双链体的长度为3个碱基对并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸，如LNA。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有21-31个核苷酸；反义链具有22个核苷酸，包括在3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端，并且反义链的5′-末端核苷酸任选地包含磷酸模拟物；第一个双链体的长度为12-16个碱基对；有义链的第二区域包含三环并且第二双链体的长度为3-5个碱基对并且包含至少一个增加Tm的核苷酸或者长度为6个碱基对并且不包含增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体具有3个碱基对的长度并且第二双链体中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸，如LNA。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链具有22-32个核苷酸；反义链具有22个核苷酸，包括在3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端，并且反义链的5′-末端核苷酸任选地包含磷酸模拟物；第一个双链体的长度为12-16个碱基对；有义链的第二区域包含四环并且第二双链体的长度为3-5个碱基对并且包含至少一个增加Tm的核苷酸或者长度为6个碱基对并且不包含增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体具有3个碱基对的长度并且第二双链体中的每个核苷酸为增加Tm的核苷酸，如LNA。
在某些实施方案中，四环具有以下序列之一：UNCG(例如，UUCG、UCCG、UACG或UGCG)、GNRA(例如，GAAA、GGAA、GAGA、GCAA或GUAA)、CUYG(例如，CUUG)、GANC、A/UGNN(例如UGAA)和UUUM、GGUG、RNYA(例如，AACA)和AGNN(例如，AGUA、AGAA或AGGG)、GGAG、UUUG、CAAC、CUUGU、GACAA或GAAGA，其中N为任何核碱基，R为嘌呤，Y为嘧啶，并且M为A或C。在某些实施方案中，四环为选自UNCG、GNRA或CUUG的RNA四环。在某些实施方案中，四环具有序列GNRA。在某些实施方案中，四环具有序列GAAA。在某些实施方案中，三环具有序列GNA。在某些实施方案中，三环具有序列GAA。
在本文所述的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，第二双链体(D2)不包含任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，第二双链体含有2-12个增加Tm的核苷酸并且具有1-6个碱基对的长度。在某些实施方案中，D2包含2-6个增加Tm的核苷酸并且长度为1-3个碱基对。在某些实施方案中，D2包含2-10个增加Tm的核苷酸并且长度为3-5个碱基对。在某些实施方案中，D2包含2-8个增加Tm的核苷酸并且长度为3-4个碱基对。在某些实施方案中，D2包含6个增加Tm的核苷酸并且长度为3个碱基对。在某些实施方案中，D2包含4个增加Tm的核苷酸并且长度为2个碱基对。在某些实施方案中，D2包含2个增加Tm的核苷酸并且长度为1个碱基对。在某些实施方案中，D2中的每个核苷酸都是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2包含3个未配对的增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2包含2个未配对的增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，D2包含1个未配对的增加Tm的核苷酸。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在有义链的第一区域(R1)或反义链中不含任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在第二双链体(D2)之外不含任何增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在有义链的第一区域(R1)中包含至少一个增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，有义链的核苷酸1(P1)是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链包含在核苷酸1处的增加Tm的核苷酸以及在有义链的第一区域(R1)中的两个额外的增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链包含在核苷酸1处的增加Tm的核苷酸以及在有义链的第一区域(R1)中的三个额外的增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链包含在核苷酸1处的增加Tm的核苷酸以及在有义链的第一区域(R1)中的四个额外的增加Tm的核苷酸。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链的第一个区域(R1)中与反义链的核苷酸6(G6)碱基配对的核苷酸是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，有义链的第一个区域(R1)中与反义链的核苷酸5(G5)碱基配对的核苷酸是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，有义链的第一个区域(R1)中与反义链的核苷酸6和核苷酸5碱基配对的两个核苷酸是增加Tm的核苷酸。在某些实施方案中，有义链的第一个区域(R1)中与反义链的核苷酸1-4(G1-4)碱基配对的核苷酸中无一是增加Tm的核苷酸。
在本文所述的双链核酸抑制剂分子中，增加Tm的核苷酸可以是本文所述或本领域中以其他方式可得的双环核苷酸中的任一种。在某些实施方案中，双链核酸分子包含至少两个双环核苷酸并且每个双环核苷酸都相同。在某些实施方案中，双链核酸分子包含至少两个不同的双环核苷酸。
在本文所述的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，至少一个双环核苷酸包含双环糖部分，其中该双环糖部分为取代的呋喃糖基，该呋喃糖基包含连接呋喃糖基的2′-碳和4′-碳的桥。
在本文所述的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有如本文所述的式I、II、III、IV、Va或Vb的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有式I的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有式II的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有式III的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有式IV的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有式Va的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有式Vb的结构。
在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有如本文所述的式Ia、Ib、Ic、Id、Ie或If中的一个或多个的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有如本文所述的式IIa、IIb、IIc或IId中的一个或多个的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有如本文所述的式IIIa和/或IIIb的结构。在某些实施方案中，至少一个双环核苷酸具有如本文所述的式IVa和/或IVb的结构。
在某些实施方案中，第二双链体(D2)和/或有义链的第一个区域(R1)中的至少一个双环核苷酸(BN)为以下中的一个或多个：(a)亚甲氧基BN，(b)亚乙氧基BN，(c)氨氧基BN；(d)氧氨基BN，(e)甲基(亚甲氧基)BN(也称为约束乙基或cET)，(f)亚甲基-硫代BN，(g)亚甲基氨基BN，(h)甲基碳环BN，以及(i)丙烯碳环BN。在一个实施方案中，至少一个BN为(a)亚甲氧基BN或(d)氧氨基BN，其中R2为CH3。在一个实施方案中，至少一个BN为氧氨基BN(d)，其中R2为CH3。
在本文公开的双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，反义链中的至少一个核苷酸被2′-F修饰。在某些实施方案中，反义链中的至少一个核苷酸被2′-F修饰并且所述2′-F修饰的核苷酸侧翼是2个除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，反义链中的至少两个核苷酸被2′-F修饰并且所述至少两个2′-F修饰的核苷酸各自侧翼是2个除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，反义链中的至少三个核苷酸被2′-F修饰并且所述至少三个2′-F修饰的核苷酸各自侧翼是2个除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，反义链中的至少四个核苷酸被2′-F修饰并且所述至少四个2′-F修饰的核苷酸各自侧翼是2个除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，反义链中被2′-F修饰的任何核苷酸侧翼都是2个除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键，如硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，反义链的核苷酸2(G2)被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到反义链的核苷酸1(G1)和核苷酸3(G3)。