CN113564280A

CN113564280A - 一种用于检测禽腺病毒i群12个血清型的raa引物及其检测方法

Info

Publication number: CN113564280A
Application number: CN202110889250.5A
Authority: CN
Inventors: 赵鹏; 高源�; 王一新; 常爽
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2021-08-04
Filing date: 2021-08-04
Publication date: 2021-10-29

Abstract

本发明公开了一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法，属于禽病毒检测技术领域。用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物和探针组合中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.3所示。本发明可以同时检测12种不同血清型的FadV；而且本发明仅需必要的试剂及等温扩增设备，操作简便，特别适用于基层养殖场的鸡群大规模检测，从而有利于实现对于鸡群FadV的净化。

Description

一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及禽病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是一种DNA病毒，属于腺病毒科、腺病毒属。FAdV根据抗原性的差异被分为3个群，其中I群FAdV致病力最强，造成的经济损失最大。I群FAdV又分为5个亚群(FAdV A-FAdV E)、12个血清型(FAdV-1至7，FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9至11)。I群FAdV可引起鸡的疾病主要有包涵体肝炎(IBH)、心包积液综合征(HPS)和肌胃糜烂(GE)等病症。流行病学调查显示，近年来FAdV流行呈现多种血清型混合感染的特点，其中，血清4型FAdV(FAdV-4)、血清8a型FAdV(FAdV-8a)和血清8b型FAdV(FAdV-8b)是影响我国养禽业最为严重的三个血清型。

目前，对于I群禽腺病毒的诊断，主要方法有以下几种：一是采用鸡胚或者细胞进行病原分离。可采集病毒含量高的组织及排泄物，如病变肝、肾、法氏囊、粪便等部位的作为病料，将被感染的病料组织制成悬液接种到SPF鸡胚中，少数鸡胚在接种后48h开始发育停滞、胚体出血、出现死亡，大多数在3～6d内死亡，部分鸡胚在7d后死亡；细胞培养作为另一种培养方式，主要是将禽腺病毒接种到鸡肝癌细胞或原代肾细胞进行分离鉴定。二是采用琼脂凝胶沉淀试验。本试验在兽医临床上有广泛应用，适用于对感染FAdV鸡群进行抗体检查。先分离病鸡血清，37℃温箱培养24h以上，抗原、抗体特异性结合，形成抗原-抗体的复合物。结果判定时以是否观察到白色沉淀线为标准。三是酶联免疫吸附试验，该试验可检抗原或抗体，进行精确测定，目前ELISA用于禽腺病毒的检测已有不少研究。此外，聚合酶链式反应(PCR)技术和实时荧光定量PCR技术也被广泛应用于FAdV的病原学检测。通常取病禽的肝脏，提取病毒基因组后使用PCR仪器进行PCR反应，大量扩增目的基因片段，进行FAdV检测。目前已经建立了许多针对FAdV的PCR方法(袁万哲，2016)，并且扩增后，可通过限制性内切酶技术进行酶切，实现了对FAdV I群12个血清型的参考毒株进行区分的目的。综合来看，常规检测方法如ELISA、琼脂扩散试验的成本低、操作简单，但缺点是耗费时间较长，且敏感性较差，敏感性低于中和试验。PCR和荧光定量PCR技术灵敏度较高，但对试验仪器和操作人员提出了较高要求，不适用于临床现场的大规模检测。

重组酶介导扩增-侧向流层析技术(Recombinase-aid Amplification Lateralflow dipstick，RAA-LFD)是在重组酶介导扩增技术(Recombinase-aid Amplification)的基础上，将反应下游引物5’端用生物素(biotin)进行标记，并在反应体系中加入一个长度46bp～52bp的nfo探针，该探针的5’端用6-羧基荧光素(FAM)标记，距离5’端超过30bp的位置用四氢呋喃(THF)残基标记，3’端被磷酸化阻断，距四氢呋喃「THF」残基15bp以上。反应后形成带有双标记产物，用包被生物素和FAM抗体的侧流试纸条(Lateral flow dipstick，LFD)实现现场快速检测。RAA-LFD具有较高的灵敏度，可实现结果可视化，且基本无额外购买其他任何辅助装备，仅需39℃恒温装置即可，极端条件下采用一个保温杯即可完成反应得出试验结果，适合适合病原体现场快速筛查，尤其适合实验设备简陋地区和应急情况，该技术目前已经在多种病原检测领域中获得广泛应用。

