CN113671079A - 不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物及其筛选方法和应用，属于食品检验技术领域。本发明采用高效液相色谱‑高分辨质谱采集已知不同加工工艺的牛奶的代谢物色谱峰，提取色谱峰的特征峰信息，对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为代谢物组生物标志物。采用本申请的筛选方法筛选得到22种代谢组生物标志物，这22种代谢组生物标志物能够用于区分巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
Description
技术领域
本发明涉及食品检验技术领域，具体涉及不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物及其筛选方法和应用。
背景技术
牛奶可作为人体提供重要营养的来源，提供蛋白质、维生素、脂肪和钙等物质。即使来源于正常健康乳腺的牛奶样品，也会含有许多微生物和细菌菌群，尤其是其中的致病菌会严重威胁到人体健康，故为防止疾病的发生、致病菌的危害和微生物引起的牛奶变质，生乳通常要经过热处理工艺后才能食用，并且牛奶通过杀菌处理和无菌包装后易于储藏运输。市售牛奶通常采用均质后经高温杀菌以延长保质期，根据杀菌工艺不同可分为巴氏杀菌奶(PasteurizedMilk，Pa)、延长货架期奶(Extended ShelfLife Milk，ESL)和超高温灭菌奶(Ultra-high Temperature Sterilized Milk，UHT)方式进行热处理。热处理对牛奶及其成分的影响程度与所施加的热负荷有关，牛奶中的热诱导除了会改变其感官外，还会降低其营养价值如：牛奶受热导致维生素降解、乳清蛋白变性、蛋白质的胺基被乳糖及其分解产物修饰。因此，监测乳制品的加热程度是非常重要的。
传统方法检测牛奶加热程度主要集中在监测一些特定物质，如天然酶活性、乳蛋白变性程度、乳果糖、糠氨酸等物质含量。通常对碱性磷酸酶(碱性磷酸酶和乳过氧化物酶)采用光谱法和荧光法进行测试，以区分巴氏杀菌和超高温热处理的热负荷。通过酶法或高效液相色谱法(HPLC)测定乳果糖的含量，以区分高热负荷处理的直接或间接加热UHT奶。
目前，代谢组学技术逐步应用于牛奶热加工相关的生物标志物的检测。代谢组学技术获得的生物标志物主要用于区分巴氏杀菌奶和UHT奶，但是ESL奶与巴氏杀菌奶的生物标志物并不明确，更没有能够将巴氏杀菌奶、ESL奶和UHT奶区分开来的生物标志物。
发明内容
本发明的目的在于提供不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物及其筛选方法和应用，本发明的不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物能够用于区分巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：
1)提取已知不同加工工艺的牛奶的代谢物，作为标准样品；所述已知不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；
2)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述标准样品的色谱峰；
3)提取所述色谱峰的特征峰信息；
4)对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为代谢组生物标志物；
所述数据处理包括去除缺失值和归一化处理；
所述分析模型选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
优选的，步骤1)中所述提取不同加工工艺的牛奶的代谢物的方法包括以下步骤：
分别对所述标准样品进行第一离心，取下层液体，所述第一离心的转速为10000～13000g；所述第一离心的时间为10～30min；
将所述下层液体与溶剂混合，涡流后进行第二离心，取上清液，所述溶剂包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种，所述涡流的时间为3～10min，所述第二离心的转速为10000～13000g；所述第二离心的时间为10～30min；
将所述上清液经微孔过滤膜过滤，收集滤液，获得代谢物，所述微孔过滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
优选的，步骤2)中所述高效液相色谱分离的条件包括：流动相为流动相A和流动相B，洗脱程序为梯度洗脱；所述梯度洗脱的流速为0.2～0.5mL/min；
正离子模式下：所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；所述洗脱程序为：
负离子模式下：所述流动相A为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺水溶液；所述流动相B为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺乙腈溶液；所述洗脱程序为：