在某些实施方案中，反义链的核苷酸7(G7)被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到反义链的核苷酸6(G6)和核苷酸8(G8)。在某些实施方案中，反义链的核苷酸10(G10)被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到反义链的核苷酸9(G9)和核苷酸11(G11)。在某些实施方案中，反义链的核苷酸14(G14)被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到反义链的核苷酸13(G13)和核苷酸15(G15)。在某些实施方案中，G2、G7、G10和G14中的一个或多个被2′-F修饰并且侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，G2和G14被2′-F修饰并且侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，含磷的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，有义链中的至少一个核苷酸侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。在某些实施方案中，有义链的核苷酸1和2以除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接。在某些实施方案中，含磷的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
增加Tm的核苷酸
本文公开的双链核酸抑制剂分子可以包含在有义链的第一区域(R1)和/或存在于有义链中的茎环结构的茎部分(D2)中的一个或多个增加Tm的核苷酸。
增加Tm的核苷酸包括但不限于双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹及其类似物、己糖醇核苷酸或修饰的核苷酸。
双环核苷酸
双环核苷酸通常具有含4至7元环(包括但不限于呋喃糖基)的糖部分，所述糖部分包含连接4至7元环的两个原子以形成第二环的桥，从而产生双环结构。此类双环核苷酸具有各种名称，包括分别用于双环核酸和锁核酸的BNA和LNA。双环核苷酸的合成及其向核酸化合物中的掺入也已在文献中报道，所述文献包括例如，Singh等人，Chem.Commun.，1998，4，455-456；Koshkin等人，Tetrahedron，1998，54，3607-3630；Wahlestedt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2000，97，5633-5638；Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1998，8，2219-2222；Singh等人，J.Org.Chem.，1998，63，10035-10039；美国专利号7,427,672、7,053,207、6,794,499、6,770,748、6,268,490和6,794,499；以及公布的美国申请20040219565、20040014959、20030207841、20040192918、20030224377、20040143114和20030082807；这些文献中的每一个各自通过引用以整体并入本文。
增加Tm的核苷酸可以是包含双环糖部分的双环核苷酸。在某些实施方案中，双环糖部分包含4至7个成员的第一环和形成北型糖构型(North-type sugar confirmation)的桥，所述桥连接糖部分的第一环的任何两个原子以形成第二环。在某些实施方案中，桥连接第一环的2′-碳和4′-碳以形成第二环。
通常，桥含有2至8个原子。在某些实施方案中，桥含有3个原子。在某些实施方案中，桥含有4个原子。在某些实施方案中，桥含有5个原子。在某些实施方案中，桥含有6个原子。在某些实施方案中，桥含有7个原子。在某些实施方案中，桥含有8个原子。在某些实施方案中，桥含有超过8个原子。
在某些实施方案中，双环糖部分为包含连接呋喃糖基的2′-碳和4′-碳的桥以形成第二环的取代的呋喃糖基。在某些实施方案中，双环核苷酸具有式I的结构：
Figure BDA0003328219490000441
其中B为核碱基；
其中G为H、OH、NH2、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的硫代基；
其中X为O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；并且
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将由式I代表的核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式I代表的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式I的某些实施方案中，G为H且X为NR1，其中R1为苯或芘。在式I的某些实施方案中，G为H且X为S。
在式I的某些实施方案中，G为H且X为O：
Figure BDA0003328219490000451
在式I的某些实施方案中，G为H且X为NR1，其中R1为H、CH3或OCH3：
Figure BDA0003328219490000452
在式I的某些实施方案中，G为OH或NH2且X为O。
在式I的某些实施方案中，G为OH且X为O：
Figure BDA0003328219490000453
在式I的某些实施方案中，G为NH2且X为O：
Figure BDA0003328219490000461
在式I的某些实施方案中，G为CH3或CH2OCH3且X为O。在式I的某些实施方案中，G为CH3且X为O：
Figure BDA0003328219490000462
在式I的某些实施方案中，G为CH2OCH3且X为O：
Figure BDA0003328219490000463
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式II的结构：
Figure BDA0003328219490000471
其中B为核碱基；
其中Q1为CH2或O；
其中X为CH2、O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中如果Q1为O，则X为CH2；
其中如果Q1为CH2，则X为CH2、O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将由式II代表的核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式II代表的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式II的某些实施方案中，Q1为O且X为CH2：
Figure BDA0003328219490000472
在式II的某些实施方案中，Q1为CH2且X为O：
Figure BDA0003328219490000481
在式II的某些实施方案中，Q1为CH2且X为NR1，其中R1为H、CH3或OCH3：
Figure BDA0003328219490000482
在式II的某些实施方案中，Q1为CH2且X为NH：
Figure BDA0003328219490000483
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式III的结构：
Figure BDA0003328219490000484
其中B为核碱基；
其中Q2为O或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中X为CH2、O、S或NR1，其中R1为H、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、苯或芘；
其中如果Q2为O，则X为NR1；
其中如果Q2为NR1，则X为O或S；
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将由式III代表的核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式III代表的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式III的某些实施方案中，Q2为O且X为NR1。在式III的某些实施方案中，Q2为O且X为NR1，其中R1为C1-C6烷基。在式III的某些实施方案中，Q2为O且X为NR1且R1为H或CH3。
在式III的某些实施方案中，Q2为O且X为NR1且R1为CH3：
Figure BDA0003328219490000491
在式III的某些实施方案中，Q2为NR1且X为O。在式III的某些实施方案中，Q2为NR1，其中R1为C1-C6烷基且X为O。
在式III的某些实施方案中，Q2为NCH3且X为O：
Figure BDA0003328219490000501
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式IV的结构：
Figure BDA0003328219490000502
其中B为核碱基；
其中P1和P3为CH2，P2为CH2或O且P4为O；并且
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将由式IV代表的核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式IV代表的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在式IV的某些实施方案中，P1、P2和P3为CH2，并且P4为O：
Figure BDA0003328219490000503
在式IV的某些实施方案中，P1和P3为CH2，P2为O，并且P4为O：
Figure BDA0003328219490000511
在某些实施方案中，双环核苷酸具有式Va或Vb的结构：
Figure BDA0003328219490000512
其中B为核碱基；
