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CN113718031B - 一种卵巢癌早期诊断组合物的建立 - Google Patents

一种卵巢癌早期诊断组合物的建立 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤诊断领域，公开了一种卵巢癌早期诊断组合物的建立，通过对cfDNA含量，cfDNA TP53突变丰度和CA125蛋白表达水平的测定，可以对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估，其敏感度、特异性和准确率达到91.11％、94.34％和93.38％，对早期卵巢癌的检出率达到78.9％。采用本发明的标志物组合和模型评分方法，在CA125阴性的卵巢癌患者中，可以检出其中71.05％的患者，在CA125阳性的非肿瘤人群中，可以正确评判其中74％的受检者，可以很好地弥补CA125漏检和错检的问题。本发明能为临床提供有效的卵巢癌早期诊断或筛查标志物，有利于提升早期卵巢癌的预测准确率和检出率。

Description

一种卵巢癌早期诊断组合物的建立
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断或筛查领域，涉及一种卵巢癌早期诊断组合物的建立，特别涉及卵巢癌生物标准物组合及其应用、试剂盒和评价模型。
背景技术
卵巢癌年发病率居女性生殖系统肿瘤第3位，呈逐年上升的趋势，位于宫颈癌和子宫体恶性肿瘤之后，而死亡率位于妇科肿瘤之首，是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一。Ⅰ期卵巢癌患者5年生存率可超过90％，而晚期卵巢癌的5年生存率<20％。卵巢深处盆腔，当卵巢病变处于早期时常无特异临床症状，而当因出现症状而就诊时，70％的患者已处于晚期。由此可见，卵巢癌早期筛查与诊断对其预后有重要意义。
目前，临床上采用的检测卵巢癌的方法包括：癌抗原125(Cancer Antigen 125,CA125)、经阴道超声单独筛查或者二者联合。在卵巢癌中，CA125的阳性率与肿瘤分期、组织学类型有关，晚期、浆液性卵巢癌患者的阳性率显著高于早期及非浆液性卵巢癌患者(早期的阳性率约43.50％～65.70％，晚期的阳性率84.10％～92.40％)。CA125的表达水平受到多种因素的影响，如常见的女性生理期、妊娠状态、子宫内膜异位症、盆腔炎等良性疾病都可能导致CA125升高，同时，并不是所有卵巢癌患者的CA125都升高。阴道超声虽然应用普遍，但对操作医生的经验和技术有较高的要求，判断肿块良恶性的准确率不高。因而，无论是CA125、经阴道超声单独筛查还是二者联合，均不能达到满意的效果。
因此，亟需开发新的有诊断价值的外周血标志物，以期在早期就能灵敏且特异性地通过微创方式进行卵巢癌预测和诊断。
游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)测序是近些年出现的新技术，已经被证实肿瘤患者的血浆cfDNA含量要显著高于健康人群。基于cfDNA测序的液体活检已经被证实在诸多肿瘤的多种临床适应症中具有潜在应用价值。组织测序表明，大于90％的卵巢癌组织样本携带TP53突变。然而早期卵巢癌患者的肿瘤负荷较低，释放到血液中的cfDNA较少，ctDNA的突变丰度也较低，需要极其灵敏的技术才能检测到。虽然，ctDNA-NGS测序技术在不断进步，早期卵巢肿瘤患者仍会存在无突变检出或漏检的情况。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于建立一种卵巢癌筛查或早期诊断的组合，提供用于卵巢癌诊断的多分子标志物组合和评估模型，以及在此基础上制备用于诊断卵巢癌的芯片和试剂盒。
根据本发明的一方面，提供一种用于预测、诊断和/或预后评估卵巢癌的生物标志物群。所述生物标志物群包含循环游离DNA(cfDNA)，cfDNA TP53突变丰度(MAF)和血浆癌抗原125(CA125)蛋白。
本发明另一方面是提供所述生物标志物群cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125在对卵巢癌预测、诊断和/或预后评估中的应用。本发明中，所述预测包括对待测个体进行卵巢癌筛查或早期诊断。在一具体实施方式中，所述生物标志物群用于卵巢癌筛查或早期诊断。
本发明另一方面是提供所述生物标志物群cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125在制备卵巢癌预测、诊断和/或预后评估的体外诊断产品中的应用。
本发明另一方面是提供特异性识别或检测如上所述的生物标志物群的物质在制备卵巢癌预测、诊断和/或预后评估的体外诊断产品中的应用。所述特异性识别或检测如上所述的生物标志物群的物质包括特异性识别或检测cfDNA的物质，特异性识别或检测cfDNATP53突变丰度的物质，以及特异性识别或检测CA125蛋白表达水平的物质。
本发明应用中，所述诊断是指对待测个体是否患有卵巢癌进行诊断，或对待测个体的卵巢癌是否进展或复发进行诊断，其中所述诊断包括早期筛查或诊断；所述预测是指对待测个体患有卵巢癌的风险进行预测；所述评估是指对待测个体患有卵巢癌的程度进行评估，或对待测个体接受相关治疗后的疗效进行评估。
其中，所述对待测个体患有卵巢癌的程度进行评估是指评估卵巢癌是I期卵巢癌、II期卵巢癌、I～II期卵巢癌、III期卵巢癌、IV卵巢癌或III～IV期卵巢癌。
本发明应用中，所述卵巢癌的类型有：卵巢上皮细胞癌，分为浆液性腺癌、透明细胞癌、黏液性腺癌、子宫内膜样腺癌；卵巢恶性生殖细胞肿瘤，分为卵黄囊瘤、无性细胞瘤、未成熟畸胎瘤；恶性性索间质肿瘤，分为支持细胞-间质细胞瘤、颗粒细胞-间质细胞瘤；转移性肿瘤，为原发于胃肠道的库肯勃瘤。
本发明中，所述生物标志物群可以与其他卵巢癌相关标志物联合使用，所述其他卵巢癌相关标志物包括但不限于，癌胚抗原、甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素、乳酸脱氢酶、Prkdc蛋白、Rad54L蛋白、NPM1基因编码的蛋白、GNAS基因编码的蛋白、P53基因编码的蛋白、FUBP1基因编码的蛋白或KRAS基因编码的蛋白等。
本发明另一方面是提供一种卵巢癌相关体外诊断产品，其特征在于，所述体外诊断产品包括特异性识别或检测cfDNA的试剂，特异性识别或检测cfDNA TP53突变丰度的试剂，特异性识别或检测CA125蛋白表达水平的试剂。
本发明中，所述体外诊断产品为试剂、芯片或试剂盒。在一实施方式中，所述试剂盒包括所述芯片。
本发明中，所述试剂特异性识别或检测血浆循环游离DNA(cfDNA)含量、特异性识别或检测cfDNA TP53突变丰度(MAF)和特异性识别或检测癌抗原125(CA125)蛋白，通过检测待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的存在或水平，用于对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估。在另一优选例中，所述的试剂用于卵巢癌的治疗疗效的评估，较佳地以血浆作为样本。
本发明提供的芯片是为了对受试者进行卵巢癌诊断而利用复合生物标志物群的卵巢癌诊断用芯片。在一具体实施方式中，本发明提供的芯片包含特异性识别或结合DNA(cfDNA)含量的试剂，特异性识别或结合cfDNA TP53突变丰度(MAF)的试剂和特异性识别或结合血浆癌抗原125(CA125)蛋白的试剂。