优选的，步骤2)中，所述的高分辨质谱的条件包括：模式：数据依赖性采集模式；离子源：电喷雾离子源；数据采集范围m/z为50～1000Da；
正离子模式的采集条件包括：喷雾电压为4500～6000V；去簇电压为20～120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～600℃；碰撞能为35±15eV；
负离子模式的采集条件包括：喷雾电压为-5500～-4000V；去簇电压为-20～-120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～600℃；碰撞能为35±15eV。
优选的，步骤3)中所述特征峰信息包括：峰强度大于100cps且信噪比＞3。
优选的，步骤3)中提取所述色谱峰的特征峰信息包括以下步骤：利用高分辨质谱数据提取软件对所述色谱峰依次进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积；
提取的特征峰的参数包括：峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa。
优选的，步骤4)中对所述特征峰信息进行数据处理包括以下步骤：将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，剩下的缺失值用该代谢物在所有样品中的最小值的一半进行缺失值的填充，同时进行归一化处理，得到预处理数据；将所述预处理数据导入数据分析软件，进行可视化分析，得到可视化分析数据。
优选的，步骤4)中利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为生物标志物的条件包括：VIP＞1，Fold Change＞2或＜0.5，P值＜0.01且FDR＜0.05。
本发明还提供了上述方案所述筛选方法筛选得到的不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物，如下表所示：
**表示未定性离子，用离子信息作为特征生物标志物；—表示无修饰。
本发明还提供了上述方案所述代谢组生物标志物在区分不同加工工艺的牛奶中的应用，所述不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
本发明提供了一种不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：分别提取不同加工工艺的牛奶的代谢物；采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集不同加工工艺的牛奶的代谢物的色谱峰；提取所述色谱峰的特征峰信息；对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为生物标志物；在所述生物标志物中，选择一种或几种代谢物作为不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物。采用本申请的筛选方法能够筛选得到判别牛奶加工工艺的代谢组生物标志物，并确定代谢组生物标志物在不同加工工艺牛奶中的含量，基于本发明的代谢组生物标志物能够建立不同加工工艺奶的综合检测方法，进而为企业产品监测以及行业监管提供技术支持。
附图说明
图1为正离子模式下不同模型得分图，其中a为正离子模式下PCA得分图；b为正离子模式下Pa奶和ESL奶的OPLS-DA得分图；c为正离子模式下ESL奶和UHT奶的OPLS-DA得分图；d为正离子模式下Pa奶和UHT奶的OPLS-DA得分图；(QC，质控样品；Pa，巴氏杀菌牛奶；ESL，延长货架期牛奶；U，UHT牛奶)；
图2为负离子模式下不同模型得分图，a为负离子模式下PCA得分图；b为负离子模式下Pa奶和ESL奶的OPLS-DA得分图；c为负离子模式下ESL奶和UHT奶的OPLS-DA得分图；d为负离子模式下Pa奶和UHT奶的OPLS-DA得分图；(QC，质控样品；Pa，巴氏杀菌牛奶；ESL，延长货架期牛奶；U，UHT牛奶)；
图3三类不同杀菌工艺牛奶19个差异性代谢物的热图(正离子模式)；
图4三类不同杀菌工艺牛奶3个差异性代谢物的热图(负离子模式)；
图5不同杀菌工艺牛奶22个差异性标志物响应强度箱型图。
具体实施方式
本发明提供了一种不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：
1)提取已知不同加工工艺的牛奶的代谢物，作为标准样品；
2)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述标准样品的色谱峰；
3)提取所述色谱峰的特征峰信息；
4)对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为代谢组生物标志物；
所述已知不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；
所述数据处理包括去除缺失值和归一化处理；