其中r1、r2、r3和r4各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基；取代的C2-C12炔基；C1-C12烷氧基；取代的C1-C12烷氧基、OT1、ST1、SOT1、SO2T1、NT1T2、N3、CN、C(＝O)OT1、C(＝O)NT1T2、C(＝O)T1、O-C(＝O)NT1T2、N(H)C(＝NH)NT1T2、N(H)C(＝O)NT1T2或N(H)C(＝S)NT1T2，其中T1和T2各自独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C16烷基；或者
r1和r2或r3和r4一起为＝C(r5)(r6)，其中r5和r6各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基；并且
其中Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将由式V代表的核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，并且其中Wa或Wb中的至少一个为将由式V代表的核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在某些实施方案中，双环糖部分为包含连接呋喃糖基的2′-碳和4′-碳的桥以形成第二环的取代的呋喃糖基，其中连接呋喃糖基的2′-碳和4′-碳的桥包括但不限于：
a)4′-CH2-O-N(R)-2′和4′-CH2-N(R)-O-2′，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团，包括例如4′-CH2-NH-O-2′(也称为BNANC)、4′-CH2-N(CH3)-O-2′(也称为BNANC[NMe])(如美国专利号7,427,672中所述，该专利通过引用以整体并入本文)；
b)4′-CH2-2′；4′-(CH2)2-2′；4′-(CH2)3-2′；4′-(CH2)-O-2′(也称为LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4′-(CH2)2-O-2′(也称为ENA)；4′-CH(CH3)-O-2′(也称为cEt)；和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(也称为cMOE)，及其类似物(如美国专利号7,399,845中所述，该专利通过引用以整体并入本文)；
c)4′-C(CH3)(CH3)-O-2′及其类似物(如美国专利号8,278,283中所述，该专利通过引用以整体并入本文)；
d)4′-CH2-N(OCH3)-2′及其类似物(如美国专利号8,278,425中所述，该专利通过引用以整体并入本文)；
e)4′-CH2-O-N(CH3)-2′及其类似物(如美国专利公布号2004/0171570中所述，该专利通过引用以整体并入本文)；
f)4′-CH2-C(H)(CH3)-2′及其类似物(如Chattopadhyaya等人，J.Org.Chem.，2009，74，118-34中所述，该文献通过引用以整体并入本文)；以及
g)4′-CH2-C(＝CH2)-2′及其类似物(如美国专利号8,278,426中所述，该专利通过引用以整体并入本文)。
在某些实施方案中，双环核苷酸(BN)是以下中的一种或多种：(a)亚甲氧基BN，(b)亚乙氧基BN，(c)氨氧基BN；(d)氧氨基BN，(e)甲基(亚甲氧基)BN(也称为约束乙基或cET)，(f)亚甲基-硫代BN，(g)亚甲基氨基BN，(h)甲基碳环BN，以及(i)丙烯碳环BN，如下所示。
Figure BDA0003328219490000531
Figure BDA0003328219490000541
在上述(a)至(i)的双环核苷酸中，B为核碱基，R2为H或CH3，并且Wa和Wb各自独立地为H、OH、羟基保护基团、磷部分、或将所述双环核苷酸附接到另一个核苷酸或附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团，其中Wa或Wb中的至少一个为将所述双环核苷酸附接到寡核苷酸的核苷酸间连接基团。
在氧氨基BN(d)的一个实施方案中，R2为CH3，如下(也称为BNANC[NMe])：
Figure BDA0003328219490000551
在某些实施方案中，双环糖部分和掺入所述双环糖部分的双环核苷酸通过异构构型进一步定义。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为α-L构型。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为β-D构型。例如，在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸包含呈α-L构型的2′O，4′-C-亚甲基桥(2′-O-CH2-4′)(α-L LNA)。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为R构型。在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸为S构型。例如，在某些实施方案中，双环糖部分或核苷酸包含呈S-构型的4′-CH(CH3)-O-2′桥(即，cEt)。
三环核苷酸
在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸可以是三环核苷酸。三环核苷酸的合成及其向核酸化合物中的掺入也已在文献中报道，所述文献包括例如，Steffens等人，J.Am.Chem.Soc.1997；119：11548-11549；Steffens等人，J.Org.Chem.1999；121(14)：3249-3255；Renneberg等人，J.Am.Chem.Soc.2002；124：5993-6002；Ittig等人，Nucleic AcidsRes.2004；32(1)：346-353；Scheidegger等人，Chemistry 2006；12：8014-8023；Ivanova等人，Oligonucleotides 2007；17：54-65；这些文献中的每一个各自通过引用以整体并入本文。
在某些实施方案中，三环核苷酸是三环状核苷酸(也称为三环DNA)，其中3′-碳和5′-碳中心通过与环丙烷环稠合的乙烯连接，如例如在Leumann CJ，Bioorg.Med.Chem.2002；10：841-854和公布的美国申请2015/0259681和2018/0162897中讨论的，将它们各自通过引用以整体并入本文。在某些实施方案中，三环核苷酸包含取代的呋喃糖基环和第三稠合环，该呋喃糖基环包含连接呋喃糖基的2′-碳和4′-碳以形成第二环的桥，该第三稠合环由将5′-碳连接到桥(连接呋喃糖基的2′-碳和4′-碳)的亚甲基的基团产生，如例如在已公布的美国申请2015/0112055中所讨论的，该申请通过引用以整体并入本文。
其他增加Tm的核苷酸
除了双环和三环核苷酸之外，在本文所述的核酸抑制剂分子中可以使用其他增加Tm的核苷酸。例如，在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为G-夹、胍G-夹或其类似物(Wilds等人，Chem，2002；114：123和Wilds等人，Chim Acta 2003；114：123)、己糖醇核苷酸(Herdewijn，Chem.Biodiversity 2010；7：1-59)或修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可具有修饰的核碱基，如本文所述，包括例如5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-丙炔基-修饰的嘧啶或2-氨基腺嘌呤(也称为2，6-二氨基嘌呤)(Deleavey等人，Chem.&Biol.2012；19：937-54)或2-硫代尿苷、5Me-硫代尿苷和假尿苷。修饰的核苷酸还可具有修饰的糖部分，如例如美国专利号8,975,389中所述，该专利通过引用以整体并入本文，或如本文所述，不同之处在于增加Tm的核苷酸在糖部分的2′-碳处未用2′-F或2′-OMe修饰。
在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为三环核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为G-夹、胍G-夹或其类似物。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为己糖醇核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环或三环核苷酸。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环核苷酸、三环核苷酸、或G-夹、胍G-夹或其类似物。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸为双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹、胍G-夹或其类似物、或己糖醇核苷酸。
在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸每次掺入使核酸抑制剂分子的Tm增加至少2℃。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸每次掺入使核酸抑制剂分子的Tm增加至少3℃。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸每次掺入使核酸抑制剂分子的Tm增加至少4℃。在某些实施方案中，增加Tm的核苷酸每次掺入使核酸抑制剂分子的Tm增加至少5℃。
其他修饰
除了第二双链体(D2)和/或有义链的第一区域(R1)中的至少一个增加Tm的核苷酸之外，本文所述的双链核酸抑制剂分子还可包含其他核苷酸修饰。通常，双链核酸抑制剂分子的多个核苷酸被修饰以改善分子的各种特性，诸如对核酸酶的抗性或降低的免疫原性。参见例如，Bramsen等人(2009)，Nucleic Acids Res.，37，2867-2881。许多核苷酸修饰已用于寡核苷酸领域，特别是用于核酸抑制剂分子。可在核苷酸的包括糖部分、磷酸二酯键和核碱基的任何部分上进行此类修饰。核苷酸修饰的典型示例包括但不限于2′-F、2′-O-甲基(“2′-OMe”或“2′-OCH3”)和2′-O-甲氧基乙基(“2′-MOE”或“2′-OCH2CH2OCH3”)。如本文所述，修饰也可发生在核苷酸的糖部分的其他部分诸如5′-碳处。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子还可在1′-位处包括除腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的一种或多种如本领域已知和如本文所述的修饰的核碱基。在某些实施方案中，修饰或通用的核碱基为含氮碱基。在某些实施方案中，修饰的核碱基不含氮原子。参见例如，公布的美国专利申请号20080274462。在某些实施方案中，修饰的核苷酸不含核碱基(脱碱基)。修饰的核碱基的典型示例为5′-甲基胞嘧啶。