专利CN112746135A公开了一种基于RAA技术检测I群4型禽腺病毒的引物探针组合；专利CN107385110A公开了一种用于检测禽腺病毒血清4型的RPA引物；上述专利是基于RAA技术在I群4型禽腺病毒的检测中具有较好的灵敏性和特异性，但是，其只能检测单一血清型，无法实现对禽腺病毒I群12个血清型的同时检测。

专利CN106868212A公开了一种I亚群禽腺病毒通用型PCR检测引物，但其只对I亚群禽腺病毒A种、C种、D种和E种4个种6种血清型进行了通用性验证，仍未实现对禽腺病毒I群12个血清型的同时检测。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物和探针组合，所述RAA引物和探针组合中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示，具体如下：

上游引物：5’-AGGTCCTGTTCGAAGAGGATDCGCGTGGTR-3’；(SEQ ID NO.1)

下游引物：5’-[Biotin]GAHTACGTCAGCAAAAACATCGCVGCCAA -3’；(SEQ ID NO.2)

探针：TGTTGGTGGCGAAGGCGCCGTAGAGGGCGT[FAM-dT]「THF」C[BHQ1-dT]GAGCATTTGGAGATGG-C3spacer；(SEQ ID NO.3)

说明：上述引物和探针中，D＝A/G/T，R＝A/G，H＝A/C/T，V＝A/C/G。

本发明的第二方面，提供上述RAA引物和探针组合在制备检测禽腺病毒I群12个血清型的试剂或试剂盒中的应用。

本发明的第三方面，提供一种检测禽腺病毒I群12个血清型的试剂盒，所述试剂盒包含上述的RAA引物和探针组合。

进一步的，所述试剂盒中还包括：RAA反应试剂和侧流层析试纸条。

优选的，所述RAA反应试剂包括：A buffer和B buffer。

本发明的第四方面，提供一种利用上述试剂盒检测禽腺病毒I群12个血清型的方法，包括如下步骤：

提取待测样品DNA作为模板，利用试剂盒中的RAA引物和探针组合进行RAA扩增，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测。

优选的，RAA扩增的反应体系为：A buffer 40.9μL；B buffer 2.5μL；上游引物2μL；下游引物2μL；探针0.6μL；模板2μL。

优选的，RAA扩增的条件为：39℃恒温下反应8-15min。

优选的，采用侧流层析试纸条对RAA扩增产物进行检测的方法为：将RAA-LFD扩增产物滴加到侧流层析试纸条样品垫上，然后将侧流层析试纸条插入到含有200μL缓冲液的EP管中，3min后观察结果。

本发明的有益效果：

本发明设计了针对12种不同血清学FAdV的引物和探针，建立了RAA-LFD的FAdV检测方法。本方法的检测的灵敏度可达100个copies/μl，试验的重复性好、准确率高，大大提高了检测效率。并且，由于该方法设计的靶位点位于12个不同血清型的FAdV基因组，因此，该方法可以同时检测12种不同血清型的FAdV。此外，此方法对设备要求低，既可以在实验室应用，又可以现场操作；既可以用来检测鸡群FAdV的感染，又可以检测禽用弱毒疫苗中的FAdV污染情况。

附图说明

图1：本发明针对FadV的12种血清型的RAA-LFD方法灵敏度检测；图中，A-L分别为阳性标准品FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、FAdV-11RAA-LFD检测方法灵敏度；1为各阳性标准品的10²copies/μL；2为阴性对照。

图2：针对FAdV的12种血清型的PCR方法灵敏度检测；图中，A-L分别为阳性标准品FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、FAdV-11的普通PCR方法灵敏度；M：2000DNA Marker；1-7分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copies/μL阳性标准品；8为阴性对照。