所述分析模型选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
本发明首先提取已知不同加工工艺的牛奶的代谢物，作为标准样品。
在本发明中，所述提取已知不同加工工艺的牛奶的代谢物的方法优选的包括以下步骤：分别对所述标准样品进行第一离心，取下层液体；将所述下层液体与溶剂混合，涡流后进行第二离心，取上清液；将所述上清液经微孔过滤膜过滤，收集滤液，获得代谢物。
在本发明中，所述第一离心和第二离心的转速独立优选为10000～13000g，更优选为12000g；所述第一离心和第二离心的的时间独立优选为10～30min，更优选为15～20min；所述涡流的时间优选为3～10min，更优选为5～8min；所述微孔过滤膜的孔径优选为0.2～0.5μm，更优选为0.22μm；所述溶剂优选的包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种。在本发明中，对所述不同加工工艺的牛奶离心的作用是除去牛奶中的脂肪，离心后的上层为脂肪层。
得到标准样品后，本发明采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述标准样品的色谱峰。
在本发明中，所述高效液相色谱分离的条件优选的包括：以流动相A和流动相B进行梯度洗脱；
色谱柱为ZORBAX Eclipse C18(1500mm×3.0mm，粒径1.8μm)；进样量为5μL，流速为0.4mL/min，柱温为40℃；
所述梯度洗脱的流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.4mL/min；
正离子模式下：所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；所述洗脱程序为：
负离子模式下：所述流动相A为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺水溶液；所述流动相B为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺乙腈溶液；所述洗脱程序为：
在本发明中，所述的高分辨质谱的条件包括：
模式：数据依赖性采集模式；
离子源：电喷雾离子源；
数据采集范围m/z为50～1000Da；
正离子模式的采集条件包括：喷雾电压为4500～6000V，优选5500V；去簇电压为20～120V，优选70V；气帘气压力(Curtain Gas，CUR)为15～40psi，优选30psi；喷雾气压力为15～70psi，优选45psi；加热辅助气压力为0～70psi，优选65psi；离子源温度(Temperature，TEM)为450～600℃，优选550℃；碰撞能为35±15eV；
负离子模式的采集条件包括：采用负离子模式采集，喷雾电压为-5500～-4000V，优选-4500V；去簇电压为-20～-120V，优选-70V；气帘气压力(Curtain Gas，CUR)为15～40psi，优选30psi；喷雾气压力为15～70psi，优选45psi；加热辅助气压力为0～70psi，优选65psi；离子源温度(Temperature，TEM)为450～600℃，优选550℃；碰撞能为35±15eV。
在本发明具体实施过程中，进行高分辨质谱采用的仪器为UPLC-ESI-TOF质谱仪。
采集到不同加工工艺的牛奶的代谢物的色谱峰后，本发明提取所述色谱峰的特征峰信息。
在本发明中，提取所述色谱峰的特征峰信息优选的包括以下步骤：利用高分辨质谱数据提取软件对所述色谱峰依次进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积；提取的特征峰的参数：峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa，选择峰强度大于100cps且信噪比(S/N)＞3的色谱峰。
在本发明具体实施过程中，所述高分辨质谱数据提取软件为Peakview2.2软件(ABSciex，美国)，所述Peakview 2.2软件对UPLC-ESI-TOF质谱仪收集的原始数据进行预处理(用于噪声设置、基线校正、峰值检测和校准)从中提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰以检测其模型离子及其峰形，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积。
提取到所述色谱峰的特征峰信息后，本发明对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用所述分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为生物标志物。
在本发明中，对所述特征峰信息进行数据处理优选的包括以下步骤：将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，剩下的缺失值用该代谢物在所有样品中的最小值的一半来进行缺失值的填充，同时进行归一化处理，得到预处理数据；将所述预处理数据导入数据分析软件，进行可视化分析，得到可视化分析数据。
