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CN113543808A - 多特异性蛋白质分子及其用途 - Google Patents

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CN113543808A
CN113543808A CN202080018987.3A CN202080018987A CN113543808A CN 113543808 A CN113543808 A CN 113543808A CN 202080018987 A CN202080018987 A CN 202080018987A CN 113543808 A CN113543808 A CN 113543808A
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CN
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specifically binds
tumor
multispecific antibody
cases
binding
Prior art date
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CN202080018987.3A
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希瓦鲁帕姆·博米克
威廉·A·布雷迪
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Treo Pharmaceuticals
Original Assignee
Treo Pharmaceuticals
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Abstract

本文公开了可以与肿瘤细胞和免疫抑制细胞相互作用的多特异性结合多肽分子(例如，多特异性抗体)。在一些实施方案中，本文还描述了使用多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)治疗一种或多种疾病或病况(例如，癌症)的方法。

Description

多特异性蛋白质分子及其用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2019年1月4日提交的系列号为62/788,495的美国临时申请的权益，该美国临时申请的内容通过引用整体并入本文，包括所有附图和表格。
发明内容
本文描述了可用于治疗癌症的多特异性结合多肽。所述多特异性结合多肽包含至少两个不同的结合部分，其中一个结合部分对肿瘤相关抗原是特异性的，而另一个对免疫抑制细胞上表达的抗原是特异性的。在某些实施方案中，所述免疫抑制细胞是髓源性抑制细胞(MDSC)。在某些实施方案中，所述免疫抑制细胞是肿瘤相关巨噬细胞，任选地M2-肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAM)。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽进一步包含细胞毒性部分。
在某些方面，本文描述了一种多特异性结合多肽，其包含与肿瘤相关抗原特异性结合的肿瘤结合部分和与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与肿瘤相关抗原特异性结合的肿瘤结合部分和与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的免疫细胞结合部分。
在某些实施方案中，本文描述了一种治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)，包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)、基本上由其组成或由其组成的药物组合物，或编码该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的核酸。在一些方面，本文还描述了一种治疗患有癌症的个体的方法，该方法包括向患有癌症的个体施用多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)，包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)、基本上由其组成或由其组成的药物组合物，或编码该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的核酸。在某些实施方案中，所述个体先前已用免疫检查点抑制剂治疗进行过治疗。
在某些实施方案中，本文描述了一种在靶细胞群体中诱导肿瘤和免疫抑制细胞杀伤作用的方法，该方法包括使包含至少一种肿瘤细胞和至少一种免疫抑制细胞的靶细胞群体与多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)，包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)、基本上由其组成或由其组成的药物组合物，或编码该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的核酸接触足以诱导细胞杀伤作用的一段时间，从而杀死靶细胞群体中的所述至少一种肿瘤细胞和所述至少一种免疫抑制细胞。
在某些实施方案中，本文另外描述了一种进行癌症治疗的方法，其包括使编码多特异性结合多肽的核酸与合适的细胞系与合适的细胞系接触以建立转染的细胞系，在促进多特异性结合多肽分泌的条件下培养所述转染的细胞系，以及从所述转染的细胞系的上清液中收获所述多特异性结合多肽。在某些实施方案中，所述方法进一步包括从所述转染的细胞系的上清液中纯化所述多特异性多肽。在某些实施方案中，所述转染的细胞系被稳定转染。在某些实施方案中，本文描述了一种进行癌症治疗的方法，其包括将所述多特异性结合多肽与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合，基本上由其组成，或由其组成。
附图说明
本公开的各个方面在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本公开的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：
图1A示出了本公开的多特异性结合多肽的非限制性实施方案。
图1B示出了具有细胞毒性部分的本公开的多特异性结合多肽的非限制性实施方案。
图1C示出了结合并杀死癌细胞但不结合或杀死免疫抑制细胞的示例性单作用双特异性抗体的卡通表示。示例性的单作用双特异性抗体为非申请人的双特异性抗体。
图1D示出了结合并调节癌细胞和免疫抑制细胞的杀伤的本文所述多作用多特异性抗体的卡通表示。
图2描绘了在相同TNBC活检物中检测到的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，TNBC细胞表达高水平的TROP2。选定的受体在热图中标注为：TROP2＝TACSTD2；TRAIL-R2＝TNFRSF10B；PD1＝PDCD1；PDL1＝CD274。
图3描绘了在相同LUAD活检物中检测到的肺腺癌(LUAD)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，LUAD细胞表达高水平的TROP2。
图4描绘了在相同LUSC活检物中检测到的肺鳞状细胞癌(LUSC)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，LUSC细胞表达高水平的TROP2。
图5描绘了在相同PRAD活检物中检测到的前列腺腺癌(PRAD)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，PRAD细胞表达高水平的TROP2。
图6描绘了在相同LIHC活检物中检测到的肝脏肝细胞癌(LIHC)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，LIHC细胞表达高水平的GPC3。
图7描绘了在相同LUAD活检物中检测到的肺腺癌(LUAD)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，LUAD细胞表达高水平的GPC3。
图8描绘了在相同LUAD活检物中检测到的肺腺癌(LUAD)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，LUAD细胞表达高水平的FOLR1。
图9描绘了在相同LUSC活检物中检测到的肺鳞状细胞癌(LUSC)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，LUSC细胞表达高水平的FOLR1。
图10描绘了在相同OV活检物中检测到的卵巢囊腺癌(OV)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，OV细胞表达高水平的FOLR1。
图11描绘了在相同PRAD活检物中检测到的前列腺腺癌(PRAD)细胞和免疫抑制细胞上表达的受体的表达热图。如该图所示，PRAD细胞表达高水平的FOLH1。
图12A-图12E示出了αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体的表达和分析表征。图12A显示了αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体的瞬时表达滴度。滴度估计基于蛋白A纯化后产生的双特异性抗体的净量。图12B显示了通过大小排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)对蛋白A纯化的αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体的溶液谱分析。保留时间＝3.596的主峰对应于完整双特异性抗体构建体的单体形式，占所有观察到的物质的约85％。保留时间为2.980和3.142的峰是双特异性抗体构建体的较高分子量种类。图12C显示了蛋白A纯化的αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体的SDS-PAGE分析。在还原(R)和非还原(NR)条件下分析样品。在还原条件下观察到两条带，顶部条带对应于重链的分子量，下部条带对应于轻链的分子量。在非还原条件下，仅观察到一条带，其对应于完整双特异性抗体构建体的分子量。图12D显示了蛋白A纯化的αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体的完整质量分析。在分析质量之前，对样品进行还原和去糖基化。重链(上图)和轻链(下图)均表现出对应于基于氨基酸序列的理论分子量的主峰。在上图中观察到的第二个峰对应于由不完全去糖基化产生的糖基化重链种类。图12E显示了αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体对TROP2和TRAIL-R2抗原的结合亲和力测量。通过ELISA测量结合亲和力。对癌细胞上表达的TROP2抗原的结合亲和力为KD＝0.0024nM，而对免疫抑制细胞上表达的TRAIL-R2的结合亲和力为KD＝0.22nM。兔抗TROP2和抗TRAIL-R2抗体分别以0.004nM和0.0009nM的结合亲和力KD结合TROP2和TRAIL-R2抗原。非结合人IgG1同种型对照不与TROP2和TRAIL-R2抗原结合。
图13A-图13G示出了通过荧光激活细胞分选方法(FACS)测量的αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体在癌细胞表面上的靶标介导的选择性结合。图13A显示了αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体在TROP2+癌细胞系SKBR3表面上的选择性结合，结合亲和力KD＝2.4nM(0.463μg/ml)。非结合IgG1同种型对照不与SKBR3表面结合。图13B显示了在SKBR3细胞系表面上表达的高水平的TROP2。非结合兔抗体同种型对照不在SKBR3细胞系表面上结合，如根据无荧光信号所检测到的。图13C显示了在SKBR3细胞系中TRAIL-R2的低表达。非结合兔抗体同种型对照不在SKBR3细胞系的表面上结合。图13D显示了αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体在TRAIL-R2+癌细胞系U937的表面上的选择性结合。αTROP2×αTRAIL-R2在U937中引起的荧光强度呈浓度依赖性增加。相比之下，Herceptin在U937中引起的荧光强度没有浓度依赖性增加，提示它不结合U937。Herceptin是一种已知结合HER2抗原的治疗性抗体，不在已知不表达HER2的U937的表面上结合。图13E显示了αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体不在TROP2─和TRAIL-R2─细胞系THP1的表面上结合。Herceptin是一种已知结合HER2的治疗性抗体，不在THP1的表面上结合。荧光强度没有浓度依赖性增加，提示αTROP2×αTRAIL-R2和Herceptin都不结合THP1。图13F显示了在U937细胞系中低水平的TRAIL-R2和没有可检测水平的TROP2表达。兔抗TRAIL-R2抗体结合U937的表面，如根据可检测水平的荧光信号所测量的。小鼠抗TROP2抗体不结合U937的表面，如根据没有荧光信号所检测到的。兔和小鼠抗体同种型对照均不结合U937的表面。图13G显示在U937中没有可检测到的TRAIL-R2和TROP2的表达。兔抗TRAIL-R2抗体和小鼠抗TROP2抗体不结合U937的表面，如根据没有荧光信号所检测到的。兔和小鼠抗体同种型对照均不结合U937的表面。
图14显示了αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体在U937中引起的剂量依赖性TRAIL-R2介导的凋亡和细胞死亡，在IC50＝0.65nM(0.13μg/ml)时，在第7次细胞传代时最大细胞杀伤率为11％，而在第10次细胞传代时最大细胞杀伤率为15％。
图15显示了通过大小排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)对蛋白A和制备型大小排阻色谱法(SEC)纯化的αTROP2×αCD33、αTROP2×αCSF1R和αTROP2×αCD163双特异性抗体的溶液谱分析。样品在Waters Acquity Protein BEH SEC 125A 1.7μm柱上进行分析，使用含10％异丙醇的PBS作为流动相。对于αTROP2×αCD33和αTROP2×αCSF1R均观察到对应于单体双特异性抗体装配体分子量的单个主峰，提示不存在低分子和高分子聚集体，表明稳定性。对应于单体双特异性抗体装配体分子量的αTROP2×αCD163的主峰为81％，前肩对应于可能的高分子量形式。
图16显示了蛋白A纯化的αTROP2×αCD33、αTROP2×αCSF1R和αTROP2×αCD163双特异性抗体的SDS-PAGE分析。在还原(R)和非还原(NR)条件下分析样品。在还原条件下观察到两条带，顶部条带对应于重链的分子量，下部条带对应于轻链的分子量。在非还原条件下，仅观察到一条带，其对应于完整双特异性抗体构建体的分子量。将2μg每种抗体样品+/-β-巯基乙醇(分别为还原/未还原的)加载到NuPage4-12％Bis-Tris凝胶(ThermoFisher，Loughborough，UK)上，并在200V下运行40分钟。凝胶用InstantBlue(Expedeon，Swavesey，UK)染色。M：PAGERulerTMPlus预染色蛋白阶梯(ThermoFisher，Loughborough，UK)。泳道1、2：αTROP2×αCSF1R双特异性抗体，分别为还原的和非还原的；泳道3、4；αTROP2×αCD163双特异性抗体，分别为还原的和非还原的；泳道5、6：αTROP2×αCD33双特异性抗体，分别为还原的和非还原的；泳道7、8：aTROP2单特异性抗体，分别为还原的和非还原的。
图17显示了在蛋白A和制备型SEC纯化之后，αTROP2×αCD33与TROP2和CD33结合的Biacore多周期动力学传感图。使用1比1模型进行拟合。
图18显示了在蛋白A和制备型SEC纯化之后，αTROP2×αCD163与TROP2和CD33结合的Biacore多周期动力学传感图。使用1比1模型进行拟合。
图19显示了在蛋白A和制备型SEC纯化之后，αTROP2×αCSF1R与TROP2和CSF1R结合的Biacore多周期动力学传感图。使用1比1模型进行拟合。
图20A-图20D显示了通过荧光激活细胞分选方法(FACS)测量的αTROP2×αCD33双特异性抗体在癌细胞表面上的靶标介导的选择性结合。图20A显示了αTROP2×αCD33双特异性抗体在TROP2+癌细胞系SKBR3表面上的选择性结合，结合亲和力KD＝2.7nM(0.55μg/ml)。非结合IgG1同种型对照不与SKBR3表面结合。作为系统对照，Herceptin在SKBR3的表面上结合，结合亲和力，KD＝4.1nM(0.62μg/ml)，这是由于与αTROP2×αCD33的结合相比，通过高荧光强度表现出的HER2的高表达。图20B显示了αTROP2×αCD33双特异性抗体在CD33+癌细胞系THP1表面上的选择性结合，结合亲和力KD＝6.7nM(1.33μg/ml)。αTROP2×αCD33的荧光强度呈浓度依赖性增加。相比之下，非结合IgG1同种型对照和Herceptin在THP1中的荧光强度均未表现出任何浓度依赖性增加，提示这两种抗体均不结合THP1。图20C显示了在SKBR3细胞系表面上表达的高水平的TROP2。非结合兔抗体同种型对照不在SKBR3细胞系的表面上结合，如通过低荧光信号所检测到的。图20D显示了在THP1细胞系表面上表达的高水平CD33。非结合兔抗体同种型对照不在THP1细胞系的表面上结合，如根据没有荧光信号所检测到的。
图21A示出了目标癌细胞上TRAIL-R2介导的活化的卡通表示，该癌细胞被本文公开的多特异性抗体选择性激活。如该图所示，多特异性抗体与位于脂筏中的肿瘤特异性抗原结合，其募集并促进TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)，随后激活目标癌细胞内TRAIL-R2介导的凋亡。
图21B示出了与位于目标癌细胞的脂筏外部的肿瘤特异性抗原结合的示例性多特异性抗体的卡通表示。示例性多特异性抗体在与肿瘤特异性抗原结合后不激活目标癌细胞内TRAIL-R2介导的凋亡。
图21C示出了常规抗体如图21C中所示的单作用双特异性抗体的卡通表示，该抗体由于炎性细胞因子、粒酶和/或穿孔蛋白泄漏到附近的正常细胞和组织而产生非肿瘤毒性。如该图所示，在将免疫效应细胞募集到癌细胞并通过常规抗体激活免疫效应细胞后，活化的免疫效应细胞不仅分泌可通过TRAIL-R2途径导致激活癌细胞内凋亡的可溶性TRAIL，而且可以释放细胞因子、粒酶和/或穿孔蛋白，它们泄漏到附近的正常细胞会导致非肿瘤毒性。
图21D示出了调节TRAIL-R2介导的癌细胞凋亡并且不激活免疫效应细胞的示例性多特异性抗体的卡通表示。如该图所示，免疫效应细胞活化的缺乏最小化或阻止了炎性细胞因子、粒酶和/或穿孔蛋白的释放，并因此降低或抑制了对附近正常细胞或组织的毒性。
图22示出了示例性多特异性抗体在TRAIL敏感的MDAMB231细胞系中没有引起细胞杀伤。
具体实施方式
肿瘤微环境与免疫抑制
肿瘤微环境(TME)在肿瘤进展、肿瘤细胞适应和抗癌疗法抗性中起着不可或缺的作用。肿瘤微环境的组成部分包括髓源性抑制细胞(MDSC)、抗原呈递细胞(APC)、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、成纤维细胞、由胶原蛋白和蛋白聚糖组成的细胞外基质，以及可溶性因子(例如，细胞因子和生长因子)，所有这些都可能有助于或阻碍抗肿瘤免疫应答。免疫疗法利用先天性和适应性免疫系统来攻击和破坏肿瘤细胞。然而，肿瘤细胞利用多种机制，包括改变抗原呈递机制、分泌可诱导淋巴细胞凋亡的免疫抑制因子或激活负调节途径，导致逃避抗肿瘤免疫应答，从而限制抗肿瘤免疫应答的有效性。
示例性免疫抑制因子和细胞包括CD4+T调节(Treg)细胞、MDSC、TAM和抑制性免疫检查点分子。在一些实施方案中，Treg细胞的特征在于表达FOXP3、CD4和CD25。在一些实施方案中，Treg细胞通过分泌抑制性细胞因子(例如IL-10、IL-35和TGF-β)或通过直接细胞接触来抑制T-效应细胞应答。
髓源性抑制细胞(MDSC)是源自骨髓干细胞的一组异质免疫细胞。MDSC通常分化为粒细胞、巨噬细胞或树突细胞。然而，在肿瘤微环境中，MDSC变为活化的，迅速扩充，但保持未分化。在一些实施方案中，临床研究中已显示MDSC与包括结直肠癌和乳腺癌在内的几种人类肿瘤的存活率降低相关。
巨噬细胞是丰富的髓源性吞噬细胞，可分类为促炎性或抗炎性的，也称为经典的(M1)和替代的(M2)。TAM是巨噬细胞的一个子集，它影响对免疫治疗的反应并协调促进肿瘤的血管生成、纤维基质沉积和转移形成。TAM表现出替代激活的M2表型，已知可控制组织稳态和伤口愈合。然而，在肿瘤环境中，这种表型能够通过细胞因子(例如，IL-10)、代谢物的消耗(例如，精氨酸酶、IDO的表达)和/或通过接触抑制(例如，通过PD-L1)来抑制T细胞。
癌症疗法的重点是直接地或通过动员身体的免疫系统来消除癌细胞(也参见图1C)。例如，诸如化疗、放疗、抗体药物缀合物、CAR-T或BiTE等疗法旨在直接消除癌细胞，而诸如免疫检查点抑制剂等免疫疗法会阻断癌细胞或T细胞上的某些免疫检查点受体，从而激活T细胞以消除癌细胞。涉及双特异性抗体的免疫肿瘤学策略也旨在通过动员或利用T细胞或NK细胞来消除癌细胞。事实上，有86项临床试验评价了双特异性抗体，所有这些试验都旨在动员和/或激活免疫系统。因此，这些癌症治疗方式仅针对并杀死肿瘤细胞，而不针对免疫抑制细胞。
在某些实施方案中，本文公开了多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)，其包含对肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原或受体具有特异性的第一结合部分，和对免疫抑制细胞上表达的受体或抗原具有特异性的第二结合部分。在一些实施方案中，该免疫抑制细胞包括髓源性抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞或CD4+T调节(Treg)细胞。在一些实施方案中，本文还描述了多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)，其包含对肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原或受体具有特异性的第一结合部分，和对MDSC或肿瘤相关巨噬细胞上表达的受体或抗原具有特异性的第二结合部分。在另外的实施方案中，本文描述了多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)，其包含对肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原或受体具有特异性的第一结合部分，和对Treg细胞上表达的受体或抗原具有特异性的第二结合部分。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)调节免疫抑制细胞群体。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)减少免疫抑制细胞群体，诱导对免疫抑制细胞群体的细胞杀伤作用，减少免疫抑制细胞扩充，减少免疫抑制细胞活化，和/或减少免疫抑制细胞增殖。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)改善、消除和/或阻断癌细胞用来逃避抗肿瘤免疫应答的逃逸机制。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)不靶向或特异性结合免疫检查点途径受体。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)通过消除免疫抑制因子，如免疫抑制细胞和免疫抑制细胞因子，来调节肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩充。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)增强TIL群体扩充、细胞毒性T细胞增殖和/或细胞毒性T细胞活化。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)增加TIL与免疫抑制细胞之比。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)调节Treg群体。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)减少靶标群体内的Treg，减少Treg增殖，减少Treg扩充，和/或减少Treg活化。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)降低靶标群体中Treg与TIL之比。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)调节MDSC群体。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)减少MDSC增殖，减少MDSC活化，和/或减少MDSC扩充。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)减少靶标群体中的MDSC。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)降低靶标群体中MDSC与TIL之比。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)调节巨噬细胞的M1极化。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)增加M1极化。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)降低M2极化。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)降低TAM(例如，M2-TAM)增殖、扩充和/或活化。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)增加呈递M1表型的巨噬细胞与呈递M2表型的巨噬细胞之比。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)增加抗肿瘤巨噬细胞增殖和/或活化。在一些情况下，本文所述的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)增强抗肿瘤巨噬细胞群体的扩充。
在某些实施方案中，本文进一步描述了用多特异性蛋白质分子(例如，多特异性抗体)治疗受试者的方法，其包括施用多特异性多肽(例如，多特异性抗体)，该多特异性多肽包含对肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原或受体具有特异性的第一结合部分，和对免疫抑制细胞上表达的受体或抗原具有特异性的第二结合部分。
在某些实施方案中，本文另外描述了使用多特异性蛋白质分子(例如，多特异性抗体)在靶细胞群体中诱导肿瘤和免疫抑制细胞杀伤的方法，该多特异性蛋白质分子包含对肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原或受体具有特异性的第一结合部分，和对免疫抑制细胞上表达的受体或抗原具有特异性的第二结合部分。
在某些实施方案中，本文另外描述了通过用多特异性蛋白质分子(例如，多特异性抗体)激活凋亡途径，通过诱导癌细胞和免疫抑制细胞两者的直接细胞死亡而在靶细胞群体中诱导肿瘤和免疫抑制细胞杀伤的方法，该多特异性蛋白质分子包含对肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原或受体具有特异性的第一结合部分，和对免疫抑制细胞上表达的受体或抗原具有特异性的第二结合部分。在一些情况下，该方法包括通过与多特异性蛋白质分子(例如，多特异性抗体)缀合的细胞毒性有效负载诱导细胞死亡。在其他情况下，该方法包括利用抗体依赖性细胞毒性来诱导细胞杀伤效应。在另外的情况下，该方法包括与细胞毒性相关的细胞毒性有效负载和抗体依赖性细胞毒性以诱导细胞杀伤效应的组合。
在某些实施方案中，本文进一步描述了与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的抗体-细胞毒素缀合物。在一些情况下，所述抗体-细胞毒素缀合物用于在有需要的受试者中诱导免疫抑制细胞杀伤的方法中，该方法包括施用与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的抗体-细胞毒素缀合物，从而杀死所述受试者中的免疫抑制细胞。在其他情况下，所述抗体-细胞毒素缀合物用于在有需要的受试者中激活杀伤肿瘤细胞的免疫细胞的方法中，该方法包括施用与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的抗体-细胞毒素缀合物，从而杀死所述受试者中的免疫抑制细胞并激活所述杀伤肿瘤细胞的免疫细胞。在另外的情况下，所述抗体-细胞毒素缀合物用于在有需要的受试者中减少对杀伤肿瘤细胞的免疫细胞的抑制的方法中，该方法包括施用与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的抗体-细胞毒素缀合物，从而杀死所述受试者中的免疫抑制细胞并减少对所述杀伤肿瘤细胞的免疫细胞的抑制。在一些情况下，所述抗体-细胞毒素缀合物用于进一步包含肿瘤特异性结合部分。在一些情况下，所述抗体-细胞毒素缀合物是本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)。
多特异性结合多肽结构
本文公开了多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)，其包含与肿瘤相关抗原特异性结合的肿瘤结合部分和与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)结合并调节癌细胞的杀伤，并且结合并调节免疫抑制细胞的杀伤。另见图1D。在一些情况下，该多特异性结合多肽包含单一多肽复合物，该复合物包含至少两个不同的非重叠结合域，每个不同的结合域对不同的非重叠抗原或表位具有特异性。该抗原或表位可以在不同的分子(例如，不同的蛋白质)上，或同一分子的非重叠部分上。单一多肽复合物包含单一多肽、二聚化或多聚化以形成结合单元的多肽(例如，IgG的重链和轻链，形成成熟IgG的两个重链和轻链对)、不同但通过共价(例如，二硫键、连接体分子)或非共价相互作用(例如，生物素-链霉亲和素；亲和相互作用；电荷相互作用，杵臼(knob-in-hole))保持在一起的多肽。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽包含抗体或抗体的结合片段。所提供的多特异性结合多肽包括单克隆抗体、多特异性抗体，例如双特异性抗体和抗体片段。抗体包括抗体缀合物和包含抗体的分子，如嵌合分子。因此，抗体包括但不限于全长和天然抗体，以及保留其结合特异性的其片段和部分，例如其任何特异性结合部分，包括具有任意数量的免疫球蛋白类别和/或同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和IgM)的那些；及其生物学相关(抗原结合)片段或特异性结合部分，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv和scFv(单链或相关实体)。单克隆抗体通常是在基本同质的抗体组合物内的抗体；因此，除了可能少量存在的天然发生的突变以外，包含在单克隆抗体组合物内的任何单个抗体都是相同的。多克隆抗体是包含不同序列的不同抗体的制品，这些抗体通常针对两个或更多个不同的决定簇(表位)。单克隆抗体可包含人IgG1恒定区。单克隆抗体可包含人IgG4恒定区。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体包括全长抗体、附加抗体、双特异性融合蛋白或双特异性抗体缀合物。在一些情况下，所述多特异性抗体包括纳米抗体、BiTE、双抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、三抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、scDiabody-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc或胞内抗体。在一些情况下，所述多特异性抗体包括附加抗体。在一些情况下，所述多特异性抗体包括双特异性融合蛋白。在一些情况下，所述多特异性抗体包括双特异性抗体缀合物。在一些情况下，所述多特异性抗体包括附加抗体，该附加抗体进一步包含缀合物(例如，有效负载，如细胞毒性部分)。
本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)具有某些结构属性。图1A显示了一种这样的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的具体非限制性实施方案。该多肽最低限度地包含结合肿瘤相关抗原的第一结合部分。该结合部分包含，例如，对肿瘤相关抗原具有特异性的单克隆抗体的VH/VF对。该多肽还包含第二结合部分，该第二结合部分包含与在免疫抑制细胞上表达的抗原结合的单链可变区(scFv)。第一结合部分被描述为对肿瘤相关抗原具有特异性，而第二结合部分被描述为对免疫抑制细胞上表达的抗原具有特异性，但这个顺序可以颠倒，第一结合部分与免疫抑制细胞上表达的抗原结合，第二结合部分与肿瘤相关抗原结合。图1A还显示了本文所述多肽的可选特征，包括Fc区和偶联第一结合部分和第二结合部分的多肽连接体(例如，柔性多肽连接体)。在一个实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含含有单克隆IgG抗体的第一结合部分和含有scFv的第二结合部分，其中scFv抗体与单克隆抗体的一个或两个Fc区的C末端偶联。在某些实施方案中，IgG包含IgG1同种型。在某些实施方案中，IgG包含IgG2同种型。在某些实施方案中，IgG包含IgG4同种型。在某些实施方案中，所述多肽连接体包含聚-Ala连接体、聚-Gly连接体或聚-Ala和聚-Gly残基的组合。在一些情况下，所述多肽连接体包含(Gly4Ser)n，其中n为1至10的整数。在一些情况下，n为1至6、1至4或1至2的整数。在一些情况下，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些情况下，n为1、2、3、4、5或6。在一些情况下，n为1、2、3或4。在一些情况下，所述多肽连接体包含GGGSGGGS(SEQ ID NO:78)。在一些情况下，所述多肽连接体包含GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:140)。在一些情况下，所述多肽连接体包含GGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:141)。在某些实施方案中，Fc区已被修饰以延长循环中的半衰期。在某些实施方案中，半衰期延长至至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、28、30、60天或更多天。在某些实施方案中，半衰期延长至至少7、14或21天。在某些实施方案中，Fc区已被修饰以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在某些实施方案中，Fc区已被修饰以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力。在某些实施方案中，Fc区已被修饰以减轻嗜中性粒细胞减少症。在某些实施方案中，一个或两个铰链区已被修饰。
除了图1A所示的构型，还设想了其他构型。示例性多特异性抗体构型包括但不限于：(1)轻链c末端scFv形式，其中scFv与抗体的一条或多条轻链的C末端偶联，如US 2013/0216543中所述；(2)双可变域(DVD)抗体，其中轻链和重链可变区包含不同的第二结合域，如US8,258,268中所述；(3)杵臼(knob-in-hole)双特异性抗体，其中一个重链恒定区包含工程化臼(hole)，而一个重链恒定区包含工程化杵(knob)，如Merchant等人.“Anefficient route to human bispecific IgG.”Nat Biotechnol.1998Jul；16(7):677-81和WO 2016/172485中所述；(4)双scFv，其中两个具有不同结合特异性的scFv通过连接体接合在一起；以及(5)双F(ab’)2，其中具有不同结合特异性的两个F(ab’)通过连接体或化学交联接合在一起。任何双特异性抗体形式均可用作本公开的多特异性结合多肽。参见Spiess等人,Molecular Immunology,67(2):95-106(2015)。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽是选自以下列表的格式的双特异性多肽：IgG-scFv、纳米抗体、双抗体、双亲和力重新靶向抗体(DART)、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、三抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、杵臼交联单克隆抗体(Cross-mab Knob-in-hole(KIH)、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、scDiabody-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc和胞内抗体。
在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含Godar等人,“Therapeutic bispecific antibody formats:a patent applications review(1994-2017),”Expert Opinion on Therapeutic Patents,28(3):251-276(2018)中描述的双特异性形式。
在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含Labrijn等人,“Bispecific antibodies:a mechanistic review of the pipeline,”NatureReviews 18:585-608(2019)中描述的双特异性形式。
靶抗原
在某些实施方案中，本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)具有与肿瘤相关抗原和免疫抑制细胞表达的抗原结合的不同结合部分。在某些实施方案中，本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)有助于杀死肿瘤/癌细胞和免疫抑制细胞。
肿瘤相关抗原(TAA)是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可接近的细胞表面抗原。本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可通过ADCC机制或通过靶标介导的细胞毒性有效负载的递送直接促进细胞杀伤。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是TROP2(也称为TACSTD2)、HER2(也称为ERBB2)、GPC3(也称为磷脂酰肌醇聚糖3)、GD2、FOLR1(也称为叶酸受体1)、FLT3、BCMA(也称为B细胞成熟抗原)、MUC16、SLC4A4、STEAP1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD38、CD30、CD47、CD123、间皮素、MT1-MMP(也称为MMP14)或PSMA(也称为FOLH1)。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是TROP2。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是HER2。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是CD30。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是CD22。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是GD2。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是FOLR1。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是CD33。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是GPC3。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是CD38。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是FLT3。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是CD47。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是CD22。在某些实施方案中，该肿瘤相关抗原是FOLH1。
在某些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2、HER2、GPC3、GD2、FOLR1、FLT3、BCMA、MUC16、SLC4A4、STEAP1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD38、CD30、CD47、CD123、间皮素、MT1-MMP或PSMA结合的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，该肿瘤结合部分与TROP2、GPC3、HER2、FOLR1、CD33、CD38、FLT3、CD30、CD22或GD2结合。在一些实施方案中，该肿瘤结合部分与TROP2、GPC3、FOLR1、CD33、CD38或FLT3结合。在一些实施方案中，该肿瘤结合部分与TROP2、CD47、HER2、CD30、CD22、GD2或FOLR1结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与TROP2结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与CD30结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与CD22结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与GD2结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与FOLR1结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与CD33结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与GPC3结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与HER2结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与CD38结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与FLT3结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与CD47结合。在一些情况下，该肿瘤结合部分与CD22结合。
免疫抑制细胞浸润肿瘤部位并抑制对癌细胞的内源性免疫应答。通过细胞毒性有效负载或ADCC杀死免疫抑制细胞可能有助于增加自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤的杀伤。在某些实施方案中，该免疫抑制细胞包括髓源性抑制细胞(MDSC)、CD4+T调节细胞、CD8+T调节细胞或肿瘤相关巨噬细胞。示例性MDSC受体包括但不限于TNF相关凋亡诱导配体受体2(TRAIL-R2)和集落刺激因子1受体(CSF1R)。示例性肿瘤相关巨噬细胞受体包括但不限于分化簇163(CD163)和具有胶原结构的巨噬细胞受体(MARCO)。示例性Treg受体包括但不限于肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)和脑信号蛋白4A(SEMA4A)。
在某些实施方案中，由免疫抑制细胞表达的示例性抗原包括但不限于TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括SEMA4A、SEMA4D或TNFR2。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R。在一些情况下，由免疫抑制细胞表达的抗原包括CD33、CD163或CSF1R。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是CSF1R。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是SEMA4A。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是CD163。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是TNFR2(或TNFRSF1B)。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是TRAIL-R2(或TNFRSF10B或DR5)。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是CD33。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是SEMA4D。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是LILRB4。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是TREM2。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是C5AR1。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是SIGLEC1。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是TMEM37。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是TMEM119。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是IL4R。在一些情况下，免疫抑制细胞上表达的抗原是SIGLEC7。
