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CN113661177A - EGFR x CD28多特异性抗体 - Google Patents

EGFR x CD28多特异性抗体 Download PDF

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CN113661177A CN202080022975.8A CN202080022975A CN113661177A CN 113661177 A CN113661177 A CN 113661177A CN 202080022975 A CN202080022975 A CN 202080022975A CN 113661177 A CN113661177 A CN 113661177A
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G·D·扬科普洛斯
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Abstract

本发明提供了与EGFR和CD28结合的多特异性抗体(EGFRxCD28)以及抗EGFR抗体。此类抗体可以与如抗PD1抗体等另外的治疗剂组合。还提供了用于通过施用所述抗体(例如，和其与抗PD1的组合)来治疗癌症(例如，表达EGFR的癌症)的方法。本发明的EGFRxCD28抗体体现了与PD‑1抑制组合的肿瘤靶向性免疫治疗模式。这些双特异性抗体用一个臂结合肿瘤特异性抗原(TSA)(EGRF)并且用另一个臂结合T细胞上的共刺激受体CD28。在各种同基因和人肿瘤异种移植物模型中，与PD‑1抑制剂的组合疗法特别加强了肿瘤内T细胞活化，从而促进效应记忆样T细胞表型而无全身性细胞因子分泌。将此类CD28共刺激双特异性抗体与经临床验证的抗PD‑1治疗组合提供了具有显著增强的抗肿瘤功效的耐受性良好的抗体疗法。

Description

EGFR x CD28多特异性抗体
相关申请
本申请涉及并要求于2019年3月22日提交的美国临时申请第62/822,124号的优先权。前述申请的全部内容通过引用明确地并入本文。
技术领域
本发明涉及与EGF受体和CD28结合的抗体和其使用方法，例如，用于治疗或预防癌症的方法。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表并且特此通过引用整体并入。所述ASCII副本创建于2020年3月19日，被命名为118003-10620_SL.txt并且大小为63,481字节。
背景技术
T细胞识别和杀伤其细胞靶标—如病毒感染的细胞或肿瘤细胞—的能力取决于一系列协调的相互作用。其中最重要的是T细胞受体(TCR)复合物(其包含相关的CD3γ链、δ链、ε链和ζ链)对靶细胞的识别和结合，并且这种相互作用被称为用于T细胞活化的“信号1”。TCR识别存在于在靶细胞表面上表达的MHC蛋白凹槽上的病毒或肿瘤肽。因为此类结合通常是低亲和性的，所以“信号1”的成功触发要求很多TCR复合物沿T细胞与其靶细胞之间的界面聚集；此界面已经被称为“免疫突触”。T细胞活化可以进一步通过另外的相互作用促进。例如，T细胞在其表面上具有被称为CD28的分子，所述分子能提供共刺激“信号2”以通过TCR复合物增强活化。当T细胞通过其TCR复合物识别其靶细胞，并且然后还通过CD28与其在靶细胞上的同源配体结合来接合“信号2”时，T细胞活化被增强；如同“信号1”，CD28介导的“信号2”被认为是通过在免疫突触处共聚集发生的。
激动性抗CD28 mAb可以应用于经培养的T细胞的持续的离体扩增；然而，作为其中系统性测试超级激动剂抗CD28 mAb的I期临床试验中的一系列急性且严重不良事件的结果，已经不鼓励使用抗CD28的抗体(Hünig,《自然综述·免疫学(Nature ReviewsImmunology)》.2012；12:317-318)。抗CD28 mAb的局部或靶向使用可以以较低的风险用于促进抗肿瘤免疫。Jung等人,《国际癌症杂志(Int J Cancer)》.2001年1月15日；91(2):225-30。
不同的生长因子家族和生长因子受体已经表明涉及癌细胞的自主生长。其中，表皮生长因子受体(EGFR)和肽生长因子的EGF家族在不同癌类型的发病机理和进展中起中心作用。EGFR属于涵盖三种另外的蛋白质，即ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4的受体家族。EGF家族的这些蛋白质和生长因子形成集成化系统，其中将击中单独受体类型的信号经常传递到同一家族的其它受体。
旨在增强T细胞活化的单克隆抗体(mAb)作为抗肿瘤治疗正在临床开发中。然而，当前大多数治疗很难克服肿瘤微环境的抑制性质，从而无法产生有效的肿瘤特异性T细胞活化和后续的肿瘤细胞杀伤。针对如CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白)等检查点抑制剂和程序性细胞死亡1(PD-1)/程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的若干阻断性mAb已经在临床上被批准用于黑色素瘤、肾细胞癌、非小肺癌和晚期转移性皮肤鳞状细胞癌。阻断性PD-1释放对T细胞活化的中断，但其作为单一药物的功效经常不足以得到肿瘤清除和持久的抗肿瘤应答。
发明内容
本发明提供了使用靶向分化簇28(CD28)和表皮生长因子受体的双特异性抗体(EGFRxCD28或CD28xEGFR)的免疫治疗模式，当与PD-1阻断性抗体组合时，所述双特异性抗体在同基因和人肿瘤异种移植物模型中诱导长期抗肿瘤免疫并促进稳健的肿瘤内T细胞活化而无全身性细胞因子分泌的迹象。在经基因人源化的免疫活性小鼠和食蟹猴中进行的毒理学研究证明，这些双特异性自身或在与抗PD-1抗体组合时均表现出某种单药剂活性并且无毒性。总的来说，这些数据表明，将此类基于CD28的双特异性与PD-1抑制组合起来可以提供具有显著增强的、特异性的并且协同的抗肿瘤活性的安全的生物制剂解决方案。
在一方面，本发明提供了一种分离的双特异性抗原结合分子，其包括：第一抗原结合结构域，所述第一抗原结构物以如在25℃下通过表面等离子体共振测量的小于约10-6M的KD结合人CD28；以及第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域以如在25℃下通过表面等离子体共振测量的小于约10-9M的KD特异性地结合靶肿瘤细胞上的人表皮生长因子受体(EGFR)。
在另一方面，当结合抗黏蛋白16(MUC16)X CD3双特异性抗体使用并在表达EGFR的靶细胞上测试时，所述分离的双特异性抗原结合分子表现出共刺激效应。在一个实施例中，所述共刺激效应通过以下中的一项或多项示出：(a)活化并引导人T细胞杀伤表达EGFR的靶细胞的能力；(b)在T细胞上上调PD-1的能力；(c)增加从PBMC释放细胞因子IFNγ和TNF的能力；(d)耗竭肿瘤细胞的能力；或者(f)增强肿瘤清除的能力。在另一个实施例中，所述共刺激效应通过以下中的一项或多项进一步示出：(g)在T细胞/APC基于荧光霉素的报告基因测定中活化NFκB活性；或(h)使用原代CD4+ T细胞/APC功能测定测量IL-2细胞因子产生。
本发明提供了结合EGFR和CD28的多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述多特异性抗原结合蛋白包括：(1)EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：(a)包括重链可变区的HCDR的免疫球蛋白链，所述重链可变区包括选自由SEQ IDNO:2、30、40和50组成的组的成员中所示的氨基酸序列或其变体；和/或(b)包括轻链可变区的LCDR的免疫球蛋白链，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列或其变体；
以及CD28结合臂；或(2)CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：(c)包括重链可变区的HCDR的免疫球蛋白链，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:10、59和63组成的组的成员中所示的氨基酸序列或其变体；和/或(d)包括轻链可变区的LCDR的免疫球蛋白链，所述轻链可变区包括选自由SEQ ID NO:16和67组成的组的成员中所示的氨基酸序列或其变体；以及EGFR结合臂。
例如，在本发明的实施例中，结合EGFR和CD28的多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含：(1)EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：(a)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:2、24、30、40和50中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体；和/或(b)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:16和28中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体；以及CD28结合臂；或(2)CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：(c)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:10、26、59和63中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体；和/或(d)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:16、28和67中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体；以及EGFR结合臂。
在本发明的实施例中，结合EGFR和CD28的多特异性抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含：(1)EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：(a)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链可变区包括SEQ ID NO:2、30、40或50中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:2、30、40或50中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％；和/或轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％；以及CD28结合臂；或(2)CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：(c)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10、59或63中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:10、59或63中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％；和/或(d)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16或67中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:16或67中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％；以及EGFR结合臂。
在本发明的实施例中，结合EGFR和CD28的多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含：
(1)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GDSIITFY(SEQID NO:4；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARVSEDSYFHYGMDV(SEQ ID NO:8；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQ ID NO:12；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
(2)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GFTFSTFI(SEQID NO:32；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：ISSNGGTI(SEQ ID NO:34；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-H3：TRGGDFWSGYYPFDY(SEQ ID NO:36；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQID NO:12；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；
以及包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
(3)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GFSFRDAW(SEQID NO:42；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IRNKIDGGTT(SEQ ID NO:44；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-H3：TTDIWNYVLFYYYGLDV(SEQ ID NO:46；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQID NO:12；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
(4)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：包括以下氨基酸序列的CDR-H1：DDSIISYY(SEQID NO:52；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGRT(SEQ ID NO:54；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARVSEDSYYHYGMDV(SEQ ID NO:56；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQID NO:12；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)。
在本发明的实施例中，结合EGFR和CD28的多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含：
(1)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
(2)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:30中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ IDNO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ IDNO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
(3)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:40中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ IDNO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ IDNO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
(4)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:50中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ IDNO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ IDNO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)。
在本发明的实施例中，结合EGFR和CD28的多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含：
(1)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
(2)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
(3)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
(4)
EGFR结合臂，所述EGFR结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
以及
CD28结合臂，所述CD28结合臂包括：重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)。
在本发明的实施例中，所述多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)是REGN7075(本文中也被称为bsAb7075)；REGN6321(本文中也被称为bsAb6321)；REGN6322(本文中也被称为bsAb6322)；REGN6323(本文中也被称为bsAb6323)。可以使用本文在表9A、9B和9C中描述的亲本EGFR抗体产生其它双特异性抗体，由此EGFR亲本抗体的HCVR臂的序列可以在WO2014/004427中找到，并且亲本CD28抗体的HCVR氨基酸序列可以在本文的表3中找到。任何EGFR HCVR臂可以与本文描述的CD28 HCVR臂中的任何臂配对。
本发明还提供了一种与表皮生长因子受体特异性地结合的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述抗原结合蛋白包括：(i)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括重链免疫球蛋白或其可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括SEQ ID NO:2、24、30、38、40、48、50或58中所示的氨基酸序列；或其变体；和/或(ii)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括轻链免疫球蛋白或其可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括SEQ ID NO:16或28中所示的氨基酸序列；或其变体。在本发明的实施例中，所述抗原结合蛋白是多特异性的(例如，双特异性的)。
本发明还提供了本文所阐述的多特异性抗原结合蛋白，所述多特异性抗原结合蛋白与(例如，肿瘤细胞的表面上的)EGFR多肽或其抗原片段和(例如，如T细胞等免疫细胞的表面上的)CD28多肽或其抗原片段结合。
本发明还提供了一种用于制备本文所阐述的多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白的方法，所述方法包括：(a)将对所述抗原结合蛋白的所述免疫球蛋白链进行编码的一种或多种多核苷酸引入到宿主细胞(例如，CHO细胞)中；(b)在有利于表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞；以及(c)任选地，从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长的培养基中分离所述抗原结合蛋白或免疫球蛋白链。作为此类方法的产物的任何抗原结合蛋白或免疫球蛋白链是本发明的一部分。
本发明还提供了一种多核苷酸，其对本发明的多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白的免疫球蛋白链中的一种或多种免疫球蛋白链进行编码。包括本发明的多核苷酸的载体以及包括本发明的多核苷酸、载体或抗原结合蛋白的宿主细胞(例如，CHO)也是本发明的一部分。
本发明还提供了一种组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒包括本发明的与一种或多种其它物质或项联合，任选地与另外的治疗剂(例如，PD-1抑制剂、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、PD-L1抑制剂、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、铂抗癌化学治疗剂、紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、长春新碱(vincristine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、抗癌抗体或其抗原结合片段、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、曲妥单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)和/或西米普利单抗(cemiplimab))联合的多特异性抗原结合蛋白中的一种或多种多特异性抗原结合蛋白。包括本发明的多特异性抗原结合蛋白的药物调配物和药学上可接受的载体或赋形剂，以及任选地另外的治疗剂也是本发明的一部分。
本发明还提供了容器和注射装置(例如，注射器、预充式注射器或自动注射器)，所述容器和注射装置包含本发明的多特异性抗原结合蛋白、组合物和/或调配物。
本发明还提供了一种用于向受试者(例如，人)施用本发明的多特异性抗原结合蛋白、其组合物或调配物的方法，所述方法包括例如用注射器、预充式注射器或自动注射器向所述受试者的体内注射所述抗原结合蛋白、组合物或调配物。任选地，还向受试者施用另外的治疗剂(例如，西米普利单抗、派姆单抗或纳武单抗)。
本发明还提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者(例如，人)的过度增殖性疾病(例如，表达EGFR的癌症)的方法，所述方法包括任选地与另外的治疗剂(例如，西米普利单抗、派姆单抗或纳武单抗)联合(例如，皮下、静脉内或肌肉内)施用有效量的多特异性抗原结合蛋白或组合物或调配物。在本发明的实施例中，所述表达EGFR的癌症是食管癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、宫颈鳞状细胞癌、子宫内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、皮肤癌、头颈部鳞状细胞癌、脑癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、胃食管癌、胃食管腺癌、前列腺癌或卵巢癌。
附图说明
图1A-1E示出了在具有内源性TSA的癌细胞系中，在存在通过TSAxCD3(MUC16xCD3)的TCR刺激的情况下，EGFRxCD28双特异性抗体(REGN7075)加强了T细胞活化。在图1A和1B中，流式细胞术分析示出了EGFRxCD28双特异性抗体与CD28+细胞和EGFR+细胞结合。(图1A)杰卡特(Jurkat)细胞(CD28+细胞)。(图1B)PEO1细胞(EGFR+细胞)。在图1C-1E中，将人T细胞与表达内源性MUC16和EGFR的癌症靶细胞(卵巢癌细胞系PEO1)和指定双特异性抗体一起培养，持续96小时。(图1C)活细胞的肿瘤细胞杀伤％。(图1D)CD25+ T细胞(在CD2中的％)的频率。(图1E)使用流式微珠阵列(CBA)试剂盒分析来自细胞毒性测定的上清液。以pg/ml为单位绘制释放的IFN。
图2A到2D示出了CD28配体(CD86)在肿瘤细胞上的表达与抗PD1治疗协同作用，以诱导CD8依赖性抗肿瘤免疫。用CD28、CD86(MC38/CD86)或空载体对照(MC38/EV)的配体来转导MC38肿瘤细胞。最初，向WT C57BL6小鼠植入每只大鼠1×106个肿瘤细胞，并且在肿瘤植入后第0天、第3天、第7天、第10天和第14天用PD-1mAb或rIgG2a同种型对照以5mg/kg进行治疗。图2A：随时间推移的平均肿瘤体积。误差条表示+/-SEM。用双向ANOVA和图克多重比较测试(Tukey's multiple comparisons test)测定统计学显著性。图2B：随时间推移的存活率(患有肿瘤<2000mm3的小鼠的百分比)。用对数秩(Mantel-Cox)测试测定植入后第60天的统计学显著性。图2C：用CD8耗竭性抗体(CD8耗竭的)或同种型对照(无耗竭)治疗小鼠。在CD8耗竭(虚线)和无耗竭(实线)的情况下随时间推移的平均肿瘤体积被示出为+/-SEM。用双向ANOVA和图克多重比较测试测定统计学显著性。图2D：植入MC38/CD86并用PD1 mAb治疗的没有肿瘤的小鼠的继发性肿瘤植入(再激发)。对于图2A到2D，示出来自每组10只小鼠的1个实验的数据。数据表示至少4个独立实验。指定了统计显著性(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001)。
图3A和3B示出了A431人肿瘤异种移植物模型。数据与图4和5相对应。图3A示出了治疗前外周血中的人CD45+细胞移植。图3B示出了A431 FACS分析。针对每个绘图指定了所关注的标志物。
图4和5示出了EGFRxCD28(REGN7075)与抗PD1(西米普利单抗)治疗协同作用，以诱导移植人胚胎肝CD34+细胞的VH小鼠中的抗肿瘤免疫。具体地，在图4和5中，在移植胚胎肝CD34+细胞的SIRPAh/h TPOh/m Rag2-/-Il2rg-/-小鼠中皮下植入A431表皮样癌肿瘤细胞(从ATCC获得)。基于胚胎肝供体、人免疫细胞移植频率和性别将小鼠分成指定的治疗组。在整个实验中，从肿瘤激发的那一天开始对小鼠进行腹膜内(IP)治疗并且每2-3天施用一次。抗PD-1的剂量是10mg/kg，并且EGFRxCD28或PSMAxCD28是5mg/kg。所示数据是针对肿瘤激发后的天数绘制的每个治疗组的平均A431肿瘤体积(mm3±SEM)。双向ANONA，图基比较：**P<0.01，****P<0.001。(n＝每组10～12只小鼠)。
图4具体地示出了针对移植人CD34+细胞的VH小鼠的肿瘤后的天数绘制的每个治疗组的平均A431肿瘤体积(mm3±SEM)(同种型、抗PD1单一疗法(西米普利单抗)、EGFRxCD28(REGN7075)单一疗法或EGFRxCD28(REGN7075)+抗PD1组合疗法)。双向ANONA，图基比较：**P<0.01，****P<0.0001。
图5示出了针对移植人CD34+细胞的VH小鼠的肿瘤后的天数绘制的对照组的平均A431肿瘤体积(mm3±SEM)(同种型、抗PD1单一疗法(西米普利单抗)、PSMAxCD28单一疗法或PSMAxCD28+抗PD1组合疗法)。双向ANONA，图基比较：**P<0.01，****P<0.0001。
图6示出了A431肿瘤细胞上缺乏PSMA表达的验证。经工程化以表达人PSMA的MC38小鼠肿瘤细胞系用作阳性对照。
图7A和7B：针对在预防性地(图7A)或治疗性地(图7B)治疗的NSG小鼠中进行肿瘤激发之后的天数绘制的接受EGFRxCD28(REGN7075)的每个治疗组的平均A431肿瘤体积(mm3±SEM)。双向ANONA，图基比较：****P<0.0001。
图8：针对在NSG小鼠中进行肿瘤激发之后的天数绘制的每个治疗组的平均A549肿瘤体积(mm3±SEM)(同种型或以1mg/kg或10mg/kg的EGFRxCD28(REGN7075))。双向ANONA，图基比较：*同种型对EGFRxCD28 1mg/kg(P<0.05)，****：P<0.0001；$同种型对EGFRxCD2810mg/kg(P<0.05)，$$$：P<0.001，$$$$：P<0.0001；@EGFRxCD28 1mg/kg对10mg/kg(P<0.05)。
图9A-9D：EGFRxCD28(REGN7075)与抗PD1(西米普利单抗)治疗协同作用，以诱导移植人胚胎肝CD34+细胞的VH小鼠中的抗肿瘤免疫。(图9A)通过CITRUS(簇鉴定、表征和回归)分析鉴定选定肿瘤CD8+ T细胞簇的MFI；(图9B)来自指示治疗组的每个簇中的细胞的频率；(图9C)通过CITRUS分析鉴定选定肿瘤CD4+ T细胞簇的MFI；(图9D)来自指定治疗组的每个簇中的细胞的频率；图9B和9D表明EGFRxCD28与抗PD1治疗协同作用，以诱导移植人胚胎肝CD34+细胞的VH小鼠中的抗肿瘤免疫。
图10A-10C：与食蟹猴中的CD28超级激动剂相比，单独的EGFRxCD28(REGN7075)或与抗PD1(西米普利单抗)疗法的组合不会诱导全身性T细胞活化。以指定剂量(mg/kg)用单剂量的双特异性抗体治疗食蟹猴。指示给药后时间(小时)(图10A)血清细胞因子(IFNγ、IL-2、IL-6、IL-8和IL-10)，(图10B)相对外周血T细胞计数，(图10C)Ki67+和ICOS+ T细胞(在CD3中的％)的频率。值表示平均值+/-SEM。N＝每组3只动物。与同种型对照相比，通过双向ANOVA计算P值。(**，p<0.01；***，p<0.001，并且****，p<0.0001)。