根据本发明的另一方面，提供的试剂盒是为了对受试者进行卵巢癌诊断而利用复合生物标志物群的卵巢癌诊断用试剂盒。在一具体实施方式中，本发明提供的试剂盒包含特异性识别或结合DNA(cfDNA)含量的试剂，特异性识别或结合cfDNA TP53突变丰度(MAF)的试剂和特异性识别或结合血浆癌抗原125(CA125)蛋白的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒是化学发光试剂盒。优选地，所述化学发光试剂盒包括捕获抗体、检测抗体以及化学发光底物。
本发明另一方面是提供体外诊断产品在预测、诊断和/或预后评估卵巢癌中的应用。所述体外诊断产品用于对待测个体是否患有卵巢癌进行诊断，或对待测个体患有卵巢癌的风险进行预测，或对待测个体患有卵巢癌的程度进行评估，或对待测个体的卵巢癌是否进展或复发进行诊断，或对待测个体接受相关治疗后的疗效进行评估。
本发明中，所述对待测个体患有卵巢癌的程度进行评估是指评估卵巢癌是I期卵巢癌、II期卵巢癌、I～II期卵巢癌、III期卵巢癌、IV卵巢癌或III～IV期卵巢癌。在另一优选例中，所述的诊断卵巢癌包括：区分良性和恶性。
本发明中，所述卵巢癌的分期通常参照NCCN指南和AJCC第七版。在本发明一些实施方式中，所述卵巢癌的类型有：卵巢上皮细胞癌，分为浆液性腺癌、透明细胞癌、黏液性腺癌、子宫内膜样腺癌；卵巢恶性生殖细胞肿瘤，分为卵黄囊瘤、无性细胞瘤、未成熟畸胎瘤；恶性性索间质肿瘤，分为支持细胞-间质细胞瘤、颗粒细胞-间质细胞瘤；转移性肿瘤，为原发于胃肠道的库肯勃瘤。
本发明中，所述待测个体的样本来自于全血、血清、血浆、唾液、颊粘膜拭子、淋巴液、脑脊液、腹水、宫颈巴氏涂片、膀胱冲洗物、子宫冲洗物、粪便、尿和组织活检物等。
本发明另一方面是提供一种对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估模型，其特征在于，所述模型包括：
确定待测个体中cfDNA的含量，cfDNA TP53突变丰度和CA125的表达水平；和
通过分析测定的含量、丰度或表达水平以产生风险评分，其中该风险评分用于对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估。
在一实施方式中，所述模型是用于卵巢癌筛查或早期诊断的模型。
在一具体实施方式中，所述风险评分的表达分析用统计学分析完成，通过如下数学函式可以待测个体患卵巢癌的风险进行评估：
Figure BDA0003215711030000041
Score值代表待测个体患卵巢癌的风险值，Score＞0.15表示高风险卵巢癌，Score≤0.15表示低风险即健康或良性疾病。
其中，TP53 MAF丰度测定值的计算方式为：突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)*100％；其测定方法可以采用任何已知的方式，本发明优选为高通量测序，测序针对TP53的全部编码区，如：全基因组序列或全外显子序列或其他包含TP53全部编码区的靶向序列。
其中，cfDNA含量的单位为ng/ml；其测定方法为血浆中提取的cfDNA总量(ng)除以血浆体积(mL)，其中cfDNA总量通过对溶液中的cfDNA进行测定获得，测定方法可以通过Qubit或Q-seq或其他仪器进行，得到的cfDNA的浓度乘以溶液体积即可获得cfDNA总量。
其中，CA125含量的单位为U/ml；其测定方法可以采用任何已知的方式，包括但不限于电化学免疫发光法、化学发光免疫分析、酶联免疫(ELISA)等；本发明优选为电化学免疫发光法、化学发光免疫分析或酶联免疫(ELISA)。
本发明中，通过选择某一值作为参照值/参照水平，通过测定的值和参照值/参照水平相比较，可以区分个体是存活良好与存活差；或区分个体将会受益于给予特定药物与不会受益于给予特定药物等。可受益于给予特定药物是指，个体状态任意量度的改善，包括本领域常用的那些量度如总体存活、长期存活、无复发存活和远期无复发存活等。
本发明中，所述待测个体的参照值/参照水平可以根据群里的正常个体进行确定。所述确定的方法可以参考本领域公知的方法进行。在一实施方式中，所述CA125临界值范围可以为临床常用的含量范围(35U/mL)。
本发明另一方面是提供一种对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估的装置，其中所述诊断包括早期筛查或诊断；所述装置包括：
数据提供模块：用于提供待测个体中cfDNA的含量，cfDNA TP53突变丰度和CA125的表达水平的数据；
分析模块：用于通过分析待测个体中cfDNA的含量，cfDNA TP53突变丰度和CA125的表达水平数据以产生风险评分，其中该风险评分用于对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估。
所述分析模块中，所述风险评分通过如下数学函式计算：
Figure BDA0003215711030000051
其中，Score值代表待测个体患卵巢癌的风险值，Score＞0.15表示高风险卵巢癌，Score≤0.15表示低风险即健康或良性疾病；
其中，TP53 MAF丰度测定值的计算方式为：突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)*100％；其测定方法可以采用任何已知的方式，本发明优选为高通量测序，测序针对TP53的全部编码区，如：全基因组序列或全外显子序列或其他包含TP53全部编码区的靶向序列。
其中，cfDNA含量的单位为ng/ml；其测定方法为血浆中提取的cfDNA总量(ng)除以血浆体积(mL)，其中cfDNA总量通过对溶液中的cfDNA进行测定获得，测定方法可以通过Qubit或Q-seq或其他仪器进行，得到的cfDNA的浓度乘以溶液体积即可获得cfDNA总量。
其中，CA125含量的单位为U/ml；其测定方法可以采用任何已知的方式，包括但不限于电化学免疫发光法、化学发光免疫分析、酶联免疫(ELISA)等；本发明优选为电化学免疫发光法、化学发光免疫分析或酶联免疫(ELISA)。
本发明人通过靶向的高通量测序技术(下一代测序技术，next generationsequencing，NGS)和电化学免疫发光法技术对156例卵巢癌患者，56例卵巢良性疾病人群和315例无症状健康人群进行检测，以确定血浆cfDNA含量，cfDNA TP53突变及突变丰度和血浆CA125蛋白的表达水平，并进一步研究了三者单独及联合用于卵巢癌诊断的效能，发现CA125单独用于卵巢癌诊断的敏感度、特异性和准确率分别为：73.33％、85.85和82.12％；本发明联合三种标志物指标综合评分用于卵巢癌诊断的敏感度、特异性和准确率分别为：91.11％、94.34和93.38％，均显著高于CA125单一指标和现有其他的检测方法。其中，三种指标综合评分对于I-III期卵巢癌的敏感度分别为：70％，88.9％，100％，对于早期(I期+II期)的敏感度为：78.9％，均显著高于CA125单一指标。同时本组合物评分方法与现有方法相比，其特异性和敏感度也显著提升。特别的，在CA125阴性的卵巢癌患者，本发明所述生物标志物群和模型评分方法，可以成功检出其中71.05％的患者，说明本发明可以很好弥补CA125漏检的问题。在CA125阳性的非肿瘤人群中，采用本发明的标志物组合和模型评分方法，可以正确评判其中74％的受检者，说明本发明也可以弥补CA125错检的问题。由此揭示了cfDNA含量，cfDNA TP53突变丰度联合CA125蛋白的表达水平建立的综合评分模型进行早期卵巢癌诊断的价值。
