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CN113786391B - 一种mRNA递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种mRNA递送系统及其制备方法和应用 Download PDF

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CN113786391B CN202111114926.XA CN202111114926A CN113786391B CN 113786391 B CN113786391 B CN 113786391B CN 202111114926 A CN202111114926 A CN 202111114926A CN 113786391 B CN113786391 B CN 113786391B
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Abstract

本发明提供一种mRNA递送系统及其制备方法和应用，所述mRNA递送系统包括载体以及负载于所述载体上的mRNA；所述载体包括含有季铵盐脂样分子的脂样纳米粒；所述季铵盐脂样分子具有如式I或式II所示结构；所述mRNA递送系统通过如下方法进行制备，所述方法包括：将季铵盐脂样分子与有机溶剂混合，得到有机相；将所述有机相与水混合，得到混合相；所述混合相与mRNA溶液混合，得到mRNA递送系统。所述mRNA递送系统组分简单，单组分或者双组分载体能够实现高效、高特异性的肺靶向mRNA递送，而且稳定性优异，生物相容性好，制备工艺简化，批次之间稳定性好，为mRNA药物在治疗肺部疾病中的应用奠定基础。

Description

一种mRNA递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种mRNA递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
信使RNA(mRNA)是以DNA的一条链作为模板转录而来、携带有遗传信息、可以指导蛋白质合成的单链核糖核酸，其作为核酸类药物之一，能够在基因水平发挥作用。mRNA药物具有研发周期短、安全性高、合成快速、免疫原性好等特点，目前已广泛用于蛋白替代疗法、癌症免疫疗法、疫苗等领域。作为mRNA药物研究的重点和难点，mRNA递送载体有利于保护外源性mRNA不被核酸酶降解，且将难以入胞的mRNA导入至细胞内，然后通过机体的蛋白翻译系统产生功能活性蛋白。因此，研发安全有效的mRNA递送系统是mRNA药物的关键技术之一。
脂质纳米粒递送技术在递送核酸药物领域已取得了一定成功，例如CN111467321A公开了一种mRNA核酸类药物递送系统、制备方法和应用，所述mRNA核酸类药物递送系统包括用于负载一种或多种mRNA的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒由包括可电离的阳离子脂质、磷脂辅助脂质、胆固醇和磷脂聚乙二醇衍生物的原料制备而成，具有良好、稳定的mRNA药物胞内递送效率。CN112999360A公开了一种DMP纳米粒在mRNA递送中的用途，针对目前mRNA递送缺乏高效安全的载体的问题，提供一种由DOTAP阳离子磷脂与两亲性双嵌段共聚物mPEG-PCL混合制备得到的DMP纳米粒，为mRNA递送提供一种新的递送载体；所述DMP纳米粒递送mRNA的细胞毒性低、转染率高，具有很好的前景。CN111658782A公开了一种mRNA疫苗递送载体，所述mRNA疫苗递送载体包括类脂分子A和类脂分子B，所述类脂分子A由溴壬烯和三氟甲基辛-2-烯-1-醇的反应制备得到，所述类脂分子B由环二赖氨和三氟甲基1,2-环氧十二烷反应合成；所述mRNA疫苗递送载体应用于mRNA疫苗，还包括二油酰磷脂酰乙醇胺、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000等稳定剂；该mRNA疫苗递送载体可在体内实现安全表达和激活免疫反应，具有较好的稳定性、递送效率和安全性。从目前的研究成果来看，已经有采用脂质纳米粒递送技术的核酸药物取得临床应用的成功，例如用于临床的mRNA疫苗BNT162b2与mRNA-1273，siRNA药物Onpattro等。
然而，现有的mRNA脂质纳米递送载体大多成分复杂，且所翻译的蛋白大多数都富集在肝脏，肝脏以外其他器官例如肺部的特异性靶向递送问题亟待解决，从而极大地限制了核酸药物的治疗水平。因此，开发一种具有器官靶向性的高效的核酸药物递送系统，是本领域的研究重点。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种mRNA递送系统及其制备方法和应用，通过采用含有季铵盐脂样分子的脂样纳米粒作为载体，解决了核酸药物递送系统器官特异性问题，实现了肺靶向递送的效果，使mRNA在肺部高度特异性的表达，为mRNA药物在肺部疾病的治疗奠定基础。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种mRNA递送系统，所述mRNA递送系统包括载体以及负载于所述载体上的mRNA；所述载体包括含有季铵盐脂样分子的脂样纳米粒；所述季铵盐脂样分子具有如式I或式II所示结构：
