CN113584189B

CN113584189B - 一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用

Info

Publication number: CN113584189B
Application number: CN202111168146.3A
Authority: CN
Inventors: 盛滔; 张亚楠
Original assignee: Shanghai Siludi Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Shanghai Siludi Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2021-10-08
Filing date: 2021-10-08
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2041-10-08
Also published as: CN113584189A

Abstract

本发明公开了一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用。所述类外泌体包括蛋白质外壳、特异性标志物以及核酸，所述核酸被包裹在蛋白质外壳内部，所述特异性标志物位于蛋白质外壳的表面，所述蛋白质外壳的直径范围在20~200 nm之间。该类外泌体具有与外泌体类似的特征：相似的结构、相似的大小、相似的表面特异性抗原、可以用与提取外泌体相同的方法提取类外泌体。本发明通过人工合成的方法制备一种类外泌体，可以作为外泌体的参考品、标准品，可以工业化大规模生产，且不需要额外的分离富集过程，解决了工业化制备外泌体参考品的制备和分离富集难题；此外，这种类外泌体相对于天然的外泌体更稳定，可以在更高的温度下保存，可以解决外泌体运输和保存的问题。

Description

一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用

技术领域

本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用。

背景技术

外泌体是大多数细胞都会分泌的一种囊泡结构，其大小在30~150 nm之间。由于外泌体携带了细胞中很多物质，包括蛋白质、核酸、脂质等，因此外泌体被认为在细胞通讯中起着关键作用。此外，越来越多的研究表明外泌体在诊断、治疗、载药以及疾病的预后等方面起着重要的作用。但是外泌体的制备和保存难题限制了其研发的进展、临床的应用以及商业化产品的开发。

首先是外泌体的制备方面：现在外泌体，特别是外泌体标准品的制备方式主要还是通过细胞培养或者从一些生物样本中收集和富集。但是通过细胞培养获得外泌体的周期很长，需要专业人员操作，且需要避免细胞的染菌，对洁净度有很高的要求；此外大规模细胞培养成本也很高昂，一方面需要专业的设备如CellSTACK®、Wave Bioreactor™、Quantum®等，这些设备价格昂贵；另一方面培养细胞需要消耗大量的胎牛血清，这也会造成很大的试剂成本。也可以通过生物样本收集和富集外泌体，但是，由于生物样本的个体差异，无法保证每次收集的样本的性状一致，也就无法保证通过这些样本制备的外泌体每批的性状保持一致；此外，通过生物样本收集和富集的外泌体还会造成伦理问题，在一些国家，比如我们国家是禁止公司或个人收集人的血清、血浆用于实验或者生产需求。因此，不管是科研领域还是工业领域都希望可以开发出一种新的可以规模生产外泌体的技术。

其次是外泌体的富集方面：目前分离和富集外泌体的方法有很多，比如超高速离心法、沉淀法、色谱法、免疫亲和磁珠法、微流控技术、超滤法等。沉淀法富集的外泌体中含有大量的杂质（可能90%以上为杂质），这种纯度无法满足外泌体标准品的纯度；色谱法处理富集外泌体的速度相对较慢，且外泌体的浓度太低，无法有效浓缩，且色谱柱的耗材费成本高昂，限制了色谱法在外泌体工业化生产方面的大规模运用；免疫亲和磁珠法需要消耗大量的特异性抗体，因此成本非常高昂，无法在工业上应用；微流控技术是操控微小流体的一种技术，因此也无法实现工业级的外泌体分离；超高速离心和超滤法可以用于大规模外泌体的生产，但是超高速离心法设备昂贵，需要较长的离心时间，因为离心速度要提升到100000 g以上（1万倍地球重力），因此样本处理能力有限，且可能带来安全隐患；超滤法可以用于外泌体的浓缩，但是浓缩液中含有大量的大分子量的杂质，一般和其他外泌体分离富集方法配合使用。因此，不管是科研领域还是工业领域都希望可以开发出一种新的不需要额外分离和富集外泌体的技术。

最后是外泌体的保存和运输方面，由于外泌体是由很薄的磷脂双分子层包裹的囊泡结构，因此外泌体是很不稳定的，容易发生破裂，必须保存在-80℃的条件下。有些公司会通过冻干的方式，将外泌体冷冻干燥，从而实现外泌体在4℃的保存。但是冻干存在以下问题：1. 需要摸索适合的赋形剂；2. 需要摸索适宜的冻干条件；3. 冻干的外泌体复溶后仍然需要在-80℃保存，即冻干解决了外泌体的运输问题，但是解决不了外泌体复溶后的保存问题；4. 外泌体冻干后性状改变的问题；5. 赋形剂可能对后期检测造成干扰；6. 冻干的外泌体复溶后多次使用反复冻融的问题，反复冻融会导致外泌体破裂。因此，不管是科研领域还是工业领域都希望可以开发出一种新的更稳定的外泌体标准品，以解决外泌体的保存和运输问题。