利用上述模型可筛查或诊断卵巢癌，与现有技术相比，本发明的有益效果包括
(1)本发明采用cfDNA含量，cfDNA TP53突变丰度联合癌抗原125(CA125)进行卵巢癌的筛查或诊断，所检测的指标可采用临床常用检测平台进行检测，具有较高的重复性和可操作性，可实现高通量自动检测。
(2)所述生物标志物群cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125构成与现有的生物标志物相比具有更高卵巢癌诊断能力的复合生物标志物群。cfDNA指标(cfDNA血浆含量，TP53突变丰度)能够弥补CA125特异性低，易受生理状态影响的缺陷，通过本发明的技术方案，能够提高预测、筛查或诊断早期卵巢癌的准确率、特异性等。
(3)评分结果的解读客观，并且易懂，能够进一步提高卵巢癌诊断用试剂盒及利用卵巢癌诊断用试剂盒的卵巢癌诊断方法的效率。
(4)利用本发明的产品/模型诊断卵巢癌，其敏感度、特异性和准确率高，分别达到91.11％、94.34％和93.38％，能够降低假阳性；此外对于早期卵巢癌患者的检出率达到78.9％，显著高于现有临床常用方法(CA125，ROMA)的检出率。
(5)本发明检测快速，稳定性好，能够实现高通量检测，且成本低廉。
(6)本发明能够通过有效的诊断来提高卵巢癌患者的生存率，而且能够监测患者对治疗的反应，从而根据该结果更换治疗方式。为临床诊断和科研工作提供一种非常有效的检测手段，为医生评定是否为卵巢癌提供了很好的辅助作用。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
为了使本发明的目的，技术方案和有益效果更加清晰，本发明提供如下附图：
图1CA125在不同组别受试者中的表达水平。
图2不同组别受试者的血浆游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)含量分布。
图3游离DNATP53基因突变在不同组别受试者中的突变丰度。
图4不同组别受试者的综合评分分布。
图5A训练集中的ROC曲线。
图5B验证集中的ROC曲线。
图6采用不同检测方法/模型对不同分期卵巢癌检测的敏感度对比。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本领域技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、免疫学、检验学、基因测序技术、生物信息技术及相关领域的常规技术。
本发明提供一种用于预测、诊断和/或预后评估卵巢癌的生物标志物群。所述生物标志物群包含循环游离DNA(cfDNA)，cfDNA TP53突变丰度(MAF)和血浆癌抗原125(CA125)蛋白。
cfDNA是血浆循环游离DNA(cfDNA)，这些DNA多由身体的细胞或白血球破裂释放出来。循环游离DNA(cfDNA)的含量是指每毫升血浆中提取的游离DNA量。
TP53基因又称为P53，是一种抑癌基因，该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质。由该基因编码的蛋白质是一种转录因子，控制着细胞周期的启动，从细胞分裂初始该蛋白即起着决定性作用。cfDNA TP53突变为COSMIC数据库所报道过的突变或者预测会对TP53的功能活性产生影响的变异。针对TP53突变丰度的检测包含TP53的全部编码区，如：全基因组测序或全外显子序列或其他包含TP53全部编码区的靶向序列，测定方法可以通过高通量测序进行。
“CA125”，即糖类抗原(carbohydrate antigen)125，也被称为粘蛋白-16，是MUC16基因编码的蛋白。CA125是卵巢上皮癌的标志物之一，目前广泛用于卵巢上皮癌的诊断与随访。本发明中，“CA125”意指与NCBI登录号NP_078966.2具有至少85％序列同一性的多肽生物标志物或其片段。
本发明中，所述“预测”是指对待测个体患卵巢癌概率的评估。进一步地，设定所述生物标志物群的参照水平，当待测个体的生物标志物水平低于所述参照水平时，所述待测个体为正常个体，当待测个体的生物标志物水平高于所述参照水平时，所述待测个体为存在卵巢癌发生风险。
本发明中，“诊断”意指鉴定待测个体卵巢癌的存在或性质。所述诊断包括对卵巢癌的早期诊断(I期、II期或I+II期)或区分良性和恶性。本发明中，卵巢癌具体分期为I期、II期、III期和IV期肿瘤。其中，I期：肿瘤局限在卵巢，无其他部位的转移；Ⅱ期：肿瘤在累及卵巢的同时，发生了盆腔内的扩散，如子宫、输卵管、宫旁组织的转移；Ⅲ期：肿瘤发生了盆腔外腹膜种植或者局部淋巴结转移；Ⅳ期：远处转移，如肝、肺、脑、骨等。一般来说，分期越高，恶性程度越高，预后越差；反之，分期越低，预后越好。另外地，“卵巢癌的早期阶段”或“早期卵巢癌”意指处于I期或II期的卵巢癌。
本发明中，诊断测定的“敏感度”是群体中，测试为阳性的患病个体占总患病个体的百分比。
本发明中，诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性率”是指测试为阳性但实际上未患病的个体的比例。
本发明中，诊断测定的“准确率”也称效率(efficiency)，用测试为真阳性与真阴性的人数之和占受试总人数的百分率表示。
本发明中，诊断测定的“阳性预测值”是指真阳性人数占试验结果阳性人数的百分比，表示试验结果阳性者属于真病例的概率。
本发明中，诊断测定的“阴性预测值”是指真阴性人数占试验结果阴性人数的百分比，表示试验结果阴性者属于非病例的概率。
本发明中，“对早期卵巢癌的检出率/敏感度”是指测试为I期或II期卵巢癌的患病个体之和占实际为I期或II期卵巢癌患病个体之和的百分比。
本发明中，“对于I期卵巢癌的敏感度”是指测试为I期卵巢癌的患病个体占实际为I期卵巢癌患病个体的百分比。
本发明中，“对于II期卵巢癌的敏感度”是指测试为II期卵巢癌的患病个体占实际为II期卵巢癌患病个体的百分比。
本发明中，“对于III期卵巢癌的敏感度”是指测试为III期卵巢癌的患病个体占实际为III期卵巢癌患病个体的百分比。
本发明中，“对于IV期卵巢癌的敏感度”是指测试为IV期卵巢癌的患病个体占实际为IV期卵巢癌患病个体的百分比。
本发明中，“预后评估”是指对卵巢癌患者的病程和/或结局进行预后判断，或对治疗剂治疗效果的评估判断或进行监测。例如，采用药物治疗后，待测个体中所述生物标志物群的水平仍持续高于参照水平，指示卵巢癌在所述待测个体中的进展。
本发明中，“卵巢癌”的含义应由本领域技术人员熟知。为避免疑义，卵巢癌是从卵巢出现生长的癌。多于90％的卵巢癌的起源是上皮，其来源于卵巢表面。然而，认为输卵管也可能是一些卵巢癌的来源，而在这种情况中，由输卵管发展的癌也被术语“卵巢癌”涵盖。
本发明中，预测、诊断和/或预后评估卵巢癌的类型有：卵巢上皮细胞癌，分为浆液性腺癌、透明细胞癌、黏液性腺癌、子宫内膜样腺癌；卵巢恶性生殖细胞肿瘤分为卵黄囊瘤、无性细胞瘤、未成熟畸胎瘤；恶性性索间质肿瘤，分为支持细胞-间质细胞瘤、颗粒细胞-间质细胞瘤；转移性肿瘤，如原发于胃肠道的库肯勃瘤。其中，上皮性肿瘤占卵巢癌的2/3左右，一般来自卵巢表面的生发上皮。生殖细胞肿瘤可以占到卵巢癌的20％，发病率仅次于上皮性肿瘤；生殖器肿瘤可见于任何年龄，一般以年轻妇女多见；儿童和青春期妇女60％的卵巢肿瘤为生殖细胞来源。性索间质肿瘤，约占卵巢肿瘤5％到10％；此类卵巢肿瘤能分泌激素，并出现相应的症状。转移性肿瘤，约有5％-10％卵巢肿瘤是转移性的。本发明优选地，所述预测、诊断和/或预后评估的卵巢癌为上皮性卵巢癌。