在一些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD33、CD163或CSF1R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CSF1R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SEMA4A结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD163结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TNFR2(或TNFRSF1B)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2(或TNFRSF10B或DR5)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD33结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SEMA4D结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TREM2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与C5AR1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与LYVE1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与ABCC3结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与LILRB4结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MRC1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SIGLEC1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与STAB1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TMEM37结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MERTK结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TMEM119结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SIGLEC7结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SIGLEC9结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与IL4R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MARCO结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD163结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MS4A7结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD200R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MGL1结合。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽是多特异性抗体(任选地，双特异性抗体)，其包含与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD33、CD163或CSF1R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CSF1R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SEMA4A结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD163结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TNFR2(或TNFRSF1B)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TRAIL-R2(或TNFRSF10B或DR5)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD33结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SEMA4D结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TREM2结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与C5AR1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与LYVE1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与ABCC3结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与LILRB4结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MRC1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SIGLEC1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与STAB1结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TMEM37结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MERTK结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与TMEM119结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SIGLEC7结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SIGLEC9结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与IL4R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MARCO结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD163结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MS4A7结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与CD200R结合。在一些情况下，该免疫细胞结合部分与MGL1结合。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，其包含与TROP2、HER2、GPC3、GD2、FOLR1、FLT3、BCMA、MUC16、SLC4A4、STEAP1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD38、CD30、CD47、CD123、间皮素、MT1-MMP或PSMA特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与TROP2、GPC3、HER2、FOLR1、CD33、CD38、FLT3、CD30、CD22或GD2特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与TROP2、GPC3、FOLR1、CD33、CD38或FLT3特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与HER2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD30特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与CD22特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分；以及与TRAIL-R2(也称为TNFRSF10B、死亡受体5或DR5)、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2(也称为TNFRSF1B)、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1(也称为CD206)、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1(也称为CD301或CLEC10A)、MGL2(也称为CD301B)、CD200R或SELPLG(也称为PSLG-1或CD162)特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SEMA4A、SEMA4D或TNFR2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33、CD163或CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TREM2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与C5AR1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LYVE1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与ABCC3特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与LILRB4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MRC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与STAB1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM37特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MERTK特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与TMEM119特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SIGLEC9特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与IL4特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MARCO特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与SELPLG特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MS4A7特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与CD200R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，所述多特异性抗体包含与GD2特异性结合的肿瘤结合部分，以及与MGL1特异性结合的免疫细胞结合部分。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与以下物质特异性结合的免疫细胞结合部分：TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、TREM2、ABCC3、STAB1或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM119或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、CD163、TREM2、LILRB4、STAB1、TMEM119或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、TREM2、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、TNFR2、TREM2、MS4A7、CSAR1、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R；TRAIL-R2、TNFR2、ABCC3、STAB1或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、TMEM119、CLEC10A或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、TREM2、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、MERTK、TMEM37、TMEM119或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、MERTK、TMEM37或IL4R；TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、MERTK、TMEM37、TMEM119或IL4R；或者TRAIL-R2、CSF1R、TNFR2、ABCC3、STAB1、TMEM37、TMEM119或IL4R。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、TREM2、ABCC3、STAB1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM119或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、CD163、TREM2、LILRB4、STAB1、TMEM119或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、TREM2、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、TNFR2、TREM2、MS4A7、CSAR1、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、TNFR2、ABCC3、STAB1或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、TMEM119、CLEC10A或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、TREM2、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、MERTK、TMEM37、TMEM119或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、MERTK、TMEM37或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、MERTK、TMEM37、TMEM119或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、TNFR2、ABCC3、STAB1、TMEM37、TMEM119或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)是双特异性抗体。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2或FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与以下物质特异性结合的免疫细胞结合部分：TRAIL-R2、CD33、CSF1R、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R；TNFRSF10B、TNFRSF1B、CSF1R、SEMA4A、CD163、MARCO、TNFRSF1B、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1或CLEC10A；或者TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、STAB1、LILRB4、TMEM37、MERTK、TMEM119或IL4R。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2或FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM37或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2或FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，和与TNFRSF10B、TNFRSF1B、CSF1R、SEMA4A、CD163、MARCO、TNFRSF1B、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1或CLEC10A特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2或FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、STAB1、LILRB4、TMEM37、MERTK、TMEM119或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)是双特异性抗体。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2或FOLH1/PSMA特异性结合的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、STAB1、LILRB4、TMEM37、MERTK、TMEM119或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)是双特异性抗体。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、MERTK、TMEM37、TMEM119、IL4R或SIGLEC1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)是双特异性抗体。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与CD33或CD123特异性结合的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TNFRSF10B/TRAIL-R2、TNFRSF1B/TNFR2、CSF1R、SEMA4A、MS4A7、C5AR1、LILRB4、STAB1、MERTK、SIGLEC7、SIGLEC9、CLEC10A或CD200R1特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)是双特异性抗体。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与CD123、CD30、CD22或CD19特异性结合的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TNFRSF10B、CSF1R、SEMA4A、CD163、MARCO、TNFRSF1B、C5AR1、ABCC3、LILRB4、STAB1、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、CLEC10A或IL4R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)是双特异性抗体。
多特异性抗体
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含与选自表1和/或表2的序列(例如，CDR或VH/VL序列)至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的序列。
表1
Figure BDA0003247743320000561
*示例性肿瘤相关抗原前面的符号“α”表示与该肿瘤相关抗原特异性结合的抗体。例如，αTROP2是指与TROP2特异性结合的抗体；αGPC3是指与GPC3特异性结合的抗体；αFOLR1是指与FOLR1特异性结合的抗体；αCD38是指与CD38特异性结合的抗体；而αFLT3是指与FLT3特异性结合的抗体。
#带下划线的序列表示相应的HCDR1、HCDR2和HCDR3。例如，αTROP2中第一个带下划线的序列表示HCDR1；αTROP2中第二个带下划线的序列表示HCDR2；而αTROP2中第三个带下划线的序列表示HCDR3。
表2
Figure BDA0003247743320000571
*示例性肿瘤相关抗原前面的符号“α”表示与该肿瘤相关抗原特异性结合的抗体。
#带下划线的序列表示相应的LCDR1、LCDR2和LCDR3。例如，αTROP2中第一个带下划线的序列表示LCDR1；αTROP2中第二个带下划线的序列表示LCDR2；而αTROP2中第三个带下划线的序列表示LCDR3。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9、16、20、24或28所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10、32、36、40或44所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:9、16、20、24或28所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:10、32、36、40或44所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:9所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:10所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:16所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:32所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:20所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:36所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:24所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:40所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:28所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:44所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原结合。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含肿瘤结合部分，该肿瘤结合部分包含来源于已知抗体如RS7、MAAP-9001a、7E6、4F6(TROP2)、Codrituzumab/GC33/RO5137382、HN3、YP7、HS20、4G5、MDX-1414(GPC3)曲妥珠单抗(Trastuzumab)(HER2)、本妥昔单抗(brentuximab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、伊妥木单抗(iratumumab)、olinvacimab、vesencumab(CD30)、dinutuximab、Hu3F8、MAb-3F8、MORAb-028/MT228、KM666(GD2)、mirvetuximab/huFR107、法利珠单抗(farletuzumab)、MORAb-003、SP8166、26B3.F2、HuRA15(FOLR1)、达雷木单抗(daratumumab)、isatuximab、mezagitamab(CD38)或IMC-EB10(FLT3)的序列(例如，CDR或VH/VL序列)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫细胞结合部分，该免疫细胞结合部分包含与选自表3和/或表4的序列(例如，CDR或VH/VL序列)至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的序列。
表3
Figure BDA0003247743320000621
Figure BDA0003247743320000631
*免疫抑制细胞上表达的示例性抗原前面的符号“α”表示与免疫抑制细胞上表达的该抗原特异性结合的抗体。
#带下划线的序列表示相应的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
表4
Figure BDA0003247743320000632
*免疫抑制细胞上表达的示例性抗原前面的符号“α”表示与免疫抑制细胞上表达的该抗原特异性结合的抗体。
#带下划线的序列表示相应的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫细胞结合部分，该免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11、48、52或59所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12、63、67或74所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:11、48、52或59所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:12、63、67或74所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫细胞结合部分，该免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:11所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:12所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫细胞结合部分，该免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQID NO:63所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:48所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:63所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫细胞结合部分，该免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQID NO:67所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:52所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:67所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫细胞结合部分，该免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQID NO:74所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:59所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链可变区的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:74所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链可变区的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的免疫细胞结合部分包含来源于已知抗体如可那木单抗(Conatumumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、drozitumab、来沙木单抗(Lexatumumab)、Benufutamab、Zaptuzumab(TRAIL-R2)、Cabiralizumab、Emactuzumab、LY3022855、AMG820(CSF1R)、吉妥珠单抗(Gemtuzumab)、Vadastuximab、林妥珠单抗(Lintuzumab)(CD33)或TBI 304H(CD163)的序列(例如，CDR或VH/VL序列)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与表5的重链(HC)序列下所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链包含与表5的轻链(LC)序列下所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链的框架区中，并且CDR相对于表5中相应HC序列所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链的框架区中，并且CDR相对于表5中相应LC序列所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
如以下表5所示，HC序列中带下划线的部分表示多特异性抗体的scFv部分。重链中相应的连接体序列以小写字母显示。
表5
Figure BDA0003247743320000681
Figure BDA0003247743320000691
Figure BDA0003247743320000701
Figure BDA0003247743320000711
Figure BDA0003247743320000721
Figure BDA0003247743320000731
Figure BDA0003247743320000741
Figure BDA0003247743320000751
Figure BDA0003247743320000761
Figure BDA0003247743320000771
Figure BDA0003247743320000781
Figure BDA0003247743320000791
Figure BDA0003247743320000801
Figure BDA0003247743320000811
Figure BDA0003247743320000821
Figure BDA0003247743320000831
Figure BDA0003247743320000841
Figure BDA0003247743320000851
Figure BDA0003247743320000861
Figure BDA0003247743320000871
Figure BDA0003247743320000881
Figure BDA0003247743320000891
Figure BDA0003247743320000901
Figure BDA0003247743320000911
Figure BDA0003247743320000921
Figure BDA0003247743320000931
Figure BDA0003247743320000941
Figure BDA0003247743320000951
Figure BDA0003247743320000961
Figure BDA0003247743320000971
Figure BDA0003247743320000981
Figure BDA0003247743320000991
Figure BDA0003247743320001001
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:7或75-77所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:7或75-77所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:8所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:79-83所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:79-83所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:80所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:84-88所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:84-88所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:85所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:89、91或93所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:90、92或94所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白重链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:89、91或93所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白轻链的框架区中，并且CDR相对于SEQ ID NO:90、92或94所示的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白重链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白轻链的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2/TACSTD2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在某些实施方案中，与TROP2/TACSTD2结合的部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，与TRAIL-R2结合的部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽的重链包含与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述轻链包含与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。SEQ ID NO:7和8形成如图1A所示的双特异性分子，该双特异性分子可以与图1B所示的细胞毒性部分缀合。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽包含特异性结合TROP2的IgG，其包含轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含具有如KASQDVSIAVA(SEQ ID NO:1)所示氨基酸序列的CDR1，具有如SASYRYT(SEQ ID NO:2)所示氨基酸序列的CDR2，以及具有如QQHYITPLT(SEQ ID NO:3)所示氨基酸序列的CDR3；并且所述重链可变区包含具有NYGMN(SEQ ID NO:4)所示氨基酸序列的CDR1，具有如WINTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO:5)所示氨基酸序列的CDR2，以及具有如GGFGSSYWYFDV(SEQ ID NO:6)所示氨基酸序列的CDR3。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽包含特异性结合TROP2的scFv，其包含轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含具有如KASQDVSIAVA(SEQ ID NO:1)所示氨基酸序列的CDR1，具有如SASYRYT(SEQ ID NO:2)所示氨基酸序列的CDR2，以及具有如QQHYITPLT(SEQID NO:3)所示氨基酸序列的CDR3；并且所述重链可变区包含具有NYGMN(SEQ ID NO:4)所示氨基酸序列的CDR1，具有如WINTYTGEPTYTDDFKG(SEQ ID NO:5)所示氨基酸序列的CDR2，以及具有如GGFGSSYWYFDV(SEQ ID NO:6)所示氨基酸序列的CDR3。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，和与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:4，HCDR2包含SEQ ID NO:5，并且HCDR3包含SEQ ID NO:6。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:1，LCDR2包含SEQ ID NO:2，并且LCDR3包含SEQ ID NO:3。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:45，HCDR2包含SEQ IDNO:46，并且HCDR3包含SEQ ID NO:47。在一些情况下，与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:60，LCDR2包含SEQ ID NO:61，并且LCDR3包含SEQ ID NO:62。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:75所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，和与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:4，HCDR2包含SEQ ID NO:5，并且HCDR3包含SEQ ID NO:6。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:1，LCDR2包含SEQ ID NO:2，并且LCDR3包含SEQ ID NO:3。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:49，HCDR2包含SEQ IDNO:50，并且HCDR3包含SEQ ID NO:51。在一些情况下，与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:64，LCDR2包含SEQ ID NO:65，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:77所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，和与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:4，HCDR2包含SEQ ID NO:5，并且HCDR3包含SEQ ID NO:6。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:1，LCDR2包含SEQ ID NO:2，并且LCDR3包含SEQ ID NO:3。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:56，HCDR2包含SEQ IDNO:57，并且HCDR3包含SEQ ID NO:58。在一些情况下，与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:71，LCDR2包含SEQ ID NO:72，并且LCDR3包含SEQ ID NO:73。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:4，HCDR2包含SEQ ID NO:5，并且HCDR3包含SEQ ID NO:6。在一些情况下，与TROP2特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:1，LCDR2包含SEQ ID NO:2，并且LCDR3包含SEQ ID NO:3。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:53，HCDR2包含SEQID NO:54，并且HCDR3包含SEQ ID NO:55。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:68，LCDR2包含SEQ ID NO:69，并且LCDR3包含SEQ ID NO:70。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，和与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:13，HCDR2包含SEQ ID NO:14，并且HCDR3包含SEQ ID NO:15。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:29，LCDR2包含SEQ ID NO:30，并且LCDR3包含SEQ ID NO:31。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:45，HCDR2包含SEQ IDNO:46，并且HCDR3包含SEQ ID NO:47。在一些情况下，与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:60，LCDR2包含SEQ ID NO:61，并且LCDR3包含SEQ ID NO:62。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，和与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:13，HCDR2包含SEQ ID NO:14，并且HCDR3包含SEQ ID NO:15。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:29，LCDR2包含SEQ ID NO:30，并且LCDR3包含SEQ ID NO:31。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:49，HCDR2包含SEQID NO:50，并且HCDR3包含SEQ ID NO:51。在一些情况下，与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:64，LCDR2包含SEQ ID NO:65，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:80所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，和与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:13，HCDR2包含SEQ ID NO:14，并且HCDR3包含SEQ ID NO:15。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:29，LCDR2包含SEQ ID NO:30，并且LCDR3包含SEQ ID NO:31。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:56，HCDR2包含SEQID NO:57，并且HCDR3包含SEQ ID NO:58。在一些情况下，与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:71，LCDR2包含SEQ ID NO:72，并且LCDR3包含SEQ ID NO:73。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:81所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:80所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，和与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:17，HCDR2包含SEQ ID NO:18，并且HCDR3包含SEQ ID NO:19。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:33，LCDR2包含SEQ ID NO:34，并且LCDR3包含SEQ ID NO:35。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:45，HCDR2包含SEQ IDNO:46，并且HCDR3包含SEQ ID NO:47。在一些情况下，与CD33特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:60，LCDR2包含SEQ ID NO:61，并且LCDR3包含SEQ ID NO:62。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，和与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:17，HCDR2包含SEQ ID NO:18，并且HCDR3包含SEQ ID NO:19。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:33，LCDR2包含SEQ IDNO:34，并且LCDR3包含SEQ ID NO:35。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:49，HCDR2包含SEQ ID NO:50，并且HCDR3包含SEQ ID NO:51。在一些情况下，与CD163特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:64，LCDR2包含SEQ ID NO:65，并且LCDR3包含SEQ ID NO:66。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:85所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，和与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:17，HCDR2包含SEQ ID NO:18，并且HCDR3包含SEQ ID NO:19。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:33，LCDR2包含SEQ IDNO:34，并且LCDR3包含SEQ ID NO:35。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:56，HCDR2包含SEQ ID NO:57，并且HCDR3包含SEQ ID NO:58。在一些情况下，与CSF1R特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:71，LCDR2包含SEQ ID NO:72，并且LCDR3包含SEQ ID NO:73。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:85所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:13，HCDR2包含SEQ ID NO:14，并且HCDR3包含SEQ ID NO:15。在一些情况下，与GPC3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:29，LCDR2包含SEQ ID NO:30，并且LCDR3包含SEQ ID NO:31。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:53，HCDR2包含SEQID NO:54，并且HCDR3包含SEQ ID NO:55。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:68，LCDR2包含SEQ ID NO:69，并且LCDR3包含SEQ ID NO:70。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:80所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:17，HCDR2包含SEQ ID NO:18，并且HCDR3包含SEQ ID NO:19。在一些情况下，与FOLR1特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:33，LCDR2包含SEQ IDNO:34，并且LCDR3包含SEQ ID NO:35。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:53，HCDR2包含SEQ ID NO:54，并且HCDR3包含SEQ ID NO:55。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:68，LCDR2包含SEQ IDNO:69，并且LCDR3包含SEQ ID NO:70。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQID NO:85所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与CD33特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与CD33特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:45，HCDR2包含SEQ ID NO:46，并且HCDR3包含SEQ ID NO:47。在一些情况下，与CD33特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:60，LCDR2包含SEQ ID NO:61，并且LCDR3包含SEQ ID NO:62。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:53，HCDR2包含SEQID NO:54，并且HCDR3包含SEQ ID NO:55。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:68，LCDR2包含SEQ ID NO:69，并且LCDR3包含SEQ ID NO:70。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:90所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与CD38特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与CD38特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:21，HCDR2包含SEQ ID NO:22，并且HCDR3包含SEQ ID NO:23。在一些情况下，与CD38特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:37，LCDR2包含SEQ ID NO:38，并且LCDR3包含SEQ ID NO:39。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:53，HCDR2包含SEQID NO:54，并且HCDR3包含SEQ ID NO:55。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:68，LCDR2包含SEQ ID NO:69，并且LCDR3包含SEQ ID NO:70。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:92所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分，和与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分。在一些情况下，与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:25，HCDR2包含SEQ ID NO:26，并且HCDR3包含SEQ ID NO:27。在一些情况下，与FLT3特异性结合的肿瘤结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:41，LCDR2包含SEQ ID NO:42，并且LCDR3包含SEQ ID NO:43。在一些情况下，所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区，该免疫球蛋白重链可变区包含CDR1(HCDR1)、CDR2(HCDR2)和CDR3(HCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO:53，HCDR2包含SEQID NO:54，并且HCDR3包含SEQ ID NO:55。在一些情况下，与TRAIL-R2特异性结合的免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白轻链可变区，该免疫球蛋白轻链可变区包含CDR1(LCDR1)、CDR2(LCDR2)和CDR3(LCDR3)，其中LCDR1包含SEQ ID NO:68，LCDR2包含SEQ ID NO:69，并且LCDR3包含SEQ ID NO:70。在一些情况下，所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ IDNO:94所示的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含有效负载(例如，细胞毒性部分)。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含一个或多个Fc修饰(例如，置换)，以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力，降低ADCC功能(例如，L234、L235、P238或P331处的修饰，或其组合)，减轻嗜中性粒细胞减少症(例如，L234、S239、S442处的修饰，或其组合)，增强ADCC(例如，S239、A330、I332处的修饰，或其组合)，和/或调节铰链区刚度(例如，在S228处的修饰)。
可以调整肿瘤结合部分和免疫细胞结合部分的亲和力以减少脱靶细胞毒性作用。在某些实施方案中，肿瘤结合部分对其靶标的亲和力大于免疫细胞结合部分对其靶标的亲和力。在某些实施方案中，肿瘤结合部分对其靶标的亲和力为免疫细胞结合部分对其靶标的亲和力的约1.25倍、约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍或约10倍。在某些实施方案中，肿瘤结合部分的亲和力小于约50纳摩尔、约40纳摩尔、约30纳摩尔、约20纳摩尔、约10纳摩尔、约5纳摩尔、约4纳摩尔、约3纳摩尔、约2纳摩尔或约1纳摩尔。在某些实施方案中，免疫细胞结合部分的亲和力大于约1纳摩尔、约2纳摩尔、约3纳摩尔、约4纳摩尔、约5纳摩尔、约10纳摩尔、约20纳摩尔、约30纳摩尔、约40纳摩尔、约50纳摩尔或约100纳摩尔。在一些情况下，免疫细胞结合部分对免疫抑制细胞上表达的抗原的亲和力比肿瘤结合部分对肿瘤相关抗原的亲和力小约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍或更多。
在某些实施方案中，当本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)与细胞毒性有效负载缀合时，它们具有小于约100纳摩尔、小于约75纳摩尔、小于约50纳摩尔、小于约25纳摩尔、小于约10纳摩尔、小于约5纳摩尔的肿瘤细胞杀伤(例如，至少约75％)的EC50。在某些实施方案中，当本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)与细胞毒性有效负载缀合时，它们具有小于约100纳摩尔、小于约75纳摩尔、小于约50纳摩尔、小于约25纳摩尔、小于约10纳摩尔、小于约5纳摩尔的免疫抑制细胞杀伤(例如，至少约75％)的EC50。
在一些实施方案中，改变所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)，以增加或降低其糖基化(例如，通过改变氨基酸序列，使得产生或去除一个或多个糖基化位点)。附接至抗体Fc区的碳水化合物可以被改变。来自哺乳动物细胞的天然抗体通常包含通过N连接与Fc区的CH2结构域的Asn297附接的分支双触角寡糖(参见例如，Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997))。该寡糖可以是与双触角寡糖结构的茎中的GlcNAc附接的各种碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、唾液酸、岩藻糖。可对抗体中的寡糖进行修饰，例如，以产生具有某些改善性质的抗体变体。抗体糖基化变体可具有改善的ADCC和/或CDC功能。在一些实施方案中，提供了具有碳水化合物结构的抗体变体，该碳水化合物结构缺乏(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖。例如，此类抗体中岩藻糖的量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量通过相对于与Asn297附接的所有糖结构的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来确定(参见例如，WO 08/077546)。Asn297是指位于Fc区大致第297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号；参见例如，Edelman等人,ProcNatl Acad Sci U S A.1969年5月；63(1):78–85)。然而，由于抗体中的微小序列变异，Asn297也可以位于位置297上游或下游约±3个氨基酸，即位置294和300之间。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能(参见例如，Okazaki等人,J.Mol.Biol.