发明内容

本发明的目的是，提供一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用。旨在解决工业化制备、分离和保存外泌体参考品、标准品较为困难的技术问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种类外泌体，包括蛋白质外壳、特异性标志物以及核酸，所述核酸被包裹在白质外壳内部，所述特异性标志物位于蛋白质外壳的表面，所述蛋白质外壳的直径范围在20~200 nm之间。

作为优选实施方案，所述蛋白质外壳用于保护内部的核酸，避免核酸被降解。所述蛋白质外壳可以是人工合成的，也可以是市售购买获得的。所述蛋白质外壳具有和外泌体相似的直径，直径范围在20~200 nm之间。

作为优选实施方案，所述蛋白质外壳为病毒蛋白质外壳。

作为优选实施方案，所述病毒为假病毒，优选为装甲病毒、慢病毒、腺病毒、逆转录病毒、噬菌体。

作为优选实施方案，所述核酸为用于检测外泌体是否存在或对外泌体进行定量的内参核酸。所述内参核酸为DNA或者RNA或者同时包含DNA和RNA。

作为优选实施方案，所述特异性标志物为外泌体表面含有的抗原。

作为优选实施方案，所述外泌体表面含有的抗原包括CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、MHCI/II、HLA-G、Integrins、Claudins、Tim4中的一种或多种抗原；优选为CD9、CD63、CD81中的一种或多种抗原。

作为优选实施方案，所述类外泌体还包括：标识类外泌体存在的定制位点。所述标识类外泌体存在的定制位点是指在蛋白质外壳表面修饰荧光基团、量子点、金、银或者其他能通过仪器检测、分辨出的标志物。

作为优选实施方案，所述特异性标志物基于化学键的交联反应和/或基于生物活性的交联反应连接在蛋白质外壳的表面。

作为优选实施方案，所述化学键的交联反应包括蛋白质表面氨基和醛基的反应或氨基与羧基的反应、蛋白质表面未被取代的芳基叠氮化物与氨基的反应、蛋白质表面碳化二亚胺与羧基或氢氧基的反应、蛋白质表面酰肼与醛基、酮基、羧基的反应、蛋白质表面亚氨酸酯与氨基的反应、蛋白质表面碘乙酰基与硫氢基的反应、蛋白质表面异氰酸酯与氢氧基、氨基的反应、蛋白质表面马来酰亚胺与硫氢基的反应、蛋白质表面琥珀酰亚胺与氨基的反应、蛋白质表面吡啶基二硫化物与硫氢基的反应、蛋白质表面乙烯基砜与硫氢基的反应中的一种或多种。

作为优选实施方案，所述生物活性的交联反应包括生物素-亲和素反应、免疫亲和反应、免疫沉淀、适配体结合反应中的一种或多种。

本发明还提供所述的类外泌体应用于外泌体提取的参考品和/或标准品。所述类外泌体的作用是模拟外泌体、作为外泌体的参考品和/或标准品。模拟外泌体指的是类外泌体具有与外泌体相似的性状以及可以用提取外泌体的手段提取到类外泌体。类外泌体具有与外泌体相似的性状包括：具有与外泌体相似的大小（直径20-200 nm）；具有外泌体相似的结构：核酸被包裹在结构内部，使得核酸免受核酸酶的影响，更稳定、不易降解；类外泌体表面的抗原来源于外泌体表面的抗原中的一种或者多种；并且可以用提取外泌体的手段提取到类外泌体。

可以用提取外泌体的手段提取到类外泌体的方法包括基于大小的外泌体分离方法，如超高速离心法、密度梯度离心法、超滤法、过滤法、离心柱、色谱法、确定性侧向位移（DLD）、不对称场流（AF4）、表面连续声波（SAW）、弹性黏流体、Dean流等；还包括基于免疫亲和的外泌体捕获技术、沉淀法、种子生长法以及利用了以上任意一个或多个技术进行外泌体捕获的微流控方法。

所述作为外泌体的参考品指的是本发明的类外泌体可用于定性鉴定外泌体的提取成功与否或定量测验外泌体提取效率的标准物质；所述作为外泌体的标准品指的是本发明的类外泌体可以用于外泌体提取过程中涉及的鉴别、检查、含量测定的标准物质。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1，本发明通过人工合成的方法制备一种类外泌体，由于是人工合成，因此可以工业化大规模生产，且不需要额外的分离富集过程，解决了工业化制备外泌体参考品的制备和分离富集难题；此外，这种类外泌体相对于天然的外泌体更稳定，可以在更高的温度下保存，可以解决外泌体运输和保存的问题。

2，本发明开发了一种新的类外泌体，该类外泌体具有与外泌体类似的特征：相似的结构、相似的大小、相似的表面特异性抗原。该类外泌体可以方便地大规模人工合成、易于保存，可以作为外泌体的参考品和/或标准品。该类外泌体可以在-18℃以下长期保存，在2~8℃保存1年以上，可以在室温（25℃）条件下保存3个月以上。