Figure BDA0003275221940000031
其中，R1、R2、R3各自独立地选自C1～C50直链或支链烷基、C2～C50直链或支链不饱和烃基、C3～C50脂环烃基、C2～C50脂杂环基、C6～C50芳香烃基或C6～C50含芳香环的脂环烃基中的任意一种；
R4 -为一价阴离子；
n代表亚甲基的个数，选自0～10的整数，例如可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
所述mRNA递送系统通过如下方法进行制备，所述方法包括：将季铵盐脂样分子与有机溶剂混合，得到有机相；将所述有机相与水混合，得到混合相；所述混合相与mRNA溶液混合，得到所述mRNA递送系统。
本发明提供的mRNA递送系统中，以含有季铵盐脂样分子的脂样纳米粒作为载体，解决了核酸药物递送系统的器官特异性问题，获得高效、高特异性的肺靶向mRNA递送，稳定性优异，生物相容性好，而且组分简单，制备工艺简化，为mRNA药物在肺部疾病的治疗奠定基础。
本发明中，所述C1～C50直链或支链烷基可以为C2、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的直链或支链烷基。
所述C2～C50直链或支链不饱和烃基可以为C3、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的直链或支链不饱和烃基，所述“不饱和烃基”意指基团中含有至少一个C＝C双键或至少一个C≡C三键。
所述C3～C50脂环烃基可以为C3、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的脂环烃基，所述“脂环烃基”意指非芳香性碳环基团，包括饱和脂环烃基或不饱和脂环烃基；所述饱和脂环烃基包含单环、多环(包含2个、3个或4个环的稠环)、螺环，示例性地包括但不限于：环己烷基、环庚烷基、金刚烷基等；所述“不饱和脂环烃基”意指脂环烃基团中含有至少一个C＝C双键或至少一个C≡C三键，示例性地包括但不限于：环己烯基、环庚烯基等。
所述C2～C50脂杂环基可以为C3、C5、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的脂杂环基，即在脂环烃基中引入杂原子后形成的基团，所述脂环烃基的含义如前文所述，此处不再赘述。
所述C6～C50芳香烃基可以为C6、C9、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等的芳香烃基，示例性地包括但不限于：苯基、萘基、联苯基、蒽基、菲基等。
所述C6～C50(例如C6、C9、C10、C12、C15、C18、C20、C22、C25、C28、C30、C32、C35、C38、C40、C42、C45或C48等)含芳香环的脂环烃基，即在脂环烃基上引入芳香环后形成的基团，所述脂环烃基的含义如前文所述，此处不再赘述。
本发明中，所述脂杂环基中的杂原子包括但不限于N、P、O或S。
优选地，所述mRNA包括但不限于萤火虫荧光素酶mRNA、增强型绿色荧光蛋白mRNA或β半乳糖苷酶mRNA等。
优选地，所述R1、R2、R3各自独立地选自C6～C20(例如C8、C10、C12、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20等)直链烷基或C6～C20(例如C8、C10、C12、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20等)直链烯烃基中的任意一种。
优选地，所述R1、R2、R3各自独立地选自如下基团中的任意一种：
Figure BDA0003275221940000051
其中，波浪线标记处代表基团的连接键。
优选地，所述R4 -选自Br-、I-、Cl-、OH-或NO3 -，进一步优选为I-。
优选地，所述n为1。
优选地，所述季铵盐脂样分子具有如下结构中的任意一种：
Figure BDA0003275221940000052
Figure BDA0003275221940000061
Figure BDA0003275221940000071
优选地，所述季铵盐脂样分子为qtB-UC18。
优选地，所述季铵盐脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(简称为氮磷比)为(0.1～20):1，例如可以为0.2:1、0.3:1、0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1等，进一步优选为(1.5～15):1。
优选地，所述脂样纳米粒中还包括脂质分子，所述脂质分子的结构与季铵盐脂样分子的结构不同。
优选地，所述脂样纳米粒中季铵盐脂样分子与脂质分子的摩尔比为(0.1～10):1，例如可以为0.2:1、0.3:1、0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。