336:1239-1249(2004)；和Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004))。细胞系，例如敲除细胞系，及其使用方法，可用来产生去岩藻糖基化的抗体，例如缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞和α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除的CHO细胞(参见例如，Ripka等人,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；Yamane-Ohnuki等人,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006))。还包括其他抗体糖基化变体(参见例如，美国专利6,602,684)。
在一些实施方案中，可将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的多特异性结合多肽的Fc区中，从而产生Fc区变体。本文中的Fc区是包含恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C-末端区域。Fc区包括天然序列Fc区和变异Fc区。Fc区变体可包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)的人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。
在一些实施方案中，本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含具有一些但并非全部效应子功能的Fc变体，这使其对于其中抗体的体内半衰期至关重要而某些效应子功能(如补体和ADCC)非必需或有害的应用，成为理想的候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。在美国专利5,500,362和5,821,337中描述了用来评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例。或者，可以采用非放射性测定方法(例如，ACTITM和CytoTox
Figure BDA0003247743320001291
非放射性细胞毒性测定)。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞。
抗体和多特异性结合多肽可具有延长的半衰期和改善的与新生Fc受体(FcRn)的结合(参见，例如，US 2005/0014934)。此类抗体可包含其中具有一个或多个改善Fc区与FcRn的结合的置换的Fc区，并且包括在一个或多个以下Fc区残基处具有置换的抗体：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，其根据EU编号系统(参见，例如，美国专利7,371,826)。还考虑了Fc区变体的其他实例(参见，例如，Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利5,648,260和5,624,821；以及WO94/29351)。
在一些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含经修饰以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力的Fc区。
在一些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含经修饰以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc区。在一些情况下，该Fc区在L234、L235、P238或P331或其组合处包含修饰，其中根据EU编号惯例，L234、L235、P238和P331对应于野生型IgG1的位置234、235、238和331。在一些情况下，该Fc区在L234、L235、P238和P331处包含修饰，其中根据EU编号惯例，L234、L235、P238和P331对应于野生型IgG1的位置234、235、238和331。在一些情况下，该Fc区包含L234A、L235A、P238S、P331S或其组合。在一些情况下，该Fc区包含L234A、L235A、P238S和P331S。
在一些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含经修饰以减轻嗜中性粒细胞减少症的Fc区。在一些情况下，该Fc区在L234、S239、S442或其组合处包含修饰，其中根据EU编号惯例，L234、S239和S442对应于野生型IgG1的位置234、239、442。在一些情况下，该Fc区包含L234F、S239C、S442C或其组合。
在一些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含经修饰以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc区。在一些情况下，该Fc区在S239、A330、I332或其组合处包含修饰，其中根据EU编号惯例，S239、A330和I332对应于野生型IgG1的位置239、330和332。在一些情况下，该Fc区包含S239D、A330L、I332E或其组合。在一些情况下，该Fc区包含S239D、A330L和I332E。
在一些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含对铰链区的修饰。在一些情况下，该铰链区在S228处包含修饰，其中根据EU编号惯例，S228对应于野生型IgG4的位置228。在一些情况下，该铰链区包含S228P。
在一些实施方案中，可能需要产生半胱氨酸变体多特异性结合多肽，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基置换。在一些实施方案中，置换的残基出现在抗体的可及位点。反应性巯基可以位于用于与其他部分如药物部分或连接体药物部分缀合以产生免疫缀合物的位点处。在一些实施方案中，以下残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸置换：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A114(Kabat编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可以被进一步修饰，以包含已知和可用的额外的非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可以在生产上具有优势。该聚合物可以具有任何分子量，并且可以是分支的或非分支的。与抗体附接的聚合物的数目可以变化，并且如果附接了两个或更多个聚合物，则这些聚合物可以是相同或不同的分子。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含聚乙二醇分子，该聚乙二醇分子的平均分子量例如为约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da。
在一些实施方案中，聚环氧烷(例如PEG)是离散的PEG，其中该离散的PEG是包含多于一个重复环氧乙烷单元的聚合PEG。在一些实施方案中，离散的PEG(dPEG)包含2至60、2至50或2至48个重复的环氧乙烷单元。在一些实施方案中，dPEG包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、42、48、50个或更多个重复的环氧乙烷单元。在这样的实施方案中，本文提供的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含离散的PEG，该离散的PEG包含例如2至60、2至50或2至48个重复的环氧乙烷单元。
在一些实施方案中，本文还公开了一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
在一些实施方案中，本文公开了一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:7或75-77所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
在一些实施方案中，本文公开了一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:79-83所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
在一些实施方案中，本文公开了一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:84-88所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
在一些实施方案中，本文公开了一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:89、91或93所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:90、92或94所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
在一些实施方案中，本文公开了一种编码多特异性抗体的核酸，该多特异性抗体包含表1和表2中公开的VH和VL，并且任选地与表3和表4的VH和VL组合。
在一些实施方案中，本文另外公开了一种包含编码多特异性抗体的核酸的载体，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。在一些情况下，该载体包括病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或嵌合病毒载体)。在另外的情况下，该载体包括非病毒载体。
靶标选择方法
在某些实施方案中，本文描述了一种为了产生用于治疗癌症的多特异性多肽分子(例如，多特异性抗体)而选择第一靶受体和第二靶受体的方法。在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：
a.选择在通过IHC确定强度评分为+2至+3的肿瘤中检测到的癌细胞中表达的抗原/受体，并且/或者选择在表达水平评分为RNASeqV2(Log)>5的肿瘤中检测到的癌细胞中表达的抗原/受体；
b.选择在通过IHC确定强度评分为+2至+3的肿瘤中检测到的免疫抑制细胞中表达的抗原/受体，并且/或者选择在表达水平评分为RNASeqV2(Log)>5的肿瘤中检测到的免疫抑制细胞中表达的抗原/受体；以及
c.选择在表达水平评分为RNASeqV2(Log)>5的相同肿瘤中检测到的各自细胞类型中的抗原/受体，并且/或者选择在通过IHC确定强度评分为+2至+3的相同肿瘤中检测到的各自细胞类型中的抗原/受体；
其中各自细胞类型中选定的靶标在通过IHC确定强度评分为0至+1的非肿瘤组织中表达，并且/或者各自细胞类型中选定的靶标在表达水平评分为RNASeqV2(Log)<4的非肿瘤组织中表达。在某些实施方案中，通过分析癌症基因组数据库来选择受体，该数据库通过估计RNA水平、蛋白质水平和IHC染色强度来报告受体的表达水平。在某些实施方案中，通过使用执行步骤a-c的数据分析软件分析癌症基因组数据库来选择受体。
多特异性结合多肽的产生
本文包括制备多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的方法。多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可以通过本领域已知的若干方法产生。例如，多特异性结合多肽可由核酸编码。该核酸可以是，例如，质粒或病毒载体，然后将其转移至合适的细胞系，例如真核宿主细胞或原核宿主细胞。
示例性的哺乳动物宿主细胞包括293T细胞系、293A细胞系、293FT细胞系、293F细胞、293H细胞、A549细胞、MDCK细胞、CHO DG44细胞、CHO-S细胞、CHO-K1细胞、Expi293FTM细胞、Flp-InTMT-RExTM293细胞系、Flp-InTM-293细胞系、Flp-InTM-3T3细胞系、Flp-InTM-BHK细胞系、Flp-InTM-CHO细胞系、Flp-InTM-CV-1细胞系、Flp-InTM-Jurkat细胞系、FreeStyleTM293-F细胞、FreeStyleTMCHO-S细胞、GripTiteTM293MSR细胞系、GS-CHO细胞系、HCC-38、HCC-1806、HepaRGTM细胞、MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231、SK-BR-3、T-RExTMJurkat细胞系、Per.C6细胞、T-RExTM-293细胞系、T-RExTM-CHO细胞系和T-RExTM-HeLa细胞系。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是昆虫宿主细胞。示例性的昆虫宿主细胞包括果蝇S2细胞、Sf9细胞、Sf21细胞、High FiveTM细胞和expresSF+
Figure BDA0003247743320001341
细胞。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是酵母宿主细胞。示例性的酵母宿主细胞包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)酵母菌株，如GS115、KM71H、SMD1168、SMD1168H和X-33；以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株，如INVScl。
在一些实施方案中，真核宿主细胞是植物宿主细胞。在一些实施方案中，该植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性的植物细胞系包括来自莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)137c或细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PPC 7942的株。
在一些实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞包括BL21、Mach1TM、DH10BTM、TOP10、DH5α、DH10BacTM、OmniMaxTM、MegaXTM、DH12STM、INV110、TOP10F’、INVαF、TOP10/P3、ccdB Survival、PIR1、PIR2、Stbl2TM、Stbl3TM或Stbl4TM。
在一些实施方案中，质粒载体包括来自细菌(例如大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如巴斯德毕赤酵母)、藻类或哺乳动物来源的载体。细菌载体包括，例如，pACYC177、pASK75、pBAD载体系列、pBADM载体系列、pET载体系列、pETM载体系列、pGEX载体系列、pHAT、pHAT2、pMal-c2、pMal-p2、pQE载体系列、pRSET A、pRSET B、pRSET C、pTrcHis2系列、pZA31-Luc、pZE21-MCS-1、pFLAG ATS、pFLAG CTS、pFLAG MAC、pFLAG Shift-12c、pTAC-MAT-1、pFLAG CTC或pTAC-MAT-2。
昆虫载体包括，例如，pFastBac1、pFastBac DUAL、pFastBac ET、pFastBac HTa、pFastBac HTb、pFastBac HTc、pFastBac M30a、pFastBact M30b、pFastBac、M30c、pVL1392、pVL1393、pVL1393 M10、pVL1393M11、pVL1393 M12、FLAG载体如pPolh-FLAG1或pPolh-MAT2，或者MAT载体如pPolh-MAT1或pPolh-MAT2。
酵母载体包括，例如，
Figure BDA0003247743320001351
pDESTTM14载体、
Figure BDA0003247743320001352
pDESTTM15载体、
Figure BDA0003247743320001353
pDESTTM17载体、
Figure BDA0003247743320001355
pDESTTM24载体、
Figure BDA0003247743320001354
pYES-DEST52载体、pBAD-DEST49
Figure BDA0003247743320001356
目标载体、pAO815毕赤酵母载体、pFLD1巴斯德毕赤酵母载体、pGAPZA、B和C巴斯德毕赤酵母载体、pPIC3.5K毕赤酵母载体、pPIC6 A、B和C毕赤酵母载体、pPIC9K毕赤酵母载体、pTEF1/Zeo、pYES2酵母载体、pYES2/CT酵母载体、pYES2/NT A、B和C酵母体或pYES3/CT酵母载体。藻类载体包括，例如，pChlamy-4载体或MCS载体。
哺乳动物载体包括，例如，瞬时表达载体或稳定表达载体。示例性的哺乳动物瞬时表达载体包括p3xFLAG-CMV 8、pFLAG-Myc-CMV19、pFLAG-Myc-CMV 23、pFLAG-CMV 2、pFLAG-CMV 6a,b,c、pFLAG-CMV 5.1、pFLAG-CMV 5a,b,c、p3xFLAG-CMV 7.1、pFLAG-CMV 20、p3xFLAG-Myc-CMV 24、pCMV-FLAG-MAT1、pCMV-FLAG-MAT2、pBICEP-CMV 3或pBICEP-CMV 4。示例性的哺乳动物稳定表达载体包括pFLAG-CMV 3、p3xFLAG-CMV 9、p3xFLAG-CMV 13、pFLAG-Myc-CMV 21、p3xFLAG-Myc-CMV 25、pFLAG-CMV 4、p3xFLAG-CMV 10、p3xFLAG-CMV14、pFLAG-Myc-CMV 22、p3xFLAG-Myc-CMV 26、pBICEP-CMV 1或pBICEP-CMV 2。
然后可以在合适的条件下培养包含编码多特异性结合多肽的核酸的细胞系，使得该多特异性结合多肽得到表达并分泌到细胞上清液中。细胞上清液可以经历一个或多个步骤，包括过滤、离心、沉淀、通过离子交换的纯化、蛋白A/G亲和层析、透析、脱盐或缓冲液交换。
在一些实施方案中，通过常规技术(例如，病毒转导、电穿孔、脂质体转染、磷酸钙沉淀)将包含多特异性结合多肽的核苷酸序列的表达载体转移至宿主细胞，然后培养经转染的细胞，以产生该多特异性结合多肽。在特定的实施方案中，该多特异性结合多肽的表达由组成型、诱导型或组织特异性启动子调节。
在一些实施方案中，采用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的多特异性结合多肽。此类宿主表达系统代表通过其产生多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的编码序列并随后纯化的媒介，但也代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达多特异性结合多肽的细胞。这些包括但不限于微生物，如用含有多特异性结合多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；用含有多特异性结合多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；用含有多特异性结合多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒(TMV))感染的或用含有多特异性结合多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BH、293、293T、3T3细胞)，该构建体含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。
为了长期、高产量地产生重组蛋白，优选稳定的表达。在一些实施方案中，任选地工程改造稳定表达多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的细胞系。宿主细胞不是使用含有病毒复制起点的表达载体，而是用由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA来转化。引入外源DNA后，然后使工程化细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换至选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予对选择的抗性，并允许细胞将该质粒稳定整合到其染色体中并生长以形成转化灶，继而将其克隆并扩充成细胞系。该方法可以有利地用来工程改造表达多特异性结合多肽的细胞系。
在一些实施方案中，使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人,1977,Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska&Szybalski,192,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:202)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人,1980,Cell22:817)基因，它们分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用。另外，使用抗代谢物抗性作为选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:357；O'Hare等人,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Clinical Pharmacy 12:488-505；Wu和Wu,1991,Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev,1993,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan,1993,Science 260:926-932；以及Morgan和Anderson,1993,Ann.Rev.Biochem.62:191-217；1993年5月,TIB TECH11(5):155-215)，和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,1984,Gene30:147)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等人(编,1993,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY；Kriegler,1990,Gene Transfer and Expression,ALaboratory Manual,Stockton Press,NY；以及第12和13章,Dracopoli等人(编),1994,Current Protocols inHuman Genetics,John Wiley&Sons,NY.；Colberre-Garapin等人,1981,J.Mol.Biol.150:1)。
在一些实施方案中，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的表达水平通过载体扩增而增加(有关综述，请参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based ongene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning,Vol.3.(Academic Press,New York,1987))。当表达多特异性结合多肽的载体系统中的标记可扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂水平的增加将增加该标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与多特异性结合多肽的核苷酸序列相关联，因此多特异性结合多肽的产生也将增加(Crouse等人,1983,Mol.Cell Biol.3:257)。
在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)在无细胞系统中产生。在一些实施方案中，无细胞系统包含来自细胞的细胞质和/或细胞核组分的混合物，并且适用于体外核酸合成。在一些实施方案中，无细胞系统利用原核细胞组分。在其他实施方案中，无细胞系统利用真核细胞组分。核酸合成是在基于例如果蝇细胞、爪蟾卵、古菌或HeLa细胞的无细胞系统中获得的。示例性的无细胞系统包括大肠杆菌S30 Extract系统、大肠杆菌T7 S30系统或
Figure BDA0003247743320001381
XpressCF和XpressCF+。
细胞毒性有效负载
在某些实施方案中，本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可以与有效负载(例如，细胞毒性部分)缀合，如图1B所示。这些细胞毒性部分是专门用来杀死肿瘤和免疫抑制细胞的有效负载。在某些实施方案中，所述多特异性多肽分子包含至少一个细胞毒性部分。在其他实施方案中，所述多特异性多肽分子包含两个或更多个细胞毒性部分。
在一些实施方案中，所述细胞毒性有效负载包括微管破坏剂。示例性微管破坏剂包括但不限于2-甲氧基雌二醇、查耳酮、秋水仙碱、考布他汀、dictyostatin、盘皮海绵内酯(discodermolide)、软珊瑚醇(eleutherobin)、埃坡霉素(epothilone)、laulimalide、peloruside、鬼臼毒素、紫杉烷、念珠藻素(cryptophycin)、软海绵素(halichondrin)、美登木素(maytansine)、phomopsin、根霉素(rhizoxin)、海绵抑制素、微管溶素(tubulysin)、长春花生物碱、noscapinoid、澳瑞他汀、dolastain或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，所述细胞毒性有效负载是考布他汀(combretastatin)，或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，考布他汀的类似物是奥拉布林(ombrabulin)。在一些实施方案中，所述埃坡霉素是埃坡霉素B、帕妥匹隆(patupilone)、伊沙匹隆(ixabepilone)、沙戈匹隆(sagopilone)、BMS-310705或BMS-247550。在一些实施方案中，所述微管溶素是微管溶素类似物或衍生物，例如在美国专利8580820和8980833以及美国公开20130217638、20130224228和201400363454中所描述的。在一些实施方案中，所述美登木素是美登木素生物碱(maytansinoid)。在一些实施方案中，该美登木素生物碱是DM1、DM4或安丝菌素。在一些实施方案中，该美登木素生物碱是DM1。在一些实施方案中，该美登木素生物碱是DM4。在一些实施方案中，该美登木素生物碱是安丝菌素。在一些实施方案中，该美登木素生物碱是美登木素生物碱衍生物或类似物，例如美国专利5208020、5416064、7276497和6716821或美国公开2013029900和US20130323268中所描述的。在一些实施方案中，所述紫杉烷是紫杉醇或多西紫杉醇。在一些实施方案中，所述长春花生物碱是长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、desoxyvincaminol、vincaminol、长春蔓晶(vincamajine)、长春内日定(vineridine)、长春布宁(vinburnine)、长春西汀(vinpocetine)或长春胺(vincamine)。
在一些实施方案中，所述细胞毒性有效负载是尾海兔素，或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，该尾海兔素是尾海兔素10或尾海兔素15，或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，该尾海兔素10类似物是澳瑞他汀、索利多丁(soblidotin)、symplostatin 1或symplostatin 3。在一些实施方案中，该尾海兔素10类似物是澳瑞他汀或澳瑞他汀衍生物。在一些实施方案中，该澳瑞他汀或澳瑞他汀衍生物是澳瑞他汀E(AE)、澳瑞他汀F(AF)、澳瑞他汀E5-苯甲酰基戊酸酯(AEVB)、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(MMAF)或单甲基澳瑞他汀D(MMAD)、澳瑞他汀PE或澳瑞他汀PYE。在一些实施方案中，该澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，该澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。在一些实施方案中，该澳瑞他汀是澳瑞他汀衍生物或类似物，例如在美国专利6884869、7659241、7498298、7964566、7750116、8288352、8703714和887177中所描述的。在一些实施方案中，该尾海兔素15类似物是西马多丁或他西多汀。
在一些实施方案中，所述细胞毒性有效负载包括DNA修饰剂。在一些实施方案中，该DNA修饰剂包括安吖啶、蒽环霉素、喜树碱、多柔比星、多卡米星、烯二炔、依托泊苷、吲哚并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001401
、纺缍菌素(netropsin)、替尼泊苷、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001402
或其衍生物或类似物。在一些实施方案中，所述蒽环霉素是多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素、光神霉素、奈莫柔比星、匹克生琼(pixantrone)、沙柔比星(sabarubicin)或戊柔比星。在一些实施方案中，所述喜树碱的类似物是拓扑替康、伊立替康、silatecan、可司替康(cositecan)、依沙替康(exatecan)、勒托替康(lurtotecan)、吉马替康(gimatecan)、贝洛替康(belotecan)、芦比替康(rubitecan)或SN-38。在一些实施方案中，所述多卡米星是多卡米星A、多卡米星B1、多卡米星B2、多卡米星C1、多卡米星C2、多卡米星D、多卡米星SA或CC-1065。在一些实施方案中，所述烯二炔是加利车霉素、埃斯波霉素或dynemicin A。
在一些实施方案中，所述细胞毒性有效负载是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001404
。在一些实施方案中，所述吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001403
是安曲霉素、abbeymycin、chicamycin、DC-81、甲基氨茴霉素(mazethramycin)、新茴霉素A、新茴霉素B、porothramycin、prothracarcin、西班米星(sibanomicin)(DC-102)、西伯里亚霉素(sibiromycin)或托马霉素(tomaymycin)。在一些实施方案中，该吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001405
是托马霉素衍生物，例如美国专利8404678和8163736中所描述的。在一些实施方案中，该吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001406
如美国专利8426402、8802667、8809320、6562806、6608192、7704924、7067511、US7612062、7244724、7528126、7049311、8633185、8501934和8697688以及美国公开US20140294868所述。
在一些实施方案中，所述吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001411
是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001414
二聚体。在一些实施方案中，该PBD二聚体是对称二聚体。对称PBD二聚体的实例包括但不限于SJG-136(SG-2000)、ZC-423(SG2285)、SJG-720、SJG-738、ZC-207(SG2202)和DSB-120。在一些实施方案中，该PBD二聚体是不对称的二聚体。不对称PBD二聚体的实例包括但不限于SJG-136衍生物，例如美国专利8697688和9242013以及美国公开20140286970中所描述的。
在某些实施方案中，所述至少一个细胞毒性部分包含澳瑞他汀衍生物、美登木素、美登木素生物碱、紫杉烷、加利车霉素、西马多丁、多卡米星、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001413
(PBD)或微管溶素。所述澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。在某些实施方案中，该美登木素生物碱是DM1(emtansine)。在某些实施方案中，该美登木素生物碱是DM2(mertansine)或DM4(ravtansine/soravtansine)。在某些实施方案中，该吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001415
是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320001412
二聚体。
细胞毒性部分可以以合适的化学计量与多特异性结合多肽缀合。在某些实施方案中，细胞毒性部分以约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约9:1、约10:1、约11:1、约12:1、约13:1、约14:1、约15:1、约16:1、约18:1或约20:1的细胞毒性部分:多特异性结合多肽的比例缀合。
连接体
在某些实施方案中，所述细胞毒性部分通过合适的连接体分子与赖氨酸残基、半胱氨酸残基或赖氨酸和半胱氨酸残基缀合。在某些实施方案中，该连接体是可切割连接体。在某些实施方案中，该连接体是pH可切割的连接体。在某些实施方案中，该连接体是酶可切割的连接体。在某些实施方案中，该连接体是蛋白酶敏感性连接体。在某些实施方案中，该酶切连接体是缬氨酸-瓜氨酸连接体。在某些实施方案中，该连接体是自牺牲连接体。在某些实施方案中，该连接体是不可切割的连接体。在某些实施方案中，该连接体包括零长度连接体、同双官能连接体、异双官能连接体、二肽连接体、间隔区、基于马来酰亚胺的缀合部分，或其组合。在某些实施方案中，该连接体包含聚合物。在某些实施方案中，该聚合物包括直链或支链聚乙二醇。在某些实施方案中，该连接体是肽。在某些实施方案中，该连接体是拟肽连接体。在某些实施方案中，该连接体是硫醚连接体。
示例性的同双官能连接体包括但不限于Lomant试剂二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)DSP、3'3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亚胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基DST)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯(DSG)、N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)、二亚胺代己二酸二甲酯(DMA)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、3,3'-二硫代二丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、1,4-二-(3'-(2'-吡啶基二硫代)丙酰胺基)丁烷(DPDPB)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)、含芳基卤的化合物(DFDNB)，例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯或1,3-二氟-4,6-二硝基苯、4,4'-二氟-3,3'-二硝基苯基砜(DFDNPS)、双-[β-(4-叠氮基水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED)、甲醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、己二酸二酰肼、碳酰肼、邻甲苯胺、3,3'-二甲基联苯胺、联苯胺、α,α'-对二氨基二苯基、二碘-对二甲苯磺酸、N,N'-亚乙基-双(碘乙酰胺)或N,N'-六亚甲基-双(碘乙酰胺)。
在一些实施方案中，所述连接体包括异双官能连接体。示例性的异双官能连接体包括但不限于胺反应性和巯基交联体，如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(sPDP)、长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(LC-sPDP)、水溶性长链N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(磺基-LC-sPDP)、琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(sMPT)、磺基琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代]-甲苯甲酰胺基]己酸酯(磺基-LC-sMPT)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBs)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBs)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(sIAB)、磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(磺基-sIAB)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(sMPB)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(磺基-sMPB)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(GMBs)、N-(γ-马来酰亚胺基丁酰基氧基)磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-GMBs)、琥珀酰亚胺基6-((碘乙酰基)氨基)己酸酯(sIAX)、琥珀酰亚胺基6-[6-(((碘乙酰基)氨基)己酰基)氨基]己酸酯(sIAXX)、琥珀酰亚胺基4-(((碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-甲酸酯(sIAC)、琥珀酰亚胺基6-((((4-(碘乙酰基)氨基)甲基)环己烷-1-羰基)氨基)己酸酯(sIACX)、对硝基苯基碘乙酸酯(NPIA)，羰基反应性和巯基反应性交联剂，如4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸酰肼(MPBH)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-酰肼-8(M2C2H)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基酰肼(PDPH)，胺反应性和光反应性交联体，如N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(NHs-AsA)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基水杨酸(磺基-NHs-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-(4-叠氮基水杨酰胺基)己酸酯(磺基-NHs-LC-AsA)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰胺基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAsD)、N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HsAB)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(磺基-HsAB)、N-琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(sANPAH)、磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(磺基-sANPAH)、N-5-叠氮基-2-硝基苯甲酰基氧基琥珀酰亚胺(ANB-NOs)、磺基琥珀酰亚胺基-2-(间叠氮基-邻硝基苯甲酰胺基)-乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAND)、N-琥珀酰亚胺基-4(4-叠氮基苯基)1,3'-二硫代丙酸酯(sADP)、N-磺基琥珀酰亚胺基(4-叠氮基苯基)-1,3'-二硫代丙酸酯(磺基-sADP)、磺基琥珀酰亚胺基4-(对叠氮基苯基)丁酸酯(磺基-sAPB)、磺基琥珀酰亚胺基2-(7-叠氮基-4-甲基香豆素-3-乙酰胺)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯(sAED)、磺基琥珀酰亚胺基7-叠氮基-4-甲基香豆素3-乙酸酯(磺基-sAMCA)、对硝基苯基重氮基丙酮酸(pNPDP)、对硝基苯基-2-重氮基-3,3,3-三氟丙酸酯(PNP-DTP)，巯基反应性和光反应性交联体，如1-(对叠氮基水杨酰胺基)-4-(碘乙酰胺基)丁烷(AsIB)、N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3'-(2'-吡啶基二硫基)丙酰胺(APDP)、苯甲酮-4-碘乙酰胺，苯甲酮-4-马来酰亚胺羰基反应性和光反应性交联体，如对叠氮基苯甲酰基酰肼(ABH)，羧酸反应性和光反应性交联体，如4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁胺(AsBA)，以及精氨酸反应性和光反应性交联体，如对叠氮基苯基乙二醛(APG)。