图3：本发明的特异性检测结果；图中，1：FAdV；2：ALV-A；3:ALV-J；4:CIAV；5:MDV；6:REV。

图4：利用本发明的RAA-LFD方法检测疫苗中污染FadV；图中，1-6分别为10⁴TCID₅₀/1000羽份、10³TCID₅₀/1000羽份、10²TCID₅₀/1000羽份、10TCID₅₀/1000羽份、1TCID₅₀/1000羽份、0.1TCID₅₀/1000羽份；7为PBS空白对照；8为阴性对照。

图5：普通PCR方法检测疫苗中污染FadV；图中，1-6分别为10⁴TCID₅₀/1000羽份、10³TCID₅₀/1000羽份、10²TCID₅₀/1000羽份、10TCID₅₀/1000羽份、1TCID₅₀/1000羽份、0.1TCID₅₀/1000羽份；7为PBS空白对照；8为阴性对照。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所介绍的，I群FAdV致病力最强，造成的经济损失最大。I群FAdV又分为5个亚群(FAdV A-FAdV E)、12个血清型(FAdV-1至7，FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9至11)。现有技术中对于FadV的检测主要集中于血清4型FAdV(FAdV-4)、血清8a型FAdV(FAdV-8a)和血清8b型FAdV(FAdV-8b)。但对于鸡群FadV的净化而言，若无法对I群FadV的12个血清型同时进行检测，就会容易造成漏检。

专利CN106868212A公开了一种I亚群禽腺病毒通用型PCR检测引物，其宣称在理论上可以对I亚群禽腺病毒12个血清型病毒均可扩增出494bp产物。但是，其仅验证了6种血清型的检测结果；而且所采用的方法为常规PCR方法，结果验证需要进行凝胶电泳分析，这种方法耗时长、操作复杂、对仪器设备要求高，并无适用于基层养殖场的鸡群大规模检测。

基于此，本发明根据RAA-LFD方法对引物和探针设计的要求，在12个不同血清型FAdV参考序列的保守区域设计一对引物和探针。其中，所设计的上游引物序列为：5’-AGGTCCTGTTCGAAGAGGATDCGCGTGGTR-3’，下游引物序列为：5’-[Biotin]GAHTACGTCAGCAAAAACATCGCVGCCAA-3’，该对引物可以扩增不同血清型FAdV基因组的152bp片段；所设计的探针序列为TGTTGGTGGCGAAGGCGCCGTAGAGGGCGT[FAM-dT]「THF」C[BHQ1-dT]GAGCATTTGGAGATGG-C3spacer。单管反应体系为：反应干粉1管，A Buffer(40.9μL)，上游引物(2.0μL)，下游引物(2.0μL)，探针(0.6μL)，样本(2.0μL)，B Buffer(2.5μL)，反应总体系为50μL。扩增体系配置完成后，充分振荡混匀，离心完毕后在39℃水浴下反应8-15min后，在一次性核酸试纸条上滴加10μL RAA扩增产物，将试纸条插入含有100μL缓冲液的EP管中，3min后观察结果。当出现2条红色带时(一条在质控区，另一条在测试区)为阳性，说明样品中含有待检测的核酸片段；如果只出现一条红色带(在质控区)，则为阴性，说明其中不含有待检测片段。

本发明可以同时检测12种不同血清型的FadV；而且本发明仅需必要的试剂及等温扩增设备(如水浴锅)，操作简便，特别适用于基层养殖场的鸡群大规模检测，从而有利于实现对于鸡群FadV的净化。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；D.L.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。

本发明中所使用的RAA核酸扩增试剂盒购自于杭州众测生物科技有限公司。

实施例1：RAA-LFD检测方法的优化与建立

1.RAA引物与探针的设计

RAA方法整个扩增过程均在常温且恒温条件下进行。引物和探针的设计是该方法的关键，直接影响到方法的有效性、特异性与灵敏度。

在引物设计方面，RAA方法的一般要求为：(1)引物长度：30～36bp；(2)GC含量介于40％～60％；(3)避免引物二聚体以及发卡结构；(4)扩增产物大小100～200bp最佳，建议不超过500bp。

但本发明的设计目标是对FadV的12种不同血清型同时进行检测，其能够用来作为靶点的区域极为局限，这对于RAA引物设计而言是十分困难的。为解决这一难点，本发明在满足RAA引物设计一般要求的的基础上，还重点从以下方面进行了考虑：