优选地，所述脂质分子包括非阳离子脂质、阳离子脂质或聚乙二醇修饰脂质中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述非阳离子脂质包括1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(DSPC)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、1-棕榈酰-2-油酰基卵磷脂(POPC)、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰胆碱(SOPC)、1,2-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DMPE)、1,2-二油烯-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DOPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DMPG)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(DSPG)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油(POPG)、胆固醇(Chol)、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、鞘磷脂、神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油或鞘磷脂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述阳离子脂质包括N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙基胺(DODMA)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油基氧代基-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)或2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述聚乙二醇(PEG)修饰脂质包括PEG-磷脂酰乙醇胺、PEG-磷脂酸、PEG-神经酰胺、PEG-二烃基胺或PEG-甘油二酯中的任意一种或至少两种的组合；具有代表性地包括DMG-PEG、DLPE-PEG、DMPE-PEG、DPPC-PEG或DSPE-PEG中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述聚乙二醇修饰脂质中聚乙二醇的重均分子量Mw为1000～10000，例如可以为2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000等。
优选地，所述mRNA递送系统的水合粒径为100～400nm，例如可以为120nm、140nm、150nm、160nm、180nm、200nm、210nm、230nm、250nm、270nm、290nm、300nm、310nm、330nm、350nm、370nm或390nm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
本发明提供的mRNA递送系统中，所述载体包括含有季铵盐脂样分子和任选地脂质分子的脂样纳米粒，具有如下优势：
(1)批次之间的稳定性好
现有技术中公开的用于体内递送mRNA的脂质纳米粒主要由四种或四种以上的组分组成，组分多，配方复杂；本发明所述脂样纳米粒可通过单组分(季铵盐脂样分子)或双组分(季铵盐脂样分子与脂质分子的组合)构成，配方简单，制备工艺简化，有利于规模化生产和保持批次之间的质量稳定性。
(2)转染效率高
本发明提供的mRNA递送系统中，通过载体的配方优化，体外递送mRNA的效率可达到商业化转染试剂lipofectamine 2K(赛默飞)的5倍以上。
(3)高效、高特异性肺靶向递送mRNA
所述mRNA递送系统中，通过载体的优化，即调整单组分(季铵盐脂样分子)或双组分(季铵盐脂样分子与脂质分子的组合)与mRNA的制剂配比即可获得高效、高特异性的肺靶向mRNA递送。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的mRNA递送系统的制备方法，所述制备方法包括：将季铵盐脂样分子与有机溶剂混合，得到有机相；将所述有机相与水混合，得到混合相；将所述混合相与mRNA溶液混合，得到所述mRNA递送系统。
优选地，所述有机溶剂为与水互溶的有机溶剂，进一步优选为醇类溶剂。
优选地，所述有机溶剂包括甲醇和/或乙醇。
优选地，所述有机相中季铵盐脂样分子的浓度为0.2～20mg/mL，例如可以为0.5mg/mL、0.8mg/mL、1mg/mL、3mg/mL、5mg/mL、7mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、17mg/mL或19mg/mL，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述有机相中还包括脂质分子，所述脂质分子的结构与季铵盐脂样分子的结构不同。