在一些实施方案中，该连接体包含反应性官能团。在一些实施方案中，该反应性官能团包括对存在于结合部分上的亲电子基团具有反应性的亲核基团。示例性的亲电子基团包括羰基——如醛、酮、羧酸、酯、酰胺、烯酮、酰基卤或酸酐。在一些实施方案中，所述反应性官能团是醛。示例性的亲核基团包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼。
在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团。在一些实施方案中，该马来酰亚胺基团也被称为马来酰亚胺间隔基。在一些实施方案中，该马来酰亚胺基团进一步包含己酸，从而形成马来酰亚胺基己酰基(mc)。在一些实施方案中，该连接体包含马来酰亚胺基己酰基(mc)。在一些实施方案中，该连接体是马来酰亚胺基己酰基(mc)。在其他实施方案中，该马来酰亚胺基团包括以上描述的马来酰亚胺基甲基，如琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(sMCC)或磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(磺基-sMCC)。
在一些情况下，所述马来酰亚胺基团是自稳定马来酰亚胺。在一些实施方案中，该自稳定马来酰亚胺利用二氨基丙酸(DPR)掺入与马来酰亚胺相邻的碱性氨基，以提供硫代琥珀酰亚胺环水解的分子内催化，从而避免马来酰亚胺通过逆Michael反应经历消除反应。在一些实施方案中，该自稳定马来酰亚胺是Lyon等人,“Self-hydrolyzing maleimidesimprove the stability and pharmacological properties of antibody-drugconjugates,”Nat.Biotechnol.32(10):1059-1062(2014)描述的马来酰亚胺基团。在一些实施方案中，该连接体包含自稳定马来酰亚胺。在一些实施方案中，该连接体是自稳定马来酰亚胺。
在一些实施方案中，所述连接体包含肽部分。在一些实施方案中，该肽部分包含至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，该肽部分是可切割的肽部分(例如，酶促或化学地)。在一些实施方案中，该肽部分是不可切割的肽部分。在一些情况下，该肽部分包含Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:142)、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO:143)或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ IDNO:144)。在一些实施方案中，所述连接体包含肽部分，如：Val-Cit(缬氨酸-瓜氨酸)、Gly-Gly-Phe-Gly(SEQ ID NO:142)、Phe-Lys、Val-Lys、Gly-Phe-Lys、Phe-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Arg、Phe-Cit、Phe-Arg、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQID NO:143)或Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO:144)。在一些实施方案中，该连接体包含Val-Cit。在一些实施方案中，该连接体是Val-Cit。
在一些实施方案中，所述连接体包含苯甲酸基团或其衍生物。在一些实施方案中，该苯甲酸基团或其衍生物包含对氨基苯甲酸(PABA)。在一些实施方案中，该苯甲酸基团或其衍生物包含γ-氨基丁酸(GABA)。
在一些实施方案中，所述连接体包含任意组合的马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团中的一种或多种。在一些实施方案中，所述连接体包含马来酰亚胺基团、肽部分和/或苯甲酸基团的组合。在一些实施方案中，该马来酰亚胺基团是马来酰亚胺己酰基(mc)。在一些实施方案中，该肽基团是val-cit。在一些实施方案中，该苯甲酸基团是PABA。在一些实施方案中，该连接体包含mc-val-cit基团。在一些实施方案中，该连接体包含val-cit-PABA基团。在另外的实施方案中，该连接体包含mc-val-cit-PABA基团。
在一些实施方案中，所述连接体是自牺牲连接体或自消除连接体。在一些实施方案中，该连接体是自牺牲连接体。在其他实施方案中，该连接体是自消除连接体(例如，环化自消除连接体)。在一些实施方案中，该连接体包括美国专利9,089,614或PCT公开WO2015038426中描述的连接体。
在一些实施方案中，所述连接体是无痕连接体或者在切割后不会给本文所述的有效负载或多特异性结合多肽留下连接体部分(例如，原子或连接体基团)的连接体。示例性的无痕连接体包括但不限于锗连接体、硅连接体、硫连接体、硒连接体、氮连接体、磷连接体、硼连接体、铬连接体或苯酰肼连接体。在一些实施方案中，该连接体是如Hejesen等人,“A traceless aryl-triazene linker for DNA-directed chemistry,”Org Biomol Chem11(15):2493-2497(2013)描述的无痕芳基-三氮烯连接体。在一些实施方案中，该连接体是Blaney等人,“Traceless solid-phase organic synthesis,”Chem.Rev.102:2607-2024(2002)描述的无痕连接体。在一些实施方案中，连接体是美国专利6,821,783中描述的无痕连接体。
在一些实施方案中，所述连接体是树枝型连接体。在一些实施方案中，该树枝型连接体包含支化的多官能连接体部分。在一些实施方案中，该树枝型连接体包含PAMAM树状聚体。
在一些实施方案中，所述连接体是酸可切割的连接体。在一些实施方案中，该酸可切割的连接体包含对水解切割敏感的腙连接。在一些实施方案中，该酸可切割的连接体包括硫代马来酰胺酸连接体。在一些实施方案中，该酸可切割的连接体是如Castaneda等人,“Acid-cleavable thiomaleamic acid linker for homogeneous antibody-drugconjugation,”Chem.Commun.49:8187-8189(2013)所述的硫代马来酰胺酸连接体。
在一些实施方案中，所述连接体是美国专利6,884,869；7,498,298；8,288,352；8,609,105；或8,697,688；美国专利公开号2014/0127239；2013/028919；2014/286970；2013/0309256；2015/037360；或2014/0294851；或PCT公开号WO2015057699；WO2014080251；WO2014197854；WO2014145090；或WO2014177042所述的连接体。
缀合化学
各种缀合反应在本文中描述，并且考虑用于使本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)与有效负载(例如，细胞毒性有效负载)反应。在一些实施方案中，该反应发生在本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)中的天然(“规范”)氨基酸处。在一些实施方案中，用于缀合的氨基酸是在野生型序列中发现的天然氨基酸，或者该氨基酸已被突变。在一些实施方案中，缀合反应包括在半胱氨酸残基处形成二硫键。在一些实施方案中，缀合反应包括半胱氨酸或赖氨酸的1,4-Michael加成反应。在一些实施方案中，缀合反应包括半胱氨酸的氰基苯并噻唑连接。在一些实施方案中，缀合反应包括与丙酮部分如1,3-二氯-2-丙酮的交联。在一些实施方案中，缀合反应包括通过半胱氨酸与O-均三甲苯磺酰基羟胺反应形成的脱氢丙氨酸的1,4-Michael加成。在一些实施方案中，缀合反应包括酪氨酸与三唑啉二酮(TAD)或TAD衍生物的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括色氨酸与铑卡宾体(carbenoid)的反应。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过化学连接方法与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过自然连接与有效负载缀合。在一些情况下，该缀合如下所述：Dawson等人.“Synthesis of proteins by nativechemical ligation,”Science 1994,266,776-779；Dawson等人.“Modulation ofReactivity in Native Chemical Ligation through the Use of Thiol Additives,”J.Am.Chem.Soc.1997,119,4325-4329；Hackeng等人.“Protein synthesis by nativechemical ligation:Expanded scope by using straightforward methodology.,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999,96,10068-10073；或Wu等人,“Building complexglycopeptides:Development of a cysteine-free native chemical ligationprotocol,”Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,4116-4125。在一些情况下，该缀合如美国专利8,936,910所述。在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过自然连接化学位点特异性地或非特异性地与有效负载缀合。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过“点击”化学与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，该缀合反应包括1,3-二极环加成反应。在一些实施方案中，该1,3-二极环加成反应包括叠氮化物和膦的反应(“点击”反应)。在一些实施方案中，所述缀合反应被铜催化。在一些实施方案中，该缀合反应包括叠氮化物与张力(strained)烯烃的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括叠氮化物与张力(strained)炔烃的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括叠氮化物与环炔，例如OCT、DIFO、DIFBO、DIBO、BARAC、TMTH或其他张力环炔的反应，其结构在Gong,Y.,Pan,L.Tett.Lett.2015,56,2123中显示。在一些实施方案中，1,3-二极环加成反应被光催化(“光点击”)。在一些实施方案中，缀合反应包括末端烯丙基与四唑和光的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括末端炔基与四唑和光的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括O-烯丙基氨基酸与四嗪和光的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括O-烯丙基酪氨酸与四嗪和光的反应。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过
Figure BDA0003247743320001482
位点特异性缀合技术(Life Technologies Corporation)与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，
Figure BDA0003247743320001481
位点特异性缀合化学包括Fc-聚糖重塑，其包括抗体的去糖基化，以允许使用点击化学进行位点特异性缀合。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过GlycoConnectTM缀合技术(Synaffix BV)与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，GlycoConnectTM缀合技术利用两个天然存在的聚糖锚定点的酶促修饰来参与位点特异性缀合。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过免疫球蛋白结合肽与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，免疫球蛋白结合肽利用IgG Fc亲和试剂将细胞毒性有效负载直接缀合至多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过AJICAPTM缀合技术(Ajinomoto Co.Inc.)与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，AJICAPTM缀合技术利用一类IgG Fc亲和试剂将一种或多种细胞毒性有效负载直接缀合至多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过缀合反应与上文所述的有效负载缀合，该缀合反应包括包含二烯和亲二烯体的反电子需求环加成反应。在一些实施方案中，该二烯包括四嗪。在一些实施方案中，该亲二烯体包括烯烃。在一些实施方案中，该亲二烯体包括炔烃。在一些实施方案中，该炔烃是张力炔烃。在一些实施方案中，该烯烃是张力二烯。在一些实施方案中，该炔烃是反式环辛炔。在一些实施方案中，该炔烃是环辛烯。在一些实施方案中，该烯烃是环丙烯。在一些实施方案中，该烯烃是氟环丙烯。在一些实施方案中，缀合反应导致形成经由在环中包含两个氮原子的6元环杂环附接至连接体或有效负载的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过包括烯烃复分解反应的缀合反应与上文所述的有效负载缀合。在一些实施方案中，缀合反应包括烯烃和炔烃与钌催化剂的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括两个烯烃与钌催化剂的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括两个炔烃与钌催化剂的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括烯烃或炔烃与钌催化剂和包含烯丙基的氨基酸的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括烯烃或炔烃与钌催化剂和包含烯丙基硫醚或硒化物的氨基酸的反应。在一些实施方案中，钌催化剂是Hoveda-Grubbs第2代催化剂。在一些实施方案中，烯烃复分解反应包括一种或多种张力烯烃或炔烃的反应。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过包括交叉偶合反应的缀合反应与上文所述的有效负载缀合。在一些实施方案中，交叉偶合反应包含过渡金属催化剂，如铱、金、钌、铑、钯、镍、铂或其他过渡金属催化剂和一种或多种配体。在一些实施方案中，过渡金属催化剂是水溶性的。在一些实施方案中，缀合反应包括Suzuki-Miyaura交叉偶合反应。在一些实施方案中，缀合反应包括芳基卤(或三氟甲烷磺酸酯或甲苯磺酸酯)、芳基或烯基硼酸和钯催化剂的反应。在一些实施方案中，缀合反应包括Sonogashira交叉偶合反应。在一些实施方案中，缀合反应包括芳基卤(或三氟甲烷磺酸酯或甲苯磺酸酯)、炔烃和钯催化剂的反应。在一些实施方案中，交叉偶合反应导致连接体或有效负载经由碳-碳键附接至多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过利用“无痕”偶合技术(Philochem)的定点方法与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，“无痕”偶合技术利用多特异性结合多肽上的N末端1,2-氨基硫醇基团，然后将其与含有醛基的有效负载缀合。(参见Casi等人,“Site-specific traceless couplingof potent cytotoxic drugs to recombinant antibodies for pharmacodelivery,”JACS 134(13):5887-5892(2012))。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过定点方法与上文所述的有效负载缀合，该定点方法利用掺入到该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)中的非天然氨基酸。在一些情况下，该非天然氨基酸包括对乙酰基苯丙氨酸(pAcPhe)。在一些情况下，pAcPhe的酮基与烷氧基-胺衍生的缀合部分选择性偶联，以形成肟键。(参见Axup等人,“Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids,”PNAS 109(40):16101-16106(2012))。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过利用酶催化过程的定点方法与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，该定点方法利用SMARTagTM技术(Catalent Biologics)。在一些情况下，SMARTagTM技术包括在醛标签的存在下通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)通过氧化过程从半胱氨酸生成甲酰甘氨酸(FGly)残基，以及随后通过肼基-Pictet-Spengler(HIPS)连接使FGly与烷基肼官能化的多特异性结合多肽(例如，官能化的多特异性抗体，任选地官能化的双特异性抗体)缀合。在一些情况下，将6个氨基酸的共有序列并入多特异性抗体(任选地，双特异性抗体)的重链、轻链或两条链中，以供被FGE识别，以生成用于与有效负载进行位点特异性缀合的功能性醛基团。在一些情况下，6个氨基酸的共有序列是LCXPXR，其中X是任何氨基酸。在一些情况下，将6个氨基酸的共有序列并入多特异性抗体(任选地，双特异性抗体)的N末端、C末端或Fc区内(参见Wu等人,“Site-specific chemical modification of recombinant proteinsproduced in mammalian cells by using the genetically encoded aldehyde tag,”PNAS 106(9):3000-3005(2009)；Agarwal等人,“APictet-Spengler ligation forprotein chemical modification,”PNAS 110(1):46-51(2013))。
在一些情况下，酶催化的过程包括微生物转谷氨酰胺酶(mTG)。在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)利用微生物转谷氨酰胺催化过程与上文所述的有效负载缀合。在一些情况下，mTG催化在识别序列内谷氨酰胺的酰胺侧链与官能化多特异性结合多肽(例如，官能化多特异性抗体，任选地官能化双特异性抗体)的伯胺之间形成共价键。在一些情况下，mTG由Streptomyces mobarensis产生。(参见Strop等人,“Location matters:site of conjugation modulates stability andpharmacokinetics of antibody drug conjugates,”Chemistry and Biology 20(2)161-167(2013))。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过如PCT公开号WO2014/140317所述的方法与上文所述的有效负载缀合，该方法利用序列特异性转肽酶。
在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体，任选地双特异性抗体)通过如美国专利公开2015/0105539和2015/0105540所述的方法与上文所述的有效负载缀合。
使用方法
本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可用于治疗疾病或病况。在一些情况下，该疾病或病况是癌症(例如，癌、肉瘤、白血病或淋巴瘤)。在某些实施方案中，该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于治疗癌症的方法中。在某些实施方案中，该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于制备用于治疗癌症的药物。许多癌症可以用本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)治疗，包括实体瘤/癌和血液系统恶性肿瘤。在某些实施方案中，该实体癌是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。在某些实施方案中，该血液系统恶性肿瘤包括霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。示例性的血液系统恶性肿瘤包括但不限于慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病或急性髓样白血病。在一些实施方案中，该血液系统恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓样白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓样白血病或急性髓样白血病。
在一些实施方案中，所述癌症是转移癌。在一些实施方案中，该转移癌是转移性实体瘤/癌。在其他实施方案中，该转移癌是转移性血液系统恶性肿瘤。在一些实施方案中，该转移性实体瘤包括转移性膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。在一些实施方案中，该转移性血液系统恶性肿瘤包括转移性慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病或急性髓样白血病。
在一些实施方案中，所述癌症是复发性或难治性癌症。在一些实施方案中，该复发性或难治性癌症是实体癌，例如复发性或难治性膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。在一些实施方案中，该复发性或难治性癌症是血液系统恶性肿瘤，例如复发性或难治性慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病或急性髓样白血病。
在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，该乳腺癌是管腔A型乳腺癌、管腔B型乳腺癌、三阴性乳腺癌、富含HER2的乳腺癌或正常样乳腺癌。在一些实施方案中，该乳腺癌是原位导管癌(DCIS)、浸润性导管癌(IDC)、浸润性小叶癌(ILC)、炎性乳腺癌、原位小叶癌(LCIS)、男性乳腺癌、乳头佩吉特病或乳房叶状瘤。在一些实施方案中，所述IDC包括乳房管状癌、乳房髓样癌、乳房乳头状癌或乳房筛状癌。在一些实施方案中，该乳腺癌是三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，该乳腺癌是转移性乳腺癌。在另外的实施方案中，该乳腺癌是复发性或难治性乳腺癌。
在某些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，该卵巢癌是上皮癌、浆液性癌、小细胞癌、原发性腹膜癌、透明细胞癌、透明细胞腺癌、子宫内膜样癌、恶性米勒管混合瘤、粘液性癌、粘液性腺癌、腹膜假粘液瘤、未分化上皮癌、恶性Brener瘤、移行细胞癌、性索-间质瘤、粒层细胞瘤、成年粒层细胞瘤、青少年粒层细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、硬化性间质瘤、生殖细胞瘤、无性细胞瘤、绒毛膜癌、未成熟(实体)畸胎瘤、成熟畸胎瘤(皮样囊肿)、卵黄囊瘤(内胚窦瘤)、胚胎性癌、多胚瘤、鳞状细胞癌、混合瘤或低恶性潜能肿瘤。在一些实施方案中，该卵巢癌是转移性卵巢癌。在另外的实施方案中，该卵巢癌是复发性或难治性卵巢癌。
在某些实施方案中，所述癌症是肺癌。在一些实施方案中，该肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌(SCLC)。在一些实施方案中，该肺癌是转移性肺癌。在另外的实施方案中，该肺癌是复发性或难治性肺癌。
在某些实施方案中，所述癌症是肝癌。在一些实施方案中，该肝癌是肝细胞癌(HCC)、胆管癌、肝血管肉瘤或肝母细胞瘤。在一些情况下，该肝癌是转移性肝癌。在一些情况下，该肝癌是复发性或难治性肝癌。
在某些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，该前列腺癌是腺泡腺癌、导管腺癌、移行细胞(或尿路上皮)癌、鳞状细胞癌、小细胞前列腺癌、前列腺中的类癌或前列腺中的肉瘤。在一些实施方案中，该前列腺癌是转移性前列腺癌。在另外的实施方案中，该前列腺癌是复发性或难治性前列腺癌。
在某些实施方案中，所述癌症是脑癌。在一些情况下，该脑癌是胶质母细胞瘤(例如，多形性胶质母细胞瘤或GBM)。在一些情况下，该脑癌是神经母细胞瘤。在一些情况下，该脑癌是转移性脑癌。
在某些实施方案中，所述癌症是癌。
在某些实施方案中，所述癌症是肉瘤。
在某些实施方案中，所述癌症是急性髓样白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、肝脏肝细胞癌、宫颈鳞状细胞癌、胆管癌、结肠腺癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肾脏肾乳头状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、NSCLC、SCLC、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺腺癌、前列腺腺癌、肾脏肾透明细胞癌、子宫体子宫内膜癌、甲状腺癌、胃腺癌、直肠腺癌、肉瘤、睾丸和生殖细胞肿瘤或子宫癌肉瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是儿科癌症。示例性的儿科癌症包括但不限于骨癌、脑癌、白血病、肝母细胞瘤、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌样瘤、肉瘤、脊髓肿瘤和维尔姆斯瘤。在一些情况下，儿科癌症发生在18岁以下的儿童中。
在某些实施方案中，所述疾病或病况是肝脏疾病或病况。在一些情况下，该肝脏疾病或病况是非酒精性脂肪肝病(NASH)或酒精性脂肪性肝炎。
本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可用于治疗对免疫检查点抑制剂疗法治疗为难治性的、免疫检查点抑制剂疗法治疗失败的或对免疫检查点抑制剂疗法治疗的反应不是最优的癌症和/或肿瘤。在某些实施方案中，检查点抑制剂疗法包括靶向PD-1、PDL-1、PDL-2、CTLA4、LAG-3、TIM-3、KIR、VISTA或其他免疫检查点受体的疗法。目前的检查点抑制剂疗法包括，例如，纳武单抗(nivolumab)
Figure BDA0003247743320001551
派姆单抗(pembrolizumab)
Figure BDA0003247743320001552
pidilizumab(CT-011)、BMS-936559、阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、avelumab、伊匹木单抗(ipilimumab)
Figure BDA0003247743320001561
或曲美木单抗(tremelimumab)。在某些实施方案中，在接受检查点抑制剂疗法之后，选择受试者用本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进行治疗。在某些实施方案中，在检查点抑制剂疗法失败之后，选择受试者用本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进行治疗。在某些实施方案中，检查点抑制剂疗法失败是缺乏完全反应(例如，肿瘤或癌症指征的完全减少)。在某些实施方案中，检查点抑制剂疗法失败是缺乏客观反应(例如，缺乏可测量的肿瘤缩小或癌症指征的减少)。在某些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于治疗已经施用一种或多种先前免疫检查点抑制剂治疗的受试者的方法中。在某些实施方案中，基于免疫检查点抑制剂的低表达或不表达，选择受试者用本文提供的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进行治疗。在某些实施方案中，基于PD-1、PDL-1、PDL-2、CTLA4、LAG-3、TIM-3、KIR、VISTA或其他免疫检查点受体的低表达或不表达，选择受试者用本文提供的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进行治疗。可以使用诸如免疫组织化学、流式细胞术、RT-PCR、RNA-Seq、ELISA或Western印迹法等方法适当地确定低表达或不表达。用于PDL-1诊断目的的示例性测定是已知的，并且例如可见于Udall等人.Diagn Pathol.2018；13:12。在一些实施方案中，所述受试者对免疫检查点抑制剂不敏感，对免疫检查点抑制剂治疗没有反应，或表达低水平的或不表达免疫检查点蛋白。在一些情况下，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)与免疫检查点调节剂一起施用于受试者，例如与免疫检查点调节剂同时施用，或与免疫检查点调节剂顺序施用。
肿瘤相关抗原(TAA)和多特异性结合多肽的免疫细胞结合部分的选择可取决于所治疗的癌症类型。表6列出了一些具体的癌症和抗原选择。在某些实施方案中，用于治疗指定癌症的多特异性结合多肽包含表6中所列的结合特异性。
Figure BDA0003247743320001571
Figure BDA0003247743320001581
Figure BDA0003247743320001591
Figure BDA0003247743320001601
在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用附加治疗剂。在一些实施方案中，该附加治疗剂是化疗剂、放射或其组合。示例性附加治疗剂包括但不限于烷基化剂，如六甲蜜胺、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、洛莫司汀、美法仑、奥沙利铂、替莫唑胺或噻替派；抗代谢物，如5-氟尿嘧啶(5-FU)、6-巯基嘌呤(6-MP)、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤或培美曲塞；蒽环类药物，如柔红霉素、多柔比星、表柔比星或伊达比星；拓扑异构酶I抑制剂，如托泊替康或伊立替康(CPT-11)；拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷(VP-16)、替尼泊苷或米托蒽醌；有丝分裂抑制剂，如多西他赛、雌莫司汀、伊沙匹隆、紫杉醇、长春碱、长春新碱或长春瑞滨；或皮质类固醇，如泼尼松、甲泼尼龙或地塞米松；或SRC家族蛋白质-酪氨酸激酶抑制剂，如达沙替尼。
在一些情况下，所述附加治疗剂包括免疫检查点调节剂。示例性免疫检查点调节剂包括但不限于纳武单抗(nivolumab)
Figure BDA0003247743320001602
派姆单抗(pembrolizumab)
Figure BDA0003247743320001603
pidilizumab(CT-011)、BMS-936559、阿特珠单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、avelumab、伊匹木单抗(ipilimumab)
Figure BDA0003247743320001604
或曲美木单抗(tremelimumab)。在一些情况下，该附加治疗剂包括特异性结合和/或调节PD-L1、PD-L2、PD1、CTLA-4、LAG3、B7-H3、KIR、CD137、PS、TFM3、CD52、CD30、CD20、CD33、CD27、OX40、GITR、ICOS、BTLA(CD272)、CD160、2B4、LAIR1、TIGHT、LIGHT、DR3、CD226、CD2或SLAM的活性的免疫检查点调节剂。
在一些情况下，所述附加治疗剂包括一线疗法。如本文所用的，“一线疗法”包括针对患有癌症的受试者的主要治疗。在一些情况下，该癌症是原发性癌症。在其他情况下，该癌症是转移性或复发性癌症。在一些情况下，该一线疗法包括化学疗法。在其他情况下，该一线治疗包括放射疗法。技术人员将容易理解，不同的一线治疗可能适用于不同类型的癌症。
在一些情况下，所述附加治疗剂包括二线疗法、三线疗法、四线疗法或五线疗法。在一些情况下，二线疗法包括在主要或一线治疗停止后使用的治疗。在一些情况下，三线疗法、四线疗法或五线疗法包括后续治疗。如命名惯例所示，三线疗法包括主要和二线疗法已停止时的治疗过程。
在一些情况下，所述附加治疗剂包括过继性T细胞转移(ACT)疗法。在一个实施方案中，ACT涉及鉴定受试者中具有例如抗肿瘤活性的自体T淋巴细胞，在体外扩充该自体T淋巴细胞，随后将扩充的T淋巴细胞再输注到受试者中。在另一个实施方案中，ACT包括使用具有例如抗肿瘤活性的同种异体T淋巴细胞，在体外扩充该T淋巴细胞，随后将扩充的同种异体T淋巴细胞输注到有需要的受试者中。
在一些情况下，所述附加治疗剂包括疫苗，任选地溶瘤病毒。示例性的溶瘤病毒包括T-Vec(Amgen)、G47A(Todo等人)、JX-594(Sillajen)、CG0070(Cold Genesys)和Reolysin(Oncolytics Biotech)。
在一些情况下，所述附加治疗剂包括挽救疗法。
在一些情况下，所述附加治疗剂包括姑息疗法。
在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)和附加治疗剂同时施用。在其他实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)和附加治疗剂顺序施用。在一些实施方案中，在施用附加治疗剂之前，向受试者施用所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)。在一些实施方案中，在施用所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)之前，向受试者施用附加治疗剂。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)和附加治疗剂作为组合施用。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)和附加治疗剂作为单独的剂型施用。
在一些实施方案中，所述受试者已经进行过手术。
肿瘤和免疫抑制细胞杀伤
在一些实施方案中，本文公开了一种在靶细胞群体中诱导肿瘤和免疫抑制细胞杀伤作用的方法。在一些实施方案中，该方法包括使包含至少一种肿瘤细胞和至少一种免疫抑制细胞的靶细胞群体与以上描述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或上文描述的药物组合物接触足以诱导细胞杀伤作用的一段时间，从而杀死靶细胞群体中的所述至少一种肿瘤细胞和所述至少一种免疫抑制细胞。
在一些实施方案中，足以诱导细胞杀伤作用的时间为约5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、18小时、24小时或更长。
在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是来自实体瘤的细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞是来自血液系统恶性肿瘤的细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞来自膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。在一些实施方案中，所述肿瘤细胞来自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、急性髓样白血病。