3，相对于专利CN107002075A中涉及的噬菌体作为外泌体的参考品，本发明中类外泌体的结构和功能更接近真实的外泌体，带有外泌体的特异性抗原，结构更复杂，除了适用于静电吸附法、过滤法、沉淀法，还适用于免疫亲和法等其他外泌体提取方法。

附图说明

图1为本发明实施例制备的类外泌体的结构示意图。

图2为本发明实施例7中用不同方法提取外泌体以及类外泌体的对比结果。

图3A为本发明实施例8中装甲病毒来源类外泌体（Bos_LALBA）与外泌体标准品提取的核酸的结果以及相关性拟合图。

图3B为本发明实施例8中慢病毒来源类外泌体（LBD37）与外泌体标准品提取的核酸的结果以及相关性拟合图。

图3C为本发明实施例8中噬菌体来源类外泌体（DUF26）与外泌体标准品提取的核酸的结果以及相关性拟合图。

图4A为本发明实施例8中装甲病毒来源类外泌体与外泌体标准品提取蛋白的结果以及相关性拟合图。

图4B为本发明实施例8中慢病毒来源类外泌体与外泌体标准品提取蛋白的结果以及相关性拟合图。

图4C为本发明实施例8中噬菌体来源类外泌体与外泌体标准品提取蛋白的结果以及相关性拟合图。

图5为本发明实施例9中类外泌体的保存稳定性的曲线图。

图6为本发明实施例9中市售血浆来源的外泌体标准品的保存稳定性的曲线图。

图7为本发明实施例10中对提取的含有定制位点标识的类外泌体的分类和定量的荧光分析图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

CD9购买自NKMAX，商品名：Recombinant human CD9 protein，货号：ATGP2970；

CD81购买自NKMAX，商品名：Recombinant human CD81 protein，货号：ATGP3661；

CD63购买自ORIGENE，商品名：CD63 (NM_001780) Human Recombinant Protein，货号：TP301733；

ExoQuick购买自System Biosciences，商品名: The Original ExoQuick，货号：EXOQ20A-1；

ExoCap 购买自MBL International ，商品名：ExoCap™ Streptavidin CD9/CD63/CD81 Set，货号：MEX-SA123；

qEV购买自IZON，商品名：qEV2 / 70 nm；

exoRNeasy Midi Kit(50)购买自QIAGEN，货号：77900；

ExoDisc™以及ExoDiscovery™购买自LabSpinner，商品名：ExoDisc™-C；商品名：ExoDiscovery™，货号：EX-R2001；

血浆来源的外泌体标准品购买自Novus Biologicals，商品名：Plasma (Human)Exosome Standards，货号：NBP2-49838；

本发明中所有的核酸序列合成自生工生物工程(上海)股份有限公司；

市售装甲病毒购买自厦门致善生物；

所有细胞系购买自ATCC；

大肠杆菌BL21购买自优宝生物；

质粒购买自北京义翘神州科技股份有限公司；

培养基、Lipo2000、IPTG、NHS、EDC、FBS、PBS、EZ-Link™ NHS-Biotin购买自赛默飞世尔；

LB琼脂平板购买自云舟生物；

含卡那霉素的LB培养基购买自生工生物工程(上海)股份有限公司；

Cy5 biotin conjugate购买自AAT Bioquest。

实施例1：包裹核酸的蛋白质外壳的制备（类外泌体原料制备）

购买市售的假病毒作为合成类外泌体的原料，包裹核酸的蛋白质外壳制备可采用现有技术方法，不属于本发明的保护范围，仅作为合成类外泌体的原料之一。

1.设计目标基因

a)本发明目的基因可以是任意基因，在该实施例中，以Bos_LALBA基因为例（该核酸序列人类是没有的，因此人类本身含有的外泌体也不存在该核酸），Bos_LALBA在NCBI上的序列信息为：“NM_174378.2 Bos taurus lactalbumin alpha (LALBA), mRNA”，Bos_LALBA序列为mRNA，其反转录后的cDNA序列如下：