优选地，所述脂质分子与季铵盐脂样分子的摩尔比为1:(0.1～10)，例如可以为1:0.2、1:0.3、1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等。
优选地，所述有机相与水的体积比为1:(0.25～19)，例如可以为1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:13、1:15、1:17或1:19等，进一步优选为1:(1～10)。
优选地，所述mRNA溶液的溶剂为缓冲溶液(水性溶剂)，进一步优选为PBS缓冲溶液。
优选地，所述mRNA溶液中mRNA的浓度为5～500ng/μL，例如可以为8ng/μL、10ng/μL、15ng/μL、20ng/μL、25ng/μL、30ng/μL、40ng/μL、50ng/μL、100ng/μL、150ng/μL、200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL、350ng/μL、400ng/μL或450ng/μL，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
优选地，所述混合相与mRNA溶液的体积比为1:(0.25～19)，例如可以为1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.7、1:0.9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:13、1:15、1:17或1:19等，进一步优选为1:(1～10)。
优选地，所述制备方法中，控制体系中的季铵盐脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(简称为氮磷比)为(0.1～20):1，例如可以为0.2:1、0.3:1、0.5:1、0.6:1、0.8:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1或19:1等。
优选地，所述制备方法具体包括如下步骤：将季铵盐脂样分子、有机溶剂以及任选地脂质分子混合均匀，得到有机相；将所述有机相与水以体积比1:(0.25～19)、优选为1:(1～10)混合均匀，得到混合相；将mRNA与水性溶剂混合均匀，得到mRNA溶液；将所述混合相与mRNA溶液以体积比1:(0.25～19)、优选为1:(1～10)混合均匀，得到所述mRNA递送系统。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的mRNA递送系统在肺靶向药物中的应用。
本发明提供的mRNA递送系统具有高效、高特异性的肺靶向性，尤其适合应用于肺靶向药物/治疗肺部疾病药物中。
第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的mRNA递送系统。
优选地，所述药物组合物的给药方式包括肌肉注射、皮内注射、静脉注射或动脉注射，进一步优选为肌肉注射或静脉注射。
优选地，所述药物组合物为肺靶向药物组合物。
优选地，所述药物组合物包括治疗肺部疾病的药物组合物。
优选地，所述药物组合物还包括佐剂。
优选地，所述佐剂包括药用载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的mRNA递送系统中，以含有季铵盐脂样分子的脂样纳米粒作为载体，获得高效、高特异性的肺靶向mRNA递送，稳定性优异，生物相容性好，而且组分简单，制备工艺简化，批次之间稳定性好，为mRNA药物在治疗肺部疾病中的应用奠定基础。
附图说明
图1为实施例1～5、8～12提供的mRNA递送系统的体外递送效率结果图；
图2为实施例13提供的mRNA递送系统给药后的小鼠整体成像生物发光图；
图3为实施例6、7、13、14提供的mRNA递送系统给药后的小鼠离体器官成像生物发光图；
图4为实施例6、7、13、14提供的mRNA递送系统给药后每克小鼠器官的总光子通量值结果图；
图5为实施例6、7、13、14提供的mRNA递送系统给药后小鼠每克器官的总光子通量百分比结果图；
图6为实施例1、4、6、7、10、13、14提供的mRNA递送系统的核酸电泳图；
图7为实施例1、4、6、7、10、13、14提供的mRNA递送系统的水合粒径统计图；
图8为实施例7提供的mRNA递送系统的透射电镜图；
图9为实施例13提供的mRNA递送系统的透射电镜图；
图10为实施例6、7、13提供的mRNA递送系统在血清中的稳定性测试图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
在一个具体实施方式中，所述季铵盐脂样分子qtB-UC18的合成方法包括如下步骤：
(1)将均苯三甲醛与
Figure BDA0003275221940000131
按照摩尔比1:3.6混合并溶解于乙醇和二氯甲烷的混合溶剂中，在35℃下反应24h，再加入NaBH4室温还原24h，最后用CHCl3萃取3次；将萃取产物用中压制备色谱纯化系统(λ1＝216nm、λ2＝254nm)、以CH2Cl2和甲醇作为流动相进行提纯，减压浓缩干燥，得到中间体tB-UC18。