本发明中，可采用各种技术来检测cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平，这些技术均可包含在本发明中。所述的检测可用已有的技术，包括但不限于：Western印迹、SDS-PAGE、原位杂交、酶联免疫反应、聚合酶链反应(PCR)、Southern印迹、蛋白序列分析、质谱分析或DNA序列分析等。
本发明中，所述样品是来自所述待测个体的全血、血清、血浆、唾液、颊粘膜拭子、淋巴液、脑脊液、腹水、宫颈巴氏涂片、膀胱冲洗物、子宫冲洗物、粪便、尿和组织活检物等。较佳地，本发明以血浆作为待测样品。所述样品可以是新鲜的、冷冻的、或石蜡固定包埋的细胞。
在一个实施方式中，所述样品是获自所述待测个体的血浆样品，其为血液的黄色液体成分，正常情况下，全血中的血细胞在其中悬浮。其占总血液体积的约55％。其大部分是水(90体积％)，并且包含溶解的蛋白质、葡萄糖、凝血因子、矿物离子、激素和二氧化碳。血浆通过在离心机中对管中的新鲜血液进行离心直至血细胞沉降至管底来制备。
在一个实施方式中，所述样品是获自所述待测个体的血清样品。血清源自血浆，血清是不含血纤蛋白原或其它凝集因子的血浆。
本发明人致力于提高卵巢癌诊断敏感度、特异性和准确率等，以及卵巢癌的早期诊断。本发明人收集了大量的临床病例，经过大样本量分析和深入的研究，揭示了一组卵巢癌联合标志物：cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125。在卵巢癌患者的血清/血浆中，这些分子的表达显著高于健康对照。因此，可应用这些标志物来制备可高效诊断卵巢癌的诊断芯片或诊断试剂盒。这些标志物联合应用于临床诊断，可以得知待测个体是否罹患卵巢癌以及卵巢癌的严重程度，为疾病的诊断或预后提供依据，或可早期评估待测个体罹患卵巢癌的可能性，或是针对已经接受治疗的待测个体评估治疗的有效性等。因此，联合应用本发明所述生物标志物群可以显著提高诊断卵巢癌的敏感度、特异性和准确率等，并且能够高效检出卵巢癌早期患者。效果显著优于应用单一标志物的情形，也显著高于联合应用其它标志物的情形。
本发明还提供了所述生物标志物群cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125在预测、诊断和/或预后评估中的应用。
本发明提供了一种卵巢癌检测试剂，所述试剂特异性识别或检测cfDNA、特异性识别或检测cfDNA TP53突变丰度、特异性识别或检测CA125蛋白，提供检测待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的存在或水平，用于对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估。针对cfDNA、cfDNA TP53突变丰度的检测，可以分别是高通量测序法；在一优选实施方式中，针对TP53突变检测的高通量测序法包含TP53的全部外显子。针对CA125的检测，可以是电化学免疫发光法。
本发明中，所述试剂可依赖于带有可检测标记以用于检测目的。所述试剂通常通过如下方式来标记：将所述试剂共价或非共价地结合提供或允许可检测信号的产生的物质或配体。一些示例包括但不限于，放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质、配体、微粒、氧化还原性分子、底物、辅助因子、抑制剂、磁性颗粒等。可作为检测标记物的酶的示例包括但不限于，β-葡萄糖醛酸酶、β-葡糖苷酶、脲酶、过氧化物酶或碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、己糖激酶和GDP酶、RNA酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶、果糖磷酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶，和β-内酰胺酶。荧光物质的示例包括但不限于，荧光素、异硫氰酸酯、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛和荧光胺(fluorescamin)。发光物质的示例包括但不限于，吖啶酯、荧光素和荧光素酶。配体的示例包括但不限于，生物素及其衍生物。微粒的示例包括但不限于，胶体金和有色胶乳。氧化还原分子的示例包括但不限于，二茂铁、钌络合物、紫罗碱、醌、It离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、氢醌。
本发明提供了一种为了对受试者进行卵巢癌诊断而利用复合生物标志物群的卵巢癌诊断用芯片，其中，该卵巢癌诊断用芯片包含检测生物标志物血浆循环游离DNA(cfDNA)含量，cfDNA TP53突变丰度(MAF)和血浆癌抗原125(CA125)蛋白表达水平的试剂。所述芯片用于筛选待测个体中的早期卵巢癌，和/或用于评估待测个体中的卵巢癌进展，和/或用于评估药物的治疗效果等。在一具体实施方式中，本发明提供的芯片包含特异性识别或结合DNA(cfDNA)含量的试剂，特异性识别或结合cfDNA TP53突变丰度(MAF)的试剂和特异性识别或结合血浆癌抗原125(CA125)蛋白的试剂。
在一实施方式中，本发明提供一种卵巢癌检测芯片，包括DNA芯片和蛋白芯片，所述DNA芯片和蛋白芯片可以分开设置，或设置在同一张芯片上。当所述DNA芯片和蛋白芯片设置在不同芯片上时，不同类型的吸附剂存在于不同的固体支持物上。当所述DNA芯片和蛋白芯片设置在同一张芯片上时，不同类型的吸附剂存在于同一的固体支持物上。所述DNA芯片与对应于本文所公开的核酸杂交，用于特异性识别或检测cfDNA、特异性识别或检测cfDNA TP53突变丰度，所述蛋白芯片用于特异性识别或检测CA125蛋白。
本发明中，DNA芯片可以采用本领域公知的技术进行制备。在一具体实施方式中，所述DNA芯片包括负载有纳米金属的基板，所述纳米金属与拉曼信号分子连接，拉曼信号分子通过连接分子与探针连接。所述DNA芯片通过微阵列技术将高密度DNA片段阵列以一定的排列方式使其附着在玻璃、尼龙等材料上面。
本发明中，蛋白芯片可以采用本领域公知的技术进行制备。包括固相载体、捕获抗体和标记检测抗体。所述蛋白芯片是一种高通量监测系统，通过靶分子和捕捉分子相互作用来监测蛋白分子之间的相互作用。作为本发明的优选方式，所述蛋白芯片是液相芯片，较佳地，采用双抗夹心法结合液相芯片技术。双抗夹心法常规的做法是将捕获抗体(又称为第一抗体或一抗)固定于载体，然后捕获抗体与蛋白抗原反应，洗涤后再与带标记的检测抗体(又称为第二抗体或二抗)反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。
捕获抗体的制备可通过在适当的反应条件下，在偶联液的存在下，将针对目标生物标志物的单克隆抗体与磁微粒进行连接而获得。进一步地，检测抗体可以是具有碱性磷酸酶标记的单克隆抗体、具有碱性磷酸酶标记的单克隆抗体，及其组合。
作为本发明蛋白芯片的一种实施方式，将所述的捕获抗体固定于携带特定可检测信号(分子)的微球上，制备液相蛋白芯片，通过采用液相蛋白芯片进行检测的原理是：使单个微球通过检测通道，并使用两种激光同时对微球上的微球识别信号和可检测信号进行检测。一种激光激发的是微球上的微球识别信号，根据微球上的不同种识别信号，可以将微球分类，从而将各个不同的结合反应区分开来。另一种激光激发的是可检测信号，目的是确定微球上结合的可检测信号的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。因此，通过两种激光的同时检测，可以确定被结合的检测物的种类和数量。