在一些实施方案中，所述免疫抑制细胞是MDSC、肿瘤相关巨噬细胞或Treg细胞。在一些实施方案中，所述免疫抑制细胞是MDSC。在一些实施方案中，所述免疫抑制细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。在一些实施方案中，所述免疫抑制细胞是Treg细胞。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物调节T细胞增殖。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物调节肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)增殖。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物增强T细胞增殖。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物增强肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)增殖。在一些情况下，T细胞增殖(任选地，TIL增殖)增强约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。在一些情况下，T细胞增殖(任选地，TIL增殖)增强约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的肿瘤细胞减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的肿瘤细胞减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的肿瘤细胞增殖减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的肿瘤细胞增殖减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的免疫抑制细胞减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的免疫抑制细胞减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的免疫抑制细胞增殖减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)或包含该多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的药物组合物使靶细胞群体中的免疫抑制细胞增殖减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
在一些实施方案中，所述靶细胞群体是体内靶细胞群体。
在其他实施方案中，所述靶细胞群体是体外细胞群体。
在一些实施方案中，上文描述的受试者是人。
通过TRAIL-R2介导的凋亡的肿瘤细胞杀伤
TRAIL受体2(也称为TRAIL-R2、死亡受体5、DR5、肿瘤坏死因子受体超家族成员10B或TNFRSF10B)是与TRAIL结合并通过细胞内死亡域(DD)介导凋亡的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的细胞表面受体。在一些情况下，TRAIL-R2的寡聚化发生在凋亡信号传导途径激活之前。如本文所用的，TRAIL-R2的寡聚化包括两个或更多个TRAIL-R2单体，任选地两个、三个、四个、五个、六个或更多个TRAIL-R2单体。
在一些情况下，TRAIL-R2二聚化发生在凋亡信号传导途径激活之前。在这样的情况下，例如每个TRAIL-R2单体的Cys209之间的二硫键促进了寡聚化(例如，二聚化)。
在一些实施方案中，TRAIL-R2的寡聚化发生在靶细胞的脂筏中。在一些情况下，两个或更多个TRAIL-R2单体，任选地两个、三个、四个、五个、六个或更多个TRAIL-R2单体，在脂筏中寡聚化。在这样的情况下，在寡聚化时，凋亡信号传导途径在靶细胞内被激活。在一些情况下，TRAIL-R2的二聚化发生在靶细胞的脂筏中，任选地由例如每个TRAIL-R2单体的Cys209之间的二硫键来促进。在一些情况下，凋亡信号传导途径在脂筏中的TRAIL-R2二聚化后被激活。在一些情况下，靶细胞是癌细胞。另见图21A和图21B。图21A示出了与位于癌细胞脂筏内的肿瘤相关抗原相互作用的示例性多特异性抗体，其促进脂筏内TRAIL-R2的募集和寡聚化(例如，二聚化)，用于随后激活凋亡信号传导途径。图21B示出了与位于癌细胞脂筏外部的肿瘤相关抗原相互作用的示例性多特异性抗体，其在被抗体结合后不激活TRAIL-R2介导的凋亡信号传导途径。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞上的受体结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)不激活免疫细胞(例如，免疫效应细胞)。在这样的情况下，免疫细胞的激活降低或防止了与活化免疫细胞产生的细胞因子和死亡诱导酶向正常细胞泄漏相关的毒性。另见图21C和图21D，其显示常规抗体疗法可通过在与FcγR结合后激活免疫效应细胞来消除癌细胞，从而由于细胞因子、穿孔蛋白和/或粒酶泄漏至邻近的正常细胞而导致非肿瘤毒性(图21C)；但是TRAIL-R2介导的凋亡信号传导途径的激活减少了对激活免疫效应细胞的需要，从而消除了免疫细胞相关毒性向正常细胞的泄漏(图21D)。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与癌细胞上的受体结合的第一结合部分，以及与相同癌细胞上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，第一结合部分与癌细胞上表达的肿瘤相关抗原结合。在其他情况下，第一结合部分与癌细胞表面上表达的蛋白质结合。在另外的情况下，第一结合部分包含神经节苷脂。在进一步的情况下，第一结合部分包含小分子。在一些情况下，相比于第二结合部分对TTRAIL-R2，第一结合部分对受体具有更高的结合亲和力(例如，1、2、3、4、5、10、20、50倍或更多倍)。在一些情况下，第一结合部分促进TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。
在一些情况下，第一结合部分促进癌细胞的脂筏中TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，由多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)引起的TRAIL-R2寡聚化(例如，二聚化)调节癌细胞的凋亡信号传导途径的激活。在一些情况下，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于通过激活TRAIL-R2介导的凋亡来治疗癌症。
在一些实施方案中，第一结合部分与靶细胞(例如，癌细胞)上的受体结合。在一些情况下，第一结合部分与肿瘤相关抗原结合。在一些情况下，该肿瘤相关抗原包括FOLR1、CD33、CD38、FLT3或GPC3。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的FOLR1、CD33、CD38、FLT3或GPC3结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的FOLR1结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的CD33结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的CD38结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的FLT3结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的GPC3结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，相比于第二结合部分对TTRAIL-R2，第一结合部分对FOLR1、CD33、CD38、FLT3或GPC3具有更高的结合亲和力(例如，1、2、3、4、5、10、20、50倍或更多倍)。在一些情况下，第一结合部分促进TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。
在一些情况下，第一结合部分促进靶细胞(例如，癌细胞)的脂筏中TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，由多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)引起的TRAIL-R2寡聚化(例如，二聚化)调节靶细胞(例如，癌细胞)的凋亡信号传导途径的激活。在一些情况下，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于通过激活TRAIL-R2介导的凋亡来治疗疾病或适应症(例如，癌症)。
在一些实施方案中，第一结合部分与CD32a(也称为FcγRIIa)结合。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的CD32a结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，相比于第二结合部分对TTRAIL-R2，第一结合部分对CD32a具有更高的结合亲和力(例如，1、2、3、4、5、10、20、50倍或更多倍)。在一些情况下，第一结合部分促进TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，第一结合部分促进靶细胞(例如，癌细胞)的脂筏中TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，由多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)引起的TRAIL-R2寡聚化(例如，二聚化)调节靶细胞(例如，癌细胞)的凋亡信号传导途径的激活。在一些情况下，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)与CD16和/或CD64的结合受损或没有结合。在一些情况下，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于通过激活TRAIL-R2介导的凋亡来治疗疾病或适应症(例如，癌症)。
在一些实施方案中，第一结合部分与靶细胞(例如，癌细胞)上的蛋白质结合。在一些情况下，该蛋白质是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白质。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的GPI锚定蛋白质结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，相比于第二结合部分对TTRAIL-R2，第一结合部分对GPI锚定蛋白质具有更高的结合亲和力(例如，1、2、3、4、5、10、20、50倍或更多倍)。在一些情况下，第一结合部分促进TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，第一结合部分促进靶细胞(例如，癌细胞)的脂筏中TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，由多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)引起的TRAIL-R2寡聚化(例如，二聚化)调节靶细胞(例如，癌细胞)的凋亡信号传导途径的激活。在一些情况下，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于通过激活TRAIL-R2介导的凋亡来治疗疾病或适应症(例如，癌症)。
在一些实施方案中，第一结合部分与靶细胞(例如，癌细胞)上的神经节苷脂(GD)结合。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的神经节苷脂(GD)结合的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，相比于第二结合部分对TTRAIL-R2，第一结合部分对神经节苷脂具有更高的结合亲和力(例如，1、2、3、4、5、10、20、50倍或更多倍)。在一些情况下，第一结合部分促进TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，第一结合部分促进靶细胞(例如，癌细胞)的脂筏中TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，由多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)引起的TRAIL-R2寡聚化(例如，二聚化)调节靶细胞(例如，癌细胞)的凋亡信号传导途径的激活。在一些情况下，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于通过激活TRAIL-R2介导的凋亡来治疗疾病或适应症(例如，癌症)。
在一些实施方案中，第一结合部分包含与靶细胞(例如，癌细胞)上的受体结合的小分子。在一些情况下，该小分子是与FOLR1结合的叶酸或其盐、衍生物或类似物。示例性叶酸盐、衍生物和类似物包括但不限于四氢叶酸、亚叶酸、醛氢叶酸、左美福酸、triglu-5-甲酰基-四氢叶酸、(6S)-5,6,7,8-四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸和(6R)-亚叶酸。在一些情况下，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含与靶细胞(例如，癌细胞)上表达的FOLR1结合的、包含叶酸或其盐、衍生物或类似物的第一结合部分，以及与相同靶细胞(例如，癌细胞)上表达的TRAIL-R2结合的第二结合部分。在一些情况下，相比于第二结合部分对TTRAIL-R2，第一结合部分对FOLR1具有更高的结合亲和力(例如，1、2、3、4、5、10、20、50倍或更多倍)。在一些情况下，第一结合部分促进TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，第一结合部分促进靶细胞(例如，癌细胞)的脂筏中TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。在一些情况下，由多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)引起的TRAIL-R2寡聚化(例如，二聚化)调节靶细胞(例如，癌细胞)的凋亡信号传导途径的激活。在一些情况下，多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)用于通过激活TRAIL-R2介导的凋亡来治疗疾病或适应症(例如，癌症)。
在一些实施方案中，包含与TRAIL-R2结合的第二结合部分的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包含Fc修饰，以削弱或抑制FcγR相互作用。在一些情况下，该修饰包括在N297、L234、P238、P331、S239、S442或其组合处的突变，其中根据EU编号惯例，残基位置对应于IgG1的位置297、234、238、331、239和442。在一些情况下，该修饰包括N297A、L234A、L235A、P238S、P331S、L234F、S239C、S442C或其组合。
药物组合物和制剂
在一些实施方案中，本文所述的药物组合物和制剂通过多种给药途径施用于受试者，所述途径包括但不限于肠胃外、口服、颊部、直肠、舌下或透皮给药途径。在一些实施方案中，肠胃外给药包括静脉内、皮下、肌肉内、脑内、鼻内、动脉内、关节内、皮内、玻璃体内、骨内输注、腹膜内或鞘内(intratechal)给药。在一些实施方案中，该药物组合物被配制用于局部给药。在其他实施方案中，该药物组合物被配制用于全身给药。
在某些实施方案中，本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)被包括在包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物中。在某些实施方案中，本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)悬浮于无菌溶液中施用。在某些实施方案中，该溶液包含0.9％NaCl。在某些实施方案中，该溶液包含约5％的葡萄糖。在某些实施方案中，该溶液还包含以下一种或多种：缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)；表面活性剂，例如聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯20(吐温20)和泊洛沙姆188；多元醇/二糖/多糖，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖和葡聚糖40；氨基酸，例如甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸、甲硫氨酸；或螯合剂，例如EGTA或EGTA。在某些实施方案中，本公开的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)冻干运输/储存，并在施用前重建。在某些实施方案中，冻干的多特异性结合多肽制剂包含填充剂，如甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖或葡聚糖-40。冻干制剂可以包含在由玻璃构成的小瓶中。多特异性结合多肽在配制时，无论是否重建，都可以在一定pH值下缓冲，通常小于7.0。在某些实施方案中，pH可以是4.5至6.5、4.5至6.0、4.5至5.5、4.5至5.0或5.0至6.0。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可在Tris-Cl缓冲液中配制，Tris-Cl的浓度为至少约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM或约50mM。在另一个实施方案中，Tris-Cl的浓度为约20mM。在其他实施方案中，该组合物在柠檬酸盐缓冲液中配制，柠檬酸盐的浓度为至少约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM，或约50mM。在特定实施方案中，柠檬酸盐浓度为约10mM或约20mM。在一些实施方案中，该组合物在组氨酸缓冲液中配制，组氨酸的浓度为至少约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM或约50mM。在一些实施方案中，组氨酸浓度为约20mM。在其他实施方案中，该组合物在Tris-柠檬酸盐缓冲液中配制，Tris-Cl的浓度为至少约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM或约50mM，并且柠檬酸盐的浓度为至少约2mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约35mM、约40mM或约50mM。在某些实施方案中，Tris-Cl的浓度为约13.3mM且柠檬酸盐的浓度为约6.7mM。
在一些实施方案中，所述药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控制释放制剂、速熔制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂(例如纳米颗粒制剂)以及立即释放和控制释放混合型制剂。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含基于与本文公开的组合物的相容性和所需剂型的释放谱特性而选择的载体或载体材料。示例性的载体材料包括，例如粘合剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、表面活性剂、增溶剂、稳定剂、润滑剂、湿润剂、稀释剂等。药学上相容的载体材料包括但不限于阿拉伯胶、明胶、胶态二氧化硅、甘油磷酸钙、乳酸钙、麦芽糖糊精、甘油、硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、胆固醇、胆固醇酯、酪蛋白酸钠、大豆卵磷脂、牛磺胆酸、磷脂酰胆碱、氯化钠、磷酸三钙、磷酸二钾、纤维素和纤维素缀合物、糖、硬脂酰乳酸钠、角叉菜胶、甘油单酯、甘油二酯、预胶化淀粉等。参见，例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)，Hoover,John E.,Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975，Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical DosageForms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980，以及Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams&Wilkins1999)。
在一些实施方案中，所述药物制剂进一步包含pH调节剂或缓冲剂，其包括酸，如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；和缓冲液，如柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠和氯化铵。这类酸、碱和缓冲液以使组合物的pH保持在可接受范围内所需的量包含在内。
在一些实施方案中，所述药物制剂以使组合物的重量摩尔渗透压浓度处于可接受范围内所需的量包含一种或多种盐。这类盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐，合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含但不限于糖，如海藻糖、蔗糖、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖，或盐，如磷酸钾、柠檬酸钠、硫酸铵，和/或其他试剂，如肝素，以增加多肽的溶解度和体内稳定性。
在一些实施方案中，所述药物制剂进一步包含稀释剂，该稀释剂用来稳定化合物，因为他们可以提供更稳定的环境。本领域中利用溶解于经缓冲的溶液(其也可以提供pH控制或维持)中的盐作为稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲的盐水溶液。在某些实施方案中，稀释剂增加组合物的体积，以便于压缩或者产生用于均匀掺合以供胶囊填充的足够体积。这类化合物可包括，例如，乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋糖、诸如
Figure BDA0003247743320001721
等微晶纤维素、磷酸氢钙、磷酸二钙二水合物、磷酸三钙、磷酸钙、无水乳糖、喷雾干燥的乳糖、预胶化淀粉、诸如
Figure BDA0003247743320001722
(Amstar)等可压缩糖、甘露醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素乙酸硬脂酸酯、基于蔗糖的稀释剂、糖粉(confectioner’s sugar)、单碱式硫酸钙一水合物、硫酸钙二水合物、乳酸钙三水合物、葡萄糖结合剂(dextrates)、经水解的谷类固体、直链淀粉、粉状纤维素、碳酸钙、甘氨酸、高岭土、甘露醇、氯化钠、肌醇、膨润土等。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含崩解试剂或崩解剂，以促进物质的分解或崩解。术语“崩解”包括当剂型与胃肠液接触时的溶解和分散。崩解剂的实例包括淀粉，例如天然淀粉，如玉米淀粉或马铃薯淀粉，预胶化淀粉如National 1551或
Figure BDA0003247743320001731
或羟基乙酸淀粉钠如
Figure BDA0003247743320001732
或
Figure BDA0003247743320001733
纤维素如木制品，甲基结晶纤维素，例如
Figure BDA0003247743320001734
Figure BDA0003247743320001735
PH101、
Figure BDA0003247743320001736
PH102、
Figure BDA0003247743320001737
PH105、
Figure BDA0003247743320001738
P100、
Figure BDA0003247743320001739
Ming
Figure BDA00032477433200017310
和
Figure BDA00032477433200017311
甲基纤维素，交联羧甲纤维素，或交联的纤维素，如交联的羧甲基纤维素钠
Figure BDA00032477433200017312
交联的羧甲基纤维素或交联的交联羧甲纤维素，交联的淀粉如羟基乙酸淀粉钠，交联的聚合物如交聚维酮，交联的聚乙烯吡咯烷酮，藻酸盐如藻酸或藻酸的盐如藻酸钠，粘土如
Figure BDA00032477433200017313
HV(硅酸铝镁)，胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶或黄蓍胶，羟基乙酸淀粉钠，膨润土，天然海绵，表面活性剂，树脂如阳离子交换树脂，柑橘渣，十二烷基硫酸钠，十二烷基硫酸钠与淀粉的组合，等等。
在一些实施方案中，所述药物制剂包含填充剂，如乳糖、碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、硫酸钙、微晶纤维素、纤维素粉末、右旋糖、葡萄糖结合剂、葡聚糖、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、木糖醇、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、氯化钠、聚乙二醇等。
润滑剂和助流剂也任选地包含在本文所述的药物制剂中，以用于阻止、减少或抑制物质的粘附或摩擦。示例性的润滑剂包括，例如，硬脂酸，氢氧化钙，滑石，硬脂酰富马酸钠，碳氢化合物如矿物油，或氢化植物油如氢化大豆油
Figure BDA00032477433200017314
高级脂肪酸及其碱金属和碱土金属盐如铝盐、钙盐、镁盐、锌盐，硬脂酸，硬脂酸钠，甘油，滑石，蜡、
Figure BDA00032477433200017315
硼酸，苯甲酸钠，乙酸钠，氯化钠，亮氨酸，聚乙二醇(例如PEG-4000)或甲氧基聚乙二醇如CarbowaxTM，油酸钠，苯甲酸钠，山萮酸甘油酯，聚乙二醇，十二烷基硫酸镁或十二烷基硫酸钠，胶态二氧化硅如yloidTM、
Figure BDA00032477433200017316
淀粉如玉米淀粉，硅油，表面活性剂，等等。
增塑剂包括用来软化微胶囊化材料或膜包衣以使它们较不易碎的化合物。合适的增塑剂包括，例如，诸如PEG300、PEG400、PEG600、PEG1450、PEG3350和PEG800等聚乙二醇、硬脂酸、丙二醇、油酸、三乙基纤维素和三醋精。增塑剂还可以起到分散剂或湿润剂的作用。
增溶剂包括诸如三醋精、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、维生素E TPGS、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、正丁醇、异丙醇、胆固醇、胆盐、聚乙二醇200-600、糖原质、还氧二元醇(transcutol)、丙二醇和异山梨醇二甲醚等化合物。
稳定剂包括诸如任何抗氧化剂、缓冲剂、酸、防腐剂等化合物。示例性的稳定剂包括L-精氨酸盐酸盐、氨丁三醇、白蛋白(人)、柠檬酸、苯甲醇、苯酚、脱水磷酸氢二钠、丙二醇、间甲酚或间-甲酚、乙酸锌、聚山梨酯-20或吐温(Tween)
Figure BDA0003247743320001741
或氨丁三醇。
悬浮剂包括诸如以下的化合物，如聚乙烯吡咯烷酮，例如聚乙烯吡咯烷酮K12、聚乙烯吡咯烷酮K17、聚乙烯吡咯烷酮K25或聚乙烯吡咯烷酮K30，乙烯基吡咯烷酮/乙酸乙烯酯共聚物(S630)，聚乙二醇(例如聚乙二醇的分子量可以是约300至约6000，或约3350至约4000，或约7000至约5400)，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟甲基纤维素乙酸硬脂酸酯，聚山梨酯-80，羟乙基纤维素，藻酸钠，树胶，例如黄蓍胶和阿拉伯胶、瓜尔胶、黄原胶类(包括黄原胶)，糖，纤维素制品，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素，聚山梨酯-80，藻酸钠，聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯，聚乙氧基化失水山梨醇单月桂酸酯，聚维酮，等等。
表面活性剂包括诸如以下的化合物，如十二烷基硫酸钠、多库酯钠、吐温60或80、三醋精、维生素E TPGS、失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚山梨酯、泊洛沙姆(polaxomers)、胆盐、单硬脂酸甘油酯、环氧乙烷和环氧丙烷的共聚合物，例如
Figure BDA0003247743320001742
(BASF)等。另外的表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛苯昔醇10(octoxynol 10)、辛苯昔醇40。有时，包括表面活性剂以增强物理稳定性或用于其他目的。
粘度增强剂包括，例如，甲基纤维素、黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素乙酸硬脂酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、卡波姆、聚乙烯醇、藻酸盐、阿拉伯胶、壳聚糖及其组合。
湿润剂包括诸如油酸、单硬脂酸甘油酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、多库酯钠、油酸钠、十二烷基硫酸钠、多库酯钠、三醋精、吐温80、维生素E TPGS、铵盐等化合物。
治疗方案
在一些实施方案中，施用一种或多种包含所提供的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的本文所述药物组合物以用于治疗应用。在一些实施方案中，该药物组合物每天施用一次、每天施用两次、每天施用三次或更频繁。该药物组合物每天、每隔一天、隔日、每周五天、每周一次、每隔一周、每月两周、每月三周、每月一次、每月两次、每月三次或更频繁地施用。该药物组合物施用至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年或更长时间。
在患者的状态确实得到改善的情况下，根据医生的裁量，继续进行组合物的施用；或者，所施用的组合物的剂量暂时减少或暂时停止某段时间长度(即“休药期”)。在一些实施方案中，休药期的长度为2天至1年不等，仅举例来说，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天、70天、100天、120天、150天、180天、200天、250天、280天、300天、320天、350天或365天。在休药期期间的剂量减少是10％-100％，仅举例来说，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
一旦患者的状况已发生改善，如有必要，施用维持剂量。随后，根据症状，可将给药剂量或频率或这两者降低至改善的疾病、病症或病况得以保持的水平。
在一些实施方案中，对应于此量的给定药剂的量根据诸如具体化合物、疾病的严重程度、需要治疗的受试者或宿主的特性(例如体重)等因素而变化，不过仍根据该病例的具体情况以本领域已知的方式进行常规确定，所述情况包括例如所施用的具体药剂、给药途径和所治疗的受试者或宿主。在一些实施方案中，所需剂量方便地以单剂量或分剂量呈现，所述分剂量同时(或在短时间段内)或以适当的间隔施用，例如每天两次、三次、四次或更多次亚剂量。
前述范围仅是建议性的，因为关于个体治疗方案的变量数目很大，并且偏离这些推荐值的相当大的偏差也并不罕见。这样的剂量根据许多变量而改变，这些变量不限于所使用的化合物的活性、所治疗的疾病或病况、给药模式、受试个体的需求、所治疗的疾病或病况的严重程度，以及从业医生的判断。
在一些实施方案中，此类治疗方案的毒性和治疗效果通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定，包括但不限于LD50(群体中50％致死的剂量)和ED50(群体中50％治疗有效的剂量)的确定。毒性效果与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，并且将其表示为LD50与ED50之间的比值。表现出高治疗指数的化合物是优选的。从细胞培养试验和动物研究获得的数据用于制定在人体中使用的剂量范围。此类化合物的剂量优选地处于包括ED50且具有最小毒性的循环浓度的范围内。该剂量在该范围内变化，这取决于所使用的剂型和所采用的给药途径。
试剂盒/制品
本文公开了适合于实施本文公开的方法的试剂盒和制品。在一些实施方案中，该试剂盒包含进行本文所述的治疗方法所需的两种或更多种组分。在一些实施方案中，试剂盒组分包括但不限于一种或多种多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)，或一种或多种本文所述的多特异性结合多肽缀合物(例如，多特异性抗体-有效负载缀合物)、适当的试剂和/或设备。在一些实施方案中，该试剂盒被包装在小瓶、小袋、安瓿和/或适用于治疗方法的任何容器中。药物包装材料的其他实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，和任何适于选定制剂和可选的预期给药和治疗模式的包装材料。在一些实施方案中，试剂盒组分作为浓缩物(包括冻干组合物)提供，其在使用前进一步稀释或以使用浓度提供。在一些实施方案中，当提供一种或多种多特异性多肽缀合物(例如，多特异性抗体-有效负载缀合物)以供体内使用时，在具有所需量和浓度的抗体-有效负载缀合物的灭菌容器中提供单一剂量。
在一些实施方案中，试剂盒包括列出了内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明的包装插页。一般还包括一套说明书。
在一些实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其他字符附着、模制或蚀刻在容器本身上时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的接纳器或载具内(例如作为包装插页)时，标签与容器相关联。在一个实施方案中，标签用来指示内容物将用于特定的治疗性应用。标签还指示内容物的使用说明，例如在本文所述方法中的使用说明。
定义
在以下的描述中，阐述某些具体的细节以便提供对不同实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员应当理解，所提供的实施方案可以在没有这些细节的情况下实施。除非上下文另有要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变化形式，如“包含”和“含有”，应被解释为开放式的包含性含义，即“包括但不限于”。除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。还应指出，除非上下文另有明确规定，否则术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用。此外，本文提供的标题仅仅是为了方便起见，并非解释请求保护的实施方案的范围或含义。
如本文所用的，术语“约”是指接近所述量10％或更少的量。
如本文所用的，术语“个体”、“受试者”和“患者”是可互换的，是指任何被诊断为患有疾病或病况、被怀疑患有疾病或病况或有患疾病或病况风险的哺乳动物，该疾病或病况例如是以不受控制的细胞生长为特征的癌症、肿瘤或赘生物。在某些实施方案中，该哺乳动物是人。在一些实施方案中，该哺乳动物是非人类动物，如猫、狗、小鼠、大鼠、非人灵长类动物、牛、猪、绵羊、山羊、美洲驼、羊驼或马。
如本文所用的，“结合”或“特异性结合”是指亲和分子如受体或抗体与分子的不同部分或其表位和变体的结合。特异性结合通常由抗体的CDR残基介导，但框架残基有时也可参与与CDR残基的缀合。在某些实施方案中，特异性结合不包括抗体的Fc区与另一种分子如蛋白A、G或A/G的相互作用。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。包含提供的抗体和抗体链的多肽以及其他肽，例如连接体和结合肽，可包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面，多肽可含有相对于原始或天然序列的修饰，只要蛋白质保持所需的活性即可。这些修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括单克隆抗体，包括完整抗体和其功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(sFv或scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖免疫球蛋白的基因工程形式和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体、多特异性抗体，例如双特异性抗体、双抗体、三抗体和四抗体，串联di-scFv、串联tri-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。该术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。抗体可包含人IgG1恒定区。抗体可包含人IgG4恒定区。
抗体根据其互补决定区与靶抗原或表位结合。与“高变区”或“HVR”同义的术语“互补决定区”和“CDR”在本领域中是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3或HCDR1、HCDR2和HCDR3)，并且每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3或LCDR1、LCDR2和LCDR3)。“框架区”和“FR”在本领域中是已知的，是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知方案中的任何一种来容易地确定，包括以下文献中描述的那些方案：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)，Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，“Antibody-antigen interactions:Contact analysisand binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.”(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptorvariable domains and Ig superfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numberingscheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysistool,”J Mol Biol,2001年6月8日；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；和Whitelegg NR和Rees AR,“WAM:an improved algorithm for modelling antibodies on the WEB,”Protein Eng.2000年12月；13(12):819-24(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可因用于鉴定的方案而异。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号均基于最常见的抗体区域序列长度，插入由插入字母来提供，例如“30a”，并且在某些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入/缺失(indels)”)放置在不同的位置，从而导致不同的编号。Contact方案基于对复杂晶体结构的分析，在许多方面与Chothia编号方案相似。在某些实施方案中，所提供的抗体和抗原结合片段的CDR由Kabat、IMGT、Chothia、Contact、Aho、AbM方案或其任何组合来定义。在某些实施方案中，所提供的抗体和抗原结合片段的CDR由Kabat、IMGT、Chothia方案或其任何组合来定义。在某些实施方案中，CDR边界由Kabat、IMGT和Chothia方案或其任何组合的最长连续重叠子集来定义。
