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CN113549158B - 包含突变型il15以及嵌合抗原受体的融合蛋白 - Google Patents

包含突变型il15以及嵌合抗原受体的融合蛋白 Download PDF

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CN113549158B CN202110814329.1A CN202110814329A CN113549158B CN 113549158 B CN113549158 B CN 113549158B CN 202110814329 A CN202110814329 A CN 202110814329A CN 113549158 B CN113549158 B CN 113549158B
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Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种包含突变型IL15以及嵌合抗原受体的融合蛋白。该融合蛋白包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽和突变型IL15。分泌的突变型IL15可使宿主细胞例如γδT细胞具有更强的扩增能力和更长的体内外持久性，因而具有比传统CAR疗法更好的抗肿瘤效果。

Description

包含突变型IL15以及嵌合抗原受体的融合蛋白
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种包含突变型IL15以及嵌合抗原受体的融合蛋白。
背景技术
T细胞需要三种信号才能完全活化并维持功能：(i)肽/MHC复合物呈递的抗原(ii)有效的共刺激信号和(iii)可溶性细胞因子形式的生长和分化因子。第二代和第三代CAR可提供前两个信号，但没有主动供第三个依赖细胞因子的信号。为了将第三个信号也主动传递至表达CAR的T淋巴细胞，有研究将白介素(IL)-2受体β链的胞质结构域和STAT3结合酪氨酸-XX-谷氨酰胺(YXXQ)基序与CD3-ζ和CD28信号结构域相连。值得注意的是，第三种信号传导模块的加入使基因修饰的T细胞在体内具有更长的持久性，从而提供了更加有效的抗肿瘤作用。
细胞因子是一些比较小的蛋白质，其对免疫细胞的分化和功能具有重要的作用。因此，许多细胞因子(例如IL-2，IL-12，IL-18和IL-21)已在临床试验使用，主要用于癌症的治疗。但是，系统性施用会导致严重的副作用，例如系统性施用IL-12治疗多发性骨髓瘤。
为了克服上述问题同时充分利用细胞因子积极的作用，有研究采用表达CD19-CAR和IL12的载体转导T细胞，构建了能表达IL12的CAR-T细胞。这些CAR-T细胞有倾向性地归巢至肿瘤部位，在这里其分泌的IL12有助于有效的清除肿瘤。肿瘤免疫微环境中的Treg细胞会损伤T细胞的抗肿瘤反应，但研究表明CD19-IL12 CAR-T细胞能够抵抗Treg细胞的抑制作用。另外，伴随着巨噬细胞的激活，肿瘤部位T细胞的持久性也会相应地延长。然而，即使在这些情况下，IL12的分泌水平也需要严格的调控，因为大剂量的注射持续表达IL12的CAR-T后观察到相应的副作用。
除上述问题外，现有技术中也缺乏针对其他细胞因子与CAR技术联用的研究。
发明内容
本发明的第一方面涉及融合蛋白，包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽和突变型IL15；
所述突变型IL15的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二方面涉及一种分离的核酸，其表达得到如上所述的融合蛋白。
本发明的第三方面涉及含有如上所述核酸的载体。
本发明的第四方面涉及分离的宿主细胞，其包含如上所述的融合蛋白，或包含如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
本发明的第五方面涉及药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。
本发明的第六方面涉及如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明提供了同时表达CAR和突变型IL15的融合蛋白及其在肿瘤治疗方面的应用。分泌的突变型IL15可使宿主细胞例如γδT细胞具有更强的扩增能力和更长的体内外持久性，因而具有比传统CAR疗法更好的抗肿瘤效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中各组在Day10，Day12，Day16时CAR阳性率；各组细胞经FITC-Protein L染色，并用流式细胞术进行检测；
图2为本发明一个实施例中各组细胞在有/无抗原刺激时的细胞数量；A，抗原刺激时，在Day10，Day17和Day25各组细胞的细胞数量；B，无抗原刺激时，在Day10，Day17和Day25各组细胞的细胞数量；
图3为本发明一个实施例中Day16时CAR-γδT细胞的体外杀伤检测；A，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)的CAR-γδT细胞对Raji-luc细胞的杀伤效果；B，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)的CAR-γδT细胞对K562-luc细胞的杀伤情况；
图4为本发明一个实施例中Day20时CAR-γδT细胞的体外杀伤检测。A，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)的CAR-γδT细胞对Raji-luc细胞的杀伤效果；B，不同效靶比(1：1，3：1和10：1)的CAR-γδT细胞对K562-luc细胞的杀伤情况。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明涉及一种融合蛋白，包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽和突变型IL15；
所述突变型IL15的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
IL15是可以有效刺激NK和CD8+T等细胞的细胞因子之一。由于IL15在体内的半衰期比较短，因此它的活性非常有限，虽然使用IL15似乎具有较小的毒性。单独使用IL15对肿瘤消退的作用有限，但其与其他免疫治疗剂联合使用时却显示出巨大的潜力。
由于IL15在体内的半衰期比较短，体内应用时需要很高的剂量才产生有效的生物反应，因此会导致明显的临床毒性，限制了IL15的临床应用。本发明采用突变的IL15(N72D)代替野生型的IL15。N72D突变增加了人IL15与人IL-15β受体的结合亲和力，同时提高了IL-15的抗凋亡信号的转导活性。