Figure BDA0003275221940000132
(2)将得到的tB-UC18溶于乙醇中，以碳酸钾作为缚酸剂，加入6倍摩尔量的碘甲烷，39℃油浴搅拌48h。减压旋蒸，加入二氯甲烷，用水洗涤三次，再次旋蒸有机溶剂，得产物qtB-UC18。
Figure BDA0003275221940000141
qtB-UC18质荷比理论值为334.3468，质谱检测值为334.3612；
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.24(s,3H),5.34(t,J＝5.8Hz,6H),4.96(s,6H),3.65(s,18H),3.37(d,J＝18.1Hz,6H),2.01(dd,J＝12.7,6.7Hz,12H),1.82(s,6H),1.47–1.14(m,66H),0.88(t,J＝6.7Hz,9H)。
实施例1
一种mRNA递送系统，包括载体以及负载于所述载体上的萤火虫荧光素酶mRNA(由上海伟寰生物科技有限公司提供)，所述载体为含有季铵盐脂样分子qtB-UC18的脂样纳米粒；qtB-UC18中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(以下简称为氮磷比)为1.5:1；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为28ng/μL的mRNA溶液；
(2)将季铵盐脂样分子qtB-UC18溶解于乙醇中，得到浓度为1.5mg/mL的有机相；将所述有机相与水以体积比1:9的比例混合均匀，得到混合相；
(3)将步骤(1)得到的mRNA溶液与步骤(2)得到的混合相以体积比3:7混合均匀，使qtB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1，得到所述mRNA递送系统。
实施例2～5
一种mRNA递送系统，与实施例1的区别仅在于，qtB-UC18的浓度不同，使得qtB-UC18与mRNA的氮磷比不同，分别为2:1、3:1、4.5:1、6:1；其他组分、用量、制备方法均与实施例1相同；具体氮磷比如表1所示。
实施例6
一种mRNA递送系统，包括载体以及负载于所述载体上的萤火虫荧光素酶mRNA，所述载体为含有季铵盐脂样分子qtB-UC18的脂样纳米粒；qtB-UC18中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(以下简称为氮磷比)为9:1；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为70ng/μL的mRNA溶液；
(2)将季铵盐脂样分子qtB-UC18溶解于乙醇中，得到浓度为7.5mg/mL的有机相；将所述有机相与水以体积比3:7的比例混合均匀，得到混合相；
(3)将步骤(1)得到的mRNA溶液与步骤(2)得到的混合相以体积比3:7混合均匀，使qtB-UC18与mRNA的氮磷比为9:1，得到所述mRNA递送系统。具体氮磷比如表1所示。
实施例7
一种mRNA递送系统，包括载体以及负载于所述载体上的萤火虫荧光素酶mRNA，所述载体为含有季铵盐脂样分子qtB-UC18的脂样纳米粒；qtB-UC18中N原子与mRNA中P原子的摩尔比(以下简称为氮磷比)为15:1；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为70ng/μL的mRNA溶液；
(2)将季铵盐脂样分子qtB-UC18溶解于乙醇中，得到浓度为8.3mg/mL的有机相；将所述有机相与水以体积比4.5:5.5的比例混合均匀，得到混合相；
(3)将步骤(1)得到的mRNA溶液与步骤(2)得到的混合相以体积比3:7混合均匀，使qtB-UC18与mRNA的氮磷比为15:1，得到所述mRNA递送系统。具体氮磷比如表1所示。
表1
氮磷比
实施例1 1.5:1
实施例2 2:1
实施例3 3:1
实施例4 4.5:1
实施例5 6:1
实施例6 9:1
实施例7 15:1
实施例8
一种mRNA递送系统，包括载体以及负载于所述载体上的萤火虫荧光素酶mRNA，所述载体为含有季铵盐脂样分子qtB-UC18与脂质分子(DOPE，1,2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺)的脂样纳米粒；qtB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1，qtB-UC18与DOPE的摩尔比为4:1；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为28ng/μL的mRNA溶液；
(2)将qtB-UC18与DOPE以摩尔比4:1溶解于乙醇中，得到qtB-UC18浓度为3mg/mL、DOPE浓度为0.4mg/mL的有机相；将所述有机相与水以体积比1:9的比例混合均匀，得到混合相；