图11示出了随时间推移的剂量依赖性抗肿瘤应答，当与PD-1抗体(REGN2810，在US20150203579中描述为H2M7798N或H4H7798N)组合时，所述剂量依赖性抗肿瘤应答是通过抗EGFR X抗CD28抗体(REGN7075)介导的。
图12示出了当与PD-1抗体(REGN2810)组合时通过抗EGFR X抗CD28抗体(REGN7075)介导的剂量依赖性抗肿瘤应答。
图13A-13C描述了各种抗EGFR X抗CD28抗体与包含人和食蟹猴T细胞和杰卡特细胞(CD28+效应细胞)的各种细胞(图13A)；包含A375黑色素瘤细胞、22RV1前列腺细胞、PEO1卵巢细胞、CAPAN胰细胞、SW1990胰细胞和H292肺细胞的各种其它肿瘤靶细胞(图13B和图13C)的结合。同种型对照I和II是分别与Mers和EGFRvIII结合的抗体。
图14A和14B示出了抗EGFR X抗CD28双特异性抗体增强了抗肿瘤特异性抗原(TSA)X抗CD3双特异性抗体的细胞毒性效力。研究包含与抗STEAP2 X抗CD3双特异性抗体(图14A)或抗PSMA X抗CD3双特异性抗体(图14B)组合的抗EGFR X抗CD28抗体。WO2018/058001A中描述了抗STEAP2 x抗CD3抗体。WO2017/053856A1中描述了抗PSMA x抗CD3抗体。
图15A、B、C和D示出了抗EGFR X抗CD28双特异性抗体跨包含PEO1细胞(图15A)、CAPAN2细胞(图15B)、SW1990细胞(图15C)和H292细胞(图15D)的各种细胞系增强了抗肿瘤特异性抗原(TSA)X抗CD3双特异性抗体(抗MUC16X抗CD3)的细胞毒性效力。
具体实施方式
在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并不旨在进行限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求限制。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。如本文所使用的，当用于提及具体所列举的数值时，术语“约”意指数值可以与所列举的值相差不超过1％。例如，如本文所使用的，表述“约100”包含99和101以及介于两者之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。
已知利用PD-1阻断性mAb的检查点抑制会释放T细胞活化的中断，但其作为单一药剂的功效经常并不总是足以在许多癌症中获得肿瘤清除以及持久的抗肿瘤应答。目前正在评估用于改善对PD-1抑制的应答率的若干方法。实际上，鉴定生物标志物以预测对PD-1mAb的应答性、使用PD-1连同触发共刺激受体以改善T细胞活化一起或连同化学疗法或放射疗法的非肿瘤靶向组合疗法目前全部都正在进行临床前和临床测试。然而，挑战在于，这些组合中的许多组合通常基于现有药物的可用性和组合疗法的事后合理性，而不是真正的假设驱动的方法，这在一些情况下导致患者的结果较差。很明显，免疫系统的检查点抑制和再活化在许多患者中提供了长期缓解的可能性，因此，保证了用于进一步改善或增强T细胞活性以促进更持久应答的方法。此处，为了改善PD-1mAb的抗肿瘤功效，引入了使用EGFRxCD28双特异性来增强T细胞信号传导和活化的概念。事实上，这种新颖的组合免疫疗法表明，CD28共刺激双特异性抗体与PD-1mAb协同作用不仅会产生稳健的T细胞活化，而且会提供持久的抗肿瘤应答，而没有全身性毒性。因此，相对于先前所述的非靶向性方法，这种肿瘤靶向性组合疗法提供相当大的优势。使用CD28双特异性抗体(除非在肿瘤细胞表面上聚类，否则其不会直接活化CD28)提供了仅在肿瘤部位处促进共刺激的可能性，从而避免了常规CD28活化抗体的全身性毒性，所述毒性经常在组合CLTA-4和PD-1阻断或其它共刺激激动剂二价抗体的情况下可以观察到。在经基因人源化的免疫活性小鼠和食蟹猴中进行的毒理学研究表明，这些双特异性抗体作为单一药剂或与PD-1mAb组合时均表现出无毒性。安全特性以及跨同基因和异种模型通过EGFRxCD28利用抗PD-1mAb对抗肿瘤功效的类似增强表明，此治疗模式是稳健的，并不限于特定的肿瘤模型并且可以作为免疫疗法的新颖组合类而具有更广泛的实用性。
为了增强T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，正在开发肿瘤靶向性方法。实际上，基于CD3的双特异性抗体代表一类新兴的抗体类，所述抗体能够通过将T细胞连接到肿瘤细胞并活化TCR/CD3来有效地触发T细胞活化，从而模仿正常的“信号1”。然而，尽管所述双特异性抗体有前景的临床功效，但由于直接的T细胞活化以及缺少仅限于肿瘤的特异性，CD3双特异性抗体可以与细胞因子释放综合征(CRS)相关。进一步地，在不存在共刺激(“信号2”)的情况下的TCR/CD3活化可以导致失能或活化诱导的细胞死亡(AICD)，这可能会限制或减小这些试剂的可能的抗肿瘤效果。此处首次表明，EGFRxCD28双特异性和抗PD-1mAb组合疗法诱导肿瘤特异性T细胞活化。如本文所示，在不存在“信号1”的情况下，EGFRxCD28双特异性抗体具有受限的活性或无活性，并且PD-1阻断依赖于对肿瘤肽的内源性抗原特异性T细胞应答。因此，CD28双特异性抗体连同PD-1阻断一起可以增强内源性TCR/CD3依赖性T细胞应答，从而驱动持久的抗肿瘤应答。
PD-1mAb的抗肿瘤活性是CD28依赖性的，并且T细胞活化的PD-1抑制通过可能会影响那些分子的空间定位的TCR/CD3和/或CD28减少信号传导。本文中的数据表明，当PD-L1由靶细胞表达时，PD-1在免疫突触处积聚，并且其积聚与突触处CD28的减少相关，这表明PD-1可以通过防止CD28定位于突触来执行T细胞抑制。另外，还发现PD-1阻断阻止了PD-1突触定位，同时突触处的CD28积聚增加，从而允许EGFRxCD28双特异性抗体显著增强PD-1mAb促进T细胞活化的能力。这可以是PD-1阻断抗体促进T细胞活化的机制之一。总之，在PD-1-PD-L1相互作用和/或PD-1抑制之后，免疫突触中的PD-1和CD28定位的可视化使得能够更好地理解PD-1阻断对T细胞活化的效果，以及在免疫突触水平上EGFRxCD28与PD-1mAb之间的协同作用。
尽管PD-1mAb是一类重要的新型免疫疗法，但在许多情况下，进一步优化抗肿瘤活性肯定是重要的。正如CAR-T方法已经采用人工活化“信号1”和“信号2”两者的嵌合受体，以改善其抗肿瘤活性一样，现在示出了将PD-1抑制与CD28双特异性抗体(其提供“信号2”)组合的潜在益处，以增强抗肿瘤活性。与CAR-T疗法相比，这种方法具有若干实际益处，因为其不要求必须为每个患者单独定制的费事的细胞疗法制备，也不要求通过经常与副作用相关的毒性化学疗法对患者预先进行“淋巴耗竭”，从而导致患者无法接受细胞疗法。这种双特异性方法通过其作用的特异性提供了增加功效以及增加安全性的可能性。总的来说，此处的数据表明，将基于CD28的双特异性抗体与如西米普利单抗等临床验证的PD-1mAb组合可以提供具有显著增强和协同的抗肿瘤活性的耐受性良好的生物制剂解决方案。
定义
除非被指定为来自非人物种(例如，“小鼠EGFR”、“小鼠EGFR片段”、“猴EGFR”、“猴EGFR片段”等)，否则如本文使用的“EGFR”和“EGFR片段”是指众所周知的人EGFR蛋白或其片段。在本发明的实施例中，人EGFR包括NCBI登录号NP_005219.2中所示的氨基酸序列。在一个实施例中，人EGFR(登录号005228.4的氨基酸L25-A647)被示出为具有C端CPGG.myc表位(E1-L10).GlyGly.myc表位(E1-L10)SerGly.6XHis.SSG标签(SEQ ID NO:69)。
除非被指定为来自非人物种，否则如本文使用的“CD28”是指作为共刺激受体在T细胞上表达的众所周知的人CD28蛋白。在本发明的实施例中，人CD28包括如NCBI登录号NP_006130.1中所示的氨基酸序列。
“分离的”抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)、多肽、多核苷酸和载体至少部分地不含来自产生所述抗原结合蛋白、所述多肽、所述多核苷酸和所述载体的细胞或细胞培养物的其它生物分子。此类生物分子包含核酸、蛋白质、其它抗体或抗原结合片段、脂质、碳水化合物或其它物质，如细胞碎片和生长培养基。分离的抗原结合蛋白可以进一步至少部分地不含表达系统组分，如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子。通常，术语“分离的”并不旨在是指完全不存在此类生物分子，也不是指不存在水、缓冲液或盐或包含抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)的药物调配物的组分。
以下参考文献涉及通常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法：Altschul等人,(2005)《欧洲生物化学联合会杂志(FEBS J.)》272(20):5101-5109；Altschul,S.F.等人,(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410；Gish,W.等人,(1993)《自然遗传学(Nature Genet.)》3:266-272；Madden,T.L.等人,(1996)《酶学方法(Meth.Enzymol.)》266:131-141；Altschul,S.F.等人,(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402；Zhang,J.等人,(1997)《基因组研究(Genome Res.)》7:649-656；Wootton,J.C.等人,(1993)《计算化学(Comput.Chem.)》17:149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)《计算机应用生物科学(Comput.Appl.Biosci.)》10:67-70；比对评分系统：Dayhoff,M.O.等人,《蛋白质序列和结构图谱学(Atlas of Protein Sequence and Structure)》中的“蛋白质演化变化的模型(Amodel of evolutionary change in proteins.)”(1978)第5卷,增刊3.M.O.Dayhoff(编辑),第345-352页,《美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.)》,华盛顿特区(Washington,D.C.)；Schwartz,R.M.等人,《蛋白质序列和结构图谱学》中的“用于检测距离关系的基质(Matrices for detecting distant relationships.)”(1978)第5卷,增刊3.M.O.Dayhoff(编辑),第353-358页,《美国国家生物医学研究基金会》,华盛顿特区；Altschul,S.F.,(1991)《分子生物学杂志》219:555-565；States,D.J.等人,(1991)《方法(Methods)》3:66-70；Henikoff,S.,等人,(1992)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》89:10915-10919；Altschul,S.F.等人,(1993)《分子进化杂志(J.Mol.Evol.)》36:290-300；比对统计：Karlin,S.等人,(1990)《美国国家科学院院刊》87:2264-2268；Karlin,S.等人,(1993)《美国国家科学院院刊》90:5873-5877；Dembo,A.等人,(1994)《概率年报(Ann.Prob.)》22:2022-2039；以及Altschul,S.F.,《基因组研究中的理论和计算方法(Theoretical and Computational Methods in Genome Research)》中的“评估多个不同的局部比对的统计显著性(Evaluating the statistical significance ofmultiple distinct local alignments)”(S.Suhai编辑),(1997),第1-14页,纽约普莱南出版公司(Plenum,N.Y.)。
本发明包含包括以下中所示的氨基酸序列的多肽：SEQ ID NO:6；8；10；12；14；24；34；36；38；44；46；48；54；56和/或58。
“抗体”是包括四个多肽链，即通过二硫键互连的两个重链(HC)和两个轻链(LC)的免疫球蛋白分子。每个重链(HC)包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(例如，IgG、IgG1或IgG4)。重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2和CH3。每个轻链(LC)包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区(例如，λ或κ)。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。可以将VH区和VL区进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，其散布着更保守的被称作框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含以下顺序从氨基端到羧基端排列的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链CDR可以被称为HCDR，而轻链CDR可以被称为LCDR。在本发明的不同实施例中，抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或者可以是天然的或经人工修饰的。
Y形IgG抗体(例如，CD28或EGFR结合臂)的抗原结合臂是指赋予抗原结合特异性的抗体的结构部分。例如，IgG抗体的抗原结合臂具有与轻链(LC)相关的重链(HC)。
例如双特异性的抗体包含与第一抗原结合的一个臂以及与第二抗原结合的另一个臂。例如，EGFRxCD28双特异性抗体包含结合EGFR的一个臂以及与CD28结合的另一个臂。
双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)可以具有与第一抗原结合的效应臂和与第二抗原结合的靶向臂。效应臂可以是与效应细胞(例如，T细胞)上的抗原结合的第一抗原结合结构域(例如，抗CD28)。靶向臂可以是与靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的抗原结合的第二抗原结合结构域(例如，抗EGFR抗体)。根据某些示例性实施例，效应臂与CD28结合，并且靶向臂与EGFR结合。
如本文所使用的，抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白。抗体的多特异性抗原结合片段与多个抗原结合(例如，如果片段是双特异性的，则与两种不同抗原结合)。抗体的抗原结合片段可以例如使用如蛋白水解消化或涉及对DNA编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域进行操纵和表达的重组基因工程化技术等任何合适的标准技术从完整抗体分子衍生。抗原结合片段的非限制性实例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；和(vi)dAb片段。
在本发明的实施例中，抗体的抗原结合片段将包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包括至少一个与一个或多个框架序列相邻或在所述框架内的CDR。在具有与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何合适的布置相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在包含上文所列出的任何示例性构型的可变结构域和恒定结构域的任何构型中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链区或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列的任何可变结构域和恒定结构域构型的彼此非共价缔合和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价缔合(例如，通过二硫键)的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。
术语“重组”抗原结合蛋白如抗体或其抗原结合片段是指通过本领域已知为包含例如DNA剪接和转基因表达的重组DNA技术的技术或方法而产生、表达、分离或获得的此类分子。所述术语包含在非人哺乳动物(包含转基因非人哺乳动物，例如，转基因小鼠)或宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)或细胞表达系统中表达或从重组组合人抗体文库分离的抗体。本发明包含如本文所阐述的重组抗原结合蛋白。
术语“特异性地结合(specifically bind或bind specifically)”是指对抗原具有结合亲和性的那些抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)，如EGFR或CD28蛋白，表示为如例如在25℃或37℃下通过例如
Figure BDA0003270620590000181
HTX生物传感器的实时无标记生物层干涉法测定或通过例如BIACORETM的表面等离子体共振或通过溶液亲和性ELISA测量的小于约10- 6M(例如，10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M)的KD。“抗EGFR”是指与EGFR特异性结合的抗原结合蛋白(或如抗原结合臂等其它分子)，例如抗体或其抗原结合片段；并且“抗CD28”是指与CD28特异性结合的抗原结合蛋白(或如抗原结合臂等其它分子)，例如，抗体或其抗原结合片段。“EGFRxCD28”是指与EGFR和CD28(并且任选地与一种或多种其它抗原)特异性结合的抗原结合蛋白(或其它分子)，例如抗体或其抗原结合片段。
本发明包含与相同的EGFR表位和CD28表位结合的抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段作为本发明的抗原结合蛋白例如，REGN7075(本文中也被称为bsAb7075)；REGN6321(本文中也被称为bsAb6321)；REGN6322(本文中也被称为bsAb6322)；REGN6323(本文中也被称为bsAb6323)。其它抗EGFR X抗CD28抗原结合蛋白可以在表9A、9B和9C中找到。本文描述的双特异性抗体的EGFR HCVR臂的氨基酸序列可以在表1中找到，而本文描述的双特异性抗体的CD28 HCVR臂的氨基酸序列可以在表3中找到。WO2014/004427中描述了在本发明中供使用的其它EGFR亲本抗体。REGN7075、REGN6321、REGN6322和REGN6323的EGFRHCVR臂和CD28 HCVR臂的氨基酸序列在表6中找到。本发明中描述的共同轻链可变区的氨基酸序列也在表6中找到。
术语“表位”是指与抗原结合蛋白的特定抗原结合位点例如称为互补位的抗体分子的可变区相互作用的抗原决定簇(例如，在EGFR或CD28上)。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物学效应。术语“表位”还可以是指B和/或T细胞应答的抗原上的位点和/或与抗体结合的抗原区域。表位可以定义为结构性或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集并且具有直接有助于相互作用的亲和性的那些残基。表位可以是线性或构象的，也就是说，由非线性氨基酸构成。在某些实施例中，表位可以包含决定簇，所述决定簇是如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基等分子的化学活性表面基团并且在某些实施例中可以具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。
用于测定抗原结合蛋白例如抗体或片段或多肽的表位的方法包含丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke,(2004),《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》,248:443-63)、肽切割分析、晶体学研究和NMR分析。另外，可以采用如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰等方法(Tomer,(2000)《蛋白质科学(Prot.Sci.)》,9:487-496)。可以用于鉴定与抗原结合蛋白(例如，抗体或片段或多肽)相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测氢/氘交换。参见例如，Ehring,(1999),《分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)》,267:252-259；Engen和Smith,(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》,73:256A-265A。
本发明包含与本发明的抗原结合蛋白竞争与CD28和EGFR结合的抗原结合蛋白，例如(例如，REGN7075(本文中也被称为bsAb7075)；REGN6321(本文中也被称为bsAb6321)；REGN6322(本文中也被称为bsAb6322)；REGN6323(本文中也被称为bsAb6323))，以及表9A、9B和9C中描述的那些抗原结合蛋白。如本文所使用的，术语“竞争物”是指与抗原结合并且抑制或阻断另一种抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)与抗原结合的抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)。除非另有说明，否则所述术语还包含在两个朝向上的两个抗原结合蛋白(例如抗体，即结合抗原并阻断第二抗体的结合的第一抗体并且反之亦然)之间的竞争。因此，在本发明的实施例中，竞争在一个此类朝向上发生。在某些实施例中，第一抗原结合蛋白(例如，抗体)和第二抗原结合蛋白(例如，抗体)可以与相同的表位结合。可替代地，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白(例如，抗体)可以与不同但例如重叠或非重叠的表位结合，其中一种的结合例如通过空间位阻抑制或阻断第二抗体的结合。抗原结合蛋白(例如，抗体)之间的竞争可以通过本领域已知的方法来测量，例如通过实时无标记生物层干涉法测定来测量。而且，可以在Octet RED384生物传感器(颇尔富迪生物公司(Pall ForteBio Corp.))上使用实时无标记生物层干涉法测定来测定抗原结合蛋白(例如，单克隆抗体(mAb))之间的结合竞争。
通常，本发明的以某种方式修饰的抗体或抗原结合片段保留与EGFR和CD28特异性地结合的能力，例如，当按摩尔计表达EGFR和CD28结合活性时，保留所述活性的至少10％(在与亲本抗体比较时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的EGFR和CD28结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多。本发明的抗体或抗原结合片段还旨在可以包含基本上不改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
多肽的变体，如免疫球蛋白链(例如，REGN7075(本文中也被称为bsAb7075)；REGN6321(本文中也被称为bsAb6321)；REGN6322(本文中也被称为bsAb6322)；REGN6323(本文中也被称为bsAb6323)VH、VL、HC或LC或其CDR(包括本文中具体所示的氨基酸序列)是指包括氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与本文中所示的参考氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:6；8；10；12；14；16；18；20；22；24；26；28；30；32；34；36；38；40；42；44；46；48；50；52；54；56；或58-67中的任何一个)至少约70-99.9％(例如，至少70％、72％、74％、75％、76％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)相同或类似；当通过BLAST算法执行比较时，其中算法的参数被选择成在相应参考序列的整个长度内给出相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字号：3；查询范围内的最大匹配数：0；BLOSUM 62矩阵；空位罚分：存在11，扩展1；条件组成得分矩阵调节)。
此外，多肽的变体可以包含多肽，如免疫球蛋白链(例如，REGN7075(本文中也被称为bsAb7075)；REGN6321(本文中也被称为bsAb6321)；REGN6322(本文中也被称为bsAb6322)；REGN6323(本文中也被称为bsAb6323)VH、VL、HC或LC或其CDR)，所述多肽可以包含本文中具体示出但只有一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)突变例如一个或多个错义突变(例如，保守取代)、无义突变、缺失或插入的氨基酸序列的参考多肽的氨基酸序列。例如，本发明包含CD28xEGFR抗原结合蛋白，其包含包括SEQ IDNO:16中所示的氨基酸序列但具有此类突变中的一个或多个突变的EGFR结合臂免疫球蛋白轻链(或VL)变体和/或包括SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列但具此类突变中的一个或多个突变的免疫球蛋白重链(或VH)变体。在本发明的实施例中，CD28xEGFR抗原结合蛋白包含：包括LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白轻链变体，其中此类CDR中的一个或多个(例如，1个或2个或3个)具有此类突变(例如，保守取代)中的一个或多个突变；和/或包括HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白重链变体，其中此类CDR中的一个或多个(例如，1个或2个或3个)具有此类突变(例如，保守取代)中的一个或多个突变。
例如，本文中所示的免疫球蛋白链的“保守修饰的变体”或“保守取代”是指其中多肽中的氨基酸被具有类似特性(例如，电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的其它氨基酸取代一次或多次的变体。在不显著破坏抗体或片段的生物活性的情况下可以经常进行此类改变。本领域的技术人员认识到，通常，多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不会改变生物活性(参见，例如，Watson等人,(1987),《基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene)》,本杰明/卡明斯出版公司(Benjamin/CummingsPub.Co.),第224页,(第4版))。另外，结构上或功能上类似的氨基酸的取代不太可能显著破坏生物活性。本发明包含EGFRxCD28和抗EGFR抗原结合蛋白和/或包括此类保守修饰的变体免疫球蛋白链的结合臂。
具有类似化学特性的侧链的氨基酸基团的实例包含1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。可替代地，保守替代是在Gonnet等人,(1992),《科学(Science)》256:1443-45中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。
抗原结合分子
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一个靶多肽的不同表位具有特异性或者可以含有对多于一个靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如，Tutt等人,1991,《免疫学期刊(J.Immunol.)》147:60-69；Kufer等人,2004,《生物科技趋势(Trends Biotechnol.)》22:238-244。本发明的抗CD28抗体可以与另一种功能分子例如另一种肽或蛋白连接或共表达。例如，抗体或其片段可以与如另一个抗体或抗体片段等一个或多个其它分子实体(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)功能性地连接，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本文使用的表述“抗CD28抗体”旨在包含单特异性抗CD28抗体以及包括CD28结合臂和结合靶抗原的第二臂的多特异性(例如，双特异性)抗体两者。因此，本发明包含双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人CD28，并且免疫球蛋白的另一个臂对靶抗原具有特异性。CD28双特异性抗体的另一个臂结合的靶抗原可以是在细胞、组织、器官、微生物或病毒上或附近表达的任何抗原，期望针对所述抗原有靶向性免疫应答。CD28结合臂可以包括如本文的表3和8中所示的任何HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列。在某些实施例中，CD28结合臂结合人CD28并诱导人T细胞增殖。