CDR与抗体的可变区内源性地相关。术语“可变区”或“可变域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)通常具有类似的结构，每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个CDR(参见例如，Kindt等人.Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以通过使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛查互补VL或VH结构域文库来分离(参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991))。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指除完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv或sFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，所述抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及重组宿主细胞的产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，例如包含非天然存在的排列的片段，例如具有通过合成连接体例如多肽连接体连接的两个或更多个抗体区域或链的片段，和/或并非通过天然存在的完整抗体的酶消化产生的片段。在一些方面，所述抗体片段是scFv。
“人源化”抗体或多特异性结合多肽是其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基均衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基均衍生自人FR的抗体。人源化抗体任选地可包括衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指已经历人源化的非人抗体的变体，通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相应残基置换，例如，以便恢复或改善抗体特异性或亲和力。
所提供的抗体包括人抗体。“人抗体”是其氨基酸序列与由人类或人类细胞产生的抗体或利用人抗体组库或其他人抗体编码序列(包括人抗体文库)的非人类来源的抗体的氨基酸序列相对应的抗体。该术语不包括包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式，例如其中所有或基本上所有CDR都是非人CDR的那些。
如本文所用的，“多特异性”抗体是指与超过一种抗原结合的抗体。例如，“多特异性”抗体可以与两种、三种、四种或更多种抗原结合。在一些情况下，“多特异性”抗体与至少一种肿瘤相关抗原、至少一种在免疫抑制细胞上表达的抗原或其组合结合。在一些情况下，“多特异性”抗体进一步在Fc区中包含修饰。在一些情况下，“多特异性”抗体与至少一种肿瘤相关抗原和/或至少一种在免疫抑制细胞上表达的抗原结合，并进一步结合与抗体的Fc区相互作用的受体。
在一些实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体。如在此类情况下使用的，双特异性抗体是指能够与至少一种肿瘤相关抗原、至少一种在免疫抑制细胞上表达的抗原或其组合结合的抗体。在一些情况下，该双特异性抗体进一步在Fc区中包含修饰。在一些情况下，该双特异性抗体与至少一种肿瘤相关抗原和/或至少一种在免疫抑制细胞上表达的抗原结合，并进一步结合与抗体的Fc区相互作用的受体。
可以通过向转基因动物施用免疫原来制备人抗体，该转基因动物已被修饰为响应于抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物一般包含全部或部分人免疫球蛋白基因座，这些基因座代替内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体中。在这类转基因动物中，内源免疫球蛋白基因座通常已被灭活。人抗体也可以来源于人抗体文库，包括噬菌体展示文库和无细胞文库，其含有来源于人类组库的抗体编码序列。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在将序列进行比对并在必要时引入空位以达到最大序列同一性百分比之后，并且不认为任何保守置换是序列同一性的一部分，候选序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的百分比。旨在确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过各种已知的方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而，对于本文而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成氨基酸序列同一性百分比。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.开发，源代码已作为用户文档提交美国版权局(WashingtonD.C.,20559)，并以美国版权登记号TXU510087进行了登记。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.公开获得，也可以从源代码进行编译。ALIGN-2程序应进行编译，以供在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，并且保持不变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(或者可以用以下短语表示：给定氨基酸A与或相对于给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性百分比)计算如下：分数X/Y乘以100，其中X是在A和B的该程序比对中由序列比对程序ALIGN-2评分为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B与A的氨基酸序列同一性百分比。除非另有特别说明，否则使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得本文使用的所有氨基酸序列同一性百分比值。
在一些实施方案中，涉及本文提供的抗体的氨基酸序列变体。变体通常在一个或多个置换、缺失、添加和/或插入方面不同于本文具体公开的多肽。这样的变体可以是天然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过如本文所述和/或使用多种已知技术中的任何技术，修饰本发明上述多肽序列中的一种或多种，并评价多肽的一种或多种生物学活性。例如，改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学性质可能是期望的。可通过将适当的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中或通过肽合成来制备该抗体的氨基酸序列变体。这类修饰包括，例如，抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。可进行缺失、插入和置换的任意组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特性，例如抗原结合。
在一些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。通过置换进行诱变的目的位点包括CDR和FR。可将氨基酸置换引入目的抗体中，并针对所需活性，例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC(抗体依赖性细胞毒性)、ADCP(抗体依赖性细胞吞噬作用)或CDC(补体依赖性细胞毒性)来筛选产物。在一些实施方案中，本文提供的多特异性结合多肽可以通过基于Fc的效应子功能如ADCC、ADCP和CDC诱导癌细胞和免疫抑制细胞的直接细胞死亡。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽在Fc区包含突变，以增强基于Fc的效应子功能，如ADCC、ADCP和CDC。
在一些实施方案中，置换、插入或缺失可发生在一个或多个CDR内，其中该置换、插入或缺失基本不降低抗体与抗原的结合。例如，可在CDR中进行基本不降低结合亲和力的保守置换。这样的改变可在CDR“热点”之外。在变体VH和VL序列的一些实施方案中，每个CDR未改变。
可在CDR中进行改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。可在体细胞成熟期间在具有高突变率的编码CDR的密码子中进行这样的改变(参见例如，Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008))，并且可对所得变体的结合亲和力进行测试。亲和力成熟(例如，使用易错PCR、链改组、CDR的随机化或寡核苷酸定向诱变)可用来改善抗体亲和力(参见例如，Hoogenboom等人,Methods in Molecular Biology178:1-37(2001))。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模(参见例如，Cunningham and Wells Science,244:1081-1085(1989))，来特异性鉴别参与抗原结合的CDR残基。特别是CDR-H3和CDR-L3经常被靶向。替代地或另外地，使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴别抗体与抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可作为用于置换的候选物而被靶向或消除。可筛选变体以确定其是否含有所需性质。
氨基酸序列插入和缺失包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入和缺失。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N末端或C末端与延长该抗体的血清半衰期的酶(例如，对于ADEPT)或多肽的融合。抗体分子的序列内插入变体的实例包括在轻链中插入3个氨基酸。末端缺失的实例包括在轻链末端缺失7个或更少氨基酸的抗体。
如本文所用的，术语“保守置换”表示氨基酸残基被另一个在化学或生物学上相似的残基替换。生物学上相似的意味着该置换不会破坏生物活性或功能。
结构上相似的意味着氨基酸具有长度相似的侧链，如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或大小相似。化学相似性意味着残基具有相同的电荷或均为亲水的或疏水的。保守置换的具体实例包括疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个疏水残基，极性残基置换另一个极性残基，例如精氨酸置换赖氨酸，谷氨酸置换天冬氨酸，或谷氨酰胺置换天冬酰胺，等等。术语“保守置换”还包括使用置换的氨基酸代替未置换的亲本氨基酸。此类多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)可由核酸编码。
修饰的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)还包括一个或多个置换L-氨基酸的D-氨基酸(及其混合物)、结构和功能类似物，例如具有合成或非天然氨基酸或氨基酸类似物和衍生物形式的拟肽。修饰包括环状结构，如多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的氨基和羧基末端之间的端对端酰胺键。
修饰的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)进一步包括“化学衍生物”，其中一个或多个氨基酸具有在化学上改变或衍生的侧链。此类衍生的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包括例如氨基酸，其中来自胺盐酸盐的游离氨基、对甲苯磺酰基、羧苯氧基、形成盐的游离羧基、甲基和乙酯；形成O-酰基或O-烷基衍生物以及天然存在的氨基酸衍生物的游离羟基，例如，4-羟脯氨酸置换脯氨酸，5-羟赖氨酸置换赖氨酸，高丝氨酸置换丝氨酸，鸟氨酸置换赖氨酸。还包括可以改变共价键合的氨基酸衍生物，例如，在两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键。
GPC3，在本文中也称为磷脂酰肌醇聚糖3、DGSX、GTR2-2、MXR7、OCI-5、SDYS、SGB、SGBS或SGBS1，是肿瘤相关抗原，并且与细胞增殖有关。如本文所用的，GPC3包括全长野生型GPC3蛋白、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性GPC3蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的GPC3：AAH35972.1(全长)、NP_001158089.1(同种型1前体)、NP_004475.1(同种型2前体)、NP_001158090.1(同种型3前体)、NP_001158091.1(同种型4前体)、AQN67628.1(变体)、ABC72126.1(剪接变体A)、ABC72125.1(剪接变体B)和ABC72127.1(剪接变体C)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别GPC3蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型GPC3蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的GPC3蛋白。
TROP2，在本文中也称为TACSTD2、EGP-1、EGP1、GA733-1、GA7331、GP50、M1S1、TROP2、肿瘤相关钙信号转导物2或肿瘤相关的钙信号转导物2，是肿瘤相关抗原。如本文所用的，TROP2包括全长野生型TROP2蛋白、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性TROP2蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的TROP2：CAG47056.1(全长)或NP_002344.2(前体)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别TROP2蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型TROP2蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的TROP2蛋白。
FOLR1，在本文中也称为FBP、FOLR、叶酸受体1、叶酸受体α或FRα，是肿瘤相关抗原。如本文所用的，FOLR1包括全长野生型FOLR1蛋白、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性FOLR1蛋白包括但不限于NCBI登录号AAH02947.1中所示的全长FOLR1。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别FOLR1蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型FOLR1蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的FOLR1蛋白。
CD38，在本文中也称为ADPRC1，是肿瘤相关抗原。如本文所用的，CD38包括全长野生型CD38蛋白、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性CD38蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的CD38：BAA18966.1(全长)、EAW92745.1(同种型CRA_a)和EAW92746.1(同种型CRA_b)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别CD38蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型CD38蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的CD38蛋白。
FLT3，在本文中也称为CD135、FLK-2、FLK2、STK1、胎肝激酶2、FLK2或fms相关酪氨酸激酶3，是肿瘤相关抗原。如本文所用的，FLT3包括全长野生型FLT3蛋白、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性FLT3蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的FLT3：NP_004110.2(全长)、XP_011533317.1(同种型X1)、XP_016875975.1(同种型X2)、XP_016875976.1(同种型X3)、XP_016875977.1(同种型X4)、XP_016875978.1(同种型X5)、CAA81393.1(前体)和AAI44040.1(变体)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别FLT3蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型FLT3蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的FLT3蛋白。
CD33，在本文中也称为Siglec-3、唾液酸结合Ig样凝集素3、SIGLEC3、SIGLEC-3、gp67或p67，在癌细胞和免疫抑制细胞上表达。如本文所用的，CD33包括全长野生型CD33、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性CD33蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的CD33：AAH28152.1(全长)、NP_001763.3(同种型1前体)、NP_001076087.1(同种型2)、NP_001171079.1(同种型3前体)、XP_016882997.1(同种型X1)、XP_016882998.1(同种型X2)、XP_011525834.1(同种型X3)和XP_016882999.1(同种型X4)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别CD33蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型CD33蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的CD33蛋白。
CD163，在本文中也称为M130、MM130或SCARI1，是在免疫抑制细胞上表达的抗原。如本文所用的，CD163包括全长野生型CD163、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性CD163蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的CD163：AAH51281.1(全长)、NP_004235.4(M130同种型a前体)、NP_981961.2(M130同种型b前体)、NP_001357075.1(M130同种型c前体)、CAB45233.1(变体)、AAY99762.1(变体)、EAW88665.1(同种型CRA_a)和EAW88666.1(同种型CRA_b)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别CD163蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型CD163蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的CD163蛋白。
CSF1R，在本文中也称为C-FMS、CD115、CSF-1R、CSFR、FIM2、FMS、HDLS、巨噬细胞集落刺激因子受体、M-CSF-R、集落刺激因子1受体或BANDDOS，是在免疫抑制细胞上表达的抗原。如本文所用的，CSF1R包括全长野生型CSF1R、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性CSF1R蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的CSF1R：AAH47521.1(全长)、NP_001275634.1(同种型a前体)、NP_001362250.1(同种型b前体)、AAI29940.1(变体)和ACF47629.1(可溶性变体1)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别CSF1R蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型CSF1R蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的CSF1R蛋白。
TRAIF-R2，在本文中也称为CD262、DR5、KILLER、KILLER/DR5、TRAILR2、TRICK2、TRICK2A、TRICK2B、TRICKB或ZTNFR9，是在免疫抑制细胞上表达的抗原。如本文所用的，TRAIL-R2包括全长野生型TRAIL-R2、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型。本文考虑并涵盖的示例性TRAIL-R2蛋白包括但不限于以下NCBI登录号中所示的TRAIL-R2：AAH01281.1(全长)、NP_003833.4(同种型1前体)、NP_671716.2(同种型2前体)和AAC51778.1(变体)。
在某些实施方案中，本文所述的多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别TRAIL-R2蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分。在一些实施方案中，所述多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)包含识别全长野生型TRAIL-R2蛋白的细胞外部分上的表位的肿瘤结合部分、其功能片段、变体(包括天然存在的和非天然的修饰)或同种型，以及可选的一种或多种由以上公开的NCBI登录号定义的TRAIL-R2蛋白。
如本文所用的，在多特异性抗体的背景下，相对于与抗体进行比较的亲本序列的80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性可指抗体框架区中的氨基酸差异，和/或CDR区中的保守置换。例如，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异存在于免疫球蛋白VH、VL、HC和/或LC的框架区中，并且CDR相对于亲本抗体的CDR保持不变。在一些情况下，促成至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸差异包括免疫球蛋白VH、VL、HC和/或LC的框架区、CDR区或其组合中的保守置换，但是多特异性抗体保持与靶肿瘤抗原和/或免疫抑制细胞上表达的靶抗原结合。
如本文所用的，术语“免疫抑制细胞”和“免疫抑制性细胞”可互换使用，是指在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用的细胞。在一些情况下，免疫抑制细胞或免疫抑制性细胞包括CD4+T调节(Treg)细胞、MDSC、TAM或其组合。
如本文所用的，关于单作用双特异性抗体的术语“单作用”是指减少或抑制癌细胞增殖或肿瘤生长和/或杀死癌细胞。在一些情况下，“单作用”不包括减少或抑制其他细胞类型，如免疫抑制细胞。
如本文所用的，关于多作用多特异性结合多肽(例如，多特异性抗体)的术语“多作用”是指减少或抑制癌细胞增殖或肿瘤生长、杀死癌细胞、减少或抑制免疫抑制细胞增殖以及杀死免疫抑制细胞。在这样的情况下，术语“多作用”包括抑制和杀死癌细胞和免疫抑制细胞两者。
实施例
提供这些实施例仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求书的范围。
实施例1-示例性多特异性抗体的生成
示例性双特异性抗体的重链可包含以下格式：
N-VH-CH1-CH2-CH3-肽-scFv-C，其中N和C表示构建体的N末端和C末端。重链是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，并且可以进一步克隆到哺乳动物表达载体中。将重链的5’端克隆到载体前导序列的3’端，以允许从哺乳动物表达细胞中分泌。轻链在单独的表达载体中构建，其中VL与Kappa或Lamda CL结构域一起克隆。类似地，将轻链DNA序列的5’端克隆到载体前导序列的3’端。
含有重链和轻链的质粒在HEK293或CHO细胞中瞬时共表达。
在37℃、5％CO2下，在以140rpm旋转的定轨摇床平台上，细胞在烧瓶中生长，并按照制造商的方案进行传代培养。以聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂进行共转染。简而言之，在转染前将HEK293/CHO细胞传代培养至细胞密度为0.5–0.7×106个细胞/ml，持续24小时。临转染前，将细胞密度调整为1×106个细胞/ml。将500微克的每种纯化质粒(1mg/ml)添加到19ml Optipro(Invitrogen)中。将溶解在水中的两毫升1mg/ml PEI(pH7.0)(分子量(MW)为25000)添加到18ml Optipro中。两种溶液都在室温下孵育5分钟。将DNA/Optipro溶液添加到PEI/Optipro溶液中，并在室温下孵育10分钟，然后逐滴添加到1L HEK293/CHO培养物中。转染后6-8天收集上清液。如以下实施例中所述，纯化抗体并检查表达、纯度和质量。
实施例2-靶标选择
基于通过log2(TPM+1)或TPM或通过RNASeqV2或通过IHC的染色强度测量的表达水平来选择在癌细胞和免疫抑制细胞上表达的受体/抗原。从诸如癌症基因组图集(TheCancer Genome Atlas，TCGA)、人类蛋白质图集、FireBrowse、Tumor Portal等基因组学数据库中分析表达水平。执行以下操作以选择癌细胞和免疫抑制细胞上的靶标的特定配对组合：
(1)选择在评分为TPM>5或log2(TPM+1)≥2.3的相同肿瘤样品中检测到的癌细胞和免疫抑制细胞中表达的抗原/受体；
(2)选择在中值表达水平评分为RNASeqV2(Log)>5的相同肿瘤样品中检测到的癌细胞和免疫抑制细胞中表达的抗原/受体；
(3)在通过IHC确定染色强度评分为+2至+3的相同肿瘤样品中检测到的癌细胞和免疫抑制细胞中表达的抗原/受体；
(4)通过检测以下抗原的存在，在肿瘤样品中检测免疫抑制细胞，如MDSC：CD33、CD14、FUT4/CD15、ITGAM/CD11b；(5)通过检测以下抗原的存在，在肿瘤样品中检测免疫抑制细胞，如M2-肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAM)：MRC1、CD163、CD204/MSR1、CD301/CLEC10A、CD209、CD206/MRC1、CLEC7A、ITGAM/CD11b、CD200R；
(6)在表达水平评分为TPM>5或log2(TPM+1)≥2.3的肿瘤样品中检测在4和5中提到的特异性受体；
(7)在表达水平评分为RNASeqV2(Log)>5的肿瘤样品中检测4和5中提到的特异性受体；
(8)在通过IHC确定染色强度评分为+2至+3的肿瘤样品中检测4和5中提到的特异性受体；
(9)选定的靶标在通过IHC确定强度评分为0至+1的非肿瘤组织中表达；
(10)选定的靶标在中值表达水平评分为RNASeqV2(Log)<4的非肿瘤组织中表达；
(11)各自细胞类型中选定的靶标在评分为TPM<4或log2(TPM+1)≤2的非肿瘤组织中表达；
(12)通过分析癌症基因组数据库来选择受体，该数据库通过估计RNA水平、蛋白质水平和IHC染色强度来报告受体的表达水平；
(13)通过使用执行步骤1-12的数据分析软件分析基因组数据库来选择受体。
实施例3-TROP2和免疫抑制细胞表面标志物在不同癌症中的表达
以下计算机实验通过检测相同活检物中致癌受体(TROP2)和在免疫抑制细胞表面上表达的若干受体的表达水平建立了使用示例性多特异性结合多肽的方法的临床相关性，所述多特异性结合多肽与三阴性乳腺癌(TNBC)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和前列腺腺癌中的肿瘤相关抗原和免疫抑制细胞结合。
在三阴性乳腺癌(TNBC)活检物中，如图2所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝116)中>80％的TNBC肿瘤患者表现出TROP2的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、TNFR2、CD163、TREM2、LILRB4、STAB1、TMEM119、MS4A7、IL4R和SELPLG在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。在该池中，约10％的TNBC患者在相同活检样品中表现出具有单个基因表达水平Log2(TPM+1)≥2.3的TROP2和CD33。TCGA池中TNBC肿瘤活检物的分析表明免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平；>80％的患者肿瘤活检物表现出基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3。
在肺腺癌(LUAD)活检物中，如图3所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝515)中>80％的TNBC肿瘤患者表现出TROP2的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、IL4R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、TREM2、TNFR2、MARCO、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、CLEC10A和SELPLG在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。在该池中，约20％的TNBC患者在相同活检样品中表现出具有单个基因表达水平Log2(TPM+1)≥2.3的TROP2和CD33。TCGA池中LUAD肿瘤活检物的分析表明免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平；>50％的患者肿瘤活检物表现出基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3。
在肺鳞状细胞癌(LUSC)活检物中，如图4所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝503)中>80％的LUSC肿瘤患者表现出TROP2的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、IL4R、SEMA4A、SEMA4D、TREM2、TNFR2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、CLEC10A在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。在该池中，约10–15％的LUSC患者在相同活检样品中表现出具有单个基因表达水平Log2(TPM+1)≥2.3的TROP2和CD33。TCGA池中LUSC肿瘤活检物的分析表明免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平；>50％的患者肿瘤活检物表现出基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3。
在前列腺腺癌(PRAD)肿瘤活检物中，如图5所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝497)中>70％的TNBC肿瘤患者表现出TROP2的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、STAB1、LILRB4、MERTK、TMEM119、IL4R、SEMA4D、CLEC10A和SELPLG在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。在该池中，<10％的PRAD患者在相同活检样品中表现出具有单个基因表达水平Log2(TPM+1)≥2.3的TROP2和CD33。TCGA池中PRAD肿瘤活检物的分析表明免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平；>80％的患者肿瘤活检物表现出基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3。
实施例4-GPC3和免疫抑制细胞表面标志物在不同癌症中的表达
以下计算机实验通过检测相同活检物中致癌受体(GPC3)和在免疫抑制细胞表面上表达的若干受体的表达水平建立了使用相关多特异性结合多肽的方法的临床相关性，所述多特异性结合多肽与肝脏肝细胞癌(LIHC)和肺腺癌(LUAD)中的肿瘤相关抗原和免疫抑制细胞结合。
在肝脏肝细胞癌(LIHC)活检物中，如图6所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝371)中>80％的LIHC肿瘤患者表现出GPC3的高表达水平，ABCC3、TMEM37、STAB1、IL4R、TNFRSF10B、TNFRSF1B、CSF1R、TREM2、MS4A7和CD163在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。TCGA池中LIHC肿瘤活检物的分析表明>80％的患者肿瘤活检物表现出免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平(基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3)。
在LUAD活检物中，如图7所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝515)中>50％的LUAD肿瘤患者表现出GPC3的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、IL4R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、TREM2、TNFR2、MARCO、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1和CLEC10A在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。TCGA池中LUAD肿瘤活检物的分析表明>80％的患者肿瘤活检物表现出免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平(基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3)。
实施例5-FOLR1和免疫抑制细胞表面标志物在不同癌症中的表达
以下计算机实验通过检测相同活检物中致癌受体(FOLR1)和在免疫抑制细胞表面上表达的若干受体的表达水平建立了使用相关多特异性结合多肽的方法的临床相关性，所述多特异性结合多肽与肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和卵巢浆液性囊腺癌(OV)中的肿瘤相关抗原和免疫抑制细胞结合。
在LUAD肿瘤活检物中，如图8所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝515)中>80％的LUAD肿瘤患者表现出FOLR1的高表达水平，TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、IL4R、CLEC10A和SELPLG在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。TCGA池中LUAD肿瘤活检物的分析表明>80％的患者肿瘤活检物表现出免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平(基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3)。
在LUSC肿瘤活检物中，如图9所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝503)中>50％的LUSC肿瘤患者表现出FOLR1的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、IL4R、CLEC10A和SELPLG在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。TCGA池中LUSC肿瘤活检物的分析表明>80％的患者肿瘤活检物表现出免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平(基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3)。
在卵巢囊腺癌(OV)活检物中，如图10所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝291)中>50％的OV肿瘤患者表现出FOLR1的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、SEMA4D、CD163、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LILRB4、STAB1、SIGLEC1、IL4R和SELPLG在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。TCGA池中OV肿瘤活检物的分析表明>80％的患者肿瘤活检物表现出免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平(基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3)。
实施例6-FOLH1和免疫抑制细胞表面标志物在不同癌症中的表达
以下计算机实验通过检测相同活检物中致癌受体(FOLH1)和在免疫抑制细胞表面上表达的若干受体的表达水平建立了使用相关多特异性结合多肽的方法的临床相关性，所述多特异性结合多肽与前列腺腺癌(PRAD)中的肿瘤相关抗原和免疫抑制细胞结合。
在PRAD肿瘤活检物中，如图11所示，注意到癌症基因组图集(TCGA)池(n＝497)中>50％的PRAD肿瘤患者表现出FOLH1的高表达水平，TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、ABCC3、STAB1、LILRB4、MERTK、TMEM119、IL4R、SEMA4D、CLEC10A和SELPLG在相同活检样品中具有通过Log2(TPM+1)≥2.3测得的单个基因表达水平。TCGA池中PRAD肿瘤活检物的分析表明>80％的患者肿瘤活检物表现出免疫检查点受体PD-1、PD-L1、CTLA-4和LAG-3的低表达水平(基因表达水平Log2(TPM+1)≤2.3)。