CCACCCAGGCTGAACAGTTAACAAAATGTGAGGTGTTCCGGGAGCTGAAAGACTTGAAGGGCTACGGAGGTGTCAGTTTGCCTGAATGGGTCTGTACCACG（SEQ ID NO:1）

b)可以检测上述目的基因的一组示例引物、探针序列如下：

上游引物：5′-CCACCCAGGCTGAACAGTTA-3′（SEQ ID NO:2）

下游引物：5′-CGTGGTACAGACCCATTCAGG-3′（SEQ ID NO:3）

探针：5′-GAGCTGAAAGACTTGAA-3′（SEQ ID NO:4）

2.将含有目标基因的质粒寄送给厂商，制备假病毒；（以厦门致善生物为例，将含有目标基因的质粒寄送给厦门致善生物即可委托厂商工业化生产装甲病毒）；

3.得到的含有目的基因Bos_LALBA的装甲病毒（也就是含有目的基因Bos_LALBA的蛋白质外壳）可以作为制备类外泌体的原料，进行下一步的制备。

实施例2：包裹核酸的蛋白质外壳的制备（类外泌体原料制备）

采用慢病毒法人工合成包裹核酸的蛋白质外壳作为合成类外泌体的原料，该方法仅为蛋白质包裹核酸的实现途径之一。

具体方法如下：

1.培养293细胞，当293细胞贴壁面积超过培养皿面积一半以上时开始转染慢病毒的质粒；

2.取两个EP管，其中一个EP管中加入100 μL DMEM培养基、0.8 μg含有目的基因的病毒载体核心质粒和等量的病毒包装质粒，另一个EP管中加入100 μL DMEM培养基以及3 μL Lipo2000，静置5 min；

a)本发明目的基因可以是任意基因，在该实施例中，以LBD37基因为例，LBD37在NCBI上的序列信息为：“NM_001354072.1 Glycine max LBD domain-containingtranscription factor (LBD37), mRNA”，LBD37序列为mRNA，其反转录后的cDNA序列如下：

CGAACATCTTCGTCCAGCGATCTTTCGCTCGTTGTTGTACGAGGCATGCGGTCGGATAGTGAACCCGATTTACGGGTCTGTCGGGCTATTATGGTCCGGGAGCTG（SEQ ID NO:5）

b)可以检测上述目的基因的一组示例引物、探针序列如下：

上游引物：5′- CGAACATCTTCGTCCAGCGATCT-3′（SEQ ID NO:6）

下游引物：5′- CAGCTCCCGGACCATAATAGC-3′（SEQ ID NO:7）

探针：5′-TACGAGGCATGCGGTCGGATA-3′（SEQ ID NO:8）

c)病毒包装质粒的比例如下：pMDL:VSVG:REV=10：7：5；

3.将上述两管中的试剂混合在一起，混合均匀，静置18 min；

4.将步骤c）中的试剂加入步骤a）的细胞中，继续培养12个小时（转染）；

5.洗掉细胞培养皿中含有上述试剂的培养基，再加入DMEM完全培养基继续培养；

6. 1、2、3天后分别收集培养上清，并加入DMEM完全培养基继续培养；

7.培养上清中含有包裹了目的基因（LBD37基因）的慢病毒颗粒（也就是包含目的基因的蛋白质外壳）。

实施例3：包裹核酸的蛋白质外壳的制备（类外泌体原料制备）

采用噬菌体法人工合成包裹核酸的蛋白质外壳作为合成类外泌体的原料，该方法仅为蛋白质包裹核酸的实现途径之一。

具体方法如下：

1.由上海生工合成包含Qβ噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点以及目的基因；

a)本发明目的基因可以是任意基因，在该实施例中，以DUF26基因为例，DUF26在NCBI上的序列信息为：“NM_113095.2 Arabidopsis thaliana cysteine-rich repeatsecretory-like protein (DUF26) (AT3G21990), mRNA”，DUF26序列为mRNA，其反转录后的cDNA序列如下：

TCATGTTCCAGTGTCGCGGCGACTCCTACTGGTCCAAGTGCCCCCCTTGCATTAGCACCGCTGTCTCTGGGCTTCGTAGGAGA（SEQ ID NO:9）

b)可以检测上述目的基因的一组示例引物、探针序列如下：

上游引物：5′-TCATGTTCCAGTGTCGCGG -3′（SEQ ID NO:10）

下游引物：5′-TCTCCTACGAAGCCCAGAGA -3′（SEQ ID NO:11）

探针：5′-TCCTACTGGTCCAAGT-3′（SEQ ID NO:12）

2.将上述基因亚克隆到pET-28a(+)质粒中，构建成重组表达质粒，命名为DUF26-pET-28a(+)质粒；

3.将重组质粒DUF26-pET-28a(+)转入大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布至卡那霉素(终浓度为50 mg/L)的LB琼脂平板，37 ℃培养过夜；

4.过夜后挑取单菌落，接种到5 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜；

5.取200 µL活化后的菌液于20 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养至OD600约为0.6；

6.加入终浓度0.8 mmol/L的IPTG诱导表达12 h，4 ℃、11000 r/min离心10 min收集包裹了目的基因（DUF26基因）的噬菌体颗粒（也就是包含目的基因的蛋白质外壳）。

实施例4：类外泌体的制备和定量（化学交联法）

1.按照实施例1的方法获得蛋白质外壳包裹的核酸；

2.以实施例1中所述的装甲病毒为例，装甲病毒的结构为蛋白质外壳包裹着目的基因（Bos_LALBA基因）；

3.在装甲病毒的蛋白质外壳上通过化学交联的方法，通过蛋白质外壳上的羧基与抗原上的氨基在NHS、EDC的催化下，氨基与羧基之间发生化学交联，从而将抗原交联在装甲病毒的蛋白质外壳上；

a)蛋白质基于化学键的交联方法有很多，这里仅以氨基与羧基交联作为一个例子；

b)这里在装甲病毒的蛋白质外壳上交联CD9、CD63、CD81抗原；（抗原可自定义，以上抗原仅为一个实施例）

4.通过上述步骤合成了类外泌体，参见图1，为合成的类外泌体的结构示意图。将合成的类外泌体用ddPCR对包裹的核酸进行定量。用于定量的引物，探针序列如下（引物、探针序列可自定义，以下引物探针序列仅为一个实例）：