在本发明的其中抗体的一个臂结合CD28并且另一个臂结合靶抗原的双特异性抗体的上下文中，靶抗原可以是肿瘤相关抗原，如EGFR。
根据某些示例性实施例，本发明包含特异性地结合CD28和EGFR的双特异性抗原结合分子。此类分子在本文中可以被称为例如“抗CD28/抗EGFR”或“抗CD28xEGFR”或“CD28xEGFR”或“EGFRXCD28”或“抗EGFR/抗CD28”或“抗EGFRxCD28”或“EGFRxCD28”双特异性分子，或“抗EGFR X抗CD28”或“抗CD28 X抗EGFR”或其它类似的术语。
根据某些示例性实施例，双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)可以具有效应臂和靶向臂。效应臂可以是与效应细胞(例如，T细胞)上的抗原结合的第一抗原结合结构域(例如，抗CD28抗体)。靶向臂可以是与靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的抗原结合的第二抗原结合结构域(例如，抗/EGFR抗体)。根据某些示例性实施例，效应臂与CD28结合，并且靶向臂与EGFR结合。双特异性抗CD28/EGFR可以向效应细胞(例如，T细胞)提供共刺激信号。
如本文所使用的，表述“抗原结合分子”意指包括至少一个互补决定区(CDR)或由其组成的蛋白质、多肽或分子复合物，所述至少一个互补决定区单独地或与一个或多个另外的CDR和/或框架区(FR)组合地与特定抗原特异性地结合。在某些实施例中，抗原结合分子是抗体或抗体的片段，如在本文其它地方定义的那些术语。
如本文所使用的，表述“双特异性抗原结合分子”意指至少包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物(例如抗体或其抗原结合片段)。双特异性抗原结合分子内的每个抗原结合结构域包括至少一个CDR，所述至少一个CDR单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地与特定抗原特异性地结合。在本发明的上下文中，第一抗原结合结构域特异性地结合第一抗原(例如，CD28)，并且第二抗原结合结构域特异性地结合第二不同抗原(例如，EGFR)。
在本发明的某些示例性实施例中，双特异性抗原结合分子是双特异性抗体。双特异性抗体的每个抗原结合结构域包括重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以彼此直接或间接连接以形成本发明的双特异性抗原结合分子。可替代地，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可以各自与单独的多聚化结构域连接。一个多聚化结构域与另一个多聚化结构域的缔合促进两个抗原结合结构域之间的缔合，由此形成双特异性抗原结合分子。如本文所使用的，“多聚化结构域”是具有与具有相同或类似结构或构成的第二多聚化结构域缔合的能力的任何大分子、蛋白质、多肽、肽或氨基酸。例如，多聚化结构域可以是包括免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚化组分的非限制性实例是免疫球蛋白的Fc部分(包括CH2-CH3结构域)，例如，选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的IgG以及每个同种型组内的任何同种异型的Fc结构域。
本发明的双特异性抗原结合分子通常包括两个多聚化结构域，例如，各自独立地是单独的抗体重链的一部分的两个Fc结构域。第一多聚化结构域和第二多聚化结构域可以是同一IgG同种型，例如IgG1/lgG1、IgG2/lgG2、IgG4/lgG4。可替代地，第一多聚化结构域和第二多聚化结构域可以是不同的IgG同种型，例如IgG1/IgG2、IgG1/IgG4、IgG2/IgG4等。
在某些实施例中，多聚化结构域是Fc片段或含有至少一个半胱氨酸残基的长度为1个到约200个氨基酸的氨基酸序列。在其它实施例中，多聚化结构域是半胱氨酸残基或含半胱氨酸的短肽。其它多聚化结构域包含包括亮氨酸拉链、螺旋环基序或卷曲螺旋基序或由所述亮氨酸拉链、螺旋环基序或卷曲螺旋基序组成的肽或多肽。
可以使用任何双特异性抗体形式或技术来制备本发明的双特异性抗原结合分子。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其抗原结合片段可以(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)与如具有第二抗原结合特异性的另一个抗体或抗体片段等一个或多个其它分子实体功能性地连接，以产生双特异性抗原结合分子。可以在本发明的上下文中使用的具体示例性双特异性形式包含但不限于例如，基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(OVO)-Ig、四价体瘤(Quadroma)、结节入孔(knob-into-hole)、共同轻链(例如，具有结节入孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEEO)body、亮氨酸拉链、Ouobody、IgG1/lgG2、双作用Fab(OAF)-IgG以及Mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见例如Klein等人.2012,《mAbs》4:6,1-11以及其中引用的参考文献)。
在本发明的双特异性抗原结合分子的上下文中，与野生型、天然存在形式的Fc结构域相比，多聚化结构域例如Fc结构域可以包括一个或多个氨基酸变化(例如，插入、缺失或取代)。例如，本发明包含双特异性抗原结合分子，其包括Fc结构域中的一个或多个修饰，所述一个或多个修饰引起在Fc与FcRn之间具有经修饰的结合相互作用(例如，增强或减弱)的经修饰的Fc结构域。在一个实施例中，双特异性抗原结合分子包括CH2区或CH3区中的修饰，其中所述修饰增加了Fc结构域在酸性环境中(例如，在pH范围为约5.5到约6.0的核内体中)对FcRn的亲和力。此类Fc修饰的非限制性实例包含例如以下位处的修饰：第250位(例如，E或Q)；第250位和第428位(例如，L或F)；第252位(例如，LN/FIW或T)、第254位(例如，S或T)和第256位(例如，S/R/Q/E/EID或T)；或第428位和/或第433位(例如，UR/S/P/Q或K)和/或第434位(例如，H/F或V)处的修饰；或第250位和/或第428位处的修饰；或第307位或第308位(例如，308F、V308F)和第434位处的修饰。在一个实施例中，修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、2591(例如，V2591)和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
本发明还包含双特异性抗原结合分子，其包括第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸差异降低了双特异性抗体与蛋白质A的结合。在一个实施例中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A，并且第二Ig CH3结构域含有降低或消除蛋白质A结合的突变，如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；H435R，通过EU编号)。第二CH3可以进一步包括Y96F修饰(通过IMGT；Y436F，通过EU)。可以在第二CH3内找到的另外的修饰包含：在IgG1抗体的情况下，D16E、L 18M、N44S、K52N、V57M和V821(通过IMGT；D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V4221，通过EU)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V821(IMGT；N384S、K392N和V4221，通过EU)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V821(通过IMGT；Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V4221，通过EU)。
在某些实施例中，Fc结构域可以是嵌合的，从而组合衍生自多于一种免疫球蛋白同种型的Fc序列。例如，嵌合Fc结构域可以包括衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4CH2区的CH2序列的部分或全部以及衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4的CH3序列的部分或全部。嵌合Fc结构域还可以含有嵌合铰链区。例如，嵌合铰链可以包括衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列，其与衍生自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。可以包含在本文中所示的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的具体实例包括，从N端到C端：[lgG4 CH1]-[lgG4上铰链]-[lgG2下铰链]-[lgG4 CH2]-[lgG4 CH3]。可以包含在本文中所示的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的另一个实例包括从N端到C端：[lgG1 CH1]-[lgG1上铰链]-[lgG2下铰链]-[lgG4 CH2]-[lgG1 CH3]。WO2014/022540A1中描述了可以包含在本发明的任何抗原结合分子中的嵌合Fc结构域的这些实例和其它实例。具有这些一般结构布置的嵌合Fc结构域和其变体可以具有改变的Fc受体结合，这进而影响Fc效应子功能。
本发明的抗体和抗原结合片段包括包含本文中具体所示的氨基酸序列(和其变体)的免疫球蛋白链以及对抗体或片段的细胞和体外翻译后修饰。例如，本发明包含与EGFR和CD28特异性地结合的抗体和其抗原结合片段，所述EGFR和CD28包括本文中所示的重链氨基酸序列和/或轻链氨基酸序列以及抗体和片段，其中一个或多个天冬酰胺残基、丝氨酸残基和/或苏氨酸残基被糖基化，一个或多个天冬酰胺残基被脱去酰胺基，一个或多个残基(例如，Met、Trp和/或His)被氧化，N端谷氨酰胺是焦谷氨酸(pyroE)和/或C端赖氨酸或其它氨基酸缺失。
表皮生长因子受体(EGFR)结合分子和抗EGFR抗原结合臂
本发明包含多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白例如抗体或抗原结合片段，包含一个或多个EGFR结合臂以及一个或多个CD28结合臂。
EGFR结合臂是使得EGFR结合到蛋白质上的多特异性抗原结合蛋白的部分。在本发明的实施例中，双特异性抗体REGN7075、REGN6321、REGN6322或REGN6323的EGFR结合臂阻断EGFR与EGFR的结合，并且在本发明的另一个实施例中，EGFR结合臂没有阻断EGF与EGFR的结合。例如，Y形IgG抗体的EGFR结合臂是指赋予EGFR结合特异性的抗体的结构部分。例如，在本发明的实施例中，EGFR结合臂包括HCDR1、LCDR1、HCDR2、LCDR2、HCDR3和LCDR3；HCVR(VH)和LCVR(VL)和/或与EGFR特异性结合的HC和LC。
在本发明的实施例中，EGFR结合臂包含重链免疫球蛋白和对应的轻链免疫球蛋白，所述重链免疫球蛋白包括包含重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的组合的VH，所述轻链免疫球蛋白包括包含轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的组合的VL，所述重链免疫球蛋白和所述轻链免疫球蛋白在本文中或在国际专利申请公开第WO2014/004427号中阐述。
“085N”；“086N”；“089N”；“102N”；“103N”；“116N”；“134P”；“136P”；“141P”；“142P”；“143P”；“144P”；“145P”；“147P”；“151P”；“153P”；“155P”；“157P”；“158P”；“159P”；“161P”；“163P”；“169P”和“171P”是指WO2014/004427中描述的若干抗EGFR单特异性抗体的标识号。这些抗体的HCVR臂可以用于与具有如表3中描述的HCVR氨基酸序列的抗CD28臂以及具有如表6中描述的氨基酸序列的共同轻链组合，以制备用于靶向表达EGFR的肿瘤细胞和表达CD28的T细胞的双特异性抗体。分别也被称为“bsAb7075”、“bsAb6321”、“bsAb6322”或“bsAb6323”的“REGN7075”、“REGN6321”、“REGN6322”或“REGN6323”是指双特异性抗体，所述双特异性抗体包括包含如本文在表1、6和8中所阐述的免疫球蛋白重链可变区(VH)或全长重链(或其变体)以及表1、6和8中所阐述的对应免疫球蛋白轻链可变区(VL)或全长轻链(或其变体)的EGFR结合臂，或者包括包含其CDR(HCDR1(或其变体)、HCDR2(或其变体)和HCDR3(或其变体))的VH和包含其CDR(LCDR1(或其变体)、LCDR2(或其变体)和LCDR3(或其变体))的对应VL，例如其中可变区和/或CDR包括本文中描述的具体氨基酸序列并且不是变体。此类VH可以包括其中CDR-H不是变体的变体氨基酸序列；和/或此类VL可以包括其中CDR-L不是变体的变体氨基酸序列。可以在EGFRxCD28多特异性抗原结合蛋白例如085Nx14226P2的上下文中参考此类EGFR结合臂。在本发明的实施例中，VH与IgG恒定重链结构域(例如，IgG1或IgG4(例如，包括S228P突变))连接和/或VL与λ或κ恒定轻链结构域连接。
本发明还提供了抗原结合蛋白，如与EGFR蛋白或其抗原片段(例如，EGFR的胞外结构域)特异性地结合的抗体(例如，人抗体、单克隆抗体和重组抗体)和其抗原结合片段。与EGFR上的与本文所阐述的抗原结合结构域中的任何抗原结合结构域所结合的表位相同的表位结合或与本文所阐述的抗原结合结构域中的任何抗原结合结构域竞争与EGFR结合的抗原结合蛋白也是本发明的一部分。
本发明的抗EGFR抗体和其抗原结合片段包含包括CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)、VH或以下的全长免疫球蛋白序列：085N；086N；089N；102N；103N；116N；134P；136P；141P；142P；143P；144P；145P；147P；151P；153P；155P；157P；158P；159P；161P；163P；169P；171P；如本文中或在WO2014/004427中所阐述的mAb12999P2、mAb13008P2、mAb35193P2、mAb13006P2、REGN7075、REGN6321、REGN6322或REGN6323 EGFR结合臂(或其变体)；和/或CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)、VL或以下的全长免疫球蛋白序列：085N；086N；089N；102N；103N；116N；134P；136P；141P；142P；143P；144P；145P；147P；151P；153P；155P；157P；158P；159P；161P；163P；169P；171P；如本文中或在WO2014/004427中所阐述的mAb12999P2、mAb13008P2、mAb35193P2、mAb13006P2、REGN7075、REGN6321、REGN6322或REGN6323 EGFR结合臂的那些抗体和其抗原结合片段(或其变体)。
“REGN7075”、“REGN6321”、“REGN6322”或“REGN6323”还可以是指抗EGFR抗体和其抗原结合片段(例如，单特异性抗体和片段)，所述抗体和其抗原结合片段包含本文所阐述的免疫球蛋白重链可变区(VH)或全长重链(或其变体)；和本文所阐述的对应免疫球蛋白轻链可变区(VL)或全长轻链(或其变体)；或者所述抗体和其抗原结合片段包括包含其CDR(HCDR1(或其变体)、HCDR2(或其变体)和HCDR3(或其变体))的VH和包含其CDR(LCDR1(或其变体)、LCDR2(或其变体)和LCDR3(或其变体))的对应VL，例如，其中可变区和/或CDR包括本文所描述的具体氨基酸序列并且不是变体。此类VH可以包括其中CDR-H不是变体的变体氨基酸序列；和/或此类VL可以包括其中CDR-L不是变体的变体氨基酸序列。在本发明的实施例中，VH与IgG恒定重链结构域(例如，IgG1或IgG4)连接和/或VL与λ或κ恒定轻链结构域连接。
抗原结合蛋白REGN7075、REGN6321、REGN6322和REGN6323是双特异性抗EGFR抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)，所述双特异性抗EGFR抗原结合蛋白具有与EGFR(和/或一个或多个不同抗原或不同EGFR表位)结合的一个HCVR臂以及与T细胞上的CD28结合的一个HCVR臂。
REGN7075、REGN6321、REGN6322和REGN6323的免疫蛋白球链的氨基酸序列如下所示：
REGN7075的EGFR组分
来自亲本EGFR mAb12999P2的EGFR臂的HCVR：
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双特异性抗体REGN7075的EGFR臂的全长重链
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EGFR和CD28亲本抗体以及双特异性抗体REGN7075的LCVR
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EGFR和CD28亲本抗体和双特异性抗体两者的全长轻链
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REGN6321的EGFR组分
来自亲本EGFR mAb13008P2的EGFR臂的HCVR
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双特异性抗体REGN6321的EGFR臂的全长重链
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(SEQ ID NO:38)
EGFR和CD28亲本抗体和双特异性抗体REGN6321的LCVR
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(SEQID NO:16；带下划线的CDR)
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CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20)
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EGFR和CD28亲本抗体和双特异性抗体两者的全长轻链
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(SEQ ID NO:28)
REGN6322的EGFR组分
来自亲本EGFR mAb35193P2的EGFR臂的HCVR：
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(SEQID NO:40；带下划线的CDR)
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CDR-H2：I R N K I D G G T T(SEQ ID NO:44)
CDR-H3：T T D I W N Y V L F Y Y Y G L D V(SEQ ID NO:46)
双特异性抗体REGN6322的EGFR臂的全长重链
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(SEQ ID NO:48)
EGFR和CD28亲本抗体和双特异性抗体REGN6322的LCVR
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(SEQID NO:16；带下划线的CDR)
CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18)
CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20)
CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22)
EGFR和CD28亲本抗体和双特异性抗体两者的全长轻链
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:28)
REGN6323的EGFR组分
来自亲本EGFR mAb13006P2的EGFR臂的HCVR：
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(SEQID NO:50；带下划线的CDR)
CDR-H1：D D S I I S Y Y(SEQ ID NO:52)
CDR-H2：I Y Y S G R T(SEQ ID NO:54)
CDR-H3：A R V S E D S Y Y H Y G M D V(SEQ ID NO:56)
双特异性抗体REGN6323的EGFR臂的全长重链
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSIISYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGRTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQVSLKLNSVIAADTAVYYCARVSEDSYYHYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:58)
EGFR和CD28亲本抗体和双特异性抗体REGN6323的LCVR
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
(SEQID NO:16；带下划线的CDR)
CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18)
CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20)
CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22)
EGFR和CD28亲本抗体和双特异性抗体两者的全长轻链
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:28)
在本发明的实施例中，mAb12999P2、mAb13008P2、mAb35193P2或mAb13006P2重链与包括选自以下的氨基酸序列的轻链配对：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16)；
以及
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK
(SEQ ID NO:67)。
CD28(分化簇28)结合臂
本发明包含多特异性(例如，双特异性)抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段，包含一个或多个CD28结合臂以及一个或多个EGFR结合臂。
CD28结合臂是使得CD28结合到蛋白质上的多特异性抗原结合蛋白的一部分。例如，Y形IgG抗体的CD28结合臂是指赋予CD28结合特异性的抗体的结构部分。例如，在本发明的实施例中，CD28结合臂包括HCDR1、LCDR1、HCDR2、LCDR2、HCDR3和LCDR3；HVCR(VH)和LCVR(VL)和/或与CD28特异性结合的HC和LC。
在本发明的实施例中，CD28结合臂包含在本文中阐述的重链免疫球蛋白和对应的轻链免疫球蛋白，所述重链免疫球蛋白包括包含重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)的组合的VH，所述轻链免疫球蛋白包括包含轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的组合的VL。在本发明的实施例中，CD28结合臂包含本文所阐述的重链可变区(VH)和对应的轻链可变区(VL)。
亲本抗CD28抗体14226P2、14193P2和14216P2的免疫蛋白球链的氨基酸序列如下所示：
用于制备双特异性抗体的亲本CD28 mAb
mAb14226P2
mAb14226P2的HCVR
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
(SEQ ID NO:10)
CDR-H1：GGSISSYY(SEQ ID NO:12)
CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6)
CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14)
mAb14226P2的全长重链
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGITHYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLSSVTAADTAVYYCARWGVRRDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO:26)
mAb14226P2的LCVR
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16)
CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18)
CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20)
CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22)
mAb14226P2的全长轻链
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:28)
mAb14193P2
mAb14193P2的HCVR
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYAGNNKYYADSVKGRFTVSRDNSKKTLYLQMNSLRSEDTAVYYCAKDSYYDFLTDPDVLDIWGQGTMVTVSS
(SEQ ID NO:59)
CDR-H1：GFTFSSYG(SEQ ID NO:60)
CDR-H2：ISYAGNNK(SEQ ID NO:61)
CDR-H3：AKDSYYDFLTDPDVLDI(SEQ ID NO:62)
mAb14193P2的LCVR
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16)
CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18)
CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20)
CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22)
mAb14216P2
mAb14216P2的HCVR
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNNMHWVRQAPGKGLEYVSGISSNGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMGGLRAADMAVYFCTRDDELLSFDYWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO:63)
CDR-H1：GFTFSRNN(SEQ ID NO:64)
CDR-H2：ISSNGGRT(SEQ ID NO:65)
CDR-H3：TRDDELLSFDY(SEQ ID NO:66)
mAb14216P2的LCVR
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16)
CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18)
CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20)
CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22)
在本发明的实施例中，14226P2、14193P2或14216P2重链与包括选自以下的氨基酸序列的轻链配对：
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:16)；
以及
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK
(SEQ ID NO:67)。