RNA和DNA的天然存在的核苷酸间键为3′-至5′-磷酸二酯键。修饰的磷酸二酯键包括非天然存在的核苷酸间连接基团，包括如本领域已知和如本文所述的含磷原子的核苷酸间键和不含磷原子的核苷酸间键。通常，双链核酸抑制剂分子含有一个或多个如本文所述的含磷核苷酸间连接基团。在其他实施方案中，如本文所述，双链核酸抑制剂分子的核苷酸间连接基团中的一个或多个为非含磷键。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有一个或多个含磷核苷酸间连接基团和一个或多非含磷的核苷酸间键基团。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有至少一个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有少于12个、如少于10个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有5-11个硫代磷酸酯核苷酸间连接基团“PS”)。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有5个PS。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有7个PS。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有9个PS。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子含有11个PS。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在有义链中含有1个PS。在某些实施方案中，每个被2′-F修饰的核苷酸侧翼是2个PS。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在反义链中含有2个PS。在某些实施方案中，反义链含有4个PS。在某些实施方案中，反义链含有6个PS。在某些实施方案中，反义链含有8个PS。在某些实施方案中，反义链含有10个PS。
双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5′-端可包括天然取代基，诸如羟基或磷酸基团。在某些实施方案中，羟基基团附接到双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5′-末端。在某些实施方案中，磷酸基团附接到双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5′-末端。通常，在寡核苷酸合成之前将磷酸酯加入单体中。在其他实施方案中，在将核酸抑制剂分子引入到细胞质中之后例如通过胞质Clp1激酶自然地完成5′-磷酸化。在一些实施方案中，5′-末端磷酸酯为磷酸基团，诸如5′-单磷酸酯[(HO)2(O)P-O-5′]、5′-二磷酸酯[(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5′]或5′-三磷酸酯[(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-0-5′]。
双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5′-端也可以被修饰。例如，在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5′-端附接到氨基磷酸酯[(HO)2(O)P-NH-5′，(HO)(NH2)(O)P-O-5′]。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5′-末端附接到磷酸模拟物。合适的磷酸模拟物包括5′-膦酸酯，例如5′-亚甲基膦酸酯(5′-MP)、5′-(E)-乙烯基膦酸酯(5′-VP)。Lima等人，Cell，2012，150-883-94；WO2014/130607。其他合适的磷酸模拟物包括与寡核苷酸的5′-末端核苷酸的糖部分(例如，核糖或脱氧核糖或其类似物)的4′-碳结合的4-磷酸酯类似物，如国际公布号WO 2018/045317中所述，该专利通过引用以整体并入本文。例如，在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链和/或反义链的5′-端附接到氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子与糖部分或其类似物的4′-碳结合。在其他实施方案中，磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子与糖部分或其类似物的4′-碳结合。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包括一个或多个脱氧核糖核苷酸。通常，双链核酸抑制剂分子含有少于5个脱氧核糖核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子包括一个或多个核糖核苷酸。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的所有核苷酸都是核糖核苷酸。
在某些实施方案中，在双链核酸抑制剂分子的茎(第二双链体或D2)之外的一个或多个核苷酸含有具有修饰的环结构的糖部分，包括但不限于如本文所述的存在于双环或三环核苷酸中的修饰的环结构，以及解锁核酸(“UNA”)(参见，例如，Snead等人(2013)，Molecular Therapy-NucleicAcids，2，e103(doi：10.1038/mtna.2013.36))。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的一个或两个核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。通常，谷胱甘肽敏感部分位于糖部分的2′-碳处并且包含磺酰基。在某些实施方案中，谷胱甘肽敏感部分与亚磷酰胺寡核苷酸合成方法相容，如例如国际公布号WO2018/045317中所述，该专利通过引用以整体并入本文。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的超过两个核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。在某些实施方案中，大多数核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的所有或基本上所有核苷酸被谷胱甘肽敏感部分可逆地修饰。
至少一个谷胱甘肽敏感部分通常位于双链核酸抑制剂分子的有义链或反义链的5′-或3′-末端核苷酸处。然而，该至少一个谷胱甘肽敏感部分可位于双链核酸抑制剂分子中任何感兴趣的核苷酸处。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子被完全修饰，其中有义链和反义链的每个核苷酸均被修饰；通常，每个核苷酸在糖部分的2′-位被修饰。在某些实施方案中，完全修饰的核酸抑制剂分子不含可逆修饰。在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的有义链的至少一个如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43个核苷酸被修饰。在一些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的反义链的至少一个如至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸被修饰。
在某些实施方案中，完全修饰的核酸抑制剂分子被一个或多个可逆的谷胱甘肽敏感部分修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的基本上所有核苷酸均被修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的超过一半的核苷酸被除可逆修饰以外的化学修饰所修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子的少于一半的核苷酸被除可逆修饰以外的化学修饰所修饰。修饰可在核酸抑制剂分子上的基团中发生，或者可散布不同的修饰核苷酸。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，一个至每个核苷酸在2′-碳处被修饰。在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子被2′-F、2′-OMe和/或2′-MOE部分或完全修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，一个至每个磷原子被修饰并且一个至每个核苷酸在糖部分的2′-碳处被修饰。
在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2′-碳处被修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了有义链的第二区域(R2)中的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2′-碳处用2′-F或2′-OMe修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了增加Tm的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2′-碳处用2′-F或2′-OMe修饰。在双链核酸抑制剂分子的某些实施方案中，除了增加Tm的核苷酸和环区域中与糖配体部分(诸如GalNAc)缀合的核苷酸之外，有义链和反义链上的每个核苷酸在糖部分的2′-碳处用2′-F或2′-OMe修饰。