在本发明中，所述分析模型优选的选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
在本发明中，利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为生物标志物的条件优选的包括：变量重要性(VIP)＞1，变化倍数(Fold Change)＞2或＜0.5，P值＜0.01且假发现率(FDR)＜0.05的峰值。
本发明还提供了上述方案所述筛选方法筛选得到的不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物，如下表所示：
**表示未定性离子，用离子信息作为特征生物标志物；—表示无修饰。
本发明还提供了上述方案所述的代谢组生物标志物在区分不同加工工艺的牛奶中的应用，所述不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
本发明的一些实施例中，用于筛选不同加工工艺牛奶差异性多肽的乳样是采用新希望乳业有限公司提供的29个巴氏杀菌奶、9个ESL奶和20个UHT奶，作为训练集；而用于验证不同加工工艺的奶样购买自超市的不同品牌的9个巴氏杀菌奶和15个UHT奶，作为测试集。发明的一些优选实施例如下：
1)样品的制备：
准确吸取所有牛奶样品2mL于离心管中，离心脱脂(12000g，4℃，30min)，去除上层脂肪层。脱脂牛奶与4mL预冷乙腈混合，涡流5min，在10000g和4℃下离心30min，以沉淀蛋白质，取上清液过0.22μm滤膜。将5μL上清液注入UPLC-QTOF-MS系统。
2)数据的采集和预处理：利用超高效液相色谱串联高分辨四极杆飞行时间质谱仪分别检测Pa奶、ESL奶和UHT奶，采集原始数据；对原始数据进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，从中提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰以检测其模型离子及其峰形，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积。此外，多维统计模型建立之前，需要将峰面积作为变量进行去除缺失值和归一化处理。
3)数据分析：对获得的峰面积结果进行无监督的主成分分析(PCA)和有监督的正交偏最小二乘方差的分析(OPLS-DA)，结合单因素方差分析，将VIP值，P值，FDR值和Foldchanged值作为筛选差异变量的标准，最终筛选出可鉴别三类品种奶的表征因子，并通过筛选的表征因子对超市购买样品进行判别。
实施例1
乳样的采集与制备
从新希望乳业有限公司收集不同批次的的29个巴氏杀菌奶、9个ESL奶和20个UHT奶作为训练集，购买自超市的不同品牌的9个巴氏杀菌奶和15个UHT奶，作为测试集，对其进行分装并保存在-20℃冰箱备用。准确吸取所有牛奶样品2mL于离心管中，离心脱脂(12000g，4℃，30min)，去除上层脂肪层。脱脂牛奶与4mL预冷乙腈混合，涡流5min，在10000g和4℃下离心30min，以沉淀蛋白质，取上清液过0.22μm滤膜。将5μL上清液注入UPLC-QTOF-MS系统。
数据的采集
利用超高效液相色谱-高分辨四级杆飞行时间质谱仪对上述待测乳样进行检测。
实验所用的超高效液相色谱仪器，仪器型号为ExionLC AC(美国AB SCIEX公司)，色谱柱为ZORBAX Eclipse C18(1500mm×3.0mm，粒径1.8μm)。进样量为5μL，流速为0.4mL/min，柱温为40℃。
正离子模式下，采用的流动相A为0.1％(v/v)的甲酸-水溶液；流动相B为0.1％(v/v)的甲酸-乙腈溶液。正离子模式下所述洗脱程序为：
负离子模式下，采用的流动相A为5mM乙酸胺-水溶液；流动相B为5mM乙酸胺-乙腈溶液。负离子模式下所述洗脱程序为：
实验所用的高分辨四级杆飞行时间质谱仪，仪器型号为TripleTOF 6600(美国ABSCIEX公司)，质谱离子源为电喷雾离子源(ESI)，采集模式为数据依赖性采集(IDA)，扫描范围为50～1000m/z，碰撞能量(CE)为35±15eV。正离子采集模式下电喷雾电压为5500V，离子源温度为550℃，去簇电压为70V，辅助气1为45psi，辅助气2为65psi，气帘气为30psi。负离子采集模式下电喷雾电压为-4500V，离子源温度为550℃，去簇电压为-70V，辅助气1为45psi，辅助气2为65psi，气帘气为30psi。
数据的预处理和特征提取
利用高分辨质谱数据提取软件Peakview 2.2(美国AB SCIEX公司)，对检测到的全部色谱峰进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，从中提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰以检测其模型离子及其峰形，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积。提取峰的参数：峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa，选择峰强度大于100cps且信噪比(S/N)＞3的色谱峰。将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，剩下的缺失值用该代谢物在所有样品中的最小值的一半进行缺失值的填充，同时进行归一化处理。最终，将预处理后的数据导入数据分析软件SPSS22.0和SIMCA-P中，进行可视化分析。