“14226P2”、“14193P2”或“14216P2”或“mAb14226P2”、“mAb14193P2”或“mAb14216P2”是指获得本文描述的双特异性抗体的CD28臂的亲本单特异性抗体。包含本文所阐述的免疫球蛋白重链可变区(VH)或全长重链(或其变体)的CD28结合臂；和本文所阐述的对应免疫球蛋白轻链可变区(VL)或全长轻链(或其变体)；或所述结合臂包括包含其CDR(HCDR1(或其变体)、HCDR2(或其变体)和HCDR3(或其变体))的VH和包含其CDR(LCDR1(或其变体)、LCDR2(或其变体)和LCDR3(或其变体))的对应VL，例如，其中可变区和/或CDR包括本文所描述的具体氨基酸序列并且不是变体。此类VH可以包括其中CDR-H不是变体的变体氨基酸序列；和/或此类VL可以包括其中CDR-L不是变体的变体氨基酸序列。可以在EGFRxCD28多特异性抗原结合蛋白例如085Nx14226P2的上下文中参考此类CD28结合臂。在本发明的实施例中，VH与IgG恒定重链结构域(例如，IgG1或IgG4)连接和/或VL与λ或κ恒定轻链结构域连接。
本发明还提供了抗原结合蛋白，如与CD28蛋白或其抗原片段(例如，CD28的胞外结构域)特异性地结合的抗体(例如，人抗体、单克隆抗体和重组抗体)和其抗原结合片段。与CD28上的与本文所阐述的抗原结合结构域中的任何抗原结合结构域所结合的表位相同的表位结合或与本文所阐述的抗原结合结构域中的任何抗原结合结构域竞争与CD28结合的抗原结合蛋白也是本发明的一部分。
本发明的与T细胞表面上的CD28结合并激动CD28信号传导，从而增强T细胞的活化和/或增殖的多特异性EGFRxCD28抗原结合蛋白在本文中可以被称为“共刺激(co-stimulatory)”或“共刺激(costimulatory)”。在将T细胞受体(TCR)/CD3复合物与肽-MHC复合物(“信号1”)结合时启动T细胞活化；然后，通过如T细胞上的CD28受体等第二“共刺激”受体与其在靶细胞上的同源配体(“信号2”)接合来增强活化。例如，CD28双特异性抗体对T细胞的活化可以是通过响应于TCR/CD3复合物的内源性肿瘤抗原识别或响应通过CD3双特异性的“信号1”活化的信号扩增引起的。
多特异性抗原结合蛋白
本发明提供了多特异性(例如，双特异性)的并且至少与EGFR和CD28结合的抗原结合蛋白。如本文使用的，此类抗体是指形式AxB，其中A是指多特异性分子中的与EGFR结合的结合臂，而B是指多特异性分子中的与CD28结合的结合臂，或者反之亦然。EGFRxCD28或CD28xEGFR是指与EGFR和CD28结合的多特异性抗原结合蛋白。多特异性抗原结合蛋白中的特异性EGFR和CD28结合臂也可以以AxB形式指定，其中A是指特定臂，并且B是指另一个特定臂。例如，085Nx14226P2是指具有如本文所阐述的085N的抗EGFR结合臂和如本文所阐述的14426P2的抗CD28结合臂的多特异性抗原结合蛋白。例如，085N是包含085N免疫球蛋白重链和轻链或其可变区或其序列在本文中具体所示或是其变体的CDR的结合臂。
在某些实施例中，多特异性抗原结合蛋白包括双特异性抗原结合蛋白。如本文所使用的，表述“双特异性抗原结合蛋白”意指至少包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物(例如，抗体或其抗原结合片段)。双特异性抗原结合分子内的每个抗原结合结构域包括至少一个CDR，所述至少一个CDR单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地与特定抗原特异性地结合。在本发明的上下文中，第一抗原结合结构域特异性地结合第一抗原(例如，CD28)，并且第二抗原结合结构域特异性地结合第二不同抗原(例如，EGFR)。
多特异性结合是指与可以在同一抗原或不同抗原上的两个或更多个不同表位(EGFR和CD28或更多)结合。多特异性包含双特异性、三特异性和四特异性。
本发明包含以下多特异性抗原结合蛋白中的任何多特异性抗原结合蛋白(例如，双特异性抗体或其抗原结合片段)：REGN7075、REGN6321、REGN6322、REGN6323以及通过以下制备的双特异性抗体：将表1的EGFR HCVR臂(例如，亲本单克隆抗体mAb12999P2、mAb13008P2、mAb35193P2和mAb13006P2的HCVR臂)中的任何臂与表3的CD28 HCVR臂中的任何臂(例如，亲本mAb14226、mAb14193和mAb14216的HCVR臂)组合以及如本文所阐述的其使用方法。
多核苷酸和制备方法
对本文所阐述的任何EGFRxCD28多特异性抗原结合蛋白或抗EGFR抗原结合蛋白的免疫球蛋白链进行编码的分离的多核苷酸形成本发明的一部分，如包括多核苷酸的载体和/或包括本文所阐述的多核苷酸、载体或抗原结合蛋白的宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)一样。
多核苷酸包含DNA和RNA。本发明包含本发明的例如对EGFR结合臂和/或CD28结合臂的免疫球蛋白VH、VL、CDR-H、CDR-L、HC或LC进行编码的任何多核苷酸，任选地，所述多核苷酸与启动子或其它表达控制序列可操作地连接。例如，本发明提供了包含表2中所阐述的核苷酸序列和表4中所阐述核苷酸序列的任何多核苷酸(例如，DNA)。
本发明包含包括SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、29、31、33、35、39、41、43、45、49、51、53和/或55中所示的核苷酸序列的多核苷酸，所述多核苷酸任选地与启动子或其它表达控制序列或其它多核苷酸序列可操作地连接。
通常，“启动子”或“启动子序列”是能够结合细胞中的RNA聚合酶(例如，直接或通过其它启动子结合的蛋白质或物质)并启动编码序列转录的DNA调节区。启动子可以与包含增强子序列和阻遏物序列的其它表达控制序列可操作地连接和/或与本发明的多核苷酸可操作地连接。可以用于控制基因表达的启动子包含但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利第5,385,839号和第5,168,062号)、SV40早期启动子区(Benoist等人,(1981)《自然(Nature)》,290:304-310)、劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等人,(1980)《细胞(Cell)》22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,(1981)《美国国家科学院院刊》,78:1441-1445)和金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人,(1982)《自然》,296:39-42)；原核表达载体，如β内酰胺酶启动子(VIIIa-Komaroff等人,(1978)《美国国家科学院院刊》75:3727-3731)，或tac启动子(DeBoer等人,(1983)《美国国家科学院院刊》80:21-25)；还参见《科学美国人(Scientific American)》(1980),242:74-94中的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins from recombinant bacteria)”；以及来自酵母或其它真菌的启动子元件，如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子或碱性磷酸酶启动子。
当在细胞或其它表达系统中，其它表达控制序列引导RNA聚合酶介导的编码序列转录为RNA，优选地mRNA，然后这可以是RNA剪接的(如果其还有内含子)并且任选地翻译成由编码序列编码的蛋白质时，对多肽进行编码的多核苷酸与启动子或所述序列“可操作地连接”。
本发明包含对免疫球蛋白多肽链进行编码的多核苷酸，所述多核苷酸是核苷酸序列在本文中具体示出的那些多核苷酸的变体。多核苷酸的“变体”是指包括与本文中所示的参考核苷酸序列至少约70-99.9％(例如，70％、72％、74％、75％、76％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％)相同的核苷酸序列的多核苷酸；当通过BLAST算法执行比较时，其中算法的参数被选择成给出在相应参考序列的整个长度内的相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字号：28；查询范围内的最大匹配数：0；匹配/不匹配得分：1，-2；空位罚分：线性)。在本发明的实施例中，本文中具体示出的核苷酸序列的变体包括一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个)点突变、一种或多种核苷酸的插入(例如，框内插入)或缺失(例如，框内缺失)。在本发明的实施例中，此类突变可以是错义突变或无义突变。在本发明的实施例中，此类变体多核苷酸对免疫球蛋白多肽链进行编码，所述免疫球蛋白多肽链结合到EGFR结合臂和/或CD28结合臂中，即使得蛋白质与EGFR和/或CD28保持特异性结合。
包含哺乳动物细胞的真核宿主细胞和原核宿主细胞可以用作用于表达抗EGFR和EGFRxCD28抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)或其抗原结合臂的宿主。此类宿主细胞是本领域中众所周知的，并且许多宿主细胞可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，ATCC)获得。这些宿主细胞尤其包含中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包含人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。可以使用的其它细胞系是昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包含酵母和丝状真菌细胞，所述丝状真菌细胞包含例如，毕赤酵母(Pichia)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichiafinlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、科克拉马毕赤酵母(Pichiakoclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta)(甲醇诱导型酵母(Ogataea minuta)、林氏毕赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichiasalictaria)、松栎毕赤酵母(Pichia guercuum)、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、毕赤酵母菌(Pichiasp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母菌(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(trichoderma reesei)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、镰刀菌(Fusarium sp.)、禾谷镰刀菌(Fusarium gramineum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)以及粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)。本发明包含分离的宿主细胞(例如，CHO细胞或以上所阐述的任何类型的宿主细胞)，所述分离的宿主细胞包括本发明的抗EGFR抗体(例如，在WO2014/004427中找到的EGFR抗体)或抗EGFR x抗CD28抗原结合蛋白，如REGN7075；REGN6321；REGN6322；REGN6323以及表9A、9B或9C中所示的抗EGFR X抗CD28抗原结合蛋白，或对其免疫球蛋白(Ig)重链和/或轻链进行编码的多核苷酸)；和/或对本发明的多特异性抗原结合蛋白的EGFR结合臂和CD28结合臂进行编码的一种或多种多核苷酸。
本发明还包含表达EGFR和/或CD28或其抗原片段或融合物(例如His6(SEQ ID NO：68)、Fc和/或myc)的细胞，所述EGFR和/或CD28或其抗原片段或融合物与以下结合：本发明的EGFRxCD28和/或抗EGFR抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)，例如REGN7075、REGN6321、REGN6322、REGN6323，以及通过将表1的EGFR HCVR臂(例如，亲本单克隆抗体mAb12999P2、mAb13008P2、mAb35193P2和mAb13006P2的HCVR臂)中的任何臂和表3的CD28HCVR臂(例如，亲本mAb14226、mAb14193和mAb14216的HCVR臂)中的任何臂制备的双特异性抗体，或表9A、9B和9C中所示的双特异性抗体中的任何双特异性抗体，例如，其中细胞在受试者的体内或在体外。
另外，本发明还提供了一种复合物，所述复合物包括本文的EGFRxCD28和/或抗EGFR抗原结合蛋白，例如如本文所讨论的与EGFR和/或CD28多肽或其抗原片段或其融合物复合的，和/或与同抗EGFR或EGFRxCD28抗体或片段特异性结合的次级抗体或其抗原结合片段(例如，可检测地标记为次级抗体)复合的抗体或其抗原结合片段。在本发明的实施例中，复合物处于受试者体外(例如，固定到固体底物上)或处于受试者体内。在本发明的实施例中，EGFR在肿瘤细胞的表面上，并且CD28在免疫细胞例如T细胞的表面上。在本发明的实施例中，T细胞是活化的。
本领域具有若干已知用于产生重组抗体的方法。在US4816567中公开了用于重组产生抗体的方法的一个实例。转化可以通过用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的任何已知方法。用于将异源多核苷酸引入到哺乳动物细胞中的方法是本领域公知的并且包含葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中、基因枪注射(biolistic injection)以及直接将DNA显微注射到细胞核中。另外，可以通过病毒载体将核酸分子引入到哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域公知的。参见例如，美国专利第4399216号；第4912040号；第4740461号和第4959455号。
本发明包含用于制备本发明的抗EGFR x抗CD28(例如，REGN7075、REGN6321、REGN6322或REGN6323)抗原结合蛋白，如本发明的抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的重组方法，所述重组方法包括：
(i)将对轻免疫球蛋白链和重免疫球蛋白链进行编码的一种或多种多核苷酸引入到宿主细胞中，所述轻免疫球蛋白链和重免疫球蛋白链例如对EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白的抗原结合臂进行编码，其中所述多核苷酸在载体中；和/或整合到宿主细胞染色体中和/或与启动子可操作地连接；
(ii)在有利于表达多核苷酸的条件下培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母菌属或毕赤酵母)以及
(iii)任选地，从宿主细胞和/或宿主细胞生长的培养基中分离抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)或链。本发明还包含抗EGFR或EGFRxCD28抗原结合蛋白，如抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段是本文所阐述的生产方法的产物以及任选地本文所阐述的纯化方法的产物。
在本发明的实施例中，用于制备EGFRxCD28(例如，REGN7075、REGN6321、REGN6322或REGN6323)抗原结合蛋白例如抗体或其抗原结合片段的方法包含例如通过柱色谱法、沉淀法和/或过滤纯化抗原结合蛋白的方法。如所讨论的，此类方法的产物也构成本发明的一部分。
序列变体
如与衍生单独抗原结合结构域的对应种系序列相比，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地测定此类突变。本发明的抗原结合分子可以包括衍生自本文公开的示例性氨基酸序列中的任何氨基酸序列的抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生抗体的种系序列的对应残基或突变为另一个人种系序列的对应残基或突变为对应种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域的普通技术人员可以容易地产生包括一个或多个个体种系突变或其组合的许多抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，VH结构域和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基突变回在最初衍生抗原结合结构域的原始种系序列中发现的残基。在其它实施例中，仅将某些残基突变回原始种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内发现的突变的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3内发现的突变的残基。在其它实施例中，框架和/或CDR残基中的一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列(即，与最初衍生抗原结合结构域的种系序列不同的种系序列)的对应残基。此外，抗原结合结构域可以含有框架和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如其中某些单独残基突变为特定种系序列的对应残基，而维持与原始种系序列不同的某些其它残基或所述其它残基突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得，就可以容易地测试含有一个或多个种系突变的抗原结合结构域的一种或多种期望的特性，如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。包括以这种通用方式获得的一个或多个抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子涵盖在本发明内。
本发明还包含抗原结合分子，其中一个或两个抗原结合结构域包括本文公开的具有一个或多个保守取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任何一个的变体。例如，本发明包含抗原结合分子，其包括具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域，相对于本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任何一个，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。具有化学性质类似的侧链的氨基酸基团的实例包含(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在Gonnet等人，(1992)，《科学》，256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”替代是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
本发明还包含抗原结合分子，其包括具有与本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任何一个基本上相同的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗原结合结构域。当提及氨基酸序列时，术语“基本同一性”或“基本上相同”意指当如通过使用默认间隙权重的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时，两个氨基酸序列共享至少95％的序列同一性，甚至更优选地，至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调节序列同一性百分比或相似性程度以纠正取代的保守性质。用于作出此调节的方法是本领域的技术人员所熟知的。参见例如，Pearson,(1994)《分子生物学方法》,24:307-331。
通常使用序列分析软件测量多肽的也称为序列同一性的序列相似性。蛋白质分析软件使用分配给包含保守氨基酸取代的各种取代、缺失和其它修饰的相似性度量来匹配类似的序列。例如，GCG软件含有如Gap和Bestfit等程序，所述程序可以与默认参数一起使用以测定如来自不同生物体物种的同源多肽等紧密相关的多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白质之间的序列同源性或序列同一性。参见例如6.1版GCG。还可以使用使用默认或推荐参数的FASTA(6.1版GCG中的程序)来比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列一致性百分比(Pearson(2000)，同上文)。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库比较时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如，Altschul等人,(1990)《分子生物学杂志》215:403-410以及Altschul等人,(1997)《核酸研究》25:3389-402。
包括Fc变体的抗体
根据本发明的某些实施例，提供了包括Fc结构域的抗EGFR X抗CD28双特异性抗原结合分子，所述Fc结构域包括例如如与中性pH相比在酸性pH下增强或减弱抗体与FcRn受体的结合的一个或多个突变。例如，本发明包含在Fc结构域的CH2区或CH3区中包括突变的抗体和抗原结合分子，其中突变增加Fc结构域在酸性环境中(例如，在pH范围为约5.5到约6.0的核内体中)对FcRn的亲和力。当施用于动物时，此类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。此类Fc修饰的非限制性实例包含例如以下位置处的修饰：
●第250位(例如，E或Q)；
●第250位和第428位(例如，L或F)；
●第252位(例如，L/Y/F/W或T)、
●第254位(例如，S或T)和/或
●第256位(例如，S/R/Q/E/D或T)；
或以下位置处的修饰：
●第428位和/或第433位(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或
●第434位(例如，H/F/或Y)；
或以下位置处的修饰：
●第250位和/或428位；
或以下位置处的修饰：
●第307位或308位(例如，308F、V308F)和/或
●第434位。
在一个实施例中，修饰包括：
●428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；
●428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰；
●433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；
●252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；
●250Q和428L修饰(例如，T250Q和M428L)；和/或
●307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
例如，本发明包含包括Fc结构域的EGFRxCD28双特异性抗原结合分子，所述Fc结构域包括选自由以下组成的组的一对或多对突变或一组或多组突变：
●250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；
●252Y、254T和256E(例如，M252Y、S254T和T256E)；
●428L和434S(例如，M428L和N434S)；以及
●433K和434F(例如，H433K和N434F)。
在本发明的范围内设想了前述Fc结构域突变的所有可能的组合和本文公开的抗体可变结构域内的其它突变。
抗体和抗原结合分子的生物学特性
本发明包含以高亲和力结合人CD28和EGFR的抗体和其抗原结合片段。本发明还包含以中等或低亲和力结合人CD28和/或EGFR的抗体和其抗原结合片段，这取决于治疗背景和所期望的特定靶向性质。例如，在双特异性抗原结合分子，其中一个臂结合CD28并且另一个臂结合靶抗原(例如，EGFR)的上下文中，可以期望靶抗原结合臂以高亲和力结合靶抗原，而抗CD28臂仅以中等或低亲和力结合CD28。以这种方式，可以实现抗原结合分子对表达靶抗原的细胞的优先靶向，同时避免一般/非靶向性CD28结合以及随之产生的与其相关的不良副作用。
根据某些实施例，本发明包含抗体和抗体的抗原结合片段，所述抗体和抗体的抗原结合片段以如例如使用如本文中的实例1和13中限定的测定形式通过表面等离子体共振测量的小于约200nM的KD结合人CD28(例如，在25℃下)。在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以如例如使用如本文中的实例1和13中限定的测定形式或基本上类似的测定通过表面等离子体共振测量的小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约60nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM或小于约5nM的KD结合CD28。在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以介于约5nM与约20nM之间的KD结合CD28。
本发明还包含抗体和其抗原结合片段，所述抗体和其抗原结合片段以如例如使用如本文中的实例1和13中限定的测定形式或基本上类似的测定通过表面等离子体共振在25℃或37℃下测量的大于约3分钟的解离半衰期(t1/2)结合CD28。在某些实施例中，本发明的抗体或抗原结合片段以如例如使用如本文中的实例1和13中限定的测定形式或基本上类似的测定通过表面等离子体共振在25℃或37℃下测量的大于约5分钟、大于约10分钟、大于约20分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟、大于约80分钟、大于约90分钟、大于约100分钟、大于约200分钟、大于约300分钟、大于约400分钟、大于约500分钟、大于约600分钟、大于约700分钟、大于约800分钟、大于约900分钟、大于约1000分钟或大于约1200分钟的t1/2结合CD28。
本发明包含能够同时与人CD28和人EGFR结合的双特异性抗原结合分子(例如，双特异性抗体)。根据某些实施例，本发明的双特异性抗原结合分子与表达CD28和/或EGFR的细胞特异性地相互作用。可以通过荧光活化细胞分选(FACS)来评估双特异性抗原结合分子结合表达CD28和/或EGFR的细胞的程度，如本文中的实例10A和10B中所展示的。例如，本发明包含双特异性抗原结合分子，其特异性地结合表达CD28但不表达EGFR(例如，杰卡特细胞)的人细胞系和表达EGFR但不表达CD28的人卵巢癌细胞系(例如，PEO1)。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子以小于1×10-5M的EC50值与表达CD28的人或食蟹猴T细胞结合。在一些实施例中，双特异性抗原结合分子以介于1×10-12M与1×10-5M之间的EC50值与表达CD28的人或食蟹猴T细胞结合。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子以介于1×10-9M与1×10-5M之间的EC50值与表达CD28的人或食蟹猴T细胞结合。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子以小于约2.5×10-8M的EC50与表达EGFR的细胞系表面结合。双特异性抗原结合分子与细胞或细胞系表面的结合可以通过如实例10A和10B中所述的体外FACS结合测定来测量。
本文所阐述的EGFRxCD28抗原结合蛋白，例如包括变体免疫球蛋白链，可以表现出以下性质中的一种或多种性质：
-减少移植CD34+细胞(例如，胚胎肝CD34+细胞)的小鼠(例如，VH小鼠(Rag2null/γc null/huSirp-a/huTPO))中的人肿瘤细胞(例如，A431肿瘤细胞)的生长和/或存活期；任选地，其中与PD1拮抗剂(例如，抗PD1，如西米普利单抗)联合施用EGFRxCD28；
-减少包括人PBMC(例如，其中与肿瘤细胞混合的人PBMC皮下植入到小鼠中)的小鼠(例如，(NOD/SCID/γc null))中的人肿瘤细胞(例如，A431肿瘤细胞)的生长和/或存活期；任选地，其中与PD1拮抗剂(例如，抗PD1，如西米普利单抗)联合施用EGFRxCD28；
-减少包括人PBMC(例如，其中将人PBMC腹腔内植入到小鼠中，并且将肿瘤细胞皮下植入到小鼠中)的小鼠(例如，NOD/SCID/γc null)中的人肿瘤细胞(例如，A549肿瘤细胞)的生长和/或存活期；任选地，其中与PD1拮抗剂(例如，抗PD1，如西米普利单抗)联合施用EGFRxCD28；
-与杰卡特CD28+细胞结合
-与PE01 EGFR+细胞结合和/或
-当例如以10mg/kg向食蟹猴施用时，未引起显著的细胞因子释放(例如，干扰素-γ、IL-2、IL-6、IL-8和/或IL-10)。
本发明包含能够耗竭受试者的肿瘤细胞的抗EGFR和EGFRxCD28双特异性抗原结合分子(参见例如，实例3-5)。例如，根据某些实施例，提供了抗EGFR和EGFRxCD28双特异性抗原结合分子，其中以治疗有效剂量向受试者单次施用抗原结合分子引起受试者的肿瘤细胞数量的减少。