在一个实施方式中，所述抗体衍生自CA125蛋白，是对CA125蛋白具有特异性的抗体。在一个实施方式中，所述试剂带有可检测的标记。所述的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的CA125蛋白或其具有抗原性的片段，可被施用于动物(如小鼠、大鼠、家兔等)以诱导多克隆抗体的产生，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。与之相似的，表达CA125蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用公知的杂交瘤技术来制备。
本文中所用的术语“抗体”具有其最广泛含义，并且涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如线性抗体、单链抗体分子、Fc或Fc'肽、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体，例如由至少两种完整抗体产生的双特异性抗体、包含抗体部分的融合蛋白质，和包含抗原识别位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示所需的生物活性即可。抗体可以是五类主要的免疫球蛋白中任一类之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)，基于对其重链恒定结构域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的鉴定。不同类别的免疫球蛋白具有不同的且熟知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸抗体，或与其它分子(例如毒素、放射性同位素等)偶联。
其中，所述的“微球识别信号”是指位于微球上的、用于区别不同的捕获抗体的识别信号。为了方便起见，对于固定有同一种捕获抗体的微球，微球识别信号优选是相同的。优选的，所述的微球识别信号是荧光信号，并且，对于固定有不同种捕获抗体的微球，荧光的色彩是不同的，对于固定有同种捕获抗体的微球，荧光的色彩优选是相同的。将捕获抗体固定在微球上的详细操作程序可用常规方法，从而得到不同微球与相应捕获抗体形成的偶联物。
其中，可选用多种可检测信号来标记所述的检测抗体。比如，所述的可检测信号选自：FITC、CY3、CY5、藻蓝蛋白、俄勒冈绿染料、得克萨斯红染料等。对应于可检测信号的检测物质为能够与可检测信号相结合并能够报告所述结合的分子(报告分子)。当采用生物素来标记检测抗体时，可采用链亲和素-藻红蛋白作为报告分子。可检测信号标记方法是本领域技术人员熟知的。
为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置阳性对照和阴性对照，以确定所述生物标志物的表达情况以及表达量。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的标准品。对照或标准品的设置方法采用常规的方法。较佳地，所述的特异性探针或抗体上携带可识别信号，从而可方便、直观地获得检测结果。
本发明还提供了所述生物芯片的用途，用于预测、诊断和/或预后评估卵巢癌或用于制备诊断卵巢癌的试剂盒。
本发明还提供了一种为了对受试者进行卵巢癌诊断而利用复合生物标志物群的卵巢癌诊断用试剂盒，用于检测cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125水平，从而对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估。
本发明中，所述试剂盒包含如上所述的试剂或生物芯片。所述试剂盒还可以包括用于杂交或酶联检测等所需的其它各种试剂，包括但不限于：PCR反应液、质控液、标准品、酶、对照液、显色液、洗液等。进一步地，所述试剂盒还可以包括容器、使用说明书，以指导人们按照正确的流程、条件、剂量来实施检测，包括如何收集待测样品，如何清洗探针等。所述标准品为DNA标准品和血浆癌抗原125(CA125)蛋白标准蛋白。
本发明中，所述试剂盒可以制备成化学发光试剂盒。“化学发光试剂盒”意指利用化学发光酶免疫分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay，cLEIA)对生物标志物的水平进行测定的试剂盒。具体地，在化学发光酶免疫分析中，以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，然后用发光信号测定仪进行发光测定，从而对来自待测个体的样品中的生物标志物水平进行定量分析。
本发明还提供了所述试剂盒的用途，用于预测、诊断和/或预后评估卵巢癌。
本发明还提供了一种对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估的模型，其特征在于，所述模型包括：
确定待测个体中cfDNA，cfDNA TP53突变和CA125的水平；和
分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分用于对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估。
当对待测个体患卵巢癌的风险进行评估时，具体地，所述风险评分的表达分析用统计学分析完成，数学函式如下：
Figure BDA0003215711030000141
Score值代表待测个体患卵巢癌的风险值，Score＞0.15表示高风险卵巢癌，Score≤0.15表示低风险即健康或良性疾病。
本发明还提供了一种对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估的装置，其中所述诊断包括早期筛查或诊断；所述装置包括：
数据提供模块：用于提供待测个体中cfDNA的含量，cfDNA TP53突变丰度和CA125的表达水平的数据；
分析模块：用于通过分析待测个体中cfDNA的含量，cfDNA TP53突变丰度和CA125的表达水平数据以产生风险评分，其中该风险评分用于对卵巢癌进行预测、诊断和/或预后评估。
所述分析模块中，所述风险评分通过如下数学函式计算：
Figure BDA0003215711030000142
其中，Score值代表待测个体患卵巢癌的风险值，Score＞0.15表示高风险卵巢癌，Score≤0.15表示低风险即健康或良性疾病；
其中，TP53 MAF的计算方式为：突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)*100％；
其中，cfDNA含量的测定方法为血浆中提取的cfDNA总量除以血浆体积，单位为ng/ml；
其中，CA125含量的单位为U/ml。
本发明还提供了一种检测待测个体是否罹患卵巢癌的方法，所述方法包括如下步骤：检测所述待测个体中cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125中的表达水平；分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于确定所述待测个体是否罹患卵巢癌。