实施例7-αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体的表征
αTROP2×αTRAIL-R2双特异性抗体是根据图1A中的方案生成的，并且包含SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8，其中抗TROP2结合域在第一结合部分Fab区中表达，并且抗TRAIL-R2结合域在第二结合部分scFv中表达。使用符合当前生产实践的无血清化学成分确定培养基，在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物表达系统中瞬时表达构建体。100mL瞬时表达培养物在蛋白A纯化后产生总共约23mg多特异性抗体，滴度高达0.24g/L，图12A。通过大小排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)对溶液谱的分析揭示存在约86％的完整双特异性抗体单体，而未检测到低分子量种类，提示该构建体的稳定性，如图12B所示。该构建体的稳定性和纯度通过还原和去糖基化条件下的SDS-PAGE和完整质量分析进一步证实，其中没有观察到低分子量种类，分别见图12C和图12D。与非结合人IgG1同种型(阴性对照)和结合兔抗TROP2和抗TRAIL-R2抗体(阳性对照)相比，通过ELISA测量对TROP2和TRAIL-R2抗原的结合亲和力。αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体对肿瘤相关抗原TROP2(KD＝0.0024nM)表现出比对免疫抑制细胞上表达的抗原TRAIL-R2(KD＝0.22nM)更高的结合亲和力，图12E。αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体还在癌细胞中表现出靶标选择性结合。在SKBR3——表达高水平TROP2(图13B)和低但可检测水平的TRAIL-R2(图13C)的乳腺癌细胞系中，结合亲和力为KD＝2.4nM(0.46μg/ml)，图13A。在表达极低水平的TRAIL-R2但不表达TROP2(图13F)的U937中，αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体表现出选择性结合，图13D。在既不表达TROP2也不表达TRAIL-R2(图13G)的THP1中，αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体不表现出结合，图13E。在阻断IgG抗体Fc区与Fcγ受体的非特异性结合的Fc阻断试剂的存在下，检测到αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体在U937和THP1中的TRAIL-R2介导的结合。FcγRIA(CD64A)在U937和THP1两者中的高表达有助于在那些细胞系中没有Fc阻断试剂时的结合。在Fc阻断剂的存在下，αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体在U937中表现出剂量依赖性TRAIL-R2介导的凋亡和细胞死亡，图14。在U937中，在IC50＝0.65nM(0.13μg/ml)时实现了11％和15％的细胞杀伤。αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体的TRAIL-R2介导的凋亡在没有交联的情况下进行，而几个小组的研究表明，抗TRAIL-R2激动剂单特异性抗体仅在交联时能够在TRAIL敏感的癌细胞系中诱导凋亡。αTROP2×αTRAIL-R2多特异性抗体的活性在表达高水平TRAIL-R2但不表达FcγRIA(CD64A)的癌细胞系中更高。通过抗体的Fc区结合的U937中FcγRIA(CD64A)的高表达水平促进并降低与TRAIL-R2的结合，随后降低TRAIL-R2介导的凋亡。
实施例8-αTROP2×αCD33、αTROP2×αCSF1R和αTROP2×αCD163多特异性抗体的表征
αTROP2×αCD33、αTROP2×αCSF1R和αTROP2×αCD163双特异性抗体根据图1A中的方案生成，其中抗-TROP2结合域在Fab部分中表达，而抗CD33、抗CSF1R和抗CD163结合域在scFv部分中表达。对于αTROP2×αCD33，使用SEQ ID NO:75和8；对于αTROP2×αCSF1R，使用SEQ ID NO:76和8；对于αTROP2×αCD163，使用SEQ ID NO:77和8。使用符合当前生产实践的无血清化学成分确定培养基，在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物表达系统中瞬时表达各自的构建体。50mL瞬时表达培养物产生4mg至10mg范围内的总量，转染后第8天观察的滴度为：αTROP2×αCD33–0.035g/L；αTROP2×αCSF1R–0.017g/L；而αTROP2×αCD163–0.025g/L。通过大小排阻超高效液相色谱法(SE-UPLC)对溶液谱的分析揭示存在约100％的完整双特异性抗体单体，而未检测到低分子量种类，提示该构建体的稳定性，如图15所示。该构建体的稳定性和纯度通过还原和非还原条件下的SDS-PAGE进一步证实，其中没有观察到低分子量种类，图16。为了评估多特异性抗体与其各自抗原的结合，在SEC纯化之后使用运行BiacoreT200控制软件V2.0.1和Biacore T200评价软件V3的Biacore T200(序列号1909913)(Uppsala，Sweden)进行多周期动力学分析。αTROP2×αCD33和αTROP2×αCD163多特异性抗体对肿瘤相关抗原TROP2(KD＝0.9nM)表现出比对免疫抑制细胞上表达的抗原CD33和CD163(分别为KD＝8.4nM和493nM)更高的结合亲和力，图17和图18。αTROP2×αCSF1R多特异性抗体对肿瘤相关抗原TROP2和在免疫抑制细胞上表达的抗原CSF1R表现出相似的结合亲和力；对于TROP2，KD＝0.8nM，对于CSF1R，KD＝0.5nM，图19。
αTROP2×αCD33多特异性抗体在癌细胞中也表现出靶标选择性结合。在SKBR3——表达高水平TROP2(图20C和13B)的乳腺癌细胞系中，结合亲和力为KD＝2.7nM(0.55μg/ml)，图20A。在表达高水平CD33但不表达TROP2(图20D和13F)的THP1中，αTROP2×αCD33多特异性抗体表现出选择性结合，图20B。在一些情况下，在阻断IgG抗体Fc区与Fcγ受体的非特异性结合的Fc阻断试剂的存在下检测到αTROP2×αCD33多特异性抗体在THP1中的CD33介导的结合。
实施例9-抗体人源化
亲本小鼠和兔抗体通过分别将来自重链和轻链的CDR或抗原结合序列移植到与小鼠或兔框架序列具有高度序列同一性的人框架的重链和轻链上而进行人源化。通过将人重链框架与人轻链框架配对生成一系列人源化变体。生成的人源化变体的数量取决于人重链和轻链框架的配对组合的数目。变体在HEK293或CHO或其他哺乳动物表达系统中瞬时表达。通过FACS分析来自表达培养物的上清液与特定人抗原的结合。人抗原可在哺乳动物稳定表达细胞系的细胞表面上重组表达。
人源化变体的结合亲和力在浓度方面进行测量，其中浓度越低则结合亲和力越高。通常，选择表现出纳摩尔范围内的结合亲和力的人源化抗体变体。此外，选定的人源化抗体变体还保留了与嵌合体相当的结合亲和力谱。筛选选定的人源化抗体变体，以防止其与低、中和高的不同受体拷贝数结合；理想情况下，选定的变体应保持类似的结合亲和力。
实施例10-多特异性抗体的产生
可以使用基于色谱法的分离方法来纯化多特异性抗体。在哺乳动物表达系统中表达的分泌抗体通过经适当大小的膜过滤分离细胞团和碎片来收获，以阻止细胞团和碎片聚集在滤液中。滤液中的分泌抗体通过分批结合或柱结合在蛋白A亲和色谱树脂上被捕获。在pH 2–3的酸性条件下，使用含有甘氨酸或柠檬酸盐的缓冲液从树脂上洗脱结合的抗体。将洗脱的抗体制品滴定至pH 5并用水稀释50％以降低电导率。通过阳离子交换或HIC色谱法从该制品中除去聚集体和/或杂质。通过适当的洗脱缓冲液的梯度从树脂上洗脱抗体。通过分析型大小排阻色谱法分析洗脱的级分的单体分布。另外，通过质谱法分析洗脱的级分以进行质量分析。将与序列和/或相关标准的预期分子量相匹配并且通过大小排阻色谱法还显示单体溶液谱的级分合并在一起。将合并的多特异性抗体制品用与人体等渗的缓冲溶液配制。例如，组合物可以在磷酸盐缓冲盐水、HEPES缓冲盐水、基于组氨酸的缓冲制剂、基于Tris的缓冲制剂、基于柠檬酸盐的缓冲制剂中配制。对最终制品进行质量控制评估，通过该策略生成的制品产生含有<5％聚集体和<5EU/mg内毒素水平的优质材料。
实施例11-与毒素缀合的多特异性抗体的产生
可以使用如实施例10中所述的基于色谱法的分离方法来纯化多特异性抗体。从基于色谱法的分离方法合并的多特异性抗体可以进一步基于缀合化学与毒素有效负载缀合。该缀合可以通过Cys-马来酰亚胺缀合进行，其中抗体被还原剂如TCEP(三羧基乙基膦)或DTT(1,4-二硫苏糖醇)还原。该缀合可以在含有4-6mM EDTA的缓冲溶液中进行，该缓冲溶液的缓冲能力跨越pH 6至9。将还原剂添加到多特异性抗体溶液中，达到2-4的TCEP:抗体比。加入还原剂后，将溶液在37℃下孵育1小时。通过以最终毒素:还原的半胱氨酸摩尔比为1.15添加毒素-有效负载，使还原的抗体与具有马来酰亚胺反应基团的毒素-有效负载缀合。该缀合反应可在诸如DMSO、海藻糖、甘油、蔗糖等赋形剂的存在下进行，浓度范围为1-20％v/v。该缀合反应在20℃下进行45分钟-1小时。通过添加比毒素-有效负载过量2.3摩尔的过量游离N-(乙酰基)-半胱氨酸以阻断未反应的马来酰亚胺基团来猝灭反应。该猝灭反应可在20℃下进行20-30分钟。在适当的条件下可以实现1、2、6和8的药物:抗体比(DAR)。通过使反应混合物经过阳离子交换色谱法或疏水相互作用色谱法，可以去除未缀合的抗体、未缀合的药物有效负载-连接体、聚集体和杂质。如果使用的方法是阳离子交换色谱法，则可以在0.5M氯化钠的0-100％梯度下从柱子上洗脱抗体药物缀合物。通过反相HPLC、HIC-HPLC、大小排阻HPLC和质谱法分析洗脱的级分的载药量和杂质评估。将与序列的预期分子量和所需的药物:抗体比相匹配并且通过大小排阻色谱法还显示单体溶液谱的级分合并在一起。将合并的多特异性抗体药物缀合物用与人体等渗的缓冲溶液配制。例如，本文所述的多特异性结合多肽的组合物可以在磷酸盐缓冲盐水、HEPES缓冲盐水、基于组氨酸的缓冲制剂、基于Tris的缓冲制剂、基于柠檬酸盐的缓冲制剂中配制。对最终制品进行质量控制评估，通过该策略生成的制品产生含有<5％聚集体和<5EU/mg内毒素水平的优质材料。
实施例12-癌细胞系上受体表达的测定
癌细胞系中相关受体的表达水平可以通过流式细胞术方法来估计。用AccutaseCell Detachment Solution(BD Bioscience)收获表达受体的相关细胞系，并使用QuantiBRITE PE珠(BD Bioscience)和与结合特定受体的第一抗体结合的PE缀合抗体测定受体表达。按照制造商的说明将第二抗体与PE缀合。可以在FACSCalibur Flow Cytometer(BD)上使用CellQuest Pro软件获取数据，并使用Flowjo软件(Tree Star；Ashland OR)进行分析。
实施例13-细胞杀伤效力
多特异性抗体的效力可以通过体外细胞培养物中的细胞活力来评估。具体而言，该测定根据存在的ATP定量来确定处理后存在的活细胞数目，ATP定量指示存在代谢活性细胞。细胞活力可以通过使用Cell Titer-Glo测定(Promega)进行量化，并且可以根据制造商的说明进行。简而言之，首先将细胞从主培养物中分离并接种在96孔板(Perkin&Elmer)的每个孔的底部。根据细胞系的不同，接种中使用的细胞数可在每孔8,000到15,000个活细胞的范围内。每个孔中细胞系特定培养基的体积可以在80到100微升之间不等。可以让细胞在37℃、5％CO2下在加湿室中粘附3-4小时。然后用所提出的发明中的多特异性抗体以0.004nM至250nM不等的浓度处理细胞。72-96小时后，通过在每孔中加入100微升CellTiter-Glo试剂，随后在平板振荡器上以350rpm混合2分钟，并在室温下在黑暗中孵育10分钟来确定细胞的活力。可以通过Synergy 5酶标仪(Biotek)以每孔0.5秒的读取时间(灵敏度：170)测量发光。减去仅含有培养基和Cell Titer-Glo试剂的孔中的背景发光。将数据绘制为相对于未处理的细胞活力的百分比对抗体浓度的对数，并使用Graphpad Prism 5(GraphPad Software,Inc.)拟合3PL模型。使用来自至少三个独立实验的数据计算平均IC50±标准偏差(s.d.)。
实施例14-小鼠异种移植研究的体内功效
可以进行一系列鼠异种移植研究以证明所提出的发明中多特异性抗体的抗肿瘤功效。可以对采用相关细胞系的肿瘤异种移植研究进行单剂量和重复剂量功效研究。例如，可以进行研究，以确定在采用诸如MDA-MB-468、MDA-MB-231、COLO205、SKBR3、U937、THP1、HL-60、KG-1、Shi-1、HNT-34、EOL1、CALU-3、CAPAN-1、PC-3、MCF-7、HCC38、HCC1806、DEL、SUDHL1、GDM1、P31FUJ或KASUMI6等细胞系的三阴性乳腺癌异种移植模型中的功效。4-8周龄的免疫受损裸(nu/nu)小鼠(TaconicFarms)可以植入癌症特异性相关细胞系。异种移植可以通过从原种肿瘤制备肿瘤悬浮液并与从组织培养物中收获的细胞进行混合来建立。将含有20％w/v肿瘤悬浮液和1x107个细胞的0.3mL注射液皮下注射到小鼠的胁腹或背部。在一些实施方案中，异种移植物可以通过从组织培养物中收获细胞并通过与基质胶(BDBioscience)1:1混合制备最终细胞悬浮液来建立，使得每只小鼠在胁腹或背部皮下接受总共1x107个细胞。肿瘤体积(TV)通过使用卡尺进行二维测量来确定，体积被定义为：(L×W×W)/2，其中L是肿瘤的最长维度，W是最短的维度。将小鼠随机分为治疗组，当肿瘤体积大约>0.25cm3时可以开始治疗。小鼠也定期通过放置在称重机上称重。给药强度可以从0.1mg/kg到高剂量不等，直到没有观察到毒性。给药频率根据药物的半衰期和减少肿瘤体积的能力而不等。研究方案和动物处理根据IACUC规定进行。一旦肿瘤体积增长>1.0cm3，就对小鼠施以安乐死并认为已经死于疾病。肿瘤生长的统计分析基于曲线下面积(AUC)。可以通过线性曲线建模获得单个肿瘤生长的概况。在对生长曲线进行统计分析之前，采用f检验来确定组间方差的相等性。使用双尾t检验评估不同治疗组和对照之间的统计显著性，但盐水对照除外，对其使用单尾t检验(P≤0.05的显著性)。AUC的统计学比较仅进行到组中的第一只动物因疾病进展而施以安乐死时。通过对每个处理生成的存活曲线进行对数秩检验来分析存活(P≤0.05的显著性)。
实施例15-肿瘤微阵列中的IHC
肿瘤特异性微阵列从专门生产微阵列的供应商处购买。通过将载玻片在NxGenDecloaking Chamber(Biocare Medical；Concord,CA)中在Tris/EDTA缓冲液(DaKo TargetRetrieval Solution，pH 9.0；Dako,Denmark)中于95℃孵育30分钟来进行抗原修复。用10μg/mL的山羊多克隆抗人抗原特异性抗体检测抗原，并用
Figure BDA0003247743320002021
ABC试剂盒(Vector Laboratories,Inc.；Burlingame,CA)染色。正常山羊抗体用作阴性对照(R&DSystems，Minneapolis,MN)。组织用苏木精进行复染。来自表达相关抗原的人类癌细胞系异种移植物的福尔马林固定、石蜡包埋切片可作为阳性对照。评分基于染色剂的强度：标本中>10％的肿瘤细胞，包括阴性、1+(弱)、2+(中等)和3+(强)。
实施例16-结合亲和力的测量
使用Octet Data Acquisition软件(FortéBio,Pall)由Octet Red96系统确定多特异性抗体的结合动力学参数。使用黑色96孔微孔板(Greiner Bio One)，以200微升的体积，采用1000rpm轨道传感器搅拌，在动力学缓冲液(KB：PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.02％吐温-20，Merck)中于30℃采集所有数据。相关抗原和/或胞外域用于研究。抗人IgG Fc捕获生物传感器尖头(FortéBio,Pall)在DPBS(Life Technologies)中平衡30秒。然后，将在DPBS中稀释的5μg/ml抗体固定在生物传感器尖头上120秒，在KB中记录基线60秒，然后逐步缔合和解离分析物，分别为600秒和1200秒。缓冲液对照作为背景减去，假设1:1Langmuir结合模型，通过执行由Octet数据分析软件提供的全局拟合算法来计算结合参数。
为了评价同时结合，将5μg/ml生物素化的抗原A在链霉亲和素生物传感器尖头(FortéBio,Pall)上捕获40秒。使用EZ-LinkTM Sulfo-NHS-Biotinylation Kit(ThermoScientific)进行生物素化。具有捕获抗原的生物传感器首先用1％奶粉、1％BSA、0.1％吐温
Figure BDA0003247743320002031
20和10μg/ml生物胞素封闭60秒，然后逐步使用50nM多特异性抗体和50nM抗原B各封闭300秒。作为对照，可以实施非相关同种型对照抗鸡蛋溶菌酶(抗HEL)或缓冲液对照以排除非特异性结合。
实施例17-药代动力学研究
测试多特异性抗体的药代动力学性质。抗体通过经导管静脉内团注到颈静脉中进行给药。大鼠以1mg/kg至5mg/kg范围内的强度给药一次。在给药前和给药后指定的时间点：0、2、24、48、96、168、240、384和576小时，从颈静脉导管收集血液样品。从导管中抽取大约0.1mL的全血，收集在血清分离管中，并在室温下凝结30-60分钟。通过以8000rpm离心5-10分钟，将血清与凝固的血液分离，并在-20℃下储存。通过使用电化学发光免疫吸附测定(ECLA)的ELISA类型测定，分析血清的多特异性抗体浓度。通过用固定在板上的特定抗原捕获，可以在血清中检测没有药物有效负载的多特异性抗体。然后通过标记的抗人Fc或抗κ抗体检测捕获的抗体。与药物毒素缀合的多特异性抗体用完整的有效负载检测，其中抗体被板上固定的抗原捕获。缀合的药物有效负载可以通过多克隆抗体检测。血清浓度-时间图在Excel(Microsoft，Redmond,WA)中生成。数值被报告为平均值±平均值的标准误差(SEM)。在WinNonlin(Pharsight，St.Louis,MO)中使用非房室分析进行基于测得的血清浓度对血液清除的药代动力学分析。
实施例18-示例性多特异性抗体在TRAIL-敏感的MDAMB231中缺乏细胞杀伤
MDAMB231是TRAIL敏感的细胞系，在细胞表面上同时表达TROP2和TRAIL-R2。该细胞系在TRAIL-R2通过结合TRAIL(TRAIL-R2的配体)被激活后被杀死。αTROP2×αTRAIL-R2在与TRAIL-R2结合后在MDAMB231中诱导细胞死亡的能力通过测量活细胞的数目来确定。处理后存在的活细胞数目基于存在的ATP的定量，这指示存在代谢活性细胞。通过使用CellTiter-Glo测定(Promega)量化细胞活力，其根据制造商的说明进行。简而言之，将汇合前的MDAMB231细胞以每孔1,000个细胞的密度接种在白色不透明96孔板(Pierce)中，体积为100μl。约16小时后，制备αTROP2×αTRAIL-R2和对照(小分子阳性对照-MMAE；PBS，培养基)的系列3倍稀释液，使得最终浓度范围在100nM至0.00508nM。移除细胞培养基，并添加测试物的系列稀释液。然后将板在37℃下孵育三天。三天后，使用Titer-Glo测定(Promega)，根据制造商的方案使用光度计微孔板酶标仪测定细胞杀伤。发光读数的分析表明，与MMAE处理的细胞培养物(其表现出细胞杀伤，IC50＝2nM)相比，αTROP2×αTRAIL-R2、PBS和培养基处理的细胞培养物的发光没有浓度依赖性变化。这表明αTROP2×αTRAIL-R2在MDAMB231中没有表现出任何细胞杀伤(图22)。αTROP2×αTRAIL-R2在MDAMB231中缺乏细胞杀伤是由于优先结合TROP2；αTROP2×αTRAIL-R2对TROP2抗原的结合亲和力是TRAIL-R2的100倍(图12E)。此外，TROP2参与细胞-细胞连接处的β连环蛋白信号传导，这是质膜中的一个不同子域。αTROP2×αTRAIL-R2与TROP2在细胞-细胞连接处的优先结合阻止αTROP2×αTRAIL-R2与脂筏中的TRAIL-R2结合，因此，没有观察到凋亡的激活(图21B)。
实施例19-确定通过靶向脂筏中的肿瘤特异性抗原选择性激活靶细胞中的TRAIL-R2引起的凋亡和细胞杀伤
该研究利用FACS方法来确定采用本文所述的示例性多特异性抗体对靶细胞的TRAIL-R2介导的杀伤。示例性多特异性抗体包含第一结合部分，第一结合部分与存在于靶细胞脂筏中的肿瘤相关抗原结合，以募集并促进脂筏内的TRAIL-R2的寡聚化(例如，二聚化)。靶细胞用膜联蛋白V和碘化丙锭(PI)染色，以检测凋亡和非活细胞。简而言之，首先将靶细胞从主培养物中分离并接种在96孔板(Perkin&Elmer)的每个孔的底部。根据细胞系的不同，接种中使用的靶细胞数可在每孔8,000到15,000个活细胞的范围内。每个孔中细胞系特定培养基的体积可以在80到100微升之间不等。可以让靶细胞在37℃、5％CO2下在加湿室中粘附3-4小时。然后用本文公开的多特异性抗体以0.004nM至250nM不等的浓度处理靶细胞。12-96小时后，洗涤靶细胞并用膜联蛋白V和PI染色，以检测凋亡的和坏死的细胞。将靶细胞在PBS中洗涤，然后在结合缓冲液中洗涤。靶细胞以1–5×106个细胞/ml重悬于1X结合缓冲液中。向100μl细胞悬浮液中加入5μl荧光染料缀合的膜联蛋白V。该悬浮液在室温下避光孵育10-15分钟。向细胞悬浮液中加入2ml 1X结合缓冲液，然后在室温下以400-600g离心5分钟。弃去上清液。然后将靶细胞重悬于200μL 1X结合缓冲液中，并加入5μL碘化丙锭染色溶液，并在冰上或室温下孵育5-15分钟。然后使用BD FACSVerse仪器通过FACS分析靶细胞。分析靶细胞的健康细胞(膜联蛋白V-/PI-)、早期凋亡(膜联蛋白V+/PI-)、晚期凋亡(膜联蛋白V+/PI+)和坏死(膜联蛋白V-/PI+)。通过将死亡和凋亡细胞百分比相对于测试物的特定浓度作图来计算IC50。
实施例20-αTROP2×αCD33-Val-Cit-MMAE或αTROP2×αCD33-PEG4-MMAF对于TROP2+癌症的安全性和/或功效的人类临床试验
目的：比较施用的双作用双特异性ADCαTROP2×
αCD33-Val-Cit-MMAE或αTROP2×αCD33-PEG4-MMAF的安全性和药代动力学。
研究设计：本研究是TROP2+患者中的I期、单中心、开放标签、随机化剂量递增研究，随后是II期研究。IMMU-132和/或免疫检查点抑制剂治疗失败或未接受任何一种治疗的患者具有资格。患者在试验开始14天内不得接受针对其癌症的治疗。治疗包括使用化学疗法、造血生长因子和生物疗法如单克隆抗体和CAR-T。患者应当从与先前治疗相关的所有毒性中恢复。对所有患者评价安全性，并按照日程收集用于药代动力学分析的所有血液收集物。所有研究均在机构伦理委员会批准和患者的同意下进行。
I期：患者在30天周期的第1天和第30天静脉内接受。剂量可基于以下概述的评估而得到保持或针对毒性进行修改。在不存在不可接受的毒性的情况下，每30天重复治疗。3-6名患者的群组接受递增剂量的αTROP2×αCD33-Val-Cit-MMAE或αTROP2×αCD33-PEG4-MMAF，直到确定最大耐受剂量(MTD)。MTD被定义为3名患者中的2名或6名患者中的2名经历剂量限制性毒性之前的剂量。根据国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)不良事件通用术语(CTCAE)3.0版(2006年8月9日)所设定的定义和标准来确定剂量限制性毒性。MTD是将在II期临床试验期间施用的推荐2期剂量(RP2D)。
II期：患者以RP2D像I期一样接受αTROP2×αCD33-Val-Cit-MMAE或αTROP2×αCD33-PEG4-MMAF。在不存在疾病进展或不可接受的毒性的情况下，治疗方案包括每4或8周一次，持续2-6个疗程。在完成2个疗程的治疗后，达到完全或部分反应的患者可以接受另外4个疗程。只要符合最初的资格标准，在完成6个疗程的研究治疗后维持病情稳定超过8周的患者在疾病进展时可以接受另外6个疗程。
血液采样：在施用αTROP2×αCD33-Val-Cit-MMAE或αTROP2×αCD33-PEG4-MMAF之前和之后，通过直接静脉穿刺抽取系列血液。在给药前约10分钟和给药后大约以下时间获得用于确定血清浓度的静脉血液样品(5mL)：第1、8和15天。所有血清样品均在-20oC下储存。
药代动力学：患者在开始治疗前以及第1、8和15天进行血清采集以供药代动力学评价。使用最新版本的药代动力学评价软件，通过模型独立方法计算药代动力学参数。确定以下药代动力学参数：峰值血清浓度(Cmax)；达到峰值血清浓度的时间(Tmax)；使用线性梯形规则计算的从零时间点到最后血液采样时间的浓度-时间曲线下面积(AUC)(AUC0-72)；以及根据消除速率常数计算的终末消除半衰期(T1/2)。消除速率常数通过对数-线性浓度-时间图的终末线性区域中的连续数据点的线性回归来估算。对于每次处理，计算药代动力学参数的平均值、标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比例(保留的制剂/非保留的制剂)。
患者反应：使用RECIST标准确定反应率。(Therasse等人,J.Natl.CancerInst.2000年2月2日；92(3):205-16)。通过采用X射线、CT扫描和MRI的成像来评估患者的反应。在开始研究之前和第一周期结束时进行成像，其中每四周或在后续周期结束时进行额外的成像。患者还经历癌症/肿瘤活检，以通过流式细胞术、Western印迹法和IHC评估癌祖细胞表型和克隆生长的变化，并通过FISH评估细胞遗传学变化。研究治疗完成后，定期随访患者4周。
实施方案1：一种多特异性抗体，其包含与肿瘤相关抗原特异性结合的肿瘤结合部分和与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的免疫细胞结合部分。
实施方案2：一种多特异性抗体，其包含与肿瘤相关抗原特异性结合的肿瘤结合部分和与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的免疫细胞结合部分，其中所述免疫细胞结合部分与所述免疫抑制细胞上表达的抗原之间的第一结合亲和力小于所述肿瘤结合部分与所述肿瘤相关抗原之间的第二结合亲和力。
实施方案3：一种多特异性抗体，其包含与肿瘤相关抗原特异性结合的肿瘤结合部分和与髓源性抑制细胞(MDSC)或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上表达的抗原特异性结合的免疫细胞结合部分。
实施方案4：根据实施方案3所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分与髓源性抑制细胞(MDSC)上表达的抗原特异性结合。
实施方案5：根据实施方案3所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分与TAM，任选地M2极化的TAM(M2-TAM)上表达的抗原特异性结合。
实施方案6：根据实施方案1或2所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞是髓系来源的抑制细胞(MDSC)。
实施方案7：根据实施方案1或2所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，任选地是M2极化的TAM(M2-TAM)。
实施方案8：根据实施方案1或2所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞是T调节(Treg)细胞。
实施方案9：根据实施方案1-8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是TROP2、HER2、GPC3、GD2、FOLR1、FLT3、BCMA、MUC16、SLC4A4、STEAP1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD38、CD30、CD47、CD123、间皮素、MT1-MMP或PSMA。
实施方案10：根据实施方案1-8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是TROP2、GPC3、HER2、FOLR1、CD33、CD38、FLT3、CD30、CD22或GD2。
实施方案11：根据实施方案1-8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是TROP2、GPC3、FOLR1、CD33、CD38或FLT3。
实施方案12：根据实施方案1-8中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是TROP2、CD47、HER2、CD30、CD22、GD2或FOLR1。
实施方案13：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是TRAIL-R2、CD33、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG。
实施方案14：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9。
实施方案15：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2。
实施方案16：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R。
实施方案17：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R。
实施方案18：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2。
实施方案19：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9。
实施方案20：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是SEMA4A、SEMA4D或TNFR2。
实施方案21：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R。
实施方案22：根据实施方案1-12中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是CD33、CD163或CSF1R。
实施方案23：根据实施方案1-22中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是双特异性抗体。
实施方案24：根据实施方案1-23中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含Fc部分。
实施方案25：根据实施方案1-24中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含经修饰以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力的Fc区。
实施方案26：根据实施方案1-24中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含Fc区，该Fc区包含修饰以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其中所述修饰任选地包含L234、L235、P238或P331，或其组合，其中根据EU编号惯例，L234、L235、P238和P331对应于野生型IgG1的位置234、235、238和331。
实施方案27：根据实施方案1-24中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含Fc区，该Fc区包含修饰以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其中所述修饰任选地包含L234、L235、P238和P331，其中根据EU编号惯例，L234、L235、P238和P331对应于野生型IgG1的位置234、235、238和331。
实施方案28：根据实施方案26或27所述的多特异性抗体，其中所述Fc区包含L234A、L235A、P238S、P331S或其组合。
实施方案29：根据实施方案1-28中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含经修饰以减轻嗜中性粒细胞减少症的Fc区。
实施方案30：根据实施方案29所述的多特异性抗体，其中所述Fc区在L234、S239、S442或其组合处包含修饰，其中根据EU编号惯例，L234、S239和S442对应于野生型IgG1的位置234、239、442。
实施方案31：根据实施方案29或30所述的多特异性抗体，其中所述Fc区包含L234F、S239C、S442C或其组合。
实施方案32：根据实施方案1-31中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含经修饰以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc区。
实施方案33：根据实施方案32所述的多特异性抗体，其中所述Fc区在S239、A330、I332或其组合处包含修饰，其中根据EU编号惯例，S239、A330和I332对应于野生型IgG1的位置239、330和332。
实施方案34：根据实施方案32或33所述的多特异性抗体，其中所述Fc区包含S239D、A330L、I332E或其组合。
实施方案35：根据实施方案1-34中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含对铰链区的修饰。
实施方案36：根据实施方案35所述的多特异性抗体，其中所述铰链区在S228处包含修饰，其中根据EU编号惯例，S228对应于野生型IgG4的位置228。
实施方案37：根据实施方案35或36所述的多特异性抗体，其中所述铰链区包含S228P。
实施方案38：根据实施方案1-37中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包括全长抗体、附加抗体、双特异性融合蛋白或双特异性抗体缀合物。
实施方案39：根据实施方案1-38中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包括纳米抗体、BiTE、双抗体、DART、TandAb、scDiabody、scDiabody-CH3、三抗体、微型抗体、微抗体、TriBi微抗体、scFv-CH3 KIH、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2、F(ab’)2-scFv2、scFv-KIH、Fab-scFv-Fc、四价HCAb、scDiabody-Fc、双抗体-Fc、串联scFv-Fc或胞内抗体。
实施方案40：根据实施方案1-39中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含IgG框架，任选地IgG1、IgG2或IgG4框架，进一步任选地IgG1或IgG4框架。
实施方案41：根据实施方案1-40中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是人源化抗体。
实施方案42：根据实施方案1-40中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体是嵌合抗体。
实施方案43：根据实施方案1-42中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含全长抗体或其抗原结合片段。
实施方案44：根据实施方案43所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含IgG抗体框架，任选地IgG1或IgG4框架。
实施方案45：根据实施方案43或44所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含全长抗体。
实施方案46：根据实施方案43或44所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含Fab、F(ab)2、单结构域抗体、单链可变片段(scFv)或纳米抗体。
实施方案47：根据实施方案43-46中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分是人源化抗体。
实施方案48：根据实施方案43-46中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分是嵌合抗体。
实施方案49：根据实施方案43-48中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9、16、20、24或28所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10、32、36、40或44所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案50：根据实施方案43-48中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案51：根据实施方案43-48中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案52：根据实施方案43-48中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案53：根据实施方案43-48中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案54：根据实施方案43-48中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案55：根据实施方案1-54中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含全长抗体或其抗原结合片段。
实施方案56：根据实施方案55所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含IgG抗体框架，任选地IgG1或IgG4框架。
实施方案57：根据实施方案55或56所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含全长抗体。
实施方案58：根据实施方案55或56所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含Fab、F(ab)2、单结构域抗体、单链可变片段(scFv)或纳米抗体。
实施方案59：根据实施方案55-58中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分是人源化抗体。
实施方案60：根据实施方案55-58中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分是嵌合抗体。
实施方案61：根据实施方案55-60中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11、48、52或59所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12、63、67或74所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
实施方案62：根据实施方案55-60中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
实施方案63：根据实施方案55-60中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:63所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
实施方案64：根据实施方案55-60中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