本发明包含能够与各种肿瘤细胞结合的抗EGFR X抗CD28双特异性抗原结合分子，所述肿瘤细胞包含A375黑色素瘤细胞、22RV1前列腺细胞、PEO1卵巢细胞、CAPAN2胰腺细胞、SW1990胰腺细胞和H292肺细胞(参见实例10A和10B)。如此，本发明的双特异性抗体可以证明对治疗多种癌症适应症有用。
本发明包含能够跨各种细胞系增强抗肿瘤特异性抗原(TSA)X抗CD3双特异性抗体的细胞毒性效力的抗EGFR X抗CD28双特异性抗原结合分子(参见实例11)。使用这种方法，TSA X CD3双特异性抗体可以包含抗STEAP2 X抗CD3、抗PSMA X抗CD3或抗MUC16 X抗CD3双特异性抗体。抗EGFR X抗CD28抗体还可以证明在与例如PD-1或PD-L1的抗体或任何其它检查点抑制剂的检查点抑制剂组合时有用(参见实例9)。在某些实施例中，将抗EGFR X抗CD28与抗TSA X抗CD3双特异性加检查点抑制剂两者组合可能是有益的。
还示出了本发明的抗体使用氢-氘交换结合人EGFR上的某些表位(参见实例12)。具体地，发现本发明的抗体中的某些抗体与人EGFR的氨基酸残基345-368(SEQ ID NO:70)、人EGFR的氨基酸残基399-416(SEQ ID NO:71)和人EGFR的氨基酸残基133-154(SEQ ID NO:72)结合/相互作用。
表位作图和相关技术
本发明的抗原结合分子结合的CD28或EGFR上的表位可以由CD28蛋白或EGFR蛋白的3个或更多个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)氨基酸的单个连续序列组成。可替代地，表位可以由CD28或EGFR的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。本发明的抗体可以与CD28单体中含有的氨基酸相互作用，或者可以与CD28二聚体的两个不同CD28链上的氨基酸相互作用。如本文所使用的，术语“表位”是指与被称为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的空间上并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的邻近氨基酸残基产生的线性表位。在某些情况下，表位可以包含抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
可以使用本领域的普通技术人员已知的各种技术来测定抗体的抗原结合结构域是否在多肽或蛋白质内“与一个或多个氨基酸相互作用”。可以用于测定特定抗体或抗原结合结构域的表位或结合结构域的示例性技术包含例如常规交叉阻断测定法，如在《抗体(Antibodies)》,Harlow和Lane(纽约冷泉港冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中描述的常规交叉阻断测定、点诱变(例如，丙氨酸扫描诱变、精氨酸扫描诱变等)；肽印迹分析(Reineke,2004,《分子生物学方法》248:443-463)；蛋白酶保护和肽切割分析。另外，可以采用如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰等方法(Tomer,2000,《蛋白质科学(Protein Science)》,9:487-496)。可以用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对所关注的蛋白质进行氘标记，然后将抗体与经氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，以允许在除抗体保护的残基(其保持为经氘标记的)之外的所有残基处发生氢-氘交换。在解离抗体后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，由此揭示与同抗体相互作用的特定氨基酸相对应的经氘标记的残基。参见例如，Ehring,(1999)《分析生物化学》,267(2):252-259；Engen和Smith,(2001)《分析化学》,73:256A-265A。可替代地，在某些实施例中，所关注的蛋白质与抗体结合，然后是氢-氘交换。在解离抗体后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，由此揭示与同抗体相互作用的特定氨基酸相对应的无氘标记的残基。还可以使用X射线晶体结构分析来鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸。
本发明进一步包含抗CD28和抗EGFR抗体，其与同本文所述的特定示例性抗体(例如包括如表1、3、6、9A、9B和9C中所示的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的抗体)中的任何示例性抗体的表位相同的表位结合。同样，本发明还包含抗CD28和/或抗EGFR抗体，其与本文所述的特定示例性抗体(例如，包括本文表1、3、6、9A、9B和9C中所示的氨基酸序列中的任何氨基酸序列的抗体)中的任何特定示例性抗体竞争与CD28和/EGFR结合。
本发明还包含双特异性抗原结合分子，其包括特异性地结合人CD28的第一抗原结合结构域和特异性地结合人EGFR的第二抗原结合片段，其中第一抗原结合结构域和本文所描述的特定示例性CD28特异性抗原结合结构域中的任何特定示例性CD28特异性抗原结合结构域与CD28上的同一表位结合，和/或其中第二抗原结合结构域和本文所描述的特定示例性EGFR特异性抗原结合结构域中的任何特定示例性EGFR特异性抗原结合结构域与EGFR上的同一表位结合。
在某些实施例中，本发明包含与EGFR的如SEQ ID NO:72中所示的氨基酸残基133-154或EGFR的如SEQ ID NO:70中所示的氨基酸残基345-368或EGFR的如SEQ ID NO:71中所示的氨基酸残基399-416中的一个或多个氨基酸残基相互作用的双特异性结合分子。
同样，本发明还包含双特异性抗原结合分子，其包括特异性地结合人CD28的第一抗原结合结构域和特异性地结合人EGFR的第二抗原结合片段，其中第一抗原结合结构域与本文所描述的特定示例性CD28特异性抗原结合结构域中的任何特定示例性CD28特异性抗原结合结构域竞争与CD28结合，和/或其中第二抗原结合结构域与本文所描述的特定示例性EGFR特异性抗原结合结构域中的任何特定示例性EGFR特异性抗原结合结构域竞争与EGFR结合。
通过使用本领域中已知的常规方法，可以容易地测定特定抗原结合分子(例如，抗体)或其抗原结合结构域是否和本发明的参考抗原结合分子与同一表位结合或竞争结合。例如，为了测定测试抗体是否和本发明的参考双特异性抗原结合分子与CD28(或EGFR)上的同一表位结合，首先允许参考双特异性分子与CD28蛋白(或EGFR蛋白)结合。接下来，评估测试抗体与CD28(或EGFR)分子结合的能力。如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后能够与CD28(或EGFR)结合，可以得出结论，测试抗体不与参考双特异性抗原结合分子竞争与CD28(或EGFR)结合和/或结合抗原上的不同位点的抗体之间存在空间干扰。另一方面，如果测试抗体在与参考双特异性抗原结合分子饱和结合后无法与CD28(或EGFR)分子结合，则测试抗体与本发明的参考双特异性抗原结合分子竞争与CD28(或EGFR)结合。然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)以确认所观察到的测试抗体的结合缺乏是否实际上是由于和参考双特异性抗原结合分子与同一表位结合或者空间阻断(或另一种现象)是否导致所观察到的结合缺乏。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或本领域可用的任何其它定量或定性抗体结合测定执行这种实验。根据本发明的某些实施例，如果一种抗原结合蛋白的例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量抑制另一种抗原结合蛋白的如在竞争性结合测定中所测量的至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％的结合，则两种抗原竞争与抗原结合(参见例如，Junghans等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,1990:50:1495-1502)。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的基本上所有氨基酸突变均减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则两种抗原结合蛋白可以与同一表位结合。如果仅减少或消除一种抗原结合蛋白的结合的氨基酸突变的一个子集减少或消除另一种抗原结合蛋白的结合，则两种抗原结合蛋白可以具有“重叠表位”。
为了测定抗体或其抗原结合结构域是否与参考抗原结合分子竞争结合，以两种朝向执行上述结合方法：在第一朝向中，允许参考抗原结合分子在饱和条件下与CD28蛋白(或EGFR蛋白)结合，然后评估测试抗体与CD28(或EGFR)分子的结合。在第二朝向中，允许测试抗体在饱和条件下与CD28(或EGFR)分子结合，然后评估参考抗原结合分子与CD28(或EGFR)分子的结合。如果在两个朝向中只有第一(饱和的)抗原结合分子能够与CD28(或EGFR)分子结合，则可以得出结论，测试抗体和参考抗原结合分子竞争与CD28(或EGFR)结合。如本领域的普通技术人员所理解的，和参考抗原结合分子竞争结合的抗体可能不一定和参考抗体与同一表位结合，但是可以通过结合重叠或相邻表位来空间阻断参考抗体的结合。
抗原结合结构域的制备和双特异性分子的构建
可以通过本领域已知的任何抗体产生技术来制备对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域。一旦获得，对两种不同抗原(例如，CD28和EGFR)特异的两个不同的抗原结合结构域可以相对于彼此适当地排列，以使用常规方法产生本发明的双特异性抗原结合分子。(本文其它地方提供了对可以用于构建本发明的双特异性抗原结合分子的示例性双特异性抗体形式的讨论)。在某些实施例中，本发明的多特异性抗原结合分子的个体组分(例如，重链和轻链)中的一种或多种个体组分衍生自嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。用于制备此类抗体的方法是本领域熟知的。例如，可以使用VELOCIMMUNETM技术制备本发明的双特异性抗原结合分子的重链和/或轻链中的一个或多个重链和/或轻链。使用VELOCIMMUNETM技术(或任何其它人抗体产生技术)，首先分离出具有人可变区和小鼠恒定区的对特定抗原(例如，CD28或EGFR)的高亲和力嵌合抗体。对抗体进行表征和选择以获得包含亲和力、选择性、表位等的期望的特性。用期望的人恒定区替代小鼠恒定区以产生可以掺入到本发明的双特异性抗原结合分子中的完全人重链和/或轻链。
可以使用经基因工程化的动物来制备人双特异性抗原结合分子。例如，可以使用无法重新布置和表达内源性小鼠免疫球蛋白轻链可变序列的经基因修饰的小鼠，其中小鼠仅表达由人免疫球蛋白序列编码的一个或两个人轻链可变结构域，所述人免疫球蛋白序列与内源性小鼠κ基因座处的小鼠κ恒定基因可操作地连接。可以使用此类经基因修饰的小鼠产生包括两个不同重链的完全人双特异性抗原结合分子，所述重链与包括衍生自两个不同的人轻链可变区基因区段之一的可变结构域的相同的轻链缔合。(有关此类工程化的小鼠和其产生双特异性抗原结合分子的用途的详细讨论，参见例如US 2011/0195454)。
生物等效物
本发明涵盖具有不同于所描述抗体的氨基酸序列但保留结合CD28和EGFR的能力的氨基酸序列的抗原结合分子。当与亲本序列比较时，此类变体分子包括氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但展现出与所描述抗原结合分子的生物活性基本上等效的生物活性。同样，本发明的对抗原结合分子进行编码的DNA序列涵盖当与所公开的序列相比包括核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但对与本发明所描述的抗原结合分子基本上生物等效的抗原结合分子编码的序列。上文讨论了此类变体氨基酸和DNA序列的实例。
本发明包含与本文所阐述的示例性抗原结合分子中的任何抗原结合分子生物等效的抗原结合分子。如果例如两种抗原结合蛋白或抗体是在相似的实验条件下以相同的摩尔剂量(单剂量或多剂量)施用时吸收速率和吸收程度不显示显著差异的药物等效物或药物替代物，则认为所述两种抗原结合蛋白或抗体是生物等效的。如果一些抗体在其吸收程度上等效但在其吸收速率上不等效，则认为所述抗体是等效物或药物替代物，并且仍可以认为所述抗体是生物等效的，因为吸收速率的此类差异是有意的并且反映在标记上，在例如长期使用时对于达到有效的身体药物浓度来说并非是必需的并且对于所研究的特定药物产品来说被认为是医学上无关紧要的。
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度和效力不存在临床上有意义的差异，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施例中，与没有参考产品与生物产品之间的转换的持续疗法相比，如果患者可以在参考产品与生物产品之间转换一次或多次而没有预期的副作用风险增加(包含免疫原性的临床上显著变化或有效性降低)，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白均针对一个或多个使用条件通过一种或多种共同作用机制以此类机制是已知的程度作用，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
生物等效性可以通过体内和体外方法来证明。生物等效性测量包含例如：(a)在人或其它哺乳动物中进行的体内测试，其中在血液、血浆、血清或其它生物流体中测量抗体或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物可用度数据相关并且可合理预测的体外测试；(c)在人或其它哺乳动物中进行的体内测试，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理作用随时间的变化；以及(d)在建立抗体的安全性、功效或生物可用度或生物等效性的控制良好的临床试验中。
可以通过例如对残基或序列进行各种取代或使非生物活性所需的末端或内部残基或序列缺失来构建本文所阐述的示例性双特异性抗原结合分子的生物等效变体。例如，可以使非生物活性所必需的半胱氨酸残基缺失或用其它氨基酸替代，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥。在其它上下文中，生物等效抗体可以包含本文所阐述的示例性双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包括修饰抗体的糖基化特性的氨基酸变化，例如消除或去除糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据某些实施例，本发明提供了与人CD28结合但不与来自其它物种的CD28结合的抗原结合分子。本发明还提供了与人EGFR结合但不与来自其它物种的EGFR结合的抗原结合分子。本发明还包含与人CD28结合并且与来自一个或多个非人物种的CD28结合的抗原结合分子；和/或与人EGFR结合并且与来自一个或多个非人物种的EGFR结合的抗原结合分子。
根据本发明的某些示例性实施例，提供了抗原结合分子，所述抗原结合分子与人CD28和/或人EGFR结合并且视情况而定可以与小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔子、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩CD28和或EGFR中的一种或多种结合或不与其结合。例如，在本发明的具体示例性实施例中，提供了双特异性抗原结合分子，其包括结合人CD28和食蟹猴CD28的第一抗原结合结构域以及特异性地结合人EGFR的第二抗原结合结构域。
免疫缀合物
本发明涵盖EGFRxCD28抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段，如REGN7075、REGN6321、REGN6322、REGN6323或与来自本文描述的CD28抗体中的任何抗体的HCVR配对、与例如治疗部分(“免疫缀合物”)的另一个部分缀合的抗EGFR HCVR的任何组合。在本发明的实施例中，将抗EGFR或EGFRxCD28抗原结合蛋白例如抗体或抗原结合片段与本文所阐述的另外的治疗剂中的任何治疗剂缀合。如本文所使用的，术语“免疫缀合物”是指与另一种抗原结合蛋白、药物、放射性药剂、报告基因部分、酶、肽、蛋白质或治疗剂化学或生物连接的抗原结合蛋白，例如抗体或抗原结合片段。
在某些实施例中，治疗部分可以是细胞毒素、化学治疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素。细胞毒性剂包含对细胞有害的任何药剂。用于形成免疫缀合物的合适的细胞毒性剂和化学治疗剂的实例是本领域已知的(参见例如，WO 05/103081)。
施用和治疗
本发明提供了用于向受试者(例如，人，例如患有过度增殖性病症的人)施用本发明的EGFRxCD28多特异性抗原结合蛋白例如REGN7075；REGN6321；REGN6322；REGN6323；或与来自本文描述的CD28抗体中的任何抗体的HCVR配对的抗EGFR HCVR或其药物组合物的任何组合的方法，所述方法包括，例如肠胃外将抗原结合蛋白或药物组合物引入到受试者(例如，人)体内。例如，所述方法包括用注射器的针刺穿受试者的身体，并且将抗原结合蛋白或药物组合物注射到受试者的体内，例如注射到受试者的静脉、动脉、肿瘤、肌肉组织或皮下组织中。
EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白或其药物组合物的施用模式可以改变。施用途径包含肠胃外、非肠胃外、口服、直肠、透粘膜、肠、肠胃外；肌肉内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、眼内、玻璃体腔内、透皮或动脉内。
本发明还提供了包括本发明的EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白或其药物组合物的容器(例如，塑料或玻璃小瓶或安瓿，例如具有盖或色谱柱、空心孔针或注射器筒)。
本发明还提供了包括与EGFR或EGFR和CD28(EGFRxCD28)特异性结合的一种或多种抗原结合蛋白(例如，抗体或抗原结合片段)或其药物调配物的注射装置。注射装置可以包装成试剂盒。注射装置是通过肠胃外途径例如肌肉内、皮下或静脉内将物质引入到受试者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器或自动注射器(例如，预先填充有药物调配物)，所述注射器例如包含用于保持待注射的流体(例如，包括抗体或其片段或药物调配物)的圆筒或针筒、用于刺穿皮肤、血管或其它组织以注射液体的针头；以及用于将流体推出圆筒并通过针孔并且进入到受试者体内的柱塞。
在售卖或转移到例如医生或护理人员等将组合物施用于患者/受试者的最终用户之前，预充式注射器是已经填充有组合物(例如，包括多特异性抗原结合蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物)的注射器。
抗原结合分子的治疗性用途
本发明提供了用于治疗或预防受试者的过度增殖性疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效剂量的EGFRxCD28抗原结合蛋白例如REGN7075；REGN6321；REGN6322；REGN6323；或与来自本文描述的CD28抗体中的任何抗体的HCVR配对的抗EGFR HCVR的任何组合；任选地与PD-1和/或PD-L1抑制剂联合如抗体(例如，派姆单抗、纳武单抗和/或西米普利单抗)或其抗原结合片段联合施用。在本发明的实施例中，所述方法包含测定受试者的癌症是否表达EGFR的步骤。如果观察到此类表达，则施用EGFRxCD28和/或抗EGFR抗原结合蛋白。例如，在本发明的实施例中，所述方法包括对癌症采取活检(例如，其由治疗医生执行)，以及测定癌症细胞是否表达EGFR或引导另一个个体或实体(例如，代表患者或受试者)来执行此类测定，并且如果存在EGFR表达，则向受试者施用抗EGFR或EGFRxCD28抗原结合蛋白。在本发明的实施例中，医生引导某个其它个体或实体，例如病理学家(例如，代表患者或受试者)来执行活检。在本发明的实施例中，通过免疫组织化学(IHC)或ELISA(酶联免疫吸附测定)测试EGFR表达。
本发明包含包括向有需要的受试者施用治疗性组合物的方法，所述治疗性组合物包括特异性地结合EGFR或CD28和EGFR的双特异性抗原结合分子。治疗性组合物可以包括如本文所公开的抗体或双特异性抗原结合分子中的任何抗体或双特异性抗原结合分子以及药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的抗体和双特异性抗原结合分子(以及包括其的治疗性组合物)尤其可用于治疗其中刺激、活化和/或靶向免疫应答将会有益的任何疾病或病症。具体地，本发明的抗EGFR或EGFRxCD28双特异性抗原结合分子可以用于治疗、预防和/或改善与EGFR表达或活性或者EGFR+细胞增殖相关或由其介导的任何疾病或病症。实现本发明的治疗性方法的作用机制包含在存在效应细胞例如T细胞的情况下杀伤表达EGFR的细胞。可以使用本发明的双特异性抗原结合分子抑制或杀伤的表达EGFR的细胞包含例如肺癌细胞。
如本文所使用的，术语“受试者”是指例如需要预防和/或治疗表达EGFR的癌症的哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、猫、狗、牛、绵羊、马、山羊、兔子)，优选地人。受试者可能患有表达EGFR的癌症，可能倾向于发展此类病状，和/或将从抑制或减少EGFR活性或EGFR+细胞的耗竭中获益。在一个实施例中，受试者可能患有或有风险发展过度增殖性疾病。
出于本文的目的，过度增殖性疾病是指特征为异常过多和/或不受控的细胞生长的疾病，例如，其中细胞表达EGFR。例如，过度增殖性疾病包含表达EGFR的癌症。多种多样的癌症表达EGFR。示例性表达EGFR的癌症包含但不限于食管癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、宫颈鳞状细胞癌、胶质瘤、甲状腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、结直肠癌、结肠癌、膀胱癌、直肠癌、头颈部癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、尿路上皮癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃食管癌(例如，胃食管腺癌)和黑色素瘤。因此，本发明的抗体和双特异性抗原结合分子可以用于治疗各种各样的癌症。
以实体瘤细胞或癌性血细胞为特征的可以是表达EGFR的癌症的癌症，例如其中已经确认待治疗的特定受试者的细胞中的EGFR表达，包含食管癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、宫颈鳞状细胞癌、子宫内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、结直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、皮肤癌(例如，头颈部鳞状细胞癌)、脑癌(例如，多形性胶质母细胞瘤)、乳腺癌、胃食管癌(例如，胃食管腺癌)、前列腺癌和/或卵巢癌。
本发明的抗原结合分子还可以用于治疗例如结肠癌、肺癌、乳腺癌、肾癌和膀胱癌(或来自本文讨论的任何癌症)中出现的原发性和/或转移性肿瘤。根据某些示例性实施例，本发明的双特异性抗原结合分子用于治疗卵巢癌。
本发明还包含用于治疗受试者的残留癌症的方法。如本文所使用的，术语“残留癌症”意指在用抗癌疗法治疗后受试者中的一个或多个癌细胞的存在或持续存在。
根据某些方面，本发明提供了用于治疗例如与EGFR表达相关的过度增殖性疾病(例如，肺癌)，所述方法包括例如在受试者已经显示出对其它类型的抗癌疗法无应答之后，向受试者施用如本文描述的抗EGFR或EGFRxCD28双特异性抗原结合分子中的一个或多个抗EGFR或EGFRxCD28双特异性抗原结合分子。例如，本发明包含用于治疗如肺癌等过度增殖性疾病的方法，所述方法包括在受试者已经接受针对患有癌症例如肺癌的患者的标准护理后1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或4周、2个月、4个月、6个月、8个月、1年或更长时间向患者或受试者施用抗EGFR或EGFRxCD28双特异性抗原结合分子。在其它方面，最初在一个或多个时间点向受试者施用包括IgG4 Fc结构域的本发明的抗EGFR或EGFRxCD28双特异性抗原结合分子(例如，以提供卵巢癌细胞的稳健的初始耗竭)，之后在随后的时间点施用包括如IgG1 Fc结构域等不同IgG结构域的等效双特异性抗原结合分子。设想的是，可以结合其它双特异性抗原结合分子如结合抗EGFR/抗CD3双特异性抗体使用本发明的抗EGFR或EGFRxCD28抗体。还设想的是，本发明的双特异性抗体将与另外的治疗剂例如靶向PD-1和其它靶标的那些治疗剂结合使用。将靶向同一肿瘤抗原(例如，EGFR)的两种双特异性抗体组合可以是有利的，但是其中双特异性抗体中的一种双特异性抗体靶向T细胞上的CD3，而另一种双特异性抗体靶向如CD28等共刺激分子。此组合可以单独用于增强肿瘤细胞杀伤或者可以与检查点抑制剂组合使用。
用于治疗或预防如表达EGFR的癌症等过度增殖性疾病的“有效”或“治疗有效”剂量的EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白例如抗体或抗原结合片段是足以减轻所治疗受试者的疾病的一种或多种迹象和/或症状的抗原结合蛋白的量，无论所述减轻是通过诱导此类迹象和/或症状的消退或消除完成的还是通过抑制此类迹象和/或症状的进展完成的。在本发明的实施例中，治疗有效剂量的抗EGFR或EGFRxCD28抗原结合蛋白是0.1-2000mg，例如0.1mg IV(静脉内)Q2W(每两周一次)到2000mg IV Q2W。剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。在某些实施例中，可以在初始剂量之后施用第二或多个后续剂量的抗原结合蛋白，所述第二或多个后续剂量的抗原结合蛋白的量可以近似于或小于或大于初始剂量的量，其中后续剂量间隔2周。
施用于患者的抗原结合分子的剂量可以根据患者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。通常根据体重或体表面积计算优选的剂量。根据病状的严重程度，可以调节治疗的频率和持续时间。可以凭经验测定用于施用双特异性抗原结合分子的有效剂量和时间表；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并且相应地调节剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法执行剂量的种间类推(例如，Mordenti等人,1991,《药学研究(Pharmaceut.Res.)》8:1351)。
根据本发明的某些实施例，可以在限定的时间过程内向受试者施用多剂量的抗原结合分子(例如，抗CD28抗体或特异性地结合EGFR和CD28的双特异性抗原结合分子)。根据本发明的此方面的方法包括向受试者顺序地施用多剂量的本发明的抗原结合分子。如本文所使用的，“顺序地施用”意指在不同时间点例如在隔开预定间隔(例如，小时、天、周或月)的不同天数向受试者施用于每个剂量的抗原结合分子。本发明包含方法，所述方法包括向患者顺序地施用单一初始剂量的抗原结合分子，然后施用一种或多种第二剂量的抗原结合分子，并且任选地随后施用一种或多种第三剂量的抗原结合分子。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用本发明的抗原结合分子的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也被称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可以全部含有相同量的抗原结合分子，但是在施用频率方面可能彼此不同。然而，在某些实施例中，在治疗过程期间，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中含有的抗原结合分子的量彼此不同(例如，适当地调高或调低)。在某些实施例中，在治疗方案开始时施用两个或更多个剂量作为“负荷剂量”，然后以较低频率施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性实施例中，在紧接着前一剂量之后，从一周到若干周施用每个第二剂量和/或第三剂量。如本文所使用的，短语“紧接着前一剂量”意指按照多次施用的顺序，在没有中间剂量的情况下在按顺序施用下一个剂量之前施用于患者的抗原结合分子的剂量。
根据本发明的此方面的方法可以包括向患者施用任何数量的第二剂量和/或第三剂量的抗原结合分子(例如，抗CD28抗体或特异性地结合EGFR和CD28的双特异性抗原结合分子)。例如，在某些实施例中，仅向患者施用单个第二剂量。在其它实施例中，向患者施用两种或两种以上的第二剂量。同样地，在某些实施例中，仅向患者施用单个第三剂量。在其它实施例中，向患者施用两种或更多种第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施例中，可以以与其它第二剂量的频率相同的频率施用每个第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，可以以与其它第三剂量的频率相同的频率施用每个第三剂量。可替代地，向患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。施用频率还可以在医生的治疗过程期间根据临床检查后个体患者的需要进行调节。