降低靶基因表达的方法
如本文所述，双链核酸抑制剂分子可用于降低任何感兴趣的靶基因的靶mRNA表达的方法中。通常，降低mRNA表达的方法包括以足以降低靶基因的mRNA表达的量向样本或有需要的受试者施用如本文所述的双链核酸抑制剂分子。该方法可在体外或体内进行。
靶RNA的水平或活性可以通过本领域现在已知的或后来开发的合适方法来确定。可以理解，用于测量靶RNA和/或靶基因的“表达”的方法可取决于靶基因及其编码的RNA的性质。例如，在靶RNA序列编码蛋白质的情况下，术语“表达”可以指源自靶基因(基因组或外源来源)的蛋白质或靶RNA/转录本。在此类情况下，靶RNA的表达可以通过直接测量靶RNA/转录本的量或通过测量由靶RNA/转录本编码的蛋白质的量来确定。蛋白质可在蛋白质分析中测量，诸如通过染色或免疫印迹，或者如果该蛋白质催化可被测量的反应，则通过测量反应速率来测量。所有这些方法都是本领域已知并且可以使用的。在要测量靶RNA水平的情况下，可以使用本领域公认的检测RNA水平的方法(例如，RT-PCR、RNA印迹法等)。可以对细胞、细胞提取物、组织、组织提取物或其他合适的源材料进行上述测量。
靶基因可以是来自任何哺乳动物的靶基因，诸如人靶基因。根据本发明的方法可使任何靶基因沉默。在某些实施方案中，靶基因与慢性肝病或慢性肾病有关，包括例如AGXT、GRHPR、HOGA1、HAO1、SERPINA1或LDHA。在某些实施方案中，靶基因与病毒感染性疾病相关，包括例如HBV基因或HCV基因。在某些实施方案中，靶基因与心血管疾病有关，包括例如APOC3或PCSK9。在某些实施方案中，靶基因与酒精代谢和肝功能相关，包括例如ALDH2。
其他示例性靶基因包括但不限于KRAS、因子VII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA1、TTR、PDGFβ基因、Erb-B基因、Src基因、CRK基因、GRB2基因、RAS基因、MEKK基因、JNK基因、RAF基因、Erk1/2基因、PCNA(p21)基因、MYB基因、JUN基因、FOS基因、BCL-2基因、细胞周期蛋白D基因、VEGF基因、EGFR基因、细胞周期蛋白A基因、细胞周期蛋白E基因、WNT-1基因、β联蛋白基因、c-MET基因、PKC基因、NFKB基因、STAT3基因、存活蛋白基因、Her2/Neu基因、拓扑异构酶I基因、拓扑异构酶IIα基因、p73基因、p21(WAF1/CIP1)基因、p27(KIP1)基因、PPM1D基因、RAS基因、陷窝蛋白I基因、MIB I基因、MTAI基因、M68基因、肿瘤抑制基因突变、p53肿瘤抑制基因及其组合。
药物组合物
本公开提供了药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的如本文所述的双链核酸抑制剂分子和药学上可接受的赋形剂。
这些药物组合物可通过常规的灭菌技术来灭菌或可被无菌过滤。所得水溶液可按原样或冻干形式被包装使用，将冻干制剂在施用之前与无菌水性赋形剂组合。制剂的pH通常在3和11之间，更优选在5和9之间或在6和8之间，最优选在7和8之间，例如7到7.5。
本公开的药物组合物用于治疗用途。因此，本公开的一个方面提供了一种药物组合物，其可通过向受试者(包括但不限于患有疾病或病症的人)施用治疗有效量的本公开的药物组合物来用于治疗所述受试者。在某些实施方案中，该疾病或病状为癌症，如本文所述。
在某些实施方案中，本公开的特征在于治疗有效量的如本文所述的药物组合物用于制造用于治疗有需要的受试者的药物的用途。在某些实施方案中，如本文所述，受试者患有癌症。
药学上可接受的赋形剂
可用于本公开的药学上可接受的赋形剂通常是常规的。E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，第15版(1975)描述了适用于一种或多种治疗组合物的药物递送的组合物和制剂。可充当药学上可接受的赋形剂的材料的一些示例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；麦芽；明胶；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(等渗盐水；林格氏溶液)；乙醇；pH缓冲溶液；多元醇，诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等；以及药物制剂中使用的其他无毒相容物质。
剂型
药物组合物可与常规赋形剂一起配制用于任何预期的施用途径，其可根据常规实践进行选择。
在一个实施方案中，药物组合物含有如本文所述的双链核酸抑制剂分子，并且适合于肠胃外施用，例如通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射。通常，本公开的药物组合物被配制成用于肠胃外施用的液体形式。
适合肠胃外施用的剂型通常包括一种或多种适合肠胃外施用的载体，例如包括无菌水溶液、盐水、低分子量醇如丙二醇、聚乙二醇、植物油、明胶、脂肪酸酯如油酸乙酯等。肠胃外制剂可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。可例如通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。含有双链核酸抑制剂的液体制剂可被冻干并储存，以便以后在用无菌注射溶液重构时使用。
药物组合物也可使用众所周知的技术配制用于其他施用途径，包括局部或透皮施用、直肠或阴道施用、眼内施用、鼻内施用、颊内施用或舌下施用。
递送剂
如本文所述，双链核酸抑制剂分子可与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式缔合以有助于摄取、分布或吸收，所述其他分子、分子结构或化合物的混合物包括例如脂质体和脂质，诸如美国专利号6,815,432、6,586,410、6,858,225、7,811,602、7,244,448和8,158,601中公开的那些；聚合物材料，诸如美国专利号6,835,393、7,374,778、7,737,108、7,718,193、8,137,695和公布的美国专利申请号2011/0143434、2011/0129921、2011/0123636、2011/0143435、2011/0142951、2012/0021514、2011/0281934、2011/0286957和2008/0152661中公开的那些；衣壳、类壳体或受体靶向分子。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子被配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。脂质-核酸纳米颗粒通常在脂质与核酸混合以形成复合物时自发形成。根据所期望的粒度分布，所得到的纳米颗粒混合物可以任选地通过聚碳酸酯膜(例如，100nm的截止值)使用例如热筒挤出机，如
Figure BDA0003328219490000651
挤出机(Northern Lipids公司)挤出。为了制备用于治疗用途的脂质纳米颗粒，可能需要去除用于形成纳米颗粒和/或交换缓冲液的溶剂(例如乙醇)，这可以通过例如透析或切向流过滤来实现。制造含有核酸干扰分子的脂质纳米颗粒的方法是本领域已知的，如在公布的美国专利申请号2015/0374842和2014/0107178中公开的。
在某些实施方案中，LNP包含含有阳离子脂质体和聚乙二醇化脂质的核心脂质组分。LNP还可包含一种或多种包膜脂质，诸如阳离子脂质、结构或中性脂质、固醇、聚乙二醇化脂质、或它们的混合物。
用于LNP的阳离子脂质是本领域已知的，如在公布的美国专利申请号2015/0374842和2014/0107178中讨论的。通常，阳离子脂质是在生理pH下具有净正电荷的脂质。在某些实施方案中，阳离子脂质体为DODMA、DOTMA、DL-048或DL-103。在某些实施方案中，结构或中性脂质是DSPC、DPPC或DOPC。在某些实施方案中，固醇为胆固醇。在某些实施方案中，聚乙二醇化脂质为DMPE-PEG、DSPE-PEG、DSG-PEG、DMPE-PEG2K、DSPE-PEG2K、DSG-PEG2K或DSG-mPEG。在一个实施方案中，阳离子脂质为DL-048，聚乙二醇化脂质为DSG-mPEG，并且一种或多种包膜脂质为DL-103、DSPC、胆固醇和DSPE-mPEG。参见例如，图11，其示出了可用于配制双链核酸抑制剂分子的LNP的一个非限制性实施方案。
在某些实施方案中，可将双链核酸抑制剂分子共价缀合至配体，该配体引导寡核苷酸向感兴趣的组织的递送。已经探究了许多此类配体。参见，例如，Winkler，Ther.Deliv.4(7)：791-809(2013)。例如，可将双链核酸抑制剂分子与一个或多个糖配体部分(例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))缀合，以引导寡核苷酸向肝脏中的摄入。参见，例如，美国专利号5,994,517、美国专利号5,574,142、WO 2016/100401。在某些实施方案中，一个或多个配体与双链核酸抑制剂分子的四环或三环中的一个或多个核苷酸缀合。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子在四环中与2-4个糖配体部分缀合或在三环中与2或3个糖配体部分缀合。在一个实施方案中，四环中的两个核苷酸与糖配体部分缀合。在一个实施方案中，四环中的三个核苷酸与糖配体部分缀合。在另一个实施方案中，四环中的四个核苷酸与糖配体部分缀合。在一个实施方案中，三环中的2个核苷酸与糖部分缀合。在一个实施方案中，三环中的3个核苷酸与糖部分缀合。在某些实施方案中，糖配体部分为GalNAc。可使用的其他配体包括但不限于甘露糖-6-磷酸、胆固醇、叶酸、转铁蛋白和半乳糖(对于其他具体的示例性配体，参见例如WO 2012/089352)。
配体可以与核苷酸的任何部分缀合，只要它能够将寡核苷酸引导递送至感兴趣的组织即可。在某些实施方案中，配体(例如，GalNAc)在糖部分的2′位处与核苷酸缀合。
施用/治疗方法
一个实施方案涉及治疗病症的方法，该方法包括向受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的双链核酸抑制剂分子的药物组合物。