数据分析
作为多变量统计分析的重要手段，无监督的主成分分析(PCA)和有监督正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)应用在鉴别不同加工工艺牛奶当中。
为初步对样品进行区分，采用无监督的主成分分析(PCA)对提取到的化合物峰进行建模，该模式可对其结果直观的表达出来，不需要有关样品分类的任何背景信息，得到图1a和图2a三类牛奶PCA得分图。如图所示所有QC样品聚集在一起，也同时表明该仪器具有很高的准确性和稳定性，并且能够以可重复的方式提供数据。此外，图中三种类型牛奶彼此之间表现出明显的分离，巴氏杀菌奶主要分布在得分图第三象限，UHT奶主要分布在第一象限且ESL奶主要集中在原点附近，表明不同温度加工的牛奶之间存在显著差异。
为了确定区分正离子模式和负离子模式下牛奶潜在生物标记物，进一步研究三类奶之间的差异，对经过Par缩放和log转化的数据进行有监督的正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析，使得各类样品间达到最大分离效果。使用OPLS-DA模型找寻组间物质的差异一般建议用两组分析，故采用对巴氏杀菌奶、ESL奶和UHT奶两两进行OPLS-DA分析方式，筛选其差异性代谢物。如图1和图2的b，c，d所示，三类不同加工工艺牛奶两两OPLS-DA分离效果明显，说明OPLS-DA是区分Pa奶、ESL奶和UHT奶的合适模型。为进一步提高筛选出差异物的准确性，运用MetaboAnalyst 5.0在线数据处理软件对其进行T检验并与上述多元统计分析结果相结合，从三类不同工艺牛奶的正负离子模式下采集的代谢物中选择满足：VIP＞1，FoldChange＞2或＜0.5，P值＜0.01且FDR＜0.05的代谢物。最终在正离子模式下筛选到差异性代谢物19个，负离子模式下筛选到差异性代谢物3个，如下表所示。
表1正离子采集模式下三类不同杀菌工艺牛奶的差异性代谢物
表2负离子采集模式下三类不同杀菌工艺牛奶的差异性代谢物
使用MetaboAnalyst 5.0软件对筛选的不同加工工艺牛奶差异物进行聚类分析和热图分析(图3、4)，红色表示含量高表达，蓝色表示含量低表达。通过颜色深浅对比，可看出与负离子模式下热图对比，正离子采集模式下选择的差异物对三类牛奶分离效果较好。
为了鉴定代谢物，根据代谢物分子的精确质量和同位素模式，利用内置的元素组成计算器(Masterview软件；AB Sciex，USA)推断代谢物的分子式。分子式计算中考虑的可行元素组成为：C(n≤150)、H(n≤250)、O(n≤50)、N(n≤50)、S(n≤5)、Cl(n≤5)和P(n≤5)，质量精度阈值设定为3ppm。公式、准确的质量和产物离子信息被进一步用于搜索候选数据库，包括Metlin(http://www.metlin.scripps.edu/)，Mass Bank(http://www.massbank.jp/)，HMDB(http://www.hmdb.ca)，Lipidmaps(http://www.Lipidmaps.org)和MCDB(https://www.mcdb.ca/)。不同加工工艺牛奶中存在22种生物标志物为：
**表示未定性离子，用离子信息作为特征生物标志物；—表示无修饰。
根据定性结果可看出，差异性物质主要为烟酰胺、肽、甲基腺苷和羟基癸酸。代谢组学分析结果表明，Pa奶中烟酰胺和烟酰胺核苷含量高于ESL奶和UHT奶，而ESL奶和UHT奶中甲基腺苷、肽和2-羟基癸酸的含量高于Pa奶。
为直观查看标志物变化趋势使用GraphPad Prism 7对Pa奶、ESL奶和UHT奶中22个差异性标志物的响应强度绘制箱型图(图5所示)。图中横坐标表示三类不同加工工艺牛奶，纵坐标表示响应强度，不同字母表示差异显著。由此可看出，22个标志物在三类奶中含量差异显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物及其筛选方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
1 5 10 15
<210> 3
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro
1 5 10 15
Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
20 25
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Pro Ile Gln Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro
1 5 10 15