上游引物：5′-CCACCCAGGCTGAACAGTTA-3′（SEQ ID NO:2）

下游引物：5′-CGTGGTACAGACCCATTCAGG-3′（SEQ ID NO:3）

探针：5′-GAGCTGAAAGACTTGAA-3′（SEQ ID NO:4）

5.并用TE溶液（1M Tris，0.5M EDTA，Ph 7.2~8.5）进行稀释，将类外泌体中Bos_LALBA的浓度定量稀释到50000 Copies/mL。（可任意浓度，这里以50000 Copies/mL为例）

实施例5：类外泌体的制备和定量（基于生物活性的交联法）

1.以实施例2中所述的慢病毒为例，慢病毒的结构为蛋白质外壳包裹着目的基因（LBD37基因），在慢病毒的蛋白质外壳上通过蛋白质外壳上的碳二亚胺与亲和素上的羧基之间发生化学交联，从而将亲和素交联在慢病毒的蛋白质外壳上；

2.将EZ-Link™ NHS-Biotin按照说明书修饰到EpCAM、TSG101、HSP90抗原上；（抗原可自定义，以上抗原仅为一个实施例）

3.通过慢病毒上的亲和素与抗原上的生物素（biotin），通过基于生物活性的交联：生物素-亲和素反应，将抗原与慢病毒连接在一起；

4.通过上述步骤合成了类外泌体，结构如图1所示，并将合成的类外泌体用ddPCR对包裹的核酸进行定量。用于定量的引物，探针序列如下（引物、探针序列可自定义，以下引物探针序列仅为一个实例）：

上游引物：5′- CGAACATCTTCGTCCAGCGATCT-3′（SEQ ID NO:6）

下游引物：5′- CAGCTCCCGGACCATAATAGC-3′（SEQ ID NO:7）

探针：5′-TACGAGGCATGCGGTCGGATA-3′（SEQ ID NO:8）

5.并用TE溶液（1M Tris，0.5M EDTA，Ph 7.2~8.5）进行稀释，将类外泌体中LBD37基因的浓度定量稀释到50000 Copies/mL。（可任意浓度，这里以50000 Copies/mL为例）

实施例6：类外泌体的制备和定量（定制位点）

1.以实施例3中所述的噬菌体为例，噬菌体的结构为蛋白质外壳包裹着目的基因（DUF26基因）；

2.在噬菌体的蛋白质外壳上通过蛋白质外壳上的碳二亚胺与亲和素上的羧基之间发生化学交联，从而将亲和素交联在噬菌体的蛋白质外壳上；

3.在噬菌体的蛋白质外壳上通过化学交联的方法，通过蛋白质外壳上的氨基与抗原上的羧基在NHS、EDC的催化下，氨基与羧基之间发生化学交联，从而将抗原交联在噬菌体的蛋白质外壳上；

a)这里在噬菌体的蛋白质外壳上交联Claudins、Tim4、ALIX抗原；（抗原可自定义，以上抗原仅为一个实施例）；

4.通过噬菌体上的亲和素与荧光染料Cy5 biotin conjugate上的生物素（biotin），通过基于生物活性的交联：生物素-亲和素反应，将荧光染料与噬菌体连接在一起；（Cy5仅是定制位点的一个实施例，可以选择其他荧光基团、量子点、金、银或者其他能通过仪器检测、分辨出的物质作为定制位点）

5.通过上述步骤合成了含有定制位点的类外泌体，并将合成的类外泌体用ddPCR对包裹的核酸进行定量。用于定量的引物，探针序列如下（引物、探针序列可自定义，以下引物探针序列仅为一个实例）：

上游引物：5′-TCATGTTCCAGTGTCGCGG -3′（SEQ ID NO:10）

下游引物：5′-TCTCCTACGAAGCCCAGAGA -3′（SEQ ID NO:11）

探针：5′-TCCTACTGGTCCAAGT-3′（SEQ ID NO:12）

6.并用TE溶液（1M Tris，0.5M EDTA，Ph 7.2~8.5）进行稀释，将类外泌体中DUF26的浓度定量稀释到50000 Copies/mL；（可任意浓度，这里以50000 Copies/mL为例）

7.该实施例中的类外泌体可以通过对荧光染料的检测实现类外泌体的定位以及定量。

实施例7：用不同提取外泌体的方法提取类外泌体

取实施例4制备的Bos_LALBA的总量为500 Copies的类外泌体溶于1 mL PBS中制备成样本1（共制备成30个类外泌体中Bos_LALBA的总量为500 Copies的样本1）；