本发明还提供了一种筛选待测是否患有早期卵巢癌的方法，所述方法包括如下步骤：测试所述待测个体中cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125中的表达水平；分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于确定所述待测个体是否罹患早期卵巢癌。
在一个实施方式中，所述早期卵巢癌是I期癌。
对于前述卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的鉴定也允许评估针对所述癌症的治疗在待测个体中的疗效的方法。通过测定所述待测个体中cfDNA、cfDNATP53突变丰度和CA125中的表达水平，分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于确定所述待测个体是否将受益于接受该治疗。
采用本发明的方法来监测针对卵巢癌的治疗方案的功效，最终目的在于消除疾病。在所述情况中，治疗的成功可检测为来自患病的待测个体的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的减少或消除。如果治疗有效，则前述cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平将低于各自的参照水平，而如果治疗无效，则前述cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平高于或与各自的参照水平相同。因此，在一些实施方式中，所述待测个体中的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平低于各自的参照水平，则指示卵巢癌在所述待测个体中衰退，观察到成功的治疗。所述cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125或其各自的参照水平可获自多个正常样品的平均。
因此，本发明还提供了一种评估待测个体中卵巢癌的进展或复发的方法，所述方法包括如下步骤：检测所述待测个体中cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125。在一些实施方式中，若所述待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平高于其各自的参照水平，则指示卵巢癌在所述待测个体中复发；若所述待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平低于或接近各自的参照水平，则指示卵巢癌未在所述待测个体中复发。
在一个实施方式中，所述方法包括：
(a)检测所述待测个体中卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125水平；
(b)分析所述表达水平以产生风险评分，其中该风险评分可用于确定所述待测个体中卵巢癌的进展或复发。
在一个实施方式中，所述待测个体正经历针对卵巢癌的治疗。在一些实施方式中，所述待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平高于参照水平，指示卵巢癌在所述待测个体中的进展或复发。
本发明还提供一种筛选有用于治疗待测个体中卵巢癌的候选治疗剂的方法，所述方法包括如下步骤：评估所述候选治疗剂在减少所述待测个体中卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平方面的活性。
在一个实施方式中，所述方法包括：
(a)给予所述待测个体所述候选治疗剂；
(b)检测所述待测个体中卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平；和
(c)将所述待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平与患有卵巢癌的未经治疗的待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125水平做比较；
其中，如果所述待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平低于所述未经治疗的待测个体中的卵巢癌相关的cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平，则所述候选治疗剂有用于治疗卵巢癌。
筛选试验可以体外和/或体内方式进行。例如，可在基于细胞的试验中筛选预期的试剂以鉴定用于治疗卵巢癌的候选治疗剂。就此而言，使各预期试剂与培养的细胞(例如获自正常待测个体或患卵巢癌待测个体的卵巢的细胞，或源自正常或患病待测个体的细胞系)孵育，然后检测cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的水平。
可如上所述确定所述cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125各自的参照水平。
在本发明的一些实施方式中，在多于一个时间点检测cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的存在或水平。这种“连续”取样非常适于，例如，监测卵巢癌的进展。连续取样可以任何所需时间线进行，例如每月一次、每季一次(即，每三个月一次)、半年一次、每年一次、每两年一次，或更低频率。
本发明所述生物标志物群、所述应用或方法中，所述生物标志物群可以与其他卵巢癌相关标志物联合使用，所述其他卵巢癌相关标志物为现在已经确定的或将来发现并确定的用于对卵巢癌的发生、发展、风险进行预测或评估标志物，包括但不限于，癌胚抗原、甲胎蛋白、人绒毛膜促性腺激素、乳酸脱氢酶、Prkdc蛋白、Rad54L蛋白、NPM1基因编码的蛋白、GNAS基因编码的蛋白、P53基因编码的蛋白、FUBP1基因编码的蛋白或KRAS基因编码的蛋白等。
本文中所用的术语“待测个体”指任何动物(例如，哺乳动物)，其包括但不限于，人、非人灵长类、狗、猫、马、牛、绵羊、鹿、猪、啮齿类和已知患卵巢癌的任何其它动物。因此，虽然上文述及的是关于人cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的测定信息，应理解本发明的方法不限于人类。
在一些实施方式中，所述检测包括生物标志物群cfDNA、cfDNA TP53突变丰度和CA125的检测，其中所述生物标志物群还可以与卵巢癌相关的其他标志物联用。
实验对象
实施例中所提及的受试者均为女性，包括无症状健康人群315例、卵巢良性疾病人群56例、上皮性卵巢癌156例；其中156例上皮性卵巢癌受试者和56例卵巢良性疾病受试者主要在浙江大学附属妇产科医院进行招募，招募时间为在2018年12月至2021年4月。
卵巢癌受试者被确诊为上皮性卵巢癌，在血液采集前未接受任何抗癌治疗。如表1所示，卵巢癌早期病例(I+II期)占比41％(64例)，该群体的中位年龄为55.5岁。卵巢良性疾病人群的中位年龄为50岁。所有患者均填写了知情同意书以同意使用他们的临床数据，本发明研究严格依照赫尔辛基宣言进行操作，且同时经浙江大学附属妇产科医院伦理审查委员会批准。实施例中所提及的315例无症状健康志愿者样本，中位年龄为56岁，部分来自既往生物样本库，少量通过志愿者招募形式进行，招募志愿者均填写了知情同意书以同意使用他们的血液样本。
表1.受试者的病例特征
Figure BDA0003215711030000171
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.血液样品收集