(3)将步骤(1)得到的mRNA溶液与步骤(2)得到的混合相以体积比3:7混合均匀，使qtB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1，qtB-UC18与DOPE的摩尔比为4:1，得到所述mRNA递送系统。
实施例9～12
一种mRNA递送系统，与实施例8的区别仅在于，qtB-UC18与脂质分子DOPE的摩尔比不同；其他组分、用量、制备方法均与实施例8相同；具体配方如表2所示。
实施例13
一种mRNA递送系统，包括载体以及负载于所述载体上的萤火虫荧光素酶mRNA，所述载体为含有季铵盐脂样分子qtB-UC18的脂样纳米粒；qtB-UC18与mRNA的氮磷比为6:1，qtB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为70ng/μL的mRNA溶液；
(2)将qtB-UC18与DOPE以摩尔比1:1溶解于乙醇中，得到qtB-UC18浓度为9.9mg/mL、DOPE浓度为5.3mg/mL的有机相；将所述有机相与水以体积比3:7的比例混合均匀，得到混合相；
(3)将步骤(1)得到的mRNA溶液与步骤(2)得到的混合相以体积比3:7混合均匀，使qtB-UC18与mRNA的氮磷比为6:1，qtB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1，得到所述mRNA递送系统。具体配方如表2所示。
实施例14
一种mRNA递送系统，包括载体以及负载于所述载体上的萤火虫荧光素酶mRNA，所述载体为含有季铵盐脂样分子qtB-UC18的脂样纳米粒；qtB-UC18与mRNA的氮磷比为9:1，qtB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1；其制备方法包括如下步骤：
(1)将mRNA溶解至pH值为7.4的PBS缓冲溶液中，得到浓度为70ng/μL的mRNA溶液；
(2)将qtB-UC18与DOPE以摩尔比1:1溶解于乙醇中，得到qtB-UC18浓度为9.9mg/mL、DOPE浓度为5.3mg/mL的有机相；将所述有机相与水以体积比4.5:5.5的比例混合均匀，得到混合相；
(3)将步骤(1)得到的mRNA溶液与步骤(2)得到的混合相以体积比3:7混合均匀，使qtB-UC18与mRNA的氮磷比为9:1，qtB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1，得到所述mRNA递送系统。具体配方如表2所示。
表2
qtB-UC18与DOPE的摩尔比 氮磷比
实施例8 4:1 1.5:1
实施例9 2:1 1.5:1
实施例10 1:1 1.5:1
实施例11 1:2 1.5:1
实施例12 1:4 1.5:1
实施例13 1:1 6:1
实施例14 1:1 9:1
对上述实施例1～14提供的mRNA递送系统进行性能测试及分析，具体如下：
一、制剂配方在细胞水平的优化，方法如下：
在96孔板中铺293T细胞，每孔含90μL的全细胞培养液，24h后，取10μL待测的mRNA递送系统(实施例1～5、8～12)加入到孔中，置于细胞培养箱中培养，24h后检测蛋白的表达；以赛默飞的lipofectamine 2K(简写为Lipo 2K)作为参比。
制剂配方的优化通过两种方案进行：(1)对于单组分mRNA递送系统，优化季铵盐脂样分子与mRNA的氮磷比；(2)对于双组分mRNA递送系统，先固定季铵盐脂样分子与mRNA的氮磷比，再优化季铵盐脂样分子与脂质分子的摩尔比。
上述方案得到的mRNA递送系统的体外递送效率测试结果如图1所示，纵坐标的相对光强(％)是以Lipo 2K的强度(即Lipo 2K为100％)而言。对应于第一种制剂配方的优化方案(实施例1～5)，实施例4的体外递送效率最高，为516％；对应于第二种制剂配方的优化方案(实施例8～12)，实施例10的体外递送效率最高，为484％。
二、mRNA递送系统的体内靶向性评价
以C57BL/6J小鼠为实验对象，通过尾静脉注射给药的方式向小鼠体内注入本发明提供的mRNA递送系统(简明起见，示例性提供实施例6、7、13、14的小鼠体内实验结果)，每只小鼠按mRNA量为0.5mg/kg尾静脉给药；给药4h后，按150mg/kg剂量腹腔给荧光酶底物，10min后通过小动物成像仪(珀金埃尔默，PerkinElmer)对小鼠进行整体成像；然后依次取出主要器官(心、肝、脾、肺、肾等)，进行离体成像，检测萤火虫荧光素酶的蛋白表达情况。以先前报道的tB-UC18与mRNA的氮磷比为1.5:1，tB-UC18与DOPE的摩尔比为1:1的mRNA脂样纳米递送系统tB-UC18 LLNs作为对照组(将tB-UC18与DOPE以摩尔比1:1溶解于乙醇中形成有机相；将所述有机相与萤火虫荧光素酶mRNA溶液直接以1:9体积比混合均匀，得到所述mRNA脂样纳米递送系统对照组)。