诊断用途
还可以例如出于诊断的目的使用本发明的双特异性抗体来检测和/或测量样品中的CD28或EGFR或者表达CD28的或表达EGFR的细胞。例如，可以使用抗EGFR或EGFRxCD28抗体或其片段来诊断以CD28或EGFR的异常表达(例如，过度表达、表达不足、缺乏表达等)为特征的病状或疾病。用于CD28或EGFR的示例性诊断测定可以包括例如使从患者获得的样品与本发明的抗体接触，其中用可检测的标记或报告基因分子来标记抗体。可替代地，未标记的抗体可以与本身被可检测地标记的次级抗体组合以用于诊断应用。可检测的标记或报告基因分子可以是如3H、14C、32P、35S或125I等放射性同位素；如异硫氰酸荧光素或罗丹明等荧光或化学发光部分；或酶，如碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。可以用于检测或测量样品中的CD28或EGFR的具体示例性测定包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。可以用于根据本发明的CD28或EGFR诊断测定中的样品包含可从在正常或病理条件下含有可检测量的CD28或EGFR蛋白或其片段的患者获得的任何组织或流体样品。通常，将测量从健康患者(例如，未患有与异常CD28或EGFR水平或活性相关的疾病或病状的患者)获得的特定样品中的CD28或EGFR水平，以初步建立CD28或EGFR的基线或标准水平。然后可以将CD28或EGFR的此基线水平与在从疑似患有CD28或EGFR相关疾病或病状的个体获得的样品中测量的CD28或EGFR水平进行比较。
组合和药物调配物
本发明提供了包含EGFRxCD28和/或抗EGFR抗原结合蛋白和一种或多种成分的组合物；以及其使用方法和制备此类组合物的方法。包括EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白或本发明以及药学上可接受的载体或赋形剂的药物调配物(例如，包含水的水性药物调配物)是本发明的一部分。
本发明提供了包括本发明的抗原结合分子的药物组合物。本发明的药物组合物可以与合适的载体、赋形剂和提供经改善的转移、递送、耐受性等的其它药剂一起调配。可以在所有药物化学家已知的处方集中找到许多适当的调配物：《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishing Company,Easton,PA)。这些调配物包含例如粉末、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTINTM，加利福尼亚州卡尔斯巴德的生命科技公司(Life Technologies,Carlsbad,CA))、DNA缀合物、无水吸附糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人,“用于肠胃外调配物的赋形剂的汇编(Compendium of excipients forparenteral formulations)”PDA(1998)《药物科学与技术杂志(J Pharm Sci Technol)》,52:238-311。
为制备EGFRxCD28抗原结合蛋白的药物调配物，例如抗体和其抗原结合片段，例如REGN7075；REGN6321；REGN6322；REGN6323；或与来自本文描述的CD28抗体中的任何抗体的HCVR配对的抗EGFR HCVR的任何组合，抗原结合蛋白与药学上可接受的载体或赋形剂掺和。参见例如，《雷明顿氏药物科学》和《美国药典：国家处方集(U.S.Pharmacopeia:NationalFormulary)》,宾夕法尼亚州伊斯顿麦克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,Pa.),(1984)；Hardman等人,(2001)《古德曼和吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman andGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)》,纽约州纽约市麦格劳希尔出版公司(McGraw-Hill,New York,N.Y.)；Gennaro(2000)《雷明顿：药物科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,纽约州纽约市利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,N.Y.)；Avis等人(编辑)(1993),《药物剂型：胃肠外药物(Pharmaceutical Dosage Forms:ParenteralMedications)》,纽约马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,NY)；Lieberman等人(编辑)(1990),《药物剂型：片剂(Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets)》,纽约马塞尔德克尔公司；Lieberman等人(编辑)(1990),《药物剂型：分散系统(Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems)》,纽约马塞尔德克尔公司；Weiner和Kotkoskie(2000)《赋形剂毒性和安全性(Excipient Toxicity and Safety)》,纽约州纽约市马塞尔德克尔公司。在本发明的实施例中，药物调配物是无菌的。此类组合物是本发明的一部分。
本发明的药物调配物包含EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白以及药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包含例如水、缓冲剂、防腐剂和/或洗涤剂。
本发明的范围包含干燥的(例如，冻干的)组合物，所述组合物包括EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白，例如抗体或其抗原结合片段，或包含药学上可接受的载体但基本上缺乏水的其药物调配物。
各种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用中(参见例如，Wu等人.,1987,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》262:4429-4432)。引入的方法包含但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径施用组合物，例如通过输注或团注注射、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收施用并且可以将其与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。
如本文所讨论的，本发明提供了包括本文中EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白例如抗体或其抗原结合片段或包括其药学上可接受的载体或赋形剂的药物调配物中的任何一种的容器(例如，塑料或玻璃小瓶)或注射装置(例如，注射器、预充式注射器或自动注射器)。
可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。另外，关于皮下递送，笔递送装置易于应用于递送本发明的药物组合物。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常利用含有药物组合物的可替换药筒。一旦已经施用药筒内的药物组合物中的全部药物组合物，并且药筒是空的，就可以容易地丢弃空药筒并且用含有药物组合物的新药筒替换。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可替换药筒。相反，一次性笔递送装置预填充有保留在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦贮存器中的药物组合物清空，就丢弃整个装置。
许多可重复使用的和一次性笔递送装置和自动注射器递送装置应用于皮下递送本发明的药物组合物。参见例如AUTOPENTM(英国伍德斯托克镇欧文芒福德有限公司(OwenMumford,Inc.,Woodstock,UK))或HUMIRATM Pen(伊利诺伊州雅培园雅培实验室(AbbottLabs,Abbott Park,IL))
在某些情况下，药物组合物可以在受控释放系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵(参见Langer，同上文；Sefton,1987,《CRC：生物医学工程评论(CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.)》,14:201)。在另一个实施例中，可以使用聚合物材料；参见受控释放的医学应用(Medical Applications of Controlled Release),Langer和Wise(编辑),1974,佛罗里达州波卡拉顿CRC出版社(CRC Pres.,Boca Raton,Florida)，。在又另一个实施例中，可以将受控释放系统放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见例如，Goodson,1984,受控释放的医学应用,同上文,第2卷,第115-138页)。其它受控释放系统在Langer,1990,《科学》,249:1527-1533的评论中讨论。
可注射制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。可以通过公开已知的方法来制备这些可注射制剂。例如，可以例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备可注射制剂。作为注射用水性介质，例如有生理盐水和其它可以与适当增溶剂组合使用的等渗溶液。可注射油性介质也是本发明的一部分。此类油性介质可以与增溶剂组合。
有利地是，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适合于配合一定剂量的活性成分的单位剂量的剂型。单位剂量的此类剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂(安瓿剂)、栓剂等。所含有的上述抗体的量通常为每单位剂量剂型约0.1mg到约2000mg；尤其是以注射形式。
本发明包含包括本文所述的示例性抗体和双特异性抗原结合分子中的任何一种与一种或多种另外的治疗活性组分组合的组合物和治疗调配物，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。
可以与本发明的抗原结合分子组合或与其联合施用的示例性另外的治疗剂包含例如化学疗法(例如，抗癌化学疗法，例如紫杉醇、多西他赛、长春新碱、顺铂、卡铂或奥沙利铂)、放射疗法、靶向PD-1的检查点抑制剂(例如，抗PD-1抗体，如派姆单抗、纳武单抗或西米普利单抗(参见US9,987,500))、CTLA-4、LAG3、TIM3等、靶向分子的共刺激激动剂二价抗体如GITR、OX40、4-1BB等、其它共刺激CD28双特异性抗体以及结合肿瘤相关的抗原(例如，MUC16(粘蛋白16)、PSMA或STEAP2)和例如CD3(MUC16xCD3、PSMAxCD3或STEAP2xCD3)的多特异性(例如，双特异性)抗体和其抗原结合片段。包括结合CD3的抗原结合结构域的示例性双特异性抗体包含但不限于在例如WO2017/053856A1、WO2014/047231A1、WO2018/067331A1和WO2018/058001A1中描述的那些双特异性抗体。EGFR在多种癌症范围中表达。因此，本发明的双特异性抗EGFRxCD28抗体可以与包括结合CD3的抗原结合结构域的各种各样的双特异性抗体组合用于治疗各种癌症。
在本发明的另外的实施例中，与EGFRxCD28和/或抗EGFR抗原结合蛋白例如，抗体或其抗原结合片段联合向受试者施用的另外的治疗剂是根据医生案头参考(Physicians'Desk Reference)2003(《汤姆森医疗保健(Thomson Healthcare)》；第57版(2002年11月1日))或通常设置有特定药剂的经批准的处方信息向受试者施用的。
用于通过与另外的治疗剂联合施用治疗有效剂量的EGFRxCD28和/或抗EGFR抗原结合蛋白来治疗或预防需要所述治疗或预防的受试者的表达EGFR的癌症的方法是本发明的一部分。
术语“与……联合”指示可以将本发明的组分、EGFRxCD28或抗EGFR抗原结合蛋白例如抗体或其抗原结合片段连同如西米普利单抗等另一种治疗剂一起调配成单个组合物，例如以用于同时递送或单独地调配成两种或两种以上的组合物(例如，包含每种组分的试剂盒)。彼此联合施用的组分可以在与施用其它组分的时间不同的时间施用于受试者；例如，作为治疗方案的一部分，每次施用可以以给定的时间段的间隔非同时(例如，单独地或顺序地)给予。彼此联合施用的单独组分还可以在同一施用时段期间顺序地施用，但基本上同时施用。此外，可以通过相同或不同的途径向受试者施用彼此联合施用的单独组分。
实例
提出以下实例，以向本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围。
实例1：抗EGFRxCD28抗体的构建
抗EGFR抗体的产生
通过将表达EGFR的细胞系(A431)与用于刺激免疫应答的佐剂直接施用于包括对人免疫球蛋白重链可变区和通用轻链可变区进行编码的DNA的
Figure BDA0003270620590000611
小鼠来获得抗EGFR抗体。也就是说，此小鼠中产生的抗体具有不同的重链可变区但具有基本上相同的轻链可变区。
通过EGFR特异性免疫测定监测抗体免疫应答。当实现期望的免疫应答时，抗EGFR抗体与抗原阳性B细胞在不与骨髓瘤细胞融合的情况下直接分离，如US7,582,298中所描述。
表1示出了本发明的所选抗EGFR抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识符。对应的核酸序列标识符在表2中示出。
表1：亲本EGFR单克隆抗体(mAb)的氨基酸序列标识符
Figure BDA0003270620590000621
表2：亲本EGFR单克隆抗体(mAb)的核酸序列标识符
Figure BDA0003270620590000622
抗CD28抗体的产生
通过用与小鼠IgG2a的Fc部分融合的人CD28蛋白或用表达CD28的细胞或用对CD28进行编码的DNA对
Figure BDA0003270620590000624
小鼠(即包括对人免疫球蛋白重链可变区和通用轻链可变区进行编码的DNA的工程化小鼠)进行免疫来获得抗CD28抗体。
通过CD28特异性免疫测定监测抗体免疫应答。当实现期望的免疫应答时，抗CD28抗体从抗原阳性B细胞直接分离，如US7,582,298中所描述。
表3示出了本发明的所选抗CD28抗体的重链和轻链可变区以及CDR的氨基酸序列标识符。对应的核酸序列标识符在表4中示出。
根据此实例的方法产生的示例性抗CD28抗体的某些生物学性质在下文所阐述的实例中详细描述。
表3：亲本CD28单克隆抗体(mAb)的氨基酸序列标识符
Figure BDA0003270620590000623
表4：亲本CD28抗体的核酸序列标识符
Figure BDA0003270620590000631
结合CD28和EGFR的双特异性抗体(bsAb)的产生
使用标准方法构建包括抗EGFR特异性结合结构域和抗CD28特异性结合结构域的双特异性抗体，其中抗EGFR抗原结合结构域和抗CD28抗原结合结构域各自包括与共同LCVR配对的不同的独特HCVR。在一些情况下，双特异性抗体是利用来自抗CD28抗体的重链、来自抗EGFR抗体的重链和包括如下所示的表5、6、7和8中编码抗体的组分、氨基酸和核酸序列的共同轻链构建的。可以使用具有表9A、9B和9C中所示名称的亲本单克隆抗体制备与EGFR和CD28结合的另外的双特异性抗体。
表5：抗EGFR x抗CD28双特异性抗体的HCVR臂的抗体名称汇总
Figure BDA0003270620590000632
表6：抗EGFR x抗CD28双特异性抗体的氨基酸序列
Figure BDA0003270620590000633
表7：编码抗EGFR x抗CD28双特异性抗体的核酸序列
Figure BDA0003270620590000634
表8：双特异性抗体bsAb7075、bsAb6321、bsAb6322和bsAb6323的全长免疫球蛋白链的氨基酸和核苷酸序列
Figure BDA0003270620590000641
D＝编码指示序列的DNA的核苷酸序列
P＝指示序列的多肽的氨基酸
数字是指指示序列的SEQ ID NO
HC是指示抗体的全长重链
LC是指示抗体的全长轻链
可以使用本文描述的技术制备包括来自亲本EGFR抗体的一个HCVR和来自亲本CD28的另一个HCVR臂的另外的双特异性抗体。用于产生这些另外的抗EGFR X抗CD28双特异性抗体的亲本EGFR抗体具有WO2014/004427中描述的HCVR序列。用于产生这些另外的抗EGFR X抗CD28双特异性抗体的CD28亲本抗体具有以上表3中描述的氨基酸序列。表9A、9B和9C在以下示出了这些抗EGFR和抗CD28结合结构域(配对)。
表9A：抗EGFR x抗CD28另外的双特异性抗体的HCVR臂的亲本抗体名称汇总
Figure BDA0003270620590000642
Figure BDA0003270620590000651
表9B：抗EGFR x抗CD28另外的双特异性抗体的HCVR臂的亲本抗体名称汇总
Figure BDA0003270620590000652
表9C：抗EGFR x抗CD28另外的双特异性抗体的HCVR臂的亲本抗体名称汇总
Figure BDA0003270620590000653
Figure BDA0003270620590000661
以下实例中描述的双特异性抗体由已知与人可溶性异质二聚体hCD28蛋白；和人EGFR结合的结合臂组成(参见以下Biacore结合数据)。制造了具有经修饰的(嵌合的)IgG4Fc结构域的示例化双特异性抗体，如于2014年8月28日公开的美国专利申请公开第US20140243504A1号中所阐述。
根据本发明实例产生的双特异性抗体包括两个单独的抗原结合结构域(即，结合臂)。第一抗原结合结构域包括衍生自抗CD28抗体的重链可变区(“CD28-VH”)，并且第二抗原结合结构域包括衍生自抗EGFR抗体的重链可变区(“EGFR-VH”)。抗EGFR和抗CD28两者共享共同的轻链。CD28-VH/EGFR-VH配对产生了特异性地识别T细胞上的CD28和肿瘤细胞上的EGFR的抗原结合结构域。
结合CD28和EGFR的双特异性抗体的表征
SPR动力学方法：动力学结合参数是通过表面等离子体共振(SPR)使用T-200仪器和CM5传感器(通用电气医疗集团(GE Healthcare))测定的。使用Scrubber(生物软件公司(BioLogics Software))将双参考传感图(double-referenced sensorgram)全局拟合到1:1结合模型。解离速率常数(kd)通过拟合在解离阶段期间结合应答的变化来测定，结合速率常数(ka)通过拟合不同浓度下的分析物结合来测定。KD由kd和ka的比率计算。解离半衰期(t1/2)计算为ln2/kd并转换为分钟。
EGFR细节方法：使用传统的EDC/NHS偶联化学将抗hFc单克隆Ab(REGN2567)与CM5传感器表面偶联。在此表面上捕获200-250RU的EGFRxCD28 Ab。以50微升/分钟的流速在此表面之上注射从30nM开始的六点三倍稀释系列的hEGFR.mmH，持续5分钟。通过10秒脉冲的20mM H3PO4重新产生表面。测量解离10分钟。按上述方法对传感图进行处理和拟合。
CD28捕获方法细节：使用传统的EDC/NHS偶联化学将抗mFc多克隆抗体(GE)与CM5传感器表面偶联。在此表面上捕获约30RU的hCD28.mFc。以50微升/分钟的流速在此表面之上注射从90nM开始的六点三倍稀释系列的EGFRxCD28Ab，持续4分钟。测量解离5分钟。通过40秒注射的10mM的pH 1.5的甘氨酸重新产生表面。按上述方法对传感图进行处理和拟合。
Biacore分析表明，EGFRxCD28以约9.3E-10的KD结合hEGFR并且以约5.2E-08的KD结合hCD28(表10和11)。
表10：与EGFR结合的Biacore动力学
Figure BDA0003270620590000671
表11：与CD28结合的Biacore动力学
Figure BDA0003270620590000672
接下来，使用含有外周血单核细胞(PBMC)和PEO-1的人T细胞共培养，测试EGFRxCD28诱导细胞细胞毒性和T细胞活化的能力。从健康的供体白细胞包中分离人外周血单核细胞(PBMC)。按照制造商推荐方案使用50mL SepMateTM管通过密度梯度离心来完成PBMC分离。简而言之，将15mL FicollPaque PLUS分层到50mL SepMate管中，然后添加30mL用D-PBS以1:2稀释的白血球。根据SepMate制造商的方案进行后续步骤。随后使用来自干细胞技术公司(StemCell Technologies)的EasySep人T细胞分离试剂盒并且按照制造商的推荐说明书从PBMC中分离CD3+ T细胞。将分离的CD3+ T细胞冷冻在含有10％DMSO的FBS中，浓度为每小瓶50×106个细胞。
EGFRxCD28显著增加了MUC16xCD3(数据未示出)诱导T细胞杀伤肿瘤细胞的能力，从18.8％到71.5％(图1C)。与这种增强的T细胞细胞毒性相一致，EGFRxCD28还促进了如通过CD25表达和IFNγ细胞因子释放评估的T细胞活化(图1D和1E)。值得注意的是，在存在非靶向性CD3结合对照(缺乏“信号1”)的情况下，EGFRxCD28对T细胞细胞毒性或活化没有影响(图1C-1E)。
实例2：天然CD28配体在肿瘤细胞上的过度表达与PD-1mAb治疗协同作用以在体内诱导CD8 T细胞依赖性持久抗肿瘤免疫
为了测定CD28与其天然配体的结合是否能够增强PD-1mAb在体内的抗肿瘤功效，将MC38肿瘤细胞工程化为过表达CD86，即CD28的共刺激配体之一。具体地，为了产生被工程化为表达共刺激配体的肿瘤细胞系，使用具有对小鼠CD86或空载体和嘌呤霉素抗性基因进行编码的EF1a启动子的pLVX慢病毒质粒(分别为pLVX.EF1a.CD86-puro和pLVX.EF1a.EV-puro)转染HEK293T细胞，从而促进病毒颗粒的产生，所述病毒颗粒随后用于感染MC38(美国国家癌症研究所，肿瘤免疫学和生物实验室(National Cancer Institute,Laboratory ofTumor Immunology&Biology))。通过荧光活化细胞分选(FACS)分离表达CD86的工程化细胞系。在存在0.5μg/ml嘌呤霉素的情况下，将细胞维持在ATCC推荐的条件下。所得的细胞系被指定为MC38/CD86和MC38/EV。
与用空载体对照(MC38/EV)转染的阴性对照MC38细胞相比，MC38/CD86细胞和抗PD-1mAb治疗的组合显著抑制了肿瘤生长(图2A)，从而导致肿瘤完全消退，并伴有稳健的生存益处(图2B)。在治疗过程期间，CD8+ T细胞的耗竭完全消除了通过将抗PD-1mAb疗法与MC38/CD86细胞组合所引起的抗肿瘤功效，这表明对CD8+ T细胞具有依赖性(图2C)。值得注意的是，最初植入有MC38/CD86细胞并用抗PD-1mAb治疗的无瘤小鼠排斥在原发性肿瘤植入后60多天植入的第二MC38亲本肿瘤，这表明存在T细胞记忆应答(图2D)。因此，这些数据表明，CD28配体的组成型表达和抗PD-1疗法的协同效应可以在体内产生持久的CD8依赖性抗肿瘤免疫。
实例3：施用EGFRxCD28抗体与抗PD-1抗体的组合协同地控制并根除移植有人CD34+干细胞的小鼠人肿瘤异种移植物，VH。
使用人肿瘤异种移植物模型进行测试EGFRxCD28双特异性抗体结合PD-1阻断性抗体(REGN2810(西米普利单抗)E.Burova等人,抗PD-1抗体REGN2810的表征和其在人PD-1敲入小鼠中的抗肿瘤活性(Characterization of the Anti-PD-1Antibody REGN2810 andIts Antitumor Activity in Human PD-1Knock-In Mice)《分子癌症治疗学(Mol CancerTher)》16,861-870(2017))的有效性。通过FACS验证了人免疫细胞群的植入(图3A)。在移植胚胎肝CD34+细胞的SIRPAh/h TPOh/m Rag2-/-Il2rg-/-中皮下植入A431表皮样癌肿瘤细胞(从ATCC获得)。基于胚胎肝供体、人免疫细胞植入频率和性别将小鼠分为4组。从植入当天(第0天)开始，用同种型对照、5mg/kg的EGFRxCD28、10mg/kg的PD-1或组合通过每周2x腹膜内注射向小鼠给药。然后实验期间每2-3天施用一次抗体注射剂。测量肿瘤的二维尺寸(长×宽)，并且计算肿瘤体积(长×宽2×0.5)。当肿瘤达到指定的肿瘤端点(肿瘤体积>2000mm3或肿瘤溃疡)时，将小鼠安乐死。
通过FACS验证了EGFR和PD-L1在A431肿瘤细胞上的表达(图3B)。从肿瘤激发当天开始用以下对每组进行腹膜内(IP)治疗：
(1)10mg/kg人同种型对照1号+5mg/kg人同型对照2号
(2)10mg/kg抗人PD-1(REGN2810；西米普利单抗)+5mg/kg人同种型对照2号
(3)5mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)+10mg/kg人同种型对照1号或
(4)5mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)+10mg/kg抗人PD-1(REGN2810)。然后在整个实验过程中每周2x施用抗体注射剂。测量肿瘤的二维尺寸(长×宽)，并且计算肿瘤体积(长×宽2×0.5)。当肿瘤达到指定的肿瘤端点(肿瘤体积>2000mm3或肿瘤溃疡)时，将小鼠安乐死。
同种型对照1号和同种型对照2号是结合Fel d1的阴性对照抗体。
每个治疗组中A431肿瘤大小随时间的变化如图4中所阐述。EGFRxCD28结合抗PD-1在人源化小鼠中协同控制并根除人肿瘤异种移植物。EGFRxCD28单一疗法能够显著延迟肿瘤生长，并且与抗PD-1Ab的组合进一步抑制肿瘤进展。当在相同的治疗环境中使用对照PSMAxCD28 Ab时，无论有无抗PD1治疗均未观察到肿瘤生长抑制(图5)。通过FACS验证了在A431肿瘤细胞上缺乏PSMA表达(图6)。
这些数据表明，抗PD1单一疗法引起有限的抗肿瘤应答，并且抗EGFR单一疗法引起部分抗肿瘤应答，而组合疗法表现出强烈、稳健的抗肿瘤免疫应答。
实例4：作为单一疗法施用EGFRxCD28抗体控制并根除移植有人PBMC细胞的NSG小鼠中的人A431肿瘤异种移植物。
将A431表皮样癌肿瘤细胞(从ATCC获得)与人PBMC混合并且皮下植入NSG小鼠(NOD/SCID/γc null)中。使用预防性(第0、3、7天治疗)或治疗性(第3、7、10天)方案治疗小鼠。
对于预防性方案，将小鼠分成4个治疗组。用以下对每组进行腹膜内(IP)治疗：
(1)5mg/kg对照Ab EGRvIIIxCD3(bs17664D)
(2)5mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)
(3)0.5mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)
(4)0.05mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)。
对于治疗性方案，将小鼠分成3个治疗组。用以下对每组进行治疗：
(1)5mg/kg对照Ab EGRvIIIxCD3(bs17664D)
(2)5mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)
(3)0.05mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)。
测量肿瘤的二维尺寸(长×宽)，并且计算肿瘤体积(长×宽2×0.5)。当肿瘤达到指定的肿瘤端点(肿瘤体积>2000mm3或肿瘤溃疡)时，将小鼠安乐死。
在每个治疗组中治疗的小鼠的平均肿瘤大小汇总在图7A和7B中。这些数据表明，在预防性环境中，在所有三个测试剂量下都观察到了强烈的抗肿瘤应答，而在治疗性环境中，应答较不完全。
实例5：作为单一疗法施用EGFRxCD28抗体控制并根除移植有人PBMC细胞的NSG小鼠重的人A549肿瘤异种移植物。
在第0天将A549肺腺癌肿瘤细胞(从ATCC获得)皮下植入NSG小鼠(NOD/SCID/γc null)中。在第3天腹膜内移植人PBMC。将小鼠分成4个治疗组。用以下对每组进行腹膜内(IP)治疗：
(1)10mg/kg对照Ab EGRvIIIxCD3(bs17664D)
(2)1mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)
(3)10mg/kg EGFRxCD28(REGN7075)。
在第15天、第22天和第29天施用Ab治疗。测量肿瘤的二维尺寸(长×宽)，并且计算肿瘤体积(长×宽2×0.5)。当肿瘤达到指定的肿瘤端点(肿瘤体积>2000mm3或肿瘤溃疡)时，将小鼠安乐死。
在每个治疗组中治疗的小鼠的平均肿瘤大小汇总在图8中。在具有测定肿瘤的治疗环境下观察到显著的剂量依赖性抗肿瘤应答。
实例6：EGFRxCD28共刺激双特异性抗体与CD28+细胞和EGFR+细胞结合。
流式细胞术分析用于测定EGFRxCD28(REGN6323)与杰卡特细胞(CD28+细胞)和PEO1细胞(EGFR+细胞)的结合。观察抗体与每个细胞类型的结合。参见图1A和1B。