取实施例5制备的LBD37基因的总量为500 Copies的类外泌体溶于1 mL PBS中制备成样本2（共制备成30个类外泌体中LBD37基因的总量为500 Copies的样本2）；

取实施例6制备的DUF26基因基因的总量为500 Copies的类外泌体溶于1 mL PBS中制备成样本3（共制备成30个类外泌体中DUF26基因7基因的总量为500 Copies的样本3）；

将购买的血浆来源的外泌体标准品用ddPCR对其含有的内参基因GAPDH进行定量，取GAPDH总量为500 Copies的血浆来源的外泌体标准品溶于1 mL PBS中制备成样本4（共制备成30个外泌体中GAPDH的总量为500 Copies的样本4）。

Bos_LALBA、LBD37、DUF26为类外泌体的内参基因，GAPDH为市售的血浆来源的外泌体标准品的内参基因，可以通过内参基因的量的含量来判断外泌体的提取效率，因为外泌体被破坏后包裹的核酸会游离出来，这些游离的核酸不稳定会很快被降解，而如果外泌体没被破坏的话，这些核酸在外泌体内部，可以免于降解。

利用不同的外泌体提取方法对样本1、2、3中的类外泌体以及样本4中的血浆来源的外泌体标准品进行提取，每种方法5个重复：

超高速离心法：超高速离心法提取外泌体的操作过程参照文献《Isolation ofExtracellular Vesicles by Ultracentrifugation》（DOI: 10.1007/978-1-4939-7253-1_3,）;

沉淀法：沉淀法提取外泌体的操作过程参照ExoQuick的说明书；

磁珠法：磁珠法提取外泌体的操作过程参照ExoCap的说明书；

色谱法：色谱法提取外泌体的操作过程参照qEV的说明书；

柱提法：柱提法提取外泌体的操作过程参照exoRNeasy Midi Kit(50)的说明书；

微流控芯片（过滤法）：微流控芯片（过滤法）提取外泌体的操作过程参照ExoDisc™以及ExoDiscovery™的说明书；

参见图2，为不同方法提取外泌体以及类外泌体的对比结果。图2结果表明：可以提取外泌体的方法都可以用于类外泌体的提取。

实施例8：类外泌体作为外泌体提取的参考品和/或标准品

取实施例4制备的Bos_LALBA的总量为5、10、50、100、500、1000 Copies的类外泌体分别溶于1 mL PBS中制备成样本A1、B1、C1、D1、E1、F1、G1；

取实施例5制备的LBD37的总量为5、10、50、100、500、1000 Copies的类外泌体分别溶于1 mL PBS中制备成样本A2、B2、C2、D2、E2、F2、G2；

取实施例6制备的DUF26的总量为5、10、50、100、500、1000 Copies的类外泌体分别溶于1 mL PBS中制备成样本A3、B3、C3、D3、E3、F3、G3；

取GAPDH的总量为5、10、50、100、500、1000 Copies的市售的血浆来源的外泌体标准品分别溶于1 mL PBS中制备成样本a、b、c、d、e、f、g。

用超高速离心法提取外泌体，超高速离心法提取外泌体的操作过程参照文献《Isolation of Extracellular Vesicles by Ultracentrifugation》（DOI: 10.1007/978-1-4939-7253-1_3,）。

用ddPCR以及化学发光分别从核酸和蛋白角度对类外泌体和市售的血浆来源的外泌体标准品进行定量，并做相关性分析，核酸的定量和相关性拟合结果参见图3A-图3C、蛋白的定量和相关性拟合结果参见图4A-图4C。图3A-图3C中的点的横坐标为提取到的各种类外泌体所含内参核酸的拷贝数，点的纵坐标为提取到的血浆来源的天然存在的外泌体GAPDH基因的拷贝数，图中的直线为各个点之间的相关性拟合直线，反应了提取到的不同浓度的各种类外泌体所含内参核酸的拷贝数与提取到的不同浓度的血浆来源的天然存在的外泌体GAPDH基因的拷贝数的对应关系。图4A-图4C中的点的横坐标为提取到的各种类外泌体所含特异性标志物CD63的发光值，点的纵坐标为提取到的血浆来源的天然存在的外泌体的CD63抗原的发光值，图中的直线为各个点之间的相关性拟合直线，反应了提取到的不同浓度的各种类外泌体所含特异性标志物的发光值与提取到的不同浓度的血浆来源的天然存在的外泌体的CD63抗原的发光值的对应关系。