在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可用于治疗或预防与增殖性、炎性、自身免疫性、神经性、眼、呼吸、代谢、皮肤、听觉、肝、肾或感染性疾病相关的症状。一个实施方案涉及治疗增殖性、炎性、自身免疫性、神经性、眼、呼吸、代谢、皮肤、听觉、肝、肾或感染性疾病的方法，该方法包括向受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的双链核酸抑制剂分子的药物组合物。
在某些实施方案中，病症为罕见疾病、慢性肝病、慢性肾病、心血管疾病或病毒感染性疾病。在某些实施方案中，病症为高草酸尿症，包括原发性高草酸尿症(PH1、PH2或PH3)或特发性高草酸尿症。在某些实施方案中，病症为慢性肾病症(CKD)。在某些实施方案中，病症为丙酮酸脱氢酶缺乏症。在某些实施方案中，病症为α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症。
在某些实施方案中，病症为癌症。此类癌症的非限制性示例包括胆道癌、膀胱癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、脑癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、乳腺癌、化生性癌、宫颈癌、宫颈鳞状细胞癌、直肠癌、结直肠癌、结肠癌、遗传性非息肉病结直肠癌、结直肠腺癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫内膜癌、子宫内膜间质肉瘤、食道癌、食道鳞状细胞癌、食道腺癌、眼黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、胆囊癌、胆囊腺癌、肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌、移行细胞癌、尿路上皮癌、威尔姆氏肿瘤、白血病、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓样白血病(AML)、慢性淋巴细胞(CLL)、慢性髓样(CML)、慢性骨髓单核细胞(CMML)、肝癌(liver cancer)、肝癌(livercarcinoma)、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、间皮瘤、B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体T成淋巴细胞性淋巴瘤/白血病、外周T细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌(NPC)、神经母细胞瘤、口咽癌、口腔鳞状细胞癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、假乳头状赘生物、腺泡细胞癌、前列腺癌、前列腺腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、皮肤黑色素瘤、小肠癌、胃癌、胃部癌、胃肠道间质瘤(GIST)、子宫癌或子宫肉瘤。通常，本公开的征在于通过施用治疗有效量的如本文所述的药物组合物来治疗肝癌(liver cancer)、肝部癌(liver carcinoma)、肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌和肝母细胞瘤的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了用于降低受试者中靶基因表达的方法，该方法包括以足以降低靶基因表达的量向有需要的受试者施用药物组合物，其中该药物组合物包含如本文所述的双链核酸抑制剂分子和也如本文所述的药学上可接受的赋形剂。
剂量和时间表
通常，双链核酸抑制剂分子经肠胃外施用(例如通过静脉内、肌内或皮下施用)。在其他实施方案中，药物组合物经由局部施用或全身施用来递送。然而，本文公开的药物组合物也可通过本领域已知的任何方法施用，包括例如含服、舌下、直肠、阴道、尿道内、局部、眼内、鼻内和/或耳内，所述施用可包括片剂、胶囊、颗粒、水性悬浮液、凝胶、喷剂、栓剂、药膏、软膏等。
在某些实施方案中，双链核酸抑制剂分子以每天每千克接受者体重20微克至10毫克、每千克100微克至5毫克、每千克0.25毫克至5.0毫克或每千克0.5毫克至3.0毫克的剂量施用。通常，双链核酸抑制剂分子以每天每千克接受者体重约0.25毫克至2.0毫克的剂量施用。
本公开的药物组合物可每天或间歇地施用。例如，双链核酸抑制剂分子的间歇施用可以是每周1-6天、每月1-6天、每周一次、隔周一次、每月一次、隔月一次、每三月一次或每年一次或两次施用，或分为多个年度、每月、每周或每日剂量。在一些实施方案中，间歇施用可意指在初始双链核酸抑制剂分子施用后有休息期的循环中施用，其中不施用持续至多一周、至多一个月、至多两个月、至多三个月或至多六个月或更长时间)，或者其可意指在隔数天、数周、数月或数年施用。
双链核酸抑制剂分子的治疗有效量可取决于施用途径和患者的身体特征，如受试者的体型和体重、疾病进展或侵入的程度、年龄、健康和受试者的性别，并且可以根据这些和其他因素进行必要的调整。
实施例
实施例1：含有缩短的有义链的双链核酸抑制剂分子的体内效力
评估含有不同长度有义链的双链核酸抑制剂分子降低靶基因mRNA表达的效力。图2A-H示出了实施例1中所用的八个测试核酸抑制剂分子(构建体1-8)。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸以及双环核苷酸之外，测试核酸抑制剂分子中每隔一个核苷酸在糖部分的2′-位处用2′-F或2′-OMe修饰。构建体1代表不含缩短的有义链的对照分子。在构建体1中，有义链长度为29个核苷酸并且反义链的3′-端包含至少两个核苷酸的单链突出端。构建体2-8与构建体1的差异在于有义链的长度和在反义链的3′-端产生的单链突出端。此外，构建体2-8在反义链上包含侧翼核苷酸14(G14)即2′-F修饰的核苷酸的额外的两个PS键。图2A-H中的核酸抑制剂分子总结于下表中：
表1：图1中的测试核酸抑制剂
Figure BDA0003328219490000691
除了反义链上侧翼G14的两个额外的PS键和缩短的有义链长度之外，构建体2-8与构建体1相同。同样，除了不同的有义链长度之外，构建体2-8彼此相同。
将CD-1雌性小鼠分入每组四只小鼠的研究组，并用0.5mg/kg的分配给该组的测试核酸抑制剂分子给药。此外，四只对照CD-1小鼠给药安慰剂(PBS)。给药是皮下和单次给药，给药后4天处死小鼠。进行药效学研究，并通过取两个4mm穿刺活检收集肝组织，将其储存在InvitrogenTM RNAlaterTM溶液(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)中用于随后的mRNA分析。使用TissueLyser II(Qiagen，Valencia，CA)在
Figure BDA0003328219490000701
裂解试剂中对组织样品进行匀浆。然后根据制造商说明(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)使用MagMAX技术纯化RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)制备cDNA。靶序列的引物用于在CFX384实时PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)上的PCR。
将具有缩短的有义链的测试核酸抑制剂分子(构建体2-8)与对照核酸抑制剂分子(构建体1)以及PBS对照进行比较。如图3示出的，随着有义链长度的减少，含有缩短的有义链的测试核酸抑制剂分子显示出相对平稳的mRNA表达下降。构建体2、3和4(分别包含长度为25、24和23个核苷酸的有义链，分别具有6、7和8个核苷酸的3′-反义突出端)相对于PBS保留至少约0.5mg/kg的ED50。对于构建体2-6，效力与反义链的单链3′-突出端的长度成反比。分别具有6个和7个核苷酸的3′-反义突出端的构建体2和3显示出比分别具有8个和9个核苷酸的3′-反义突出端的构建体4和5更有效的靶基因mRNA敲低。
实施例2：含有缩短的过客链和5′-末端双环核苷酸的双链核酸抑制剂分子的体内效力
评估含有不同长度有义链和位于有义链5′-末端的双环核苷酸(即有义链的核苷酸1)的双链核酸抑制剂分子降低靶基因mRNA表达的效力。图4A-H示出了实施例2中所用的八个测试核酸抑制剂分子(构建体1和9-15)。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸以及双环核苷酸之外，测试核酸抑制剂分子中每隔一个核苷酸在糖部分的2′-位处用2′-F或2′-OMe修饰。测试核酸抑制剂分子在以下方面与对照核酸抑制剂分子不同：(1)有义链的长度；(2)存在在反义链上侧翼2′-F修饰的核苷酸14(G14)的两个PS键；(3)存在在有义链的5′-端的核苷酸1(P1)处的双环核苷酸(LNA)。图4A-H中的核酸抑制剂分子总结于下表中：
表2：图4中的测试核酸抑制剂
Figure BDA0003328219490000711
除了有义链P1处的双环核苷酸之外，构建体9-15分别与构建体2-8相同。同样，除了不同的有义链长度之外，构建体9-15彼此相同。
将CD-1雌性小鼠分入每组四只小鼠的研究组并遵循上述实施例1中所述的程序，其中对每只小鼠用0.5mg/kg的分配给该组的测试核酸抑制剂分子给药并分析了肝组织样本。
将具有缩短的有义链和有义链P1处的双环核苷酸的测试核酸抑制剂分子(构建体9-15)与具有29个核苷酸有义链与反义链3′-端处2个核苷酸的单链突出端的对照核酸分子(构建体1)以及PBS对照进行比较。如图5示出的，含有缩短的有义链和有义链5′-端处的双环核苷酸的测试核酸抑制剂分子即使有义链的长度缩短至21个核苷酸(反义链3′-端处有10个核苷酸的突出端)保持了有效的靶基因mRNA敲低。参见图5。分别具有20和19个核苷酸的有义链(在反义链的3′-端处分别有11和12个核苷酸的突出端)的构建体14和15几乎没有活性。图5。值得注意的是，构建体13相对于PBS至少保留了0.5mg/kg的ED50，而除有义链5′-端处的双环核苷酸之外与构建体13相同的构建体6没有活性。参见图3和5。
实施例3：含有缩短的有义链以及有义链的R1中两个双环核苷酸的双链核酸抑制剂分子的体内效力