内源性表达EGFR(PEO1、EGFR+)的细胞系用1μM紫罗兰色细胞跟踪器进行标记并且在37℃下接种过夜。单独地，将人PBMC(纽约血液中心(New York Blood Center)或食蟹猴PBMC(新泽西州克兰福德(Cranford)科文斯(Covance))以1×106个细胞/mL接种在补充的RPMI培养基中，并在37℃下温育过夜，以通过耗竭粘附的巨噬细胞、树突状细胞和一些单核细胞来富集淋巴细胞。第二天，在37℃下，单独地或与固定浓度(2.5μg/ml)的TSAxCD28双特异性组合地，将靶细胞与粘附细胞耗竭的原初人PBMC(效应细胞/靶细胞比为4:1)和TSAxCD3或基于CD3的非靶向性双特异性的连续稀释液共温育96小时。温育后，使用无酶细胞解离缓冲液从细胞培养板中移除细胞并且通过流式细胞术(FACS)进行分析。
对于FACS分析，将细胞用活力远红细胞跟踪仪(英杰公司(Invitrogen))和直接缀合到CD2、CD4、CD8和CD25(BD)的抗体进行染色。用校准珠运行样品以进行细胞计数。为了评估杀伤的特异性，将靶细胞门控为紫罗兰色细胞跟踪器阳性群体。活的靶细胞的百分比计算如下：活细胞％＝(R1/R2)*100，其中R1＝在存在抗体的情况下活的靶细胞的％，并且R2＝在不存在测试抗体的情况下活的靶细胞的％。通过活化的(CD25+)T细胞占CD2+/CD4+或CD2+/CD8+ T细胞的百分比来测量T细胞活化。通过计算每校准珠的活CD4+或CD8+细胞的数量来测量T细胞计数。
按照制造商的方案，使用BD流式微珠阵列(CBA)人Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒来分析培养基中积聚的细胞因子的水平。
实例7：肿瘤内T细胞簇分析。
为了检验在A431肿瘤异种移植物模型中治疗是否对人T细胞活化有显著影响，对肿瘤内T细胞进行分析。使用CITRUS(簇鉴定、表征和回归)，一种独立分层具有统计学意义的不同T细胞簇的方法来鉴定在单一和组合治疗后应答的人CD8+/CD4+ T细胞簇。
对于体内实验的流式细胞术分析，收获肿瘤，制备单细胞悬浮液，并且使用ACK裂解缓冲液(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))裂解红细胞。使用活/死可固定的蓝色死细胞染色试剂盒(赛默飞世尔科技公司)来进行活/死细胞鉴别。在Symphony(BD生物科学公司(BD Bioscience))上获得样品，并且使用Cytobank软件(加利福尼亚州圣克拉拉的Cytobank(Cytobank,Santa Clara,CA))进行分析。以每样品相同的事件数执行分析。事件范围由获得的事件最少的样品决定。为了基于特异性标志物自动对T细胞进行聚类，使用来自Cytobank的CITRUS分析。
EGFRxCD28(REGN7075)和抗PD-1Ab(西米普利单抗)单药剂治疗两者降低了表达高水平的PD-L1和ICOS的CD8+ T细胞簇C1(参见图9A和9B)。单独的PD-1阻断稳健地推动了具有高度活化表型(高水平的CD2、CD86、GITR、TIGIT和ICOS)的CD8+ T细胞簇C2的扩增。有趣的是，观察到对单一或组合治疗应答的更加多样化的CD4+ T细胞簇(图9C和9D)。只有组合治疗使具有增殖效应记忆样表型(高Ki67、低CD45RA和CCR7)的簇C2显著扩增并且较少耗尽效应记忆样簇C3(低CD38、CD45RA和CCR7)。与CD8+ T细胞类似，组合治疗显著降低了具有较高PDL1表达水平的簇C1。PD-1阻断单一疗法驱动具有较高CD38表达水平的类似于更加活化的表型的效应记忆细胞(C4)的扩增。EGFRxCD28单一疗法维持了肿瘤中的一小池原初样CD4+ T细胞(C5)，所述细胞可以在抗PD1 Ab治疗后进一步致敏/活化。
这些数据表明，人源化小鼠中的人异种移植物肿瘤模型提供了强大的平台来测试EGFRxCD28双特异性抗体作为单一疗法以及与PD-1阻断剂的组合。使用高维度FACS分析和全自动聚类鉴定方法使得进一步剖析人免疫系统重建小鼠的底层免疫机制成为可能。尽管单独的PD1阻断能够驱动具有活化表型的CD8+和CD4+ T细胞的有效扩增，但不足以促进记忆发育和驱动显著的肿瘤抑制。当与EGFRxCD28治疗组合时，可以实现平衡的T细胞活化状态并驱动有效的抗肿瘤应答。
实例8：与食蟹猴中的CD28超级激动剂相比，单独地或与抗PD1疗法组合的EGFRxCD28不诱导全身性T细胞活化。
为了评估单独的EGFRxCD28双特异性抗体(REGN7075)的耐受性或与抗PD1抗体组合的协同药理学潜力，对食蟹猴进行了研究。每个治疗组的三只猴通过静脉内输注接受单剂量(10mg/kg)单独的EGFRxCD28或与REGN2810(西米普利单抗)(10mg/kg)的组合(组合组接受顺序输注)。
食蟹猴研究是根据IACUC指南进行的。对于利用EGFRxCD28的研究，在美国SNBL处进行雌性食蟹猴(成束猴(Macaca fascicularis))研究(由实验室动物护理评估和认证协会(Association for Assessment and Accredation of Laboratory Animal Care)AAALAC认可；由实验室动物福利办公室(实验室动物福利办公室)OLAW颁发动物福利保证；向美国农业部(United States Department of Agriculture)USDA和机构动物护理和使用委员会(IACUC)登记)。对于流式细胞术，从被约束的、有意识的动物的外周静脉收集血液到EDTA钾管中。用指定抗体对100μl全血进行染色。流式细胞术数据采集使用FACS Canto II进行。根据下式，从个体群体的源自亲本/祖代亲本群体门的相对百分比和来自经验证的血液分析器的总亲本/祖代亲本群体计数计算个体群体的绝对计数：绝对群体计数(x103/μL)＝(相对群体％x总亲本/祖代亲本群体计数)/100。对于血清细胞因子，将血液收集到含有抗凝血剂的血清分离管中。通过在设置为4℃的离心机中离心分离血清。使用MSD U-Plex平台(IL-2、4、6、8、10、TNFα和IFNγ)进行分析。
毒性评估基于实验完成后的临床观察结果、定性食物消耗量、体重和生命体征(体温、心率、脉搏血氧饱和度和呼吸率)以及临床和解剖病理学。收集血液样品用于细胞因子和FACS免疫表型分析。单独的或与西米普利单抗组合的EGFRxCD28耐受性良好，并且所有动物都存活到计划的尸检时间。没有观察到与测试物品相关的临床观察(数据未示出)。没有发现器官重量的变化，也没有在终末尸检时发现任何宏观变化(数据未示出)。此外，没有观察到显著的细胞因子释放、T细胞边缘化或活化(图10A-10C)。相比之下，在施用CD28“超级激动剂”的猴中观察到显著的细胞因子释放、淋巴细胞边缘化和T细胞活化(数据未示出)。在单独或与西米普利单抗组合施用EGFRxCD28的动物中未观察到显著的治疗相关的组织学变化。
实例9：通过EGFR X CD28双特异性抗体(REGN7075)和抗PD-1抗体(REGN2810)组合疗法介导的剂量依赖性抗肿瘤应答
材料和方法
NCI-H292
NCI-H292细胞系是从32岁女性患者(ATCC CRL-1848)分离的人粘液表皮样肺癌细胞系。将细胞系维持在补充有PSG(青霉素、链霉素和谷氨酰胺)的10％FBS的RPMI-1640中。
外周血单核细胞(PBMC)
人PBMC获自ReachBio，目录号0500-401，本研究中使用供体编号0190205。
用于肿瘤研究的程序：
在实验中使用雌性NSG小鼠(年龄为约10周龄)。小鼠皮下植入4×106个肿瘤细胞，所述肿瘤细胞与2×106个PBMC混合。在整个研究期间，使用卡尺每周两次监测肿瘤生长。表12中所指示的抗体在肿瘤植入后指定天数以指定剂量通过腹膜内注射作为单一疗法或组合。根据IACUC标准，当小鼠出现溃疡肿瘤或肿瘤体积超过1500cm3时，实验结束。统计学分析在表13中示出。数据汇总于表11和12中。
表12-研究设计
Figure BDA0003270620590000731
Figure BDA0003270620590000741
同种型对照1号和同种型对照2号是结合Fel d1的阴性对照抗体
REGN7075是也称为bsAb7075的抗EGFR X CD28双特异性抗体
REGN2810是抗PD-1抗体
表13：第32天统计分析：混合效应模型(REML)分析
Figure BDA0003270620590000742
汇总
图11和12所示的数据表明，与在单独使用任一抗体时获得的结果相比，在此模型中进行测试时，当REGN7075(抗EGFR X抗CD28)与抗PD-1抗体(REGN2810)结合时，观察到最稳健的抗肿瘤应答。
实例10A：使用REGN6323的流式细胞术结合滴定
利用流式细胞术分析测定抗EGFR X抗C28双特异性抗体与若干癌细胞系(A375、22RV1、PEO1、CAPAN2、SW1990和H292)、人和食蟹猴T细胞和杰卡特细胞的结合，之后用标记的抗人次级IgG抗体进行检测。简而言之，1×105个细胞/孔在4℃下与EGFRxCD28双特异性抗体或对照抗体(将没有交叉反应性的人抗原与人或食蟹猴CD28结合的人IgG4抗体)的连续稀释液一起温育30分钟，对于人和食蟹猴T细胞，连续稀释液的范围为100nM到1.5pM，而对于表达EGFR的细胞，连续稀释液的范围为133nM到2pM。温育后，用含有1％过滤FBS的冷PBS洗涤细胞两次，并且将荧光团缀合的抗人次级抗体添加到细胞中并另外温育30分钟。将活/死染料添加到人和食蟹猴T细胞温育中。使用不含抗体或仅含次级抗体的孔作为对照。
与表达EGFR的细胞一起温育之后，洗涤细胞，将其重新悬浮于200μL含有1％过滤FBS的冷PBS中，并且在BD FACS Canto II上通过流式细胞术进行分析。
与人或食蟹猴T细胞一起温育之后，洗涤细胞，并且在亮染色缓冲液中用抗CD2、抗CD16、抗CD4和抗CD8抗体的混合物染色，在4℃下另外温育20分钟。洗涤之后，将细胞重新悬浮于200μL含有1％过滤FBS的冷PBS中，在活/CD2+/CD4+/CD16-或活/CD2+/CD8+/CD16-门中进行门控，并且在BD FACS LSR-Fortessa-X20上通过流式细胞术进行分析。
流式细胞术结合滴定的结果(见表14A和14B以及图13A、13B和13C)
如上所述通过流式细胞术测试抗EGFR X抗CD28双特异性抗体(REGN6323)与人T细胞和食蟹猴T细胞表面的结合。结果表明，REGN6323与人CD4+和CD8+ T细胞和食蟹猴CD4+和CD8+ T细胞两者结合，而未在所选浓度范围内达到饱和(图13A)。
还通过流式细胞术测试了抗EGFR X抗CD28双特异性抗体(REGN6323)与其它表达EGFR的细胞系表面的结合。使用的细胞系是作为人T淋巴细胞的永生化系的杰卡特细胞(见图13C)；作为上皮黑色素瘤细胞系的A375细胞；作为上皮前列腺癌的22RV1细胞；作为源自腹水的卵巢癌细胞系的PEO1细胞；作为胰腺腺癌细胞系的CAPAN2；作为源自转移部位(脾)的胰腺癌的SW1990；以及作为肺上皮癌细胞系的H292。结果表明，REGN6323以1.48E-09M的EC50与A375细胞结合。REGN6323以5.54E-10M的EC50与22RV1细胞结合。REGN6323以6.67E-10的EC50与PEO1细胞结合。REGN6323以1.29E-09M的EC50与CAPAN2细胞结合。REGN6323以2.96E-09M的EC50与SW1990细胞结合，并且REGN6323以6.74E-10的EC50与H292细胞结合(见图13B)。
同种型对照抗体未表现出与人或食蟹猴T细胞的任何结合，也不与表达EGFR的细胞系结合。
这些数据表明，REGN6323能够结合各种表达EGFR的癌细胞系，并且如此可以有效治疗多种癌症适应症。
实例10B：使用REGN6321和REGN6322的流式细胞术结合滴定
还进行了实验以测定其它抗EGFR X抗CD28双特异性抗体是否也可以与多种细胞类型结合。按照上述方案，REGN6321和REGN6322以类似的方式进行测试。REGN6323也包含在本研究中。
图13C所示的结果表明，REGN6321、REGN6322和REGN6323表现出与前列腺细胞系22RV1以及名为PEO1的作为卵巢细胞系的细胞系结合。这些结果表明，这些另外的抗EGFR X抗CD28抗体能够跨卵巢细胞系进行结合。
表14：用各种EGFR X CD28双特异性抗体进行的流式细胞术结合研究汇总
Figure BDA0003270620590000761
NC：EC50未计算：NT：抗体未测试
实例11：如通过流式细胞术测量的细胞毒性
为了监测在存在抗TSA X抗CD3和EGFRxCD28抗体的组合的情况下各种大小的表达肿瘤特异性抗原(TSA)的细胞的杀伤，用1μM的荧光示踪染料紫罗兰色细胞跟踪器对22RV1(PSMA+，STEAP2+)或PEO1(MUC16+)或CAPAN2(MUC16+)或SW1990(MUC16+)或H292(MUC16+)细胞进行标记。标记后，使细胞在37℃下接种过夜。单独地，将人PBMC以1×106个细胞/mL接种在补充的RPMI培养基中，并在37℃下温育过夜，以通过耗竭粘附的巨噬细胞、树突细胞和一些单核细胞来富集淋巴细胞。第二天，将靶细胞与粘附细胞耗竭的原初PBMC(效应子/靶细胞比率为4:1)、靶向性TSAxCD3双特异性抗体或对照TSAxCD3双特异性抗体的连续稀释液(浓度范围：66.7nM到0.2pM)和固定浓度的EGFRxCD28共刺激分子REGN6323以2.5μg/ml(16.7nM)在37℃下共温育96小时。使用胰蛋白酶-EDTA解离缓冲液从细胞培养板中移除细胞，并在FACS BD LSRFortessa-X20上通过流式细胞术进行分析。对于流式细胞术分析，细胞用死/活近IR反应(英杰公司)染料进行染色。在流式细胞术分析之前立即向每个孔添加5E05个计数珠。针对每个样品收集1E05个珠。为了评估杀伤的特异性，在活的Violet标记的群体上对细胞进行门控。记录活群体百分比并将其用于计算存活率。
通过将细胞与直接缀合到CD2、CD4、CD8、CD25的抗体一起温育并通过报告晚期活化T细胞占总T细胞(CD2+)或CD8+ T细胞的百分比来评估T细胞活化。
基于流式细胞术的细胞毒性测定的结果(见表15以及图14和15)
测试了共刺激EGFRxCD28双特异性抗体REGN6323增强靶向各种大小的细胞表面抗原并且跨若干癌症适应症的TSAxCD3抗体的细胞毒性效力的能力。
在存在未受刺激的人PBMC的情况下，REGN6323成功增强了靶向PSMA或MUC16或STEAP2的各种TSAxCD3双特异性抗体的细胞毒性效力。与TSAxCD3单药剂治疗相比，在存在EGFRxCD28+TSAxCD3双特异性抗体组合的情况下，靶细胞杀伤增强，并且以pM EC50的剂量依赖性方式杀伤细胞。
观察到的靶细胞裂解增强与同样以pM EC50的T细胞上CD25+表达的增强相关。
表15
Figure BDA0003270620590000771
实例12：通过HDX-MS对具有REGN7075、REGN6323和REGN6322的EGFR进行的表位作图
执行氢-氘交换质谱法(HDX-MS)以测定与REGN7075(mAb12999P2 x mAb14226P2)、mAb13006P(REGN6323 EGFR臂亲本)和mAb35193P(REGN6322EGFR臂亲本)相互作用的表皮生长因子受体(重组人EGFR，氨基酸序列在附录中)的氨基酸残基。对HDX-MS方法的一般描述在例如以下中阐述：Ehring,(1999),《分析生物化学》,267(2):252-259；以及Engen和Smith,(2001),《分析化学》,73:256A-265A。表16、17和18中示出了结果。
在集成的HDX-MS平台上执行HDX-MS实验，所述平台由用于氘标记和淬火的Leaptec HDX PAL系统、用于样品消解和上样的Waters Acquity M-Class(辅助溶剂管理器)、用于解析梯度的Waters Acquity M-Class(μ二元溶剂管理器)和用于肽质量测量的赛默Q Exactive HF质谱仪组成。
在pD 7.0下，将标记溶液制备为在D2O中的PBS缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液、140mMNaCl和3mM KCl，在25℃下相当于pH 7.4)。对于氘标记，将与REGN7075以1:1摩尔比预混合的11μL 52.0μM hEGFR.mmh(Regeneron内部蛋白REGN355)或hEGFR.mmh(Ag-Ab复合物)、与mAb13006P2以1:0.6摩尔比预混合的11μL 34.3μM hEGFR.mmH(Regeneron内部蛋白REGN355)或hEGFR.mmH(Ag-Ab复合物)、与mAb35193P2以1:0.6摩尔比预混合的11μL 31.4μMhEGFR.mmH(Regeneron内部蛋白REGN355)或hEGFR.mmH(Ag-Ab复合物)在20℃下一式两份地与44μL D2O标记溶液一起温育不同时间点(例如，非氘化对照＝0秒；氘标记持续5分钟和10分钟)。通过向每个样品添加55μL预冷却的淬灭缓冲液(0.5M TCEP-HCl、8M尿素和1％甲酸)以在20℃下温育5分钟来淬灭氘化反应。然后将淬灭的样品注射到Waters HDX管理器中，以进行在线胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。通过C8柱(1.0mm x 50mm，诺华生测定公司(NovaBioassays))在-9.5℃下从0％-90％B(流动相A：水中的0.5％甲酸和水中4.5％乙腈；流动相B：乙腈中的0.5％甲酸)中以22分钟的梯度分离消化的肽。通过赛默Q Exactive HF质谱法以LC-MS/MS或LC-MS模式对洗脱的肽进行分析。
使用Byonic搜索引擎(蛋白质度量公司(Protein Metrics))针对包含hEGFR.mmH(REGN355)序列和其反向化序列的数据库搜索未氘化的EGFR样品的LC-MS/MS数据。使用非特异性酶消化和人糖基化作为常见的变量修饰，将搜索参数设置为默认值。然后将鉴定出的肽列表导入到HDX工作台软件(版本3.3)中，以计算通过LC-MS从所有氘化样品中检测到的每种肽的氘摄取量。对于给定的肽，使用每个时间点的质心质量(强度加权平均质量)来计算氘摄取量(D)和氘摄取量百分比(D％)。
氘摄取量(D摄取量)＝平均质量(氘化)-平均质量(未氘化)
Figure BDA0003270620590000781
从单独的hEGFR.mmH和与REGN7075样品复合的hEGFR.mmH两者中鉴定出总共271种来自hEGFR.mmH(REGN355)的肽，这表示hEGFR.mmH的序列覆盖率为84.4％。表现出高于5％的D摄取量值差异百分比的任何肽均被定义为受到显著保护。对应于hEGFR.mmH上的氨基酸345-368(LHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQEL SEQ ID NO:70)和399-416(LEIIRGRTKQHGQFSLAVSEQ ID NO:71)的肽受到REGN7075的显著保护(hEGFR.mmH残基是根据hEGFR.mmH序列编号的)。
从单独的hEGFR.mmH和与mAb13006P样品复合的hEGFR.mmH两者中鉴定出总共341种来自hEGFR.mmH(REGN355)的肽，这表示hEGFR.mmH的序列覆盖率为85.8％。表现出高于5％的D摄取量值差异百分比的任何肽均被定义为受到显著保护。对应于hEGFR.mmH上的氨基酸345-368(LHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQEL SEQ ID NO:70)和399-416(LEIIRGRTKQHGQFSLAV SEQ ID NO:71)的肽受到mAb13006P的显著保护(hEGFR.mmH残基是根据附录中的hEGFR.mmH序列编号的)。
从单独的hEGFR.mmH和与mAb35193P样品复合的hEGFR.mmH两者中鉴定出总共335种来自hEGFR.mmH(REGN355)的肽，这表示hEGFR.mmH的序列覆盖率为85.5％。表现出高于5％的D摄取量值差异百分比的任何肽均被定义为受到显著保护。对应于hEGFR.mmH上的氨基酸序列133-154(CNVESIQWRDIVSSDFLSNMSM SEQ ID NO:72)的肽受到mAb35193P的显著保护(hEGFR.mmH残基是根据hEGFR.mmH序列编号的)。
表16：与单独的hEGFR.mmH相比，在形成hEGFR.mmH-REGN7075复合物时显著受保护的hEGFR.mmH肽
Figure BDA0003270620590000791
表17：与单独的hEGFR.mmH相比，在形成hEGFR.mmH-mAb13006P复合物时显著受保护的hEGFR.mmH肽
Figure BDA0003270620590000801
表18：与单独的hEGFR.mmH相比，在形成hEGFR.mmH-mAb35193P复合物时显著受保护的hEGFR.mmH肽
Figure BDA0003270620590000802
hEGFR.mmh的氨基酸序列
hEGFR(ECD).CPGG.MMH6(REGN355)：人EGFR(氨基酸L25-A647，登录号NM_005228.4)，具有C端CPGG.myc表位(E1-L10).GlyGly.myc表位(E1-L10).SerGly.6XHis.SSG标签(mmh标记签加下划线)
LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDCLVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEEDGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIACPGGEQKLISEEDLGGEQKLISEEDLSGHHHHHHSSG(SEQ ID NO:69)
实例13：EGFR和CD28的EGFRxCD28双特异性和相关的亲本抗体的表面等离子体共振源性结合亲和力和动力学常数
EGFR实验程序
使用Biacore 4000仪器，使用实时表面等离子体共振生物传感器测定hEGFR.mmH(REGN355)与捕获的抗EGFRxCD28双特异性Ab结合的平衡解离常数(KD值)。通过与单克隆小鼠抗人Fc抗体(REGN2567，批号REGN2567-L1)的胺偶联衍生CM5 Biacore传感器表面，以捕获纯化的抗EGFRxCD28双特异性Ab。在由0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20(HBS-EP运行缓冲液)构成的缓冲液中执行此Biacore结合研究。在HBS-EP运行缓冲液(范围为30nM到120pM，3倍连续稀释液)中制备的具有C端myc-myc-六组氨酸标签(REGN355)的不同浓度的hEGFR.mmH以30微升/分钟的流速注射在Ab捕获的表面之上。监测缔合5分钟，并且监测HBS-EP运行缓冲液中hEGFR.mmH的解离，持续10分钟。在25℃下执行所有结合动力学实验。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时传感图拟合到1:1结合模型来测定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)为：
KD(M)＝kd/ka，并且t1/2(分钟)＝0.693/kd/60
在25℃下hEGFR.mmH与纯化的EGFRxCD28 Ab结合的结合动力参数在下表19中示出。
CD28实验程序
使用Biacore T-200仪器，使用实时表面等离子体共振生物传感器测定纯化的双特异性Ab与捕获的hCD28.mFc(REGN2012)结合的平衡解离常数(KD值)。通过与多克隆兔抗小鼠Fc抗体(通用电气医疗集团，目录号BR100838)的胺偶联衍生CM5 Biacore传感器表面，以捕获具有C端小鼠Fc标签(hCD28.mFc，REGN2012)的纯化的hCD28。在由0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20(HBS-EP运行缓冲液)构成的缓冲液中执行此Biacore结合研究。将在HBS-EP(范围为90nM到1.1nM，3倍连续稀释液)中制备的不同浓度的双特异性Ab以50微升/分钟的流速注射在hCD28.mFc捕获的表面之上。监测缔合4分钟，并且监测HBS-EP中双特异性AB的解离，持续10分钟。在25℃下执行所有结合动力学实验。通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时传感图拟合到1:1结合模型来测定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)为：
KD(M)＝kd/ka，并且t1/2(分钟)＝0.693/kd/60
在25℃下EGFRxCD28 Ab与hCD28.mFc结合的结合动力学参数在下表20中示出。
表列数据汇总：
表19：在25℃下hEGFR.mmH与抗EGFRxCD28双特异性mAb的结合动力学
Figure BDA0003270620590000821
表20：在25℃下hCD28.mFc与抗EGFRxCD28双特异性mAb的结合动力学
Figure BDA0003270620590000822
实例14：使用过表达人EGFR的工程化的BaF3细胞的配体介导的细胞生长测定中的EGFR x CD28双特异性抗体的表征
EGFR(ErbB1，HER1)受体是受体酪氨酸激酶(RTK)家族的成员，其调节多细胞生物的细胞增殖、存活、分化和迁移。受体的活化通过其可溶性配体例如EGF或TGFβ的结合发生，所述可溶性配体驱动EGFR的同二聚化和自磷酸化，最终导致如Ras/MAPK、PLCγ1/PKC、PI3-激酶/Akt和STAT路径等大量细胞内信号传导级联的活化(Wieduwilt等人,2008；《细胞与分子生命科学(Cell Mol Life Sci.)》5月；65(10):1566-1584)。
为了研究抗EGFR x CD28抗体对EGFR信号传导的阻断效果，使用工程化的IL-3依赖性Ba/F3小鼠造血细胞系部署增殖测定，所述小鼠造血细胞系经过基因修饰以稳定地过表达人表皮生长因子受体(EGFR—Genbank登录号NP_005219.2的氨基酸M1到A1210)(Kong等人.2017；《肿瘤靶标(Oncotarget)》,第8卷,(第22期),第35488页-第35489页)。在存在滴定抗体的情况下，用配体(人EGF或TGFβ)刺激工程化的BaF3/hEGFR细胞，并且通过氚掺入测量细胞生长随增殖细胞的变换。
实验程序：
工程化BaF3/hEGFR细胞在培养基(RPMI1640+10％FBS+青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺+10μg/mL小鼠IL-3+0.5μg/mL嘌呤霉素)中生长，在不含IL-3的培养基(RPMI1640+1％FBS)中饥饿24小时，之后用于细胞增殖测定。简而言之，在存在恒定配体hEGF(0.5nM)或hTGFβ(0.5nM)的情况下，在96孔圆底组织培养板中，将12.5x 10^5个细胞/孔添加到1:3连续稀释的抗体中，范围为15.2pM到100nM，包含不含抗体的对照。将板在37℃/5％CO2下温育72小时，并且将0.3μCi/孔氚化胸苷添加到细胞中，并且将板再温育16小时。胸苷并且因此氚将以更大的量掺入到分裂细胞的新合成的DNA中。温育后，将细胞收集到96孔UniFilter板上，并且向每个孔添加30μL闪烁液。使用Microplate Scintillation和LuminescenceCounter TopCount NXT仪器以每分钟计数(CPM)的形式测量氚掺入。在测定培养基(Opti-MEM+0.1％牛血清白蛋白)中制备细胞、抗体和配体，并且一式两份地测试所有连续稀释液。
使用GraphPad PrismTM软件根据10点剂量-应答曲线上的4参数逻辑方程测定抗体的IC50/EC50值。增殖的最大抑制由以下等式测定：
Figure BDA0003270620590000831
结果汇总：
在存在0.5nM的hEGF或hTGFβ的情况下，将EGFR x CD28双特异性抗体(REGN6322；REGN6323和REGN7075)和其对应的亲本EGFR抗体(mAb35193P2；mAb13006P2和mAb12999P2)与内部产生的比较抗体(Erbitux)和同种型匹配的阴性对照一起进行测试(见表21)。
在存在0.5nM EGF的情况下：
双特异性抗体(REGN6322；REGN6323和REGN7075)均未显示出剂量依赖性增殖抑制。所述双特异性抗体的最大抑制值的范围为30.5％到-6.8％(负值意味着增殖增加)。而mAb35193P2、mAb12999P2和内部Erbitux分别以IC50以及2.55nM/29.6％、19.8nM/91.8％和6.69nM/97.6％的最大抑制值抑制了BaF3/hEGFR细胞的增殖。mAb13006P2显示最大抑制率为93.2％，无法计算IC50值。阴性同种型对照抗体没有显示出预期的抑制。
在存在0.5nM hTGFβ的情况下：
REGN6322显示增殖增加40.6％，其中EC50为3.67nM，而REGN6323和REGN7075没有显示与阴性同种型对照抗体类似的应答。相比之下，mAb13006P2、mAb12999P2和内部Erbitux分别以IC50和6.55nM/97.2％、7.79nM/95.9％和1.38nM/99.8％的最大抑制值抑制增殖。mAb35193P2显示增殖增加32.7％，其中EC50值为914pM。
表21：抗体的最大抑制率和效力值
Figure BDA0003270620590000841
缩略语：ND：未测定；NC：无法计算；无法通过PRISM测定效力值。
实例15：在使用NCI-H292和人原发性T细胞的同种异体T细胞活化测定中EGFR xCD28双特异性抗体的表征。
表22：试剂/抗体信息/材料：
Figure BDA0003270620590000842
Figure BDA0003270620590000851
背景
合适的T细胞活化需要两种信号，“信号1”和“信号2”。“信号1”是通过T细胞上的T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞(APC)上的肽结合主要组织相容性复合物(MHC)分子的结合来诱导的。而“信号2”是通过将T细胞上的共刺激CD28受体与其存在于APC上的分化配体簇80或86(CD80/CD86)结合来提供的(Martin等人,1986；June等人,1987；Harding等人,1992)。因此，CD28信号传导的活化提供了用于增强现有TCR信号传导的靶向方法。