示例性地，小鼠通过尾静脉注射实施例13或者对照组提供的mRNA递送系统4h后的整体成像的生物发光图如图2所示；小鼠通过尾静脉注射实施例6、7、13、14或者对照组提供的mRNA递送系统4h后的小鼠器官离体成像的生物发光图如图3所示；通过珀金埃尔默活体成像软件(Living Image Software)对图3的生物发光进行光子通量进行定量分析(Totalflux)，获得的每克小鼠组织的总光子通量值(单位为Total flux/g)如图4所示；由图3每克小鼠组织的总光子通量值计算得到的百分比结果图如图5所示；结合图2～图5可知，上述单组份(季铵盐脂样分子)mRNA递送系统(实施例6、7)和双组份(季铵盐脂样分子与脂质分子的组合)mRNA递送系统(实施例13、14)实现了77％～95％的mRNA在肺部高效、高特异性的表达；而前述作为对照组的mRNA脂样纳米递送系统tB-UC18 LLNs无法实现肺部靶向。以上结果表明采用其他方法制备的其他类型的mRNA脂样纳米递送系统无法实现肺靶向，而通过本发明提供的特定载体和使用特定的制剂制备方法得到的mRNA递送系统实现了高特异性的肺部靶向。
三、mRNA递送系统的负载性能评价
通过核酸电泳评价本发明提供的mRNA递送系统对mRNA的负载性能，示例性地，图6为实施例1、4、6、7、10、13、14提供的mRNA递送系统的核酸电泳图，从图中可知，所述mRNA递送系统的电泳条带相对于游离mRNA的电泳条带发生迁移，说明该季铵盐脂样分子独自使用或者与脂质分子联合使用都可以成功负载mRNA。
四、mRNA递送系统的水合粒径
利用DLS(动态光散射)对本发明提供的mRNA递送系统进行水合粒径的表征，示例性地，对实施例1、4、6、7、10、13、14提供的mRNA递送系统的水合粒径进行统计，得到的水合粒径统计图如图7所示，从图中可知，所述mRNA递送系统的水合粒径范围为100～400nm。
五、mRNA递送系统的形态表征
利用Hitachi TEM System透射电镜对本发明提供的mRNA递送系统进行形态表征，示例性地，实施例7提供的mRNA递送系统的透射电镜图如图8所示，结果显示，所述mRNA递送系统具有规则的球形形貌，粒径约为120nm；实施例13提供的mRNA递送系统的透射电镜图如图9所示，结果显示，所述mRNA递送系统具有规则的球形形貌，粒径约为300nm。
六、mRNA递送系统的稳定性评价
将本发明提供的mRNA递送系统在10％血清中室温孵育后，通过检测血清在不同时间点的吸光度变化(660nm)监测mRNA递送系统的稳定性。示例性地，实施例6、7、13提供的mRNA递送系统的血清稳定性测试图如图10所示，所述mRNA递送系统与10％血清中室温孵育不同时间(6h、24h、48h、72h)后，660nm处的吸光度值相对于0h未发生明显变化，说明所述mRNA递送系统在测定范围内未发生明显的聚集，具有良好的稳定性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的mRNA递送系统及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (27)

1.一种mRNA递送系统，其特征在于，所述mRNA递送系统包括载体以及负载于所述载体上的mRNA；所述载体包括含有季铵盐脂样分子的脂样纳米粒；所述季铵盐脂样分子具有如下结构：
Figure FDA0003694731920000011
所述季铵盐脂样分子中N原子与mRNA中P原子的摩尔比为(1.5～15):1，所述mRNA递送系统的水合粒径为100～400nm；
所述mRNA递送系统通过如下方法进行制备，所述方法包括：将季铵盐脂样分子与有机溶剂混合，得到有机相；将所述有机相与水混合，得到混合相；所述混合相与mRNA溶液混合，得到所述mRNA递送系统。
2.根据权利要求1所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样纳米粒中还包括脂质分子，所述脂质分子的结构与季铵盐脂样分子的结构不同。
3.根据权利要求2所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂样纳米粒中季铵盐脂样分子与脂质分子的摩尔比为(0.1～10):1。
4.根据权利要求2所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述脂质分子为非阳离子脂质、阳离子脂质或聚乙二醇修饰脂质中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求4所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述非阳离子脂质为1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱、氢化大豆磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰基卵磷脂、1-硬脂酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1,2-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二油烯-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、二油酰磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸甘油、胆固醇、3β-[N