图3A的结果从核酸角度证明了实施例4制备的类外泌体（装甲病毒来源类外泌体、化学交联法）经过提取后内参核酸Bos_LALBA和提取到的血浆来源的天然存在的外泌体GAPDH基因的拷贝数存在着非常好的对应关系，两者的相关系数（Pearson r）>0.999，非常接近于1，且相关系数的结果经过P值的双侧检验，P值<0.0001（远小于0.05），因此结果具有显著性差异，是可信的。图3B的结果从核酸角度证明了实施例5制备的类外泌体（慢病毒来源类外泌体、基于生物活性的交联法）经过提取后内参核酸LBD37和提取到的血浆来源的天然存在的外泌体GAPDH基因的拷贝数存在着非常好的对应关系，两者的相关系数（Pearsonr）>0.999，非常接近于1，且相关系数的结果经过P值的双侧检验，P值<0.0001（远小于0.05），因此结果具有显著性差异，是可信的。图3C的结果从核酸角度证明了实施例6制备的类外泌体（噬菌体来源类外泌体、含有定制位点）经过提取后内参核酸DUF26和提取到的血浆来源的天然存在的外泌体GAPDH基因的拷贝数存在着非常好的对应关系，两者的相关系数（Pearson r）>0.999，非常接近于1，且相关系数的结果经过P值的双侧检验，P值<0.0001（远小于0.05），因此结果具有显著性差异，是可信的。

图4A的结果从蛋白角度证明了实施例4制备的类外泌体（装甲病毒来源类外泌体、化学交联法）经过提取后特异性标志物CD63和提取到的血浆来源的天然存在的外泌体的CD63抗原的发光值存在着非常好的对应关系，两者的相关系数（Pearson r）>0.999，非常接近于1，且相关系数的结果经过P值的双侧检验，P值<0.0001（远小于0.05），因此结果具有显著性差异，是可信的。图4B的结果从蛋白角度证明了实施例5制备的类外泌体（慢病毒来源类外泌体、基于生物活性的交联）经过提取后特异性标志物CD63和提取到的血浆来源的天然存在的外泌体的CD63抗原的发光值存在着非常好的对应关系，两者的相关系数（Pearsonr）>0.999，非常接近于1，且相关系数的结果经过P值的双侧检验，P值<0.0001（远小于0.05），因此结果具有显著性差异，是可信的。图4C的结果从蛋白角度证明了实施例6制备的类外泌体（噬菌体来源类外泌体、含有定制位点）经过提取后特异性标志物CD63和提取到的血浆来源的天然存在的外泌体的CD63抗原的发光值存在着非常好的对应关系，两者的相关系数（Pearson r）>0.999，非常接近于1，且相关系数的结果经过P值的双侧检验，P值<0.0001（远小于0.05），因此结果具有显著性差异，是可信的。

因此，各种类外泌体的提取效果与市售的外泌体标准品无论从蛋白还是从核酸角度，结果都高度一致，具有非常好的对应关系，因此类外泌体可以作为外泌体的参考品和/或标准品。

实施例9：类外泌体的稳定性

按照实施例4、5、6所述的方法，制备一批Bos_LALBA、LBD37、DU145的总量为5000Copies的类外泌体参考品分别在-18℃、4℃、25℃保存1年，每个月取出3个温度下保存的类外泌体用ddPCR进行定量检测，并以初始的Bos_LALBA、LBD37、DU145的总量为对照计算类外泌体的保存情况。

将购买的血浆来源的外泌体标准品用ddPCR对其含有的内参基因GAPDH进行定量，取GAPDH总量为5000 Copies的血浆来源的外泌体标准品分别在-18℃、4℃、25℃保存1个月，在第0、1、3、5、7、10、15、30天的时候取出3个温度下保存的血浆来源的外泌体标准品进行定量检测，并以初始的GAPDH的总量为对照计算外泌体的保存情况。

结果如图5、图6所示，图5结果显示：对于类外泌体-18℃和4℃保存1年仍然有80%以上的类外泌体没有破坏，稳定存在；类外泌体在室温（25℃）保存3个月仍然有80%以上的类外泌体没有破坏，稳定存在。图6结果显示：对于市售的血浆来源的外泌体标准品，-18℃保存7天左右，4℃保存1天左右就有超过20%的外泌体被破坏，如果放在室温（25℃）的条件下1天内就有超过60%的外泌体被破坏。

综上，本发明中的类外泌体相对于常规的外泌体更加稳定，可以解决现在外泌体面临的保存和运输问题。

实施例10：对含有定制位点标识的类外泌体的分类和定量

按照实施例6所述方法制备三种含有定制位点标识的类外泌体：FAM荧光标识的类外泌体、VIC荧光标识的类外泌体以及同时标识了FAM和VIC荧光的类外泌体。

在1 mL血浆中分别加入1500个FAM荧光标识的类外泌体、850个VIC荧光标识的类外泌体以及40个同时标识了FAM和VIC荧光的类外泌体。

混合均匀后用ExoQuick对血浆中的外泌体进行提取；

将提取的外泌体用20 μL水重悬，用液滴生成器生成20000个液滴；

将重悬液生成液滴后用改装过的QX200 Droplet Digital PCR System对液滴内的荧光进行检测（共检测了11471个液滴），并用QuantaSoft™对检测到的荧光进行分析，结果如图7所示：提取血浆外泌体的过程中类外泌体也被提取了出来；标识的类外泌体可以被相应的仪器检测；FAM荧光标识的类外泌体回收到了572个，VIC荧光标识的类外泌体回收到了313个，同时标识了FAM和VIC荧光的类外泌体回收到了14个（图7中每一个点代表一个检测结果，根据点所在的象限和位置可以对外泌体的数量和类型进行定量和分类）。计算可知FAM荧光标识的类外泌体的回收率为66.5%，VIC荧光标识的类外泌体的回收率为64.1%，同时标识了FAM和VIC荧光的类外泌体的回收率为60.9%，综合上面的结果可以计算出ExoQuick对血浆中的外泌体的回收率在65%左右。