评估含有缩短的有义链以及有义链的第一区域(R1)中两个双环核苷酸的双链核酸抑制剂分子降低靶基因mRNA表达的效力。实施例3中使用的七个测试核酸抑制剂分子(构建体1、4-6和16-18)示于图6A-G中。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸以及双环核苷酸之外，该测试核酸抑制剂分子中的每隔一个核苷酸在糖部分的2′-位处用2′-F或2′-OMe修饰。测试核酸抑制剂分子在以下方面与对照核酸抑制剂分子不同：(1)有义链的长度；(2)存在在反义链上侧翼核苷酸14(G14)即2′-F修饰的核苷酸的两个PS键；以及(3)有义链5′-端处的第一双环核苷酸(LNA)和有义链原始核苷酸15(P15)处(对于构建体16、17和18，分别为P9、P8和P7位)的第二双环核苷酸。在全部构建体16-18中，有义链中的第二双环核苷酸与反义链的核苷酸6(G6)碱基配对。图6A-G中的核酸抑制剂分子总结于下表中：
表3：图6中的测试核酸抑制剂
Figure BDA0003328219490000721
除了有义链的核苷酸1处的双环核苷酸以及有义链的核苷酸9、8和7外，构建体16、17和18分别与构建体4、5和6相同。同样，除了不同的有义链长度之外，构建体16、17和18彼此相同。
将CD-1雌性小鼠分入每组四只小鼠的研究组并遵循上述实施例1中所述的程序，其中对每只小鼠用0.5mg/kg的分配给该组的测试核酸抑制剂分子给药并分析了肝组织。
将具有缩短的有义链和P1以及有义链P9、P8或P7中一者处的双环核苷酸的测试核酸抑制剂分子(构建体16-18)与不具有有义链的区域1(R1)中的任何双环核苷酸的相应测试核酸分子(构建体4-6)以及PBS对照进行比较。如图7示出的，包含缩短的有义链和P1以及有义链P9、P8或P7中一者处的双环核苷酸的测试核酸抑制剂分子与不具有有义链的区域1(R1)中的任何双环核苷酸的可比较的测试核酸抑制剂分子中的每一者相比显示出了增加的mRNA敲低活性。例如，具有在反义链的3′-端处的10个核苷酸的突出端和在有义链的P1和P7处的双环核苷酸的构建体18显示出了有效的mRNA敲低活性，而构建体6(也具有10个核苷酸的3′反义突出端但无在有义链的区域1(R1)中的双环核苷酸)没有活性。图7(还参见构建体16和17，分别与构建体4和5比较)。
将来自实施例2的测试核酸抑制剂分子与来自实施例3的测试核酸抑制剂分子进行比较。将构建体11-13(各自在有义链的P1处含有单个双环核苷酸)与相应的构建体16-18(如上文所讨论的，除P9、P8或P7处有义链的第一区域(R1)中的额外的双环核苷酸之外与构建体11-13相同)进行比较。如图8示出的，与PBS对照相比，所有六种构建体11-13和16-18都显示出显著的mRNA敲低活性。尽管在构建体16和构建体17的P9和P8处分别添加双环核苷酸与对应物构建体11和12相比似乎降低了效力，但构建体18(在反义链的3′-端处有10个核苷酸的突出端)的效力与对应物构建体13相比有所增加。参见图8。
实施例4：含有缩短的过客链和有义链R1中的多个双环核苷酸的双链核酸抑制剂分子的体内效力
评估含有缩短长度的有义链以及有义链的第一区域(R1)中多个双环核酸的双链核酸抑制剂分子降低靶基因mRNA表达的效力。实施例4中使用的十二个测试核酸抑制剂分子(构建体4-6和16-24)示于图9A-L中。除了环中与GalNAc缀合的核苷酸以及双环核苷酸之外，该测试核酸抑制剂分子中的每隔一个核苷酸在糖部分的2′-位处用2′-F或2′-OMe修饰。测试核酸抑制剂分子在以下方面彼此不同：(1)有义链的长度；(2)存在在有义链5′-端处的双环核苷酸(LNA)和有义链原始(P15)处(对于构建体16、17和18，分别为P9、P8和P7位)的双环核苷酸；以及(3)存在在有义链的第一区域(R1)中的1个或3个额外的双环核苷酸。图9A-L中的核酸抑制剂分子总结于下表中：
表4：图9中的测试核酸抑制剂
Figure BDA0003328219490000741
Figure BDA0003328219490000751
除了在5′-端处和有义链的第一区域(R1)的不同位置处存在双环核苷酸之外，构建体4、16、19和22相同(所有构建体在反义链的3′-端都有8个核苷酸的突出端)，并且构建体5、17、20和23(所有构建体在反义链的3′-端处都有9个核苷酸的突出端)和构建体6、18、21和24(所有构建体在反义链的3′-端都有10个核苷酸的突出端)也如此。
将CD-1雌性小鼠分入每组四只小鼠的研究组并遵循上述实施例1中所述的程序，其中对每只小鼠用0.5mg/kg的分配给该组的测试核酸抑制剂分子给药并分析了肝组织。
如图10示出的，具有缩短的有义链的测试核酸抑制剂分子中有义链P1处的双环核苷酸以及原始核苷酸15(P15)处(即构建体16-18中分别为P9、P8和P7)的单个双环核苷酸的存在相比于有义链的第一区域(R1)中不具有任何双环核苷酸的可比较的测试核酸抑制剂分子，提高了靶基因mRNA敲低活性(构建体16-18对比构建体4-6)。此外，在有义链的第一区域(R1)中与原始P15位相邻的额外的双环核苷酸的存在(总共3个双环核苷酸)相比于有义链的第一区域中不具有任何双环核苷酸的可比较的测试核酸抑制剂分子，也提高了靶基因mRNA敲低(构建体19-21对比构建体4-6)。参见图10。然而，与在有义链的第一区域(R1)中具有两个双环核苷酸(构建体16-18)或在有义链的第一区域(R1)中具有三个双环核苷酸(构建体19-21)的测试核酸抑制剂分子相比，在原始P18和P19处添加两个额外的双环核苷酸(对于构建体22为P12和P13；对于构建体23为P11和P12；以及对于构建体24为P10和P11)显著降低了靶基因mRNA表达。尽管不希望受理论束缚，据推测紧邻反义链的5′-端的增加Tm的核苷酸可对靶基因mRNA敲低活性产生负面影响。

Claims (43)

1.一种双链核酸抑制剂分子，其包含：
有义链，所述有义链包含15-43个核苷酸并且具有第一区域(R1)和第二区域(R2)；
反义链，所述反义链包含18-35个核苷酸和5′-与3′-端，其中所述反义链在3′-端具有6-10个核苷酸的单链突出端，并且其中所述有义链和所述反义链是分开的链；
由所述有义链的所述第一区域和所述反义链形成的第一双链体(D1)，其中所述第一双链体具有8-29个碱基对的长度；
其中所述有义链的所述第二区域包含第一子区域(S1)、第二子区域(S2)以及接合所述第一子区域与所述第二子区域的单链环，其中所述第一子区域和所述第二子区域形成第二双链体(D2)；并且
其中所述第二双链体具有6个碱基对的长度并且不包含增加Tm的核苷酸或具有1-5个碱基对的长度并且包含至少一个增加Tm的核苷酸。
2.如权利要求1所述的双链核酸抑制剂分子，其中：
a)所述有义链具有15-30个核苷酸；所述反义链具有20个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有10-14个碱基对的长度；
b)所述有义链具有16-31个核苷酸；所述反义链具有21个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有11-15个碱基对的长度；
c)所述有义链具有17-32个核苷酸；所述反义链具有22个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有12-16个碱基对的长度；
d)所述有义链具有18-33个核苷酸；所述反义链具有23个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有13-17个碱基对的长度；
e)所述有义链具有19-34个核苷酸；所述反义链具有24个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有14-18个碱基对的长度；
f)所述有义链具有20-35个核苷酸；所述反义链具有25个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有15-19个碱基对的长度；
g)所述有义链具有21-36个核苷酸；所述反义链具有26个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有16-20个碱基对的长度；
h)所述有义链具有22-37个核苷酸；所述反义链具有27个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有17-21个碱基对的长度；
i)所述有义链具有23-38个核苷酸；所述反义链具有28个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有18-22个碱基对的长度；
j)所述有义链具有24-39个核苷酸；所述反义链具有29个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有19-23个碱基对的长度；
k)所述有义链具有25-40个核苷酸；所述反义链具有30个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有20-24个碱基对的长度；
l)所述有义链具有26-41个核苷酸；所述反义链具有31个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有21-25个碱基对的长度；
m)所述有义链具有27-42个核苷酸；所述反义链具有32个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有22-26个碱基对的长度；或
n)所述有义链具有28-43个核苷酸；所述反义链具有33个核苷酸并且具有3′-端处的6-10个核苷酸的单链突出端；并且所述第一双链体具有23-27个碱基对的长度。
3.如权利要求1或2所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述反义链具有20-24、21-23或22个核苷酸。
4.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述反义链的3′-端具有7-9个核苷酸的单链突出端。
5.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第一双链体具有12-16个碱基对的长度。
6.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述环是四环或三环。
7.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述反义链中的至少一个核苷酸被2′-F修饰，并且其中所述反义链中的所述至少一个被2′-F修饰的核苷酸的侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。