静脉血收集采用游离DNA采血管(LBgard血液收集试管，美国Biomatirca公司)，样品在室温条件下(4℃-37)℃被送至上海允晟医学检验所(中国上海)进行血浆和白细胞(white blood cell，WBC)分离。所有受试者均进行了10mL全血样本采集。用于获取血浆和外周血样本于手术当天麻醉前进行抽取。生物样本库的健康志愿者血浆保存于-80℃，不少于3mL，保存时间在2年内，通过干冰运输至上海允晟医学检验所。
2.cfDNA和基因组DNA(genomic DNA)的提取
外周血(每个新收集样品10mL、生物样本库样本3mL)离心，离心条件为4℃，1600g，10分钟。收集血浆(上层黄色层)和白细胞(中间层)，然后将上层血浆进行第二次离心，以去除残留细胞或细胞碎片，离心条件为：4℃，16000g，10分钟。分离出0.5mL血浆单独保存用于后续蛋白标志物检测，剩余血浆将用于cfDNA提取。血浆和白细胞样本标记对应的受试者编号和分离日期，并于-80℃保存直至使用。
参照试剂盒供应商的说明书，使用全式金游离DNA提取试剂盒自2.5-5mL血浆中提取cfDNA。参照试剂盒供应商的说明书，使用天根血液基因组DNA(genomic DNA，gDNA)提取试剂盒自白细胞样本中提取gDNA。
cfDNA通过Qubit荧光计(生命科技公司,Carlsbad,CA)进行定量和片段分析，并计算cfDNA含量(ng/mL血浆)，各组样本的cfDNA含量分布见图2。使用前DNA样本-20℃下保存。
cfDNA含量的计算公式为：
Figure BDA0003215711030000181
3.蛋白标志物检测
使用cobas e411系统(罗氏公司)进行蛋白标志物CA125的检测。使用罗氏糖类抗原125检测试剂盒(电化学发光法)进行检测，实验过程参照试剂盒供应商的说明书进行操作。
以CA125作为单一评价指标，以常用的35U/mL作为血浆CA125表达临界值。在156例上皮性卵巢癌受试者中，38例(24.4％)的CA125在正常范围内，118例(75.6％)的CA125高于临界值，156例的CA125的平均值为572.8U/mL；在56例卵巢良性疾病受试者中，38例(67.9％)的CA125在正常范围内，18例(32.1％)的血浆CA125高于临界值，56例的CA125的平均值为70.6U/mL；在315例无症状健康人群中，283例(89.8％)CA125在正常范围内，32例(10.2％)的血浆CA125超出范围，315例的CA125的平均值为17.7U/mL(详细信息见表1，图1)。总体上，单一CA125指标进行检测的假阳性率为：13.48％(即(18+32)/(56+315))。
4.cfDNATP53高通量测序和体细胞突变的鉴定
基于高通量测序的cfDNA TP53突变检测通过基于捕获建库的外显子测序进行，白细胞gDNA和cfDNA测序均使用该技术进行。cfDNA和gDNA文库构建的具体方法可参照KAPA文库构建试剂盒(美国KAPA Biosystems)的相关操作指南进行。NGS文库在MGISEQ-2000(华大智造)上进行测序，测序结果与hg19/GRCh38人参考序列进行比对，去除由随机NGS错误造成的本底噪声，随后即可识别出真正的突变体，通过将包含突变体的独有测序结果的数量与用于映射变体位置的所有测序结果的数量进行对比，以计算突变频率。胚系突变和造血克隆突变可以通过白血细胞测序予以过滤，通过扣除白细胞中检测到的突变以获得真实的cfDNATP53体细胞突变。
在156例上皮性卵巢癌受试者中，TP53体细胞突变的阳性率为77.6％(突变阳性样本的突变丰度中位值：0.35％，范围：0.01％-33.92％)；在315例无症状健康队列中，TP53的阳性率为10.2％(突变阳性样本的突变丰度中位值：0.05％，范围：0.01％-0.54％)；在56例卵巢良性疾病受试者中，16例(28.6％)中存在cfDNATP53突变(突变丰度中位值：0.28％，范围：0.02％-12.78％)(详细见图3)。
5.预测模型的构建
将各组样本按照2.5：1随机分配入选训练集和验证集，即最终111例上皮性卵巢癌样本，40例卵巢良性疾病样本以及225例健康受试者样本数据纳入训练集，其人群特征详细信息见表1。采用SPSS 26.0软件通过逻辑回归法构建模型，P值低于0.05被认为统计学上具有显著意义。将年龄，cfDNA含量，CA125表达量，TP53突变丰度(TP53野生型突变丰度定义为0)纳入分析，年龄不具有统计学意义，最终确定了以CA125表达量，TP53突变丰度，cfDNA含量为变量的模型，其数学函式如下：
Figure BDA0003215711030000201
函数值(即Score值)代表受试者患卵巢癌的风险值，Score＞0.15表示高风险(卵巢癌)，Score≤0.15表示低风险(健康或良性疾病)。
根据上述数学函式计算所有样本的综合评分，各组样本综合评分分布见图4。训练集的ROC曲线见图5-A。
6.模型的性能验证
45例上皮性卵巢癌样本，16例卵巢良性疾病样本以及90例健康受试者样本数据，作为验证集，其人群特征详细信息见表1。验证集的ROC曲线见图5-B。根据本实例的验证集数据，CA125单独用于卵巢癌诊断的敏感度、特异性和准确率分别为：73.33％、85.85和82.12％；三者指标综合评分用于卵巢癌诊断的敏感度、特异性和准确率分别为：91.11％、94.34和93.38％(表2)。其中，三者指标综合评分对卵巢癌I-III期的敏感度分别为：70％，88.9％，100％，对早期(I期+II期)卵巢癌的敏感度为：78.9％，均显著高于CA125单指标(图6)。
同时本组合物评分方法与文献报道方法进行比较，其特异性和敏感度也显著提升(表3)。特别的，通过本发明的组合物和模型可以很好地避免漏检和错检的问题，见表4；如在38例CA125阴性的卵巢癌患者，通过此组合物和模型评分方法，可以成功检出其中27例(71.05％)，说明本发明可以很好弥补CA125漏检的问题；在50例CA125阳性的非肿瘤人群中，通过此组合物和模型评分方法，可以正确评判出其中74％(37/50)的人群，说明本发明可以很好弥补CA125错检的问题。
表2综合评分模型与CA125，TP53独立指标评判卵巢癌的性能比较
Figure BDA0003215711030000202
表3综合评分模型与临床常用方法的性能比较
Figure BDA0003215711030000211
*中华人民共和国国家卫生健康委员会.卵巢癌诊疗规范(2018年版)[J].肿瘤综合治疗电子杂志,2019,5(2):87-96.链接:http://www.jmcm2018.com/CN/Y2019/V5/I2/87
表4综合评分方法弥补CA125的缺陷
Figure BDA0003215711030000212
综上所述，本发明的生物标志物群和评估模型性能优异，如高于临床现有常用的CA125及ROMA指标，在显著提升特异性的同时，敏感度、准确率等也得到提高；特别的，对于CA125阴性的卵巢癌患者，检出率达到71.05％，对于CA125阳性的非肿瘤人群，可正确评判其中74％的人群，对于卵巢癌的早诊具有较高的临床价值，同时具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.一种对卵巢癌进行诊断的装置，其特征在于，所述诊断包括早期筛查或诊断；所述装置包括：
数据提供模块：用于提供待测个体中cfDNA的含量，cfDNATP53突变丰度和CA125的表达水平的数据；
分析模块：用于通过分析待测个体中cfDNA的含量，cfDNATP53突变丰度和CA125的表达水平数据以产生风险评分，其中该风险评分用于对卵巢癌进行诊断；