Val Arg Gly Pro Phe Pro Ile Ile Val
20 25
Claims (10)
1.一种不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物的筛选方法，包括以下步骤：
1)提取已知不同加工工艺的牛奶的代谢物，作为标准样品；所述已知不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶；
2)采用高效液相色谱-高分辨质谱分别采集所述标准样品的色谱峰；
3)提取所述色谱峰的特征峰信息；
4)对所述特征峰信息进行数据处理，建立分析模型，利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为代谢组生物标志物；
所述数据处理包括去除缺失值和归一化处理；
所述分析模型选自非监督分析、监督分析、主成分分析、偏最小二乘方差分析、单因素方差分析和化学计量学分析中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述提取不同加工工艺的牛奶的代谢物的方法包括以下步骤：
分别对所述标准样品进行第一离心，取下层液体，所述第一离心的转速为10000～13000g；所述第一离心的时间为10～30min；
将所述下层液体与溶剂混合，涡流后进行第二离心，取上清液，所述溶剂包括乙腈、甲醇和水中的一种或几种，所述涡流的时间为3～10min，所述第二离心的转速为10000～13000g；所述第二离心的时间为10～30min；
将所述上清液经微孔过滤膜过滤，收集滤液，获得代谢物，所述微孔过滤膜的孔径为0.2～0.5μm。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中所述高效液相色谱分离的条件包括：流动相为流动相A和流动相B，洗脱程序为梯度洗脱；所述梯度洗脱的流速为0.2～0.5mL/min；
正离子模式下：所述流动相A为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸水溶液；所述流动相B为体积浓度为0.05％～0.15％的甲酸乙腈溶液；所述洗脱程序为：
负离子模式下：所述流动相A为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺水溶液；所述流动相B为摩尔浓度为3～8mM的乙酸胺乙腈溶液；所述洗脱程序为：
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤2)中，所述的高分辨质谱的条件包括：模式：数据依赖性采集模式；离子源：电喷雾离子源；数据采集范围m/z为50～1000Da；
正离子模式的采集条件包括：喷雾电压为4500～6000V；去簇电压为20～120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～600℃；碰撞能为35±15eV；
负离子模式的采集条件包括：喷雾电压为-5500～-4000V；去簇电压为-20～-120V；气帘气压力为15～40psi；喷雾气压力为15～70psi；加热辅助气压力为0～70psi；离子源温度为450～600℃；碰撞能为35±15eV。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中所述特征峰信息包括：峰强度大于100cps且信噪比＞3。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，步骤3)中提取所述色谱峰的特征峰信息包括以下步骤：利用高分辨质谱数据提取软件对所述色谱峰依次进行对齐谱图，读取峰信息，噪音分析，排除无效信息，提取特征离子，扫描每个化合物色谱峰，获得特征峰对应的质荷比、保留时间和峰面积；
提取的特征峰的参数包括：峰对齐保留时间偏差为0.2min，质量偏差宽度为0.02Da，质量偏差为20mDa。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)中对所述特征峰信息进行数据处理包括以下步骤：将提取到的所有的特征峰信息按缺失值大于50％进行剔除，剩下的缺失值用该代谢物在所有样品中的最小值的一半进行缺失值的填充，同时进行归一化处理，得到预处理数据；将所述预处理数据导入数据分析软件，进行可视化分析，得到可视化分析数据。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤4)中利用分析模型确定不同加工工艺的牛奶的差异性代谢物作为生物标志物的条件包括：VIP＞1，Fold Change＞2或＜0.5，P值＜0.01且FDR＜0.05。
9.权利要求1～8任意一项所述筛选方法筛选得到的不同加工工艺的牛奶的代谢组生物标志物，如下表所示：
**表示未定性离子，用离子信息作为特征生物标志物；—表示无修饰。
10.权利要求9所述代谢组生物标志物在区分不同加工工艺的牛奶中的应用，所述不同加工工艺的牛奶包括巴氏杀菌奶、延长货架期奶和超高温灭菌奶。
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