8.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述反义链的核苷酸14被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到所述反义链的核苷酸13和15并且/或者其中所述反义链的核苷酸2被2′-F修饰并且通过除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键连接到所述反义链的核苷酸1和3。
9.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述反义链包含的至少两个核苷酸被2′-F修饰并且侧翼是除磷酸二酯键以外的含磷的核苷酸间键。
10.如权利要求7-9中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述含磷的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
11.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链的区域1包含至少一个增加Tm的核苷酸。
12.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链的核苷酸1是增加Tm的核苷酸。
13.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链的区域1包含至多三个增加Tm的核苷酸。
14.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中与所述反义链的核苷酸6碱基配对的所述有义链的区域1中的核苷酸是增加Tm的核苷酸并且/或者与所述反义链的核苷酸5碱基配对的所述有义链的区域1中的核苷酸是增加Tm的核苷酸。
15.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中与所述反义链的核苷酸1-4碱基配对的所述有义链的区域1中的核苷酸中无一是增加Tm的核苷酸。
16.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体具有1-3个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。
17.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体含有2-10个增加Tm的核苷酸并且具有1-5个碱基对的长度，或者其中所述第二双链体含有2-6个增加Tm的核苷酸并且具有1-3个碱基对的长度。
18.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链的长度在16-33个核苷酸之间，所述反义链的长度在21-23个核苷酸之间，所述第一双链体具有12-17个碱基对的长度，并且所述第二双链体具有1-3个碱基对的长度并且含有至少一个增加Tm的核苷酸。
19.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链的所述第一区域的长度为12-16个核苷酸，并且所述有义链的所述第二区域的长度为5-10个核苷酸；
其中由所述有义链的所述第一区域和所述反义链形成的所述第一双链体具有12-16个碱基对的长度；
其中由所述有义链的所述第二区域的所述第一核酸和所述第二核酸形成的所述第二双链体具有3个碱基对、2个碱基对或1个碱基对的长度并且含有至少-个增加Tm的核苷酸；并且
其中所述反义链的长度为22个核苷酸并且在其3′-端处具有6-10个核苷酸的单链突出端。
20.如权利要求19所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述有义链的所述第二区域的长度为5或6个核苷酸，并且所述第二双链体具有1个碱基对的长度。
21.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第二双链体包含至少两个增加Tm的核苷酸。
22.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述四环为选自UNCG、GNRA、CUUG、A/UGNN、GGUG、RNYA或AGNN的RNA四环，或选自d(GNAB)、d(CNNG)或d(TNCG)的DNA四环。
23.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述四环具有序列GAAA。
24.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述三环具有序列GAA。
25.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述增加Tm的核苷酸选自由以下组成的组：双环核苷酸、三环核苷酸、G-夹及其类似物、己糖醇核苷酸和修饰的核苷酸，其中所述修饰的核苷酸在糖部分的2′-碳处未用2′-F或2′-OMe修饰。
26.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述修饰的核苷酸为5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-丙炔基-修饰的嘧啶、2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿苷、5Me-硫代尿苷或假尿苷。
27.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述增加Tm的核苷酸是双环核苷酸。
28.如权利要求27所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述双环核苷酸包含第一环和桥，其中所述第一环为呋喃糖基，所述桥连接所述呋喃糖基的2′-碳和4′-碳以形成第二环。
29.如权利要求28所述的双链核酸抑制剂分子，其中连接所述呋喃糖基的2′-碳和4′-碳的桥选自由以下组成的组：
a)4′-CH2-O-N(R)-2′和4′-CH2-N(R)-O-2′，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团，包括例如4′-CH2-NH-O-2′(也称为BNANC)或4′-CH2-N(CH3)-O-2′(也称为BNANC[NMe])；
b)4′-CH2-2′；4′-(CH2)2-2′；4′-(CH2)3-2′；4′-(CH2)-O-2′(也称为LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4′-(CH2)2-O-2′(也称为ENA)；4′-CH(CH3)-O-2′(也称为cEt)；和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(也称为cMOE)，及其类似物；
c)4′-C(CH3)(CH3)-O-2′及其类似物；
d)4′-CH2-N(OCH3)-2′及其类似物；
e)4′-CH2-O-N(CH3)-2′及其类似物；
f)4′-CH2-C(H)(CH3)-2′及其类似物；和
g)4′-CH2-C(＝CH2)-2′及其类似物。
30.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述四环或三环包含至少一个配体缀合的核苷酸。
31.如权利要求30所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述四环包含两个、三个或四个配体缀合的核苷酸，或所述三环包含两个或三个缀合的核苷酸。
32.如权利要求30或31所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述配体为GalNAc。
33.如权利要求32所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述GalNAc在所述糖部分的2′-位处与所述核苷酸缀合。
34.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其还包含在所述有义链和/或所述反义链的5′-末端处的5′-磷酸模拟物。
35.如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述双链核酸抑制剂分子与脂质纳米颗粒一起配制。
36.如权利要求35所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述脂质纳米颗粒包含核心脂质和包膜脂质，其中所述核心脂质包含第一阳离子脂质和第一聚乙二醇化脂质，并且其中所述包膜脂质包含第二阳离子脂质、中性脂质、固醇和第二聚乙二醇化脂质。
37.如权利要求36所述的双链核酸抑制剂分子，其中所述第一阳离子脂质为DL-048，所述第一聚乙二醇化脂质为DSG-MPEG，所述第二阳离子脂质为DL-103，所述中性脂质为DSPC，所述固醇为胆固醇，并且所述第二聚乙二醇化脂质为DSPE-MPEG。
38.一种组合物，其包含治疗有效量的如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子和赋形剂。
39.如权利要求38所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物并且所述赋形剂是药学上可接受的赋形剂。
40.一种用于降低受试者中靶基因表达的方法，所述方法包括以足以降低所述靶基因表达的量向有需要的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的双链核酸抑制剂分子或组合物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述靶基因是结构基因、管家基因、编码转录因子的基因、编码运动因子的基因、编码细胞周期因子的基因、编码细胞周期抑制剂的基因、编码酶的基因、编码生长因子的基因、编码细胞因子的基因或编码肿瘤抑制因子的基因。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述施用包括静脉内、肌内或皮下施用。
43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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