所述分析模块中，所述风险评分通过如下数学函式计算：
Figure FDA0003583682790000011
其中，Score值代表待测个体患卵巢癌的风险值，Score＞0.15表示高风险卵巢癌，Score≤0.15表示低风险即健康或良性疾病；
其中，TP53 MAF的计算方式为：突变型拷贝数/(突变型拷贝数+野生型拷贝数)*100％；
其中，cfDNA含量的测定方法为血浆中提取的cfDNA总量除以血浆体积，单位为ng/ml；
其中，CA125含量的单位为U/ml。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述诊断是指对待测个体是否患有卵巢癌进行诊断。
3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述卵巢癌是I期卵巢癌、II期卵巢癌、I～II期卵巢癌、III期卵巢癌、IV卵巢癌或III～IV期卵巢癌。
4.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，所述卵巢癌的类型有：卵巢上皮细胞癌，分为浆液性腺癌、透明细胞癌、黏液性腺癌、子宫内膜样腺癌。
5.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述待测个体的样本来自于全血、血清或血浆。
6.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述数据提供模块中，还包括提供其他卵巢癌相关标志物的含量。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114280301A (zh) * 2022-03-03 2022-04-05 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 一种同时检测两项肿瘤标志物的方法及其试剂盒
CN115851938A (zh) * 2022-10-26 2023-03-28 中国医学科学院肿瘤医院 一种基于ctDNA的筛选卵巢癌患者是否获益的药物的方法及其试剂盒
CN116879558B (zh) * 2023-09-05 2023-12-01 天津云检医学检验所有限公司 卵巢癌诊断标志物、检测试剂及检测试剂盒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020204674A2 (ko) * 2019-04-05 2020-10-08 주식회사 제놉시 Cfdna를 이용한 암 진단방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112020002555A2 (pt) * 2017-08-07 2020-08-11 The Johns Hopkins University métodos e materiais para avaliar e tratar câncer
CA3095056A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Freenome Holdings, Inc. Machine learning implementation for multi-analyte assay of biological samples

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020204674A2 (ko) * 2019-04-05 2020-10-08 주식회사 제놉시 Cfdna를 이용한 암 진단방법

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Christine Fribert Thusgaard et al..Epithelial ovarian cancer and the use of circulating tumor DNA: A systematic review.《Gynecol Oncol》.2021,第161卷(第3期), *
Circulating Cell Free DNA as the Diagnostic Marker for Ovarian Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis;Quan Zhou et al.;《PLoS One》;20160702;第11卷(第6期);摘要 *
Clinical Implications of Circulating Tumor DNA from Ascites and Serial Plasma in Ovarian Cancer;Mi-Ryung Han et al.;《Cancer Res Treat》;20200228;第52卷(第3期);第786页右栏第2，4段, 第783页左栏第2段-右栏第2段，图4 *
Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test;Joshua D Cohen et al.;《Science》;20180223;第926-930页 *
Diagnostic Value of Serum Tumor Markers for Epithelial Ovarian Cancer Stage I-II: A Retrospective Analysis;Qiang Yi et al.;《Journal of Clinical Trials》;20210504;第11卷(第3期);摘要 *
Elevation of TP53 Autoantibody Before CA125 in Preclinical Invasive Epithelial Ovarian Cancer;Wei-Lei Yang et al.;《Clin Cancer Res》;20171001;第5912-5922页 *
Epithelial ovarian cancer and the use of circulating tumor DNA: A systematic review;Christine Fribert Thusgaard et al.;《Gynecol Oncol》;20210421;第161卷(第3期);第885页左栏第2-3段，第890页右栏第1段，第891页左栏第1段，右栏第3段，表2-4 *
Mi-Ryung Han et al..Clinical Implications of Circulating Tumor DNA from Ascites and Serial Plasma in Ovarian Cancer.《Cancer Res Treat》.2020,第52卷(第3期), *
上皮性卵巢癌基因组特征及差异基因EPS8L1的筛选、验证和机制探讨;张磊;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20210215;第E068-4页 *
基于循环肿瘤DNA高通量测序技术进行卵巢癌诊断的可行性研究;邵禹铭;《中国知网》;20210501;第1-67页 *
循环肿瘤DNA检测在卵巢癌诊治中的研究进展;陆媛媛 等;《实用妇产科杂志》;20201215;第916-919页 *

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