(1)靶标区域选择：

本发明选择FadV的DNA聚合酶基因的作为靶标区域进行RAA引物设计。该基因编码病毒的DNA聚合酶，该酶以病毒亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA，在FadV复制中发挥重要功能，在FadV的12种不同血清型中均十分保守。结合RAA引物设计要求，最终确定DNA聚合酶基因的1277-1428bp为RAA引物扩增区域，扩增长度为152bp。

(2)设计“简并引物”：

简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基序列可能性引物的混合物。简并度越低，产物特异性越强；简并度越高，产物灵敏度越好。尽管DNA聚合酶在不同血清型的FadV之间同源性较高，但每个位点也有少许区别。为了增强方法的灵敏度，本方案在引物中引入了“简并引物”，核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号外还出现如D、R、H、V等其它字母(其中D＝A/G/T，R＝A/G，H＝A/C/T，V＝A/C/G)。需要注意的是，设计引物时应尽量选择简并性小的氨基酸，并避免引物3’末端简并。

最终所设计的上游引物序列为：5’-AGGTCCTGTTCGAAGAGGATDCGCGTGGTR-3’，下游引物序列为：5’-[Biotin]GAHTACGTCAGCAAAAACATCGCVGCCAA-3’。

在探针的设计方面，探针设计要求主要包括：(1)一个碱基核苷酸类似位点，例如四氢呋喃(THF)；(2)一个荧光基团，以及一个猝灭基团，分别位于THF两侧；(3)3’端修饰(常用C3-spacer)，阻断探针延伸；(4)修饰基团必须位于胸腺嘧啶上，且理想的探针位置通常局限于两个胸腺嘧啶之间的核苷酸少于5个的序列。

由上述要求可以看出由于探针不仅对序列长度、G/C含量有要求外，对一些确定的碱基类型、修饰类型及其在序列本身位置有要求，因此我们在探针筛选过程中初筛只能通过阅读碱基进行定位。由于本方案在探索最佳引物、探针浓度，以及最佳反应温度时使用的实验仪器为杭州众测生物科技有限公司生产的荧光基因检测仪，因此荧光修饰基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1。探针的修饰方法包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数17bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基C，碱基C用四氢呋喃残基替换；最终确定探针序列为：TGTTGGTGGCGAAGGCGCCGTAGAGGGCGT[FAM-dT]「THF」C[BHQ1-dT]GAGCATTTGGAGATGG-C3spacer。

2.RAA-LFD检测体系的优化

在优化设计得到RAA引物与探针之后，本发明进一步对RAA-LFD检测体系进行了优化，具体为：

(1)RAA-LFD引物探针浓度筛选：

配制反应液：在离心管中分别加入A buffer 40.9μL，B buffer 2.5μL，模板2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，探针0.6μL(引物探针浓度分别为1μM、5μM、10μM、20μM、50μM)，充分混匀，得混匀后的反应液。将混匀的反应管放入恒温荧光基因检测仪中，设定反应温度39℃，反应时间10min。根据检测仪器中的阳性判定方法，按照有无明显扩增曲线判断阴阳性。检测结果显示，引物探针浓度为0.5μM时，扩增曲线的荧光值较高，出峰时间较早，因此本实验选择0.5μM作为引物探针浓度。

	浓度1	浓度2	浓度3	浓度4	浓度5
						上游引物	0.1μM	0.25μM	0.5μM	1μM	2μM
下游引物	0.1μM	0.25μM	0.5μM	1μM	2μM
						探针	0.1μM	0.25μM	0.5μM	1μM	2μM

(2)RAA-LFD鉴别方法扩增时间优化：

配制反应液，体系如上。将混匀的反应管放入恒温荧光基因检测仪中，分别设定反应温度38℃、39℃、40℃、41℃，反应时间10min。根据检测仪器中的阳性判定方法，按照有无明显扩增曲线判断阴阳性。检测结果显示，反应温度为39℃时，扩增曲线的荧光值较高，出峰时间较早，因此本实验选择39℃作为反应温度。