实施方案65：根据实施方案55-60中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:74所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
实施方案66：根据实施方案1-65中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含IgG抗体框架，任选地全长IgG抗体框架，所述免疫细胞结合部分是scFv，并且所述免疫细胞结合部分与所述肿瘤结合部分的C末端偶联，任选地与所述肿瘤结合部分的C末端重组融合。
实施方案67：根据实施方案1-65中任一项所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含IgG抗体框架，任选地全长IgG抗体框架，所述免疫细胞结合部分是scFv，并且所述免疫细胞结合部分与所述肿瘤结合部分的N末端偶联，任选地与所述肿瘤结合部分的N末端重组融合。
实施方案68：根据实施方案1-65中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分是IgG抗体框架，任选地全长IgG抗体框架，所述肿瘤结合部分是scFv，并且所述肿瘤结合部分与所述免疫细胞结合部分的C末端偶联，任选地与所述免疫细胞结合部分的C末端重组融合。
实施方案69：根据实施方案1-65中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分是IgG抗体框架，任选地全长IgG抗体框架，所述肿瘤结合部分是scFv，并且所述肿瘤结合部分与所述免疫细胞结合部分的N末端偶联，任选地与所述免疫细胞结合部分的N末端重组融合。
根实施方案70：根据实施方案66-69中任一项所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分通过多肽连接体与所述肿瘤结合部分偶联。
实施方案71：根据实施方案70所述的多特异性抗体，其中所述多肽连接体包含(Gly4Ser)n，其中n为1至10的整数，任选地为1至6、1至4或1至2的整数，进一步任选地为1、2、3或4。
实施方案72：根据实施方案1-71中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案73：根据实施方案1-71中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:7或75-77所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案74：根据实施方案1-71中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:79-83所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案75：根据实施方案1-71中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:84-88所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案76：根据实施方案1-71中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:89、91或93所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:90、92或94所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案77：根据实施方案1-76中任一项所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体进一步包含至少一种有效负载。
实施方案78：根据实施方案77所述的多特异性抗体，其中所述至少一种有效负载包含澳瑞他汀、澳瑞他汀衍生物、美登木素、美登木素生物碱、紫杉烷、加利车霉素、西马多丁、多卡米星、吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320002161
(PBD)、微管溶素、地塞米松或达沙替尼。
实施方案79：根据实施方案78所述的多特异性抗体，其中所述澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
实施方案80：根据实施方案78所述的多特异性抗体，其中所述美登木素生物碱是DM1、DM2(mertansine)或DM4。
实施方案81：根据实施方案78所述的多特异性抗体，其中所述吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320002171
是吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0003247743320002172
二聚体。
实施方案82：根据实施方案77-81中任一项所述的多特异性抗体，其中所述至少一种有效负载通过连接体附接至所述多特异性抗体。
实施方案83：根据实施方案82所述的多特异性抗体，其中所述连接体是可切割连接体。
实施方案84：根据实施方案82所述的多特异性抗体，其中所述连接体是pH敏感的连接体。
实施方案85：根据实施方案82所述的多特异性抗体，其中所述连接体是酶敏感的连接体。
实施方案86：根据实施方案82或85所述的多特异性抗体，其中所述连接体是蛋白酶敏感的连接体。
实施方案87：根据实施方案82所述的多特异性抗体，其中所述连接体是自牺牲连接体。
实施方案88：根据实施方案82所述的多特异性抗体，其中所述连接体是不可切割的连接体。
实施方案89：根据实施方案82-88中任一项所述的多特异性抗体，其中所述连接体包括零长度连接体、同双官能连接体、异双官能连接体、二肽连接体、间隔区、基于马来酰亚胺的缀合部分，或其组合。
实施方案90：根据实施方案82-89中任一项所述的多特异性抗体，其中所述连接体包含聚合物。
实施方案91：根据实施方案90所述的多特异性抗体，其中所述聚合物包括直链或支链聚乙二醇。
实施方案92：根据实施方案82所述的多特异性抗体，其中所述连接体是肽。
实施方案93：根据实施方案82所述的多特异性抗体，其中所述连接体是拟肽连接体。
实施方案94：根据实施方案1-93中任一项所述的多特异性抗体，其中所述有效负载与所述多特异性抗体之比为约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约6:1、约7:1、约8:1、约10:1或约12:1。
实施方案95：根据实施方案2或6-94中任一项所述的多特异性抗体，其中所述第一结合亲和力比所述第二结合亲和力小约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、200倍或更多。
实施方案96：一种药物组合物，其包含实施方案1-95的多特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。
实施方案97：根据实施方案96所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于全身给药。
实施方案98：根据实施方案96所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于局部给药。
实施方案99：根据实施方案96-98中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外给药。
实施方案100：根据实施方案96-99中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于皮下、肌肉内或静脉内给药。
实施方案101：一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案102：一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:7或75-77所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案103：一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:79-83所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案104：一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:84-88所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案105：一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:89、91或93所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:90、92或94所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
实施方案106：编码实施方案1-95的多特异性抗体的核酸。
实施方案107：包含实施方案101-106的核酸的载体。
实施方案108：包含实施方案101-106的核酸或实施方案107的载体的细胞。
实施方案109：一种治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物。
实施方案110：根据实施方案109所述的方法，其中所述疾病或病况是癌症。
实施方案111：根据实施方案110所述的方法，其中所述癌症是实体瘤癌症。
实施方案112：根据实施方案111所述的方法，其中所述实体瘤癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。
实施方案113：根据实施方案111所述的方法，其中所述实体瘤癌症是乳腺癌。
实施方案114：根据实施方案113所述的方法，其中所述乳腺癌是管腔A型乳腺癌、管腔B型乳腺癌、三阴性乳腺癌、富含HER2的乳腺癌或正常样乳腺癌。
实施方案115：根据实施方案113所述的方法，其中所述乳腺癌是原位导管癌(DCIS)、浸润性导管癌(IDC)、浸润性小叶癌(ILC)、炎性乳腺癌、原位小叶癌(LCIS)、男性乳腺癌、乳头佩吉特病或乳房叶状瘤。
实施方案116：根据实施方案115所述的方法，其中所述IDC包括乳房管状癌、乳房髓样癌、乳房乳头状癌或乳房筛状癌。
实施方案117：根据实施方案111所述的方法，其中所述实体瘤癌症是卵巢癌。
实施方案118：根据实施方案117所述的方法，其中所述卵巢癌是上皮癌、浆液性癌、小细胞癌、原发性腹膜癌、透明细胞癌、透明细胞腺癌、子宫内膜样癌、恶性米勒管混合瘤、粘液性癌、粘液性腺癌、腹膜假粘液瘤、未分化上皮癌、恶性Brener瘤、移行细胞癌、性索-间质瘤、粒层细胞瘤、成年粒层细胞瘤、青少年粒层细胞瘤、Sertoli-Leydig细胞瘤、硬化性间质瘤、生殖细胞瘤、无性细胞瘤、绒毛膜癌、未成熟(实体)畸胎瘤、成熟畸胎瘤(皮样囊肿)、卵黄囊瘤(内胚窦瘤)、胚胎性癌、多胚瘤、鳞状细胞癌、混合瘤或低恶性潜能肿瘤。
实施方案119：根据实施方案111所述的方法，其中所述实体瘤癌症是肺癌。
实施方案120：根据实施方案119所述的方法，其中所述肺癌是小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。
实施方案121：根据实施方案120所述的方法，其中所述NSCLC包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌或未分化的非小细胞肺癌。
实施方案122：根据实施方案111所述的方法，其中所述实体瘤癌症是肝癌。
实施方案123：根据实施方案122所述的方法，其中所述肝癌是肝细胞癌(HCC)、胆管癌、肝血管肉瘤或肝母细胞瘤。
实施方案124：根据实施方案111所述的方法，其中所述实体瘤癌症是前列腺癌。
实施方案125：根据实施方案124所述的方法，其中所述前列腺癌是腺泡腺癌、导管腺癌、移行细胞(或尿路上皮)癌、鳞状细胞癌、小细胞前列腺癌、前列腺中的类癌或前列腺中的肉瘤。
实施方案126：根据实施方案111所述的方法，其中所述实体瘤癌症是脑癌。
实施方案127：根据实施方案126所述的方法，其中所述脑癌是胶质母细胞瘤。
实施方案128：根据实施方案110所述的方法，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
实施方案129：根据实施方案128所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病或急性髓样白血病。
实施方案130：根据实施方案110-129中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移癌。
实施方案131：根据实施方案110-129中任一项所述的方法，其中所述癌症是复发性或难治性癌症。
实施方案132：根据实施方案109所述的方法，其中所述疾病或病况是肝脏疾病或病况。
实施方案133：根据实施方案132所述的方法，其中所述肝脏疾病或病况是非酒精性脂肪肝病(NASH)或酒精性脂肪性肝炎。
实施方案134：根据实施方案109-133中任一项所述的方法，其进一步包括施用附加治疗剂。
实施方案135：根据实施方案134所述的方法，其中所述附加治疗剂是化疗剂、放射或其组合。
实施方案136：根据实施方案109-135中任一项所述的方法，其中同时施用所述多特异性抗体和所述附加治疗剂。
实施方案137：根据实施方案109-135中任一项所述的方法，其中顺序施用所述多特异性抗体和所述附加治疗剂。
实施方案138：根据实施方案109-135或137中任一项所述的方法，其中在施用所述附加治疗剂之前向所述受试者施用所述多特异性抗体。
实施方案139：根据实施方案109-135或137中任一项所述的方法，其中在施用所述多特异性抗体之前向所述受试者施用所述附加治疗剂。
实施方案140：根据实施方案109-139中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体和所述附加治疗剂作为组合施用。
实施方案141：根据实施方案109-139中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体和所述附加治疗剂作为单独的剂型施用。
实施方案142：根据实施方案109-141中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已用免疫检查点抑制剂治疗进行过治疗。
实施方案143：根据实施方案109-142中任一项所述的方法，其中所述受试者对免疫检查点抑制剂不敏感，对免疫检查点抑制剂治疗没有反应，或表达低水平的或不表达免疫检查点蛋白。
实施方案144：根据实施方案109-143中任一项所述的方法，其中所述受试者已经接受过手术。
实施方案145：在靶细胞群体中诱导肿瘤和免疫抑制细胞杀伤作用的方法，其包括：使包含至少一种肿瘤细胞和至少一种免疫抑制细胞的靶细胞群体与实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物接触足以诱导细胞杀伤作用的一段时间，从而杀死靶细胞群体中的所述至少一种肿瘤细胞和所述至少一种免疫抑制细胞。
实施方案146：根据实施方案145所述的方法，其中所述肿瘤细胞是来自实体瘤的细胞。
实施方案147：根据实施方案145所述的方法，其中所述肿瘤细胞是来自血液系统恶性肿瘤的细胞。
实施方案148：根据实施方案145或146所述的方法，其中所述肿瘤细胞来自膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。
实施方案149：根据实施方案145或147所述的方法，其中所述肿瘤细胞来自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高恶性B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病或急性髓样白血病。
实施方案150：根据实施方案145所述的方法，其中所述免疫抑制细胞是MDSC、肿瘤相关巨噬细胞或Treg细胞。
实施方案151：根据实施方案145-150中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物调节T细胞增殖，任选地肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖。
实施方案152：根据实施方案145-151中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物增强T细胞增殖，任选地肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖。
实施方案153：根据实施方案145-152中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的肿瘤细胞减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
实施方案154：根据实施方案145-152中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的肿瘤细胞减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
实施方案155：根据实施方案145-154中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的肿瘤细胞增殖减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
实施方案156：根据实施方案145-154中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的肿瘤细胞增殖减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
实施方案157：根据实施方案145-156中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的免疫抑制细胞减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
实施方案158：根据实施方案145-156中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的免疫抑制细胞减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
实施方案159：根据实施方案145-158中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的免疫抑制细胞增殖减少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
实施方案160：根据实施方案145-158中任一项所述的方法，其中实施方案1-95的多特异性抗体或实施方案96-100的药物组合物使所述靶细胞群体中的免疫抑制细胞增殖减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
实施方案161：根据实施方案145-160中任一项所述的方法，其中所述靶细胞群体是体内靶细胞群体。
实施方案162：根据实施方案145-161中任一项所述的方法，其中所述靶细胞群体在肿瘤微环境内。
实施方案163：根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案164：根据实施方案1-95中任一项所述的多特异性抗体或根据实施方案96-100所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
实施方案165：根据实施方案163所述的用途，其中所述癌症是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。
实施方案166：根据实施方案164所述的用途，其中所述乳腺癌是管腔A型乳腺癌、管腔B型乳腺癌、三阴性乳腺癌、富含HER2的乳腺癌或正常样乳腺癌。
实施方案167：根据实施方案163所述的用途，其中所述癌症是血液系统恶性肿瘤。
实施方案168：根据实施方案166所述的用途，其中所述血液系统恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓样白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓样白血病或急性髓样白血病。
实施方案169：根据实施方案163所述的用途，其中所述癌症对免疫检查点抑制剂治疗是难治性的。
实施方案170：根据实施方案1-95中任一项所述的多特异性抗体或根据实施方案96-100所述的药物组合物，其用于治疗肝脏疾病或病况，任选地NASH或酒精性脂肪性肝炎。
实施方案171：进行癌症治疗的方法，其包括使实施方案101-106的核酸与合适的细胞系接触以建立转染的细胞系，在促进多特异性抗体分泌的条件下培养所述转染的细胞系，以及从所述转染的细胞系的上清液中收获所述多特异性抗体。
实施方案172：根据实施方案171所述的方法，其进一步包括从所述转染的细胞系的上清液中纯化所述多特异性抗体。
实施方案173：根据实施方案171或172所述的方法，其中所述转染的细胞系被稳定转染。
实施方案174：进行癌症治疗的方法，其包括将实施方案1-95中任一项的多特异性抗体与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。
实施方案175：试剂盒，其包含实施方案1-95的多特异性抗体、实施方案96-100的药物组合物、实施方案101-106的核酸、实施方案107的载体或实施方案108的细胞。
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本公开时可以采用本文所述本公开的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (65)

1.一种多特异性抗体，其包含与肿瘤相关抗原特异性结合的肿瘤结合部分和与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的免疫细胞结合部分。
2.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞是髓源性抑制细胞(MDSC)。
3.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，任选地是M2极化的TAM(M2-TAM)。
4.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤相关抗原是：
TROP2、HER2、GPC3、GD2、FOLR1、FLT3、BCMA、MUC16、SLC4A4、STEAP1、CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD38、CD30、CD47、CD123、间皮素、MT1-MMP或PSMA；
TROP2、GPC3、HER2、FOLR1、CD33、CD38、FLT3、CD30、CD22或GD2；或者
TROP2、GPC3、FOLR1、CD33、CD38或FLT3。
5.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述免疫抑制细胞上表达的抗原是：
CD33、TRAIL-R2、CSF1R、SEMA4A、SEMA4D、CD163、MARCO、TNFR2、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC1、SIGLEC7、SIGLEC9、IL4R、MGL1、CD200R或SELPLG；
TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1、MGL2、CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9；
TRAIL-R2、CSF1R、MARCO、SELPLG、CD163、TREM2、MS4A7、C5AR1、LYVE1、MRC1、CD200R、STAB1、MERTK、SIGLEC1、IL4R、MGL1或MGL2；
TRAIL-R2、CSF1R、CD33、TREM2、C5AR1、LYVE1、ABCC3、LILRB4、MRC1、SIGLEC1、STAB1、TMEM37、MERTK、TMEM119、SIGLEC7、SIGLEC9或IL4R；
TRAIL-R2、CSF1R、TREM2、C5AR1、LYVE1、MRC1、STAB1、MERTK、SIGLEC1或IL4R；
MARCO、SELPLG、CD163、MS4A7、CD200R、MGL1或MGL2；
CD33、ABCC3、LILRB4、TMEM37、TMEM119、SIGLEC7或SIGLEC9；
SEMA4A、SEMA4D或TNFR2；
TRAIL-R2、CD33、CD163或CSF1R；或者
CD33、CD163或CSF1R。
6.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含IgG抗体框架，任选地IgG1或IgG4框架。
7.根据权利要求6所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含全长抗体。
8.根据权利要求6所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分是人源化抗体。
9.根据权利要求6所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:9、16、20、24或28所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:10、32、36、40或44所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
10.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含IgG抗体框架，任选地IgG1或IgG4框架。
11.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含Fab、F(ab)2、单结构域抗体、单链可变片段(scFv)或纳米抗体。
12.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分是人源化抗体。
13.根据权利要求10所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:11、48、52或59所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链可变区与SEQ ID NO:12、63、67或74所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
14.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含IgG抗体框架，任选地全长IgG抗体框架，所述免疫细胞结合部分是scFv，并且所述免疫细胞结合部分与所述肿瘤结合部分的C末端偶联，任选地与所述肿瘤结合部分的C末端重组融合。
15.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分包含IgG抗体框架，任选地全长IgG抗体框架，所述免疫细胞结合部分是scFv，并且所述免疫细胞结合部分与所述肿瘤结合部分的N末端偶联，任选地与所述肿瘤结合部分的N末端重组融合。
16.根据权利要求14或15所述的多特异性抗体，其中所述免疫细胞结合部分通过多肽连接体与所述肿瘤结合部分偶联。
17.根据权利要求16所述的多特异性抗体，其中所述多肽连接体包含(Gly4Ser)n，其中n为1至10的整数，任选地为1至6、1至4或1至2的整数，进一步任选地为1、2、3或4。
18.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述肿瘤结合部分对所述肿瘤相关抗原的KD低于所述免疫细胞结合部分对所述免疫抑制细胞上表达的抗原的KD。
19.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含经修饰以降低对人新生Fc受体(FcRn)的亲和力的Fc区。
20.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含Fc区，该Fc区包含修饰以降低抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，其中所述修饰任选地包含L234、L235、P238或P331，或其组合，其中根据EU编号惯例，L234、L235、P238和P331对应于野生型IgG1的位置234、235、238和331。
21.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含经修饰以减轻嗜中性粒细胞减少症的Fc区。
22.根据权利要求21所述的多特异性抗体，其中所述Fc区在L234、S239、S442或其组合处包含修饰，其中根据EU编号惯例，L234、S239和S442对应于野生型IgG1的位置234、239、442。
23.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含经修饰以增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc区。
24.根据权利要求23所述的多特异性抗体，其中所述Fc区在S239、A330、I332或其组合处包含修饰，其中根据EU编号惯例，S239、A330和I332对应于野生型IgG1的位置239、330和332。
25.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体包含对铰链区的修饰。
26.根据权利要求25所述的多特异性抗体，其中所述铰链区在S228处包含修饰，其中根据EU编号惯例，S228对应于野生型IgG4的位置228。
27.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述抗体包含：
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与表5所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成；
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:7或75-77所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成；
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:79-83所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成；
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:84-88所示的氨基酸序列97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成；或者
免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:89、91或93所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:90、92或94所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
28.根据权利要求1所述的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体进一步包含至少一个细胞毒性部分。
29.根据权利要求28所述的多特异性抗体，其中所述细胞毒性部分包含澳瑞他汀、澳瑞他汀衍生物、美登木素、美登木素生物碱、紫杉烷、加利车霉素、西马多丁、多卡米星、吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0003247743310000053
(PBD)、微管溶素、地塞米松或达沙替尼。
30.根据权利要求29所述的多特异性抗体，其中所述澳瑞他汀衍生物是单甲基澳瑞他汀E(MMAE)或单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。
31.根据权利要求29所述的多特异性抗体，其中所述美登木素生物碱是DM1、DM2或DM4。
32.根据权利要求29所述的多特异性抗体，其中所述吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0003247743310000051
是吡咯并苯并二氮杂
Figure FDA0003247743310000052
二聚体。
33.根据权利要求29所述的多特异性抗体，其中所述至少一个细胞毒性部分通过连接体，任选地通过可切割连接体或不可切割连接体附接至所述多特异性抗体。
34.一种药物组合物，其包含权利要求1至33中任一项的多特异性结合多肽和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外给药，任选地用于皮下、肌肉内或静脉内给药。
36.一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:7或75-77所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
37.一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:79-83所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
38.一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:84-88所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
39.一种编码多特异性抗体的核酸，所述多特异性抗体包含免疫球蛋白重链和可选的免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:89、91或93所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成的氨基酸序列；所述免疫球蛋白轻链与SEQ ID NO:90、92或94所示的氨基酸序列至少约90％、95％、97％、98％、99％或100％相同或由所述序列组成。
40.一种治疗有需要的受试者的疾病或病况的方法，该方法包括：
向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1的多特异性抗体、权利要求34的药物组合物或权利要求36-39的核酸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或病况是膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述乳腺癌是管腔A型乳腺癌、管腔B型乳腺癌、三阴性乳腺癌、富含HER2的乳腺癌或正常样乳腺癌。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或病况是血液系统恶性肿瘤。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述血液系统恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓样白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性髓样白血病或急性髓样白血病。
46.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或病况是肝脏疾病或病况。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述肝脏疾病或病况是非酒精性脂肪肝病(NASH)或酒精性脂肪性肝炎。
48.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者先前已用免疫检查点抑制剂治疗进行过治疗。
49.根据权利要求40所述的方法，其中所述受试者对免疫检查点抑制剂不敏感，对免疫检查点抑制剂治疗没有反应，或表达低水平的或不表达免疫检查点蛋白。
50.一种在靶细胞群体中诱导肿瘤和免疫抑制细胞杀伤作用的方法，其包括：
使包含至少一种肿瘤细胞和至少一种免疫抑制细胞的靶细胞群体与权利要求1-33的多特异性抗体、权利要求34-35的药物组合物或权利要求36-39的核酸接触足以诱导细胞杀伤作用的一段时间，从而杀死靶细胞群体中的所述至少一种肿瘤细胞和所述至少一种免疫抑制细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述肿瘤细胞是来自实体瘤的细胞，任选地来自膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睾丸癌或甲状腺癌。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述肿瘤细胞是来自血液系统恶性肿瘤的细胞。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述免疫抑制细胞是MDSC、肿瘤相关巨噬细胞或Treg细胞。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中权利要求1-33的多特异性抗体、权利要求34或36的药物组合物或权利要求36-39的核酸使所述靶细胞群体中的肿瘤细胞，任选地肿瘤细胞增殖减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其中权利要求1-33的多特异性抗体、权利要求34或35的药物组合物或权利要求36-39的核酸使所述靶细胞群体中的免疫抑制细胞，任选地免疫抑制细胞增殖减少约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍或更多。
56.根据权利要求50-55中任一项所述的方法，其中权利要求1-33的多特异性抗体、权利要求34或35的药物组合物或权利要求36-39的核酸增强T细胞增殖，任选地肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)增殖。
57.根据权利要求50-56中任一项所述的方法，其中所述靶细胞群体是体内靶细胞群体。
58.根据权利要求50-57中任一项所述的方法，其中所述靶细胞群体在肿瘤微环境内。
59.一种在有需要的受试者中诱导免疫抑制细胞杀伤的方法，其包括施用与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的抗体-细胞毒素缀合物，从而杀死所述受试者中的免疫抑制细胞。
60.一种在有需要的受试者中激活杀伤肿瘤细胞的免疫细胞的方法，其包括施用与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的抗体-细胞毒素缀合物，从而杀死所述受试者中的免疫抑制细胞并激活所述杀伤肿瘤细胞的免疫细胞。
61.一种在有需要的受试者中减少对杀伤肿瘤细胞的免疫细胞的抑制的方法，其包括施用与免疫抑制细胞上表达的抗原特异性结合的抗体-细胞毒素缀合物，从而杀死所述受试者中的免疫抑制细胞并减少对所述杀伤肿瘤细胞的免疫细胞的抑制。
62.根据权利要求59-61中任一项所述的方法，其中所述免疫抑制细胞是MDSC、TAM或Treg细胞。
63.根据权利要求59-62中任一项所述的方法，其中所述抗体-细胞毒素缀合物进一步包含肿瘤特异性结合部分。
64.根据权利要求59-63中任一项所述的方法，其中所述抗体-细胞毒素缀合物包含权利要求1-33的多特异性抗体。
65.根据权利要求59-64中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症。
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