综上，在作为外泌体的参考品和标准品时，本发明的类外泌体除了可以通过内参基因和表面抗原间接的对外泌体进行定量，还可以通过统计标识的类外泌体的个数对外泌体进行直接的定量。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 上海思路迪医学检验所有限公司

<120> 一种类外泌体及其作为参考品、标准品的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 牛(Bos taurus)

<400> 1

ccacccaggc tgaacagtta acaaaatgtg aggtgttccg ggagctgaaa gacttgaagg 60

gctacggagg tgtcagtttg cctgaatggg tctgtaccac g 101

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 2

ccacccaggc tgaacagtta 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

cgtggtacag acccattcag g 21

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 4

gagctgaaag acttgaa 17

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 5

cgaacatctt cgtccagcga tctttcgctc gttgttgtac gaggcatgcg gtcggatagt 60

gaacccgatt tacgggtctg tcgggctatt atggtccggg agctg 105

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 6

cgaacatctt cgtccagcga tct 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 7

cagctcccgg accataatag c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 8

tacgaggcat gcggtcggat a 21

<210> 9

<211> 83

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 9

tcatgttcca gtgtcgcggc gactcctact ggtccaagtg ccccccttgc attagcaccg 60

ctgtctctgg gcttcgtagg aga 83

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 10

tcatgttcca gtgtcgcgg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 11

tctcctacga agcccagaga 20

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 12

tcctactggt ccaagt 16

Claims

1.一种类外泌体，其特征在于：包括蛋白质外壳、特异性标志物以及核酸，所述核酸被包裹在蛋白质外壳内部，所述特异性标志物位于蛋白质外壳的表面，所述蛋白质外壳的直径范围在20～200nm之间；所述核酸为用于检测外泌体是否存在或对外泌体进行定量的内参核酸。

2.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述蛋白质外壳用于保护内部的核酸，避免核酸被降解。

3.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述蛋白质外壳为病毒蛋白质外壳。

4.如权利要求3所述的一种类外泌体，其特征在于：所述病毒为假病毒。

5.如权利要求4所述的一种类外泌体，其特征在于：所述病毒为装甲病毒、逆转录病毒、腺病毒、噬菌体。

6.如权利要求5所述的一种类外泌体，其特征在于：所述逆转录病毒为慢病毒。

7.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述特异性标志物为外泌体表面含有的抗原。

8.如权利要求7所述的一种类外泌体，其特征在于：所述抗原为CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、MHC I/II、HLA-G、Integrins、Claudins、Tim4中的一种或多种。

9.如权利要求8所述的一种类外泌体，其特征在于：所述抗原为CD9、CD63、CD81中的一种或多种。

10.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于，所述类外泌体还包括：标识类外泌体存在的定制位点；所述定制位点是指在所述蛋白质外壳表面修饰荧光基团、量子点、金、银或者其他能通过仪器检测、分辨出的标识物。

11.如权利要求1所述的一种类外泌体，其特征在于：所述特异性标志物基于化学键的交联反应和/或基于生物活性的交联反应连接在蛋白质外壳的表面。

12.如权利要求11所述的一种类外泌体，其特征在于：所述化学键的交联反应包括蛋白质表面氨基和醛基的反应或氨基与羧基的反应、蛋白质表面未被取代的芳基叠氮化物与氨基的反应、蛋白质表面碳化二亚胺与羧基或氢氧基的反应、蛋白质表面酰肼与醛基、酮基、羧基的反应、蛋白质表面亚氨酸酯与氨基的反应、蛋白质表面碘乙酰基与硫氢基的反应、蛋白质表面异氰酸酯与氢氧基、氨基的反应、蛋白质表面马来酰亚胺与硫氢基的反应、蛋白质表面琥珀酰亚胺与氨基的反应、蛋白质表面吡啶基二硫化物与硫氢基的反应、蛋白质表面乙烯基砜与硫氢基的反应中的一种或多种。

13.如权利要求11所述的一种类外泌体，其特征在于：所述生物活性的交联反应包括生物素-亲和素反应、免疫亲和反应、免疫沉淀、适配体结合反应中的一种或多种。

14.权利要求1-13任一项所述的类外泌体应用于外泌体提取的参考品和/或标准品。