通过对RAA-LFD检测方法反应条件和体系优化后，最终确定RAA-LFD检测方法最佳反应体系条件为：引物、探针浓度均为0.5μM，39℃反应10min。

实施例2：RAA-LFD检测方法的方法学考察

1、灵敏度考察：

以12种不同血清型FAdV的DNA为模板进行PCR扩增，上游引物为：5’-AGGTCCTGTTCGAAGAGGATDCGCGTGGTR-3’，下游引物为5’-GAHTACGTCAGCAAAAACATCGCVGCCAA-3’，将12个片段连接pMD-18T载体，构建12个携带靶位点基因序列的质粒标准品。将构建好的12个标准品(拷贝数为10¹⁰个拷贝)按10倍梯度依次倍比稀释至1个拷贝，选取10⁷个拷贝—1个拷贝的产物作为样品进行RAA-LFD方法检测，以空白双蒸水为模板当做阴性对照。同时，以同样的引物对12种质粒标准品进行普通PCR扩增，比较RAA-LFD方法和普通PCR方法的灵敏度。结果显示所建立的RAA-LFD方法灵敏度为100个拷贝(图1)，而普通PCR灵敏度最低为1000个拷贝，灵敏度为普通PCR的10倍(图2)。

2、特异性考察：

分别以本实验室保存的ALV-A、ALV-J、CIAV、MDV、REV的DNA或cDNA为模板，与FAdV-C4型的10²copies/μL质粒模板进行扩增比对，采用本发明实施例1优化后的RAA-LFD检测体系进行检测。

结果如图3所示，除去FAdV质粒于检测区有明显红色条带外，其余样品检测区均无红色条带且质控线有条带，表明试验成立，与其他病毒无交叉反应，说明本发明的RAA-LFD检测方法拥有良好的特异性。

实施例3：临床样本检测：

采用Reed－Muench法对血清4型FAdV分离株FAdV-N22的含量定量，使用PBS分别稀释FAdV-N22至10⁴TCID₅₀/1ml、10³TCID₅₀/1ml、10²TCID₅₀/1ml、10TCID₅₀/1ml、1TCID₅₀/1ml、0.1TCID₅₀/1ml共6个梯度，然后将上述已掺毒PBS稀释6瓶同一批次的鸡新城疫活疫苗(1000羽份)，即获得了分别人为污染的10⁴TCID₅₀/1000羽份、10³TCID₅₀/1000羽份、10²TCID₅₀/1000羽份、10TCID₅₀/1000羽份、1TCID₅₀/1000羽份、0.1TCID₅₀/1000羽份的FAdV的6瓶鸡新城疫活疫苗(1000羽份)，另外再把1瓶疫苗用1ml无菌PBS稀释，作为空白对照。

将上述7瓶不同疫苗以病毒核酸提取试剂盒提取DNA，分别使用本发明实施例1优化后的RAA-LFD方法和普通PCR方法检测人工模拟疫苗污染中的病毒。结果如图4、图5所示。

结果显示：采用RAA-LFD检测方法可检测到1个TCID₅₀/1000羽份的疫苗污染，而普通PCR方法最低可检测到100个TCID50/1000羽份的疫苗污染，

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物及其检测方法

<130> 2021

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggtcctgtt cgaagaggat dcgcgtggtr 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gahtacgtca gcaaaaacat cgcvgccaa 29

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgttggtggc gaaggcgccg tagagggcgt cgagcatttg gagatgg 47

Claims

1.一种用于检测禽腺病毒I群12个血清型的RAA引物和探针组合，其特征在于，所述RAA引物和探针组合中的引物和探针序列分别如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的RAA引物和探针组合在制备检测禽腺病毒I群12个血清型的试剂或试剂盒中的应用。

3.一种检测禽腺病毒I群12个血清型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的RAA引物和探针组合。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：RAA反应试剂和侧流层析试纸条。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RAA反应试剂包括：A buffer和Bbuffer。

6.一种利用权利要求3-5任一项所述的试剂盒检测禽腺病毒I群12个血清型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，RAA扩增的反应体系为：A buffer 40.9μL；B buffer 2.5μL；上游引物2μL；下游引物2μL；探针0.6μL；模板2μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，RAA扩增的条件为：39℃恒温下反应8-15min。