EGFRxCD28双特异性抗体被设计成通过将EGFR+靶细胞与CD28+ T细胞桥接来模拟CD28的天然配体以提供“信号2”，从而在同种异体T细胞活化测定中存在现有“信号1”的情况下增强T细胞的活化。然而，T细胞活化可以通过将T细胞上的程序性细胞死亡蛋白1受体(PD-1)连接到其在APC上的配体PD-L1进行抑制。连接的PD-1导致将磷酸酶募集到CD28和TCR复合物(Zou等人,2008、Francisco等人,2010、Hui等人,2017)，这进而抵消TCR信号传导和CD28刺激。因此，阻断PD-1/PD-L1与西米普利单抗的相互作用结合EGFRxCD28双特异性抗体可以增强T细胞功能并促进如在癌症中的靶细胞的杀伤。
实验程序：
EGFRxCD28双特异性抗体通过接合EGFR和CD28以递送如通过IL-2释放和T细胞增殖测定的“信号2”来活化人原发性T细胞的能力是在存在提供了足以作为“信号1”的同种异体TCR应答的EGFR+/PD-L1+人肺癌细胞系(NCI-H292)的情况下进行评估的。
人原发性CD3+ T细胞的分离：
使用EasySepTM Direct Human PBMC分离试剂盒，按照制造商推荐的方案，从来自精准医学公司(Precision for Medicine)的健康供体白细胞包(供体555015)中分离人外周血单核细胞(PBMC)并且冷冻。CD3+ T细胞通过解冻小瓶的冷冻PBMC进行分离。使用来自干细胞技术有限公司(StemCell Technologies)的EasySepTM人CD3+ T细胞分离试剂盒并按照制造商推荐的说明书，为供体PBMC富集CD3+ T细胞。
IL-2释放测定：
将重新悬浮于刺激培养基中的富集的CD3+ T细胞以1x105个细胞/孔的浓度添加到96孔圆底板中。将内源性表达EGFR和PD-L1的生长停滞的NCI-H292细胞以5x104个细胞/孔的最终浓度添加到CD3+ T细胞。随后，将REGN6322、REGN6323、REGN7075、非TAAxCD28和其匹配的同种型对照(IsoC-2)以1:4稀释度从0.76pM滴定到50nM并且添加到孔中。10点稀释液的最终点不含滴定抗体。在添加滴定抗体之后，将恒定20nM的西米普利单抗或其匹配的同种型对照(IsoC-1)添加到孔中。将板在37℃下温育96小时，去除5％CO2和50μL总上清液，并且从收集的上清液中取出5μL用于测量IL-2。按照制造商的方案，使用来自珀金埃尔默公司(PerkinElmer)的AlphaLisa试剂盒对测定上清液中IL-2的量进行测定。在珀金埃尔默公司的多标签酶标仪Envision上获得IL-2测量结果，并且以pg/mL的形式报告值。所有连续稀释液一式三份地进行测试。
使用GraphPad PrismTM软件根据10点剂量-应答曲线上的四参数逻辑方程测定抗体的EC50值。给出最大IL-2作为在测试剂量范围内检测到的平均最大应答。
T细胞增殖测定：
在37℃、5％CO2和上清液去除(参见IL-2释放测定)下温育96小时后，将0.25mCi/孔氚化胸苷添加到细胞中，并将板再温育6-8小时。胸苷并且因此氚将以更大的量掺入到分裂细胞的新合成的DNA中。温育后，将细胞收集到96孔UniFilter板上，并且向每个孔添加30μL闪烁液。使用Microplate Scintillation和Luminescence Counter TopCount NXT仪器以每分钟计数(CPM)的形式测量氚掺入。所有连续稀释液一式三份地进行测试。
使用GraphPad PrismTM软件根据10点剂量-应答曲线上的四参数逻辑方程测定抗体的EC50值。给出最大CPM作为在测试剂量范围内检测到的平均最大应答。
结果汇总(表23)
在存在西米普利单抗的情况下，与非TAA x CD28和IsoC-2，即CD28双特异性抗体的相应匹配同种型对照相比，EGFRxCD28抗体治疗(REGN6322、REGN6323和REGN7075)引起更高的IL-2和增殖应答。然而，在缺乏西米普利单抗的情况下，与非TAA x CD28和IsoC-1相比，EGFRxCD28抗体治疗引起更高的IL-2和增殖应答，但是最大值更低。
表23：最大IL-2释放和增殖以及抗体的效力值
Figure BDA0003270620590000871
缩略语：ND：未测定；NC：无法计算；无法通过PRISM测定效力值。
本发明不应限于本文所描述的具体实施例的范围。事实上，除了本文所述的那些修改之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员来说也将从前面的描述和附图中变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。
Figure IDA0003270620630000011
Figure IDA0003270620630000021
Figure IDA0003270620630000031
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Figure IDA0003270620630000051
Figure IDA0003270620630000061
Figure IDA0003270620630000071
Figure IDA0003270620630000081
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Claims (50)

1.一种分离的多特异性抗原结合分子，其包括：
a)第一抗原结合结构域(D1)，所述第一抗原结合结构域以如在37℃下通过表面等离子体共振测量的小于约2×10-7M的KD结合人CD28；以及
b)第二抗原结合结构域(D2)，所述第二抗原结合结构域以如在37℃下通过表面等离子体共振测量的小于约10-8M的KD特异性地结合靶肿瘤细胞上的人表皮生长因子受体(EGFR)。
2.根据权利要求1所述的分离的多特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子以如通过体外FACS结合测定测量的小于约10-5M的EC50与人T细胞表面结合。
3.根据权利要求1所述的分离的多特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子以如通过体外FACS结合测定测量的小于约10-5M的EC50与食蟹猴T细胞表面结合。
4.根据权利要求1所述的分离的多特异性抗原结合分子，其中双特异性抗原结合分子以如通过体外FACS结合测定测量的小于约2.5×10-8M的EC50与表达EGFR的细胞系的表面结合。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述D2结构域包括：
(a)包括重链可变区的HCDR的免疫球蛋白链，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:2、30、40和50组成的组的成员中所示的氨基酸序列或其变体；和/或
(b)包括轻链可变区的LCDR的免疫球蛋白链，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列或其变体；或者
其中所述D1结构域包括：
(c)包括重链可变区的HCDR的免疫球蛋白链，所述重链可变区包括选自由SEQ ID NO:10、59和63组成的组的成员中所示的氨基酸序列或其变体；和/或
(d)包括轻链可变区的LCDR的免疫球蛋白链，所述轻链可变区包括选自由SEQ ID NO:16和67组成的组的成员中所示的氨基酸序列或其变体。
6.根据权利要求5所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述D2结构域包括：
(a)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:2、24、30、38、40、48、50和58中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体；和/或
(b)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:16和28中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体；
或者其中所述D1结构域包括：
(c)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:10、26、59和63中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体；和/或
(d)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括与SEQ ID NO:16、28和67中所示的氨基酸序列具有至少90％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列或其变体。
7.根据权利要求5所述的多特异性抗原结合蛋白，其中所述D2结构域包括：
(a)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链可变区包括SEQ ID NO:2、30、40或50中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:2、30、40或50中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％；和/或
(b)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％；
或者其中所述D1结构域包括：
(c)重链免疫球蛋白或其可变区，所述重链免疫球蛋白或其可变区包括重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10、59或63中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:10、59或63中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％；和/或
(d)轻链免疫球蛋白或其可变区，所述轻链免疫球蛋白或其可变区包括轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16或67中所示的氨基酸序列并且分别与SEQ ID NO:16或67中所示的所述氨基酸序列的氨基酸序列同一性为至少90％。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其包括：
(1)D2结构域，所述D2结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GDSIITFY(SEQ ID NO:4；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARVSEDSYFHYGMDV(SEQ ID NO:8；或其变体)；
以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQ ID NO:12；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；
以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
(2)D2结构域，所述D2结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GFTFSTFI(SEQ ID NO:32；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：ISSNGGTI(SEQ ID NO:34；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：TRGGDFWSGYYPFDY(SEQ ID NO:36；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQ ID NO:12；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；
以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
(3)D2结构域，所述D2结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GFSFRDAW(SEQ ID NO:42；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IRNKIDGGTT(SEQ ID NO:44；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：TTDIWNYVLFYYYGLDV(SEQ ID NO:46；或其变体)；
以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQ ID NO:12；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；
以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；或者
(4)D2结构域，所述D2结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：DDSIISYY(SEQ ID NO:52；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGRT(SEQ ID NO:54；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARVSEDSYYHYGMDV(SEQ ID NO:56；或其变体)；
以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
包括以下氨基酸序列的CDR-H1：GGSISSYY(SEQ ID NO:12；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-H2：IYYSGIT(SEQ ID NO:6；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-H3：ARWGVRRDYYYYGMDV(SEQ ID NO:14；或其变体)；
以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L1：QSVSSSY(SEQ ID NO:18；或其变体)；
包括以下氨基酸序列的CDR-L2：GAS(SEQ ID NO:20；或其变体)；以及
包括以下氨基酸序列的CDR-L3：QQYGSSPWT(SEQ ID NO:22；或其变体)。
9.根据权利要求5到8中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其结合EGFR和CD28，所述多特异性抗原结合蛋白包括：
(1)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:2中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
(2)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:30中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
(3)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:40中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；或者
(4)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:50中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的所述氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:16中所示的所述氨基酸序列(或其变体)。
10.根据权利要求5到9中任一项所述的多特异性抗原结合蛋白，其结合EGFR和CD28，所述多特异性抗原结合蛋白包括：
(1)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
(2)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
(3)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；或者
(4)D2结构域，所述D2结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:58中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)；
以及
D1结构域，所述D1结构域包括：
重链，所述重链包括SEQ ID NO:26中所示的氨基酸序列(或其变体)；以及
轻链，所述轻链包括SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列(或其变体)。
11.根据权利要求5到10中任一项所述的抗原结合蛋白，其是双特异性的。
12.一种双特异性抗原结合分子，其与人EGFR和人CD28特异性地结合，其中第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争与人CD28结合，所述参考抗原结合蛋白包括三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包括氨基酸序列SEQ ID NO:12；其中HCDR2包括氨基酸序列SEQ ID NO:6；其中HCDR3氨基酸序列SEQ ID NO:14，其中LCDR1包括氨基酸序列SEQ ID NO:18，其中LCDR2包括氨基酸序列SEQ ID NO:20，并且其中LCDR3包括氨基酸序列SEQ ID NO:22。
13.一种双特异性抗原结合分子，其与人EGFR和人CD28特异性地结合，其中第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争与人CD28结合，所述参考抗原结合蛋白包括重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述HCVR包括选自由SEQ ID NO:10、59和63组成的组的氨基酸序列，所述LCVR包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
14.一种双特异性抗原结合分子，其与人EGFR和人CD28特异性地结合，其中第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争与人EGFR结合，所述参考抗原结合蛋白包括三个重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三个轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包括选自由SEQ ID NO:4、32、42和52组成的组的氨基酸序列，其中HCDR2包括选自由SEQ ID NO:6、34、44和54组成的组的氨基酸序列，其中HCDR3包括选自由SEQ ID NO:8、36、46和56组成的组的氨基酸序列，其中LCDR1包括氨基酸序列SEQ ID NO:18，其中LCDR2包括氨基酸序列SEQ ID NO:20，并且其中LCDR3包括氨基酸序列SEQ ID NO:22。
15.一种双特异性抗原结合分子，其与人EGFR和人CD28特异性地结合，其中第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争与人EGFR结合，所述参考抗原结合蛋白包括重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述HCVR包括选自由SEQ ID NO:2、30、40和50组成的组的氨基酸序列，所述LCVR包括氨基酸序列SEQ ID NO:16。
16.一种双特异性抗原结合分子，其与人EGFR和人CD28特异性地结合，其中第一抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争与人CD28结合，所述参考抗原结合蛋白包括重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述HCVR包括氨基酸序列SEQ ID NO:10，所述LCVR包括氨基酸序列SEQ ID NO:16，并且其中第二抗原结合结构域与参考抗原结合蛋白竞争与人EGFR结合，所述参考抗原结合蛋白包括重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，所述HCVR包括选自由SEQ ID NO:2、30、40和50组成的组的氨基酸序列，所述LCVR包括氨基酸序列SEQ IDNO:16。
17.一种用于制备根据权利要求1到16中任一项所述的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将对所述抗原结合蛋白的所述免疫球蛋白链进行编码的一种或多种多核苷酸引入到宿主细胞中；
(b)在有利于表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞；以及
(c)任选地，从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长的培养基中分离所述抗原结合蛋白或免疫球蛋白链。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
19.一种抗原结合蛋白或免疫球蛋白链，其是根据权利要求17到18中任一项所述的方法的产物。
20.一种多核苷酸，其对根据权利要求1到16和19中任一项所述的抗原结合蛋白的所述免疫球蛋白链进行编码。
21.一种载体，其包括根据权利要求20所述的多核苷酸。
22.一种宿主细胞，其包括根据权利要求1到16和19到21中任一项所述的抗原结合蛋白或多核苷酸和/或载体。
23.一种包括根据权利要求1到16和19中任一项所述的抗原结合蛋白中的一种或多种的组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒任选地与另外的治疗剂联合。
24.一种药物调配物，其包括根据权利要求1到16和19中任一项所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体或赋形剂以及任选地另外的治疗剂。
25.根据权利要求1到16、19、23和24中任一项所述的抗原结合蛋白、组合物或调配物，其与选自由以下组成的组的另外的治疗剂联合：PD-1抑制剂、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、PD-L1抑制剂、抗PD-L1抗体或其抗原结合片段、铂抗癌化学治疗剂、紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、长春新碱(vincristine)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、抗癌抗体或其抗原结合片段、派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、曲妥单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)和西米普利单抗(cemiplimab)。
26.一种容器或注射装置，其包括根据权利要求1到16、19、23、24或25中任一项所述的抗原结合蛋白或组合物或调配物。
27.一种用于向受试者施用根据权利要求1到16、19、23、24或25中任一项所述的抗原结合蛋白、组合物或调配物的方法，所述方法包括：将所述抗原结合蛋白、组合物或调配物注射到所述受试者体内。
28.一种用于治疗或预防有需要的受试者的过度增殖性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到16、19、23、24或25中任一项所述的抗原结合蛋白或组合物或调配物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述过度增殖性疾病是癌症，并且所述方法进一步包括：在施用所述抗原结合蛋白之前，测定癌症细胞是否表达EGFR或引导另一个个体或实体来执行此类测定，并且如果存在EGFR表达，则向所述受试者施用EGFRxCD28抗原结合蛋白。
30.根据权利要求28到29中任一项所述的方法，其中所述过度增殖性疾病是表达EGFR的癌症。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述过度增殖性疾病是癌症，所述癌症为食管癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、宫颈鳞状细胞癌、子宫内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、皮肤癌、头颈部鳞状细胞癌、脑癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、胃食管癌、胃食管腺癌、前列腺癌或卵巢癌。
32.根据权利要求27到31中任一项所述的方法，其中所述抗原结合蛋白通过皮下、静脉内或肌肉内注射到所述受试者体内进行施用。
33.根据权利要求1到16中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子以介于1×10-12M与1×10-5M之间的EC50值与表达CD28的人T细胞结合。
34.根据权利要求1到16中任一项所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子以介于1×10-9M与1×10-5M之间的EC50值与表达CD28的人T细胞结合。
35.根据权利要求33或34所述的多特异性抗原结合分子，其中所述抗原结合分子结合表达人CD28的人细胞和表达食蟹猴CD28的食蟹猴细胞。
36.一种药物组合物，其包括根据权利要求33到35中任一项所述的双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂。
37.一种核酸，其包括对根据权利要求33到35中任一项所述的双特异性抗体进行编码的核苷酸序列。
38.一种表达载体，其包括根据权利要求37所述的核酸。
39.一种宿主细胞，其包括根据权利要求38所述的表达载体。
40.一种抑制受试者的癌症生长的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求33到35中任一项所述的分离的双特异性抗体或根据权利要求36所述的药物组合物，由此抑制所述受试者的所述癌症生长。
41.根据权利要求28或40所述的方法，其进一步包括施用第二治疗剂。
42.根据权利要求41所述的方法，抗肿瘤剂、放射疗法、抗体药物缀合物、检查点抑制剂、包括与相同肿瘤靶抗原结合的第一抗原结合结构域和与T细胞上的CD3结合的第二抗原结合结构域的另一种不同的双特异性抗体、包括与不同肿瘤靶抗原结合的第一抗原结合结构域和与T细胞上的CD3结合的第二抗原结合结构域的另一种不同的双特异性抗体或其组合。
43.一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求24或36所述的药物组合物，由此治疗所述受试者的所述癌症。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述癌症是表达EGFR的癌症。
45.根据权利要求44所述的方法，其中其中所述表达EGFR的癌症选自由以下组成的组：食管癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌、宫颈鳞状细胞癌、子宫内膜腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、皮肤癌、头颈部鳞状细胞癌、脑癌、多形性胶质母细胞瘤、乳腺癌、胃食管癌、胃食管腺癌、前列腺癌和卵巢癌。
46.根据权利要求43到45中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述第二治疗剂是抗肿瘤剂、放射疗法、抗体药物缀合物、检查点抑制剂、包括与相同肿瘤靶抗原结合的第一抗原结合结构域和与T细胞上的CD3结合的第二抗原结合结构域的另一种不同的双特异性抗体、包括与不同肿瘤靶抗原结合的第一抗原结合结构域和与T细胞上的CD3结合的第二抗原结合结构域的另一种不同的双特异性抗体或其组合。
48.根据权利要求42或47所述的方法，其中所述检查点抑制剂是西米普利单抗。
49.根据权利要求42或47所述的方法，其中所述不同的双特异性抗体包括第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域与选自由PSMA、MUC16和STEAP2组成的组的不同肿瘤抗原结合，所述第二抗原结合结构域与T细胞上的CD3结合。
50.根据权利要求1到16中任一项所述的双特异性抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子与以下中的一个或多个相互作用：如SEQ ID NO:72中所示的EGFR的氨基酸残基133-154，或如SEQ ID NO:70中所示的EGFR的氨基酸残基345-368，或如SEQ ID NO:71中所示的EGFR的氨基酸残基399-416。
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