-(N',N'-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求4所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述阳离子脂质为N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙基胺、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷、1-亚油酰基-2-亚油氧基-3-二甲基氨基丙烷、1,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷、3-(N,N-二油基氨基)-1,2-丙二醇、1,2-二亚油基氧代基-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷或2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求4所述的mRNA递送系统，其特征在于，所述聚乙二醇修饰脂质为PEG-磷脂酰乙醇胺、PEG-磷脂酸、PEG-神经酰胺、PEG-二烃基胺或PEG-甘油二酯中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种如权利要求1～7任一项所述的mRNA递送系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将季铵盐脂样分子与有机溶剂混合，得到有机相；将所述有机相与水混合，得到混合相；将所述混合相与mRNA溶液混合，得到所述mRNA递送系统。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为醇类溶剂。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇和/或乙醇。
11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机相中季铵盐脂样分子的浓度为0.2～20mg/mL。
12.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机相中还包括脂质分子，所述脂质分子的结构与季铵盐脂样分子的结构不同。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述脂质分子与季铵盐脂样分子的摩尔比为1:(0.1～10)。
14.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机相与水的体积比为1:(0.25～19)。
15.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述有机相与水的体积比为1:(1～10)。
16.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述mRNA溶液的溶剂为缓冲溶液。
17.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述mRNA溶液的溶剂为PBS缓冲溶液。
18.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述mRNA溶液中mRNA的浓度为5～500ng/μL。
19.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述混合相与mRNA溶液的体积比为1:(0.25～19)。
20.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述混合相与mRNA溶液的体积比为1:(1～10)。
21.一种如权利要求1～7任一项所述的mRNA递送系统在制备肺靶向药物中的应用。
22.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1～7任一项所述的mRNA递送系统。
23.根据权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式为肌肉注射、皮内注射、静脉注射或动脉注射。
24.根据权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式为肌肉注射或静脉注射。
25.根据权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为治疗肺部疾病的药物组合物。
26.根据权利要求22所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括佐剂。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述佐剂为药用载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
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