在一些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含A)sc-Fv区，B)铰链区，C)跨膜域和D)胞内信号传导区。
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(CAR)”有时称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
如本文所用，所述嵌合抗原受体中所包含的“区”或者“域”是指多肽中的一个区，其可以独立于其它区而折叠成为特定结构。这些“区”或者“域”可以是鼠源或其他动物源性的序列，优选为人源序列。
如本文所用，“单链可变片段(sc-Fv)”是指衍生自抗体的单链多肽，其保留结合抗原的能力。sc-Fv的实例包括经重组DNA技术形成的抗体多肽并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区经由间隔序列连接。制备sc-Fv的多种方法是已知的，包括描述于以下文献的方法：美国专利号4694778；Science，第242卷，第423-442页(1988)；Nature，第334卷,第54454页(1989)；和Science，第242卷，第1038-1041页(1988)。
在一些实施方式中，所述sc-Fv区特异性识别肿瘤抗原。“肿瘤抗原”是指具有抗原性的生物分子，新近认识到其表达与细胞癌化相关。检测，例如，肿瘤抗原的免疫学检测可用于区分癌化细胞及其母细胞。本发明中的肿瘤抗原包括肿瘤特异性抗原(仅在肿瘤细胞中存在、而在其它正常细胞中不存在的抗原)和肿瘤相关抗原(也存在于其它器官和组织或异质和同种异体的正常细胞中的抗原，或在发育和分化过程中表达的抗原)。在一些实施方式中，所述肿瘤为血液瘤或者实体瘤，在一些实施方式中，实体瘤包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。特别地，优选预期的肿瘤可被靶向，例如胆管癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓源性白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈部癌、霍奇金氏淋巴瘤、肺癌、甲状腺髓样癌、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和尿路膀胱癌。
在一些实施方式中，所述sc-Fv区特异性识别CD19。
在一些实施方式中，所述sc-Fv区为来自FMC63的抗体区段，进一步的，所述sc-Fv区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
如本文所用，“结构域”是指多肽中的一个区，其独立于其它区而折叠成为特定结构。
在一些实施方式中，所述铰链区选自CD8α的hinge区；在一些实施方式中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些实施方式中，所述跨膜域为CD8α跨膜区，在一些实施方式中，其氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区选自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、PKCθ、FcεRIγ、ZAP70、和CD3ζ中的任一种，或其任意组合。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区包含CD3ζ信号传导域，在一些实施方式中，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导区还包含4-1BB或DAP10共刺激域；在一些实施方式中，4-1BB的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：6所示；在一些实施方式中，DAP10的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在一些实施方式中，所述2A肽为P2A。进一步的，所述2A肽的氨基酸序列如SEQ IDNO：8所示。
根据本公开的另一方面，还涉及分离的核酸，其表达如上所述的融合蛋白。
核酸可以是DNA或RNA。
根据本公开的另一方面，还涉及含有如上所述核酸的载体。
如本发明所定义，所述载体包括但不限于逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体或CRISPR/CAS系统；
在本公开的一些具体的实施方式中，所述逆转录病毒载体为慢病毒载体；
在本公开的一些具体的实施方式中，所述CRISPR/CAS系统选自I型、II型或III型系统，其使用合适的Cas蛋白，诸如Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cu1966等。
根据本公开的另一方面，还涉及分离的宿主细胞，其包含如上所述的融合蛋白，或包含如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
“宿主细胞”包括单个细胞或细胞培养物，它可以是或已经是用于掺入多核苷酸插入物的一种或多种载体的接受者。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且由于天然、偶然或有意突变，子代不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态或基因组DNA补体方面)。
在本发明的方法中，可使用来自哺乳动物的细胞(例如人细胞)或来自非人哺乳动物(例如猴、小鼠、大鼠、猪、马或狗)的细胞。用于本发明方法的细胞不受具体限制，任何细胞都可使用。例如，可使用采集、分离、纯化或诱导自体液、组织或器官例如血(外周血、脐带血等)或骨髓的细胞。可使用外周血单核细胞(PBMC)、免疫细胞[树突细胞、B细胞、造血干细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、NKT细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞，或造血细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞)]、脐带血单核细胞、成纤维细胞、脂肪细胞前体、肝细胞、皮肤角质细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、多种癌细胞株或神经干细胞。
在本发明中，尤其是使用T细胞、T细胞的前体细胞(造血干细胞、淋巴细胞前体细胞等)或含有它们的细胞群是优选的。T细胞的实例包括辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞，优选γδT细胞。含T细胞和T细胞前体细胞的细胞群包括PBMC。上述细胞可采集自活体，经采集自活体的细胞培养物扩繁而获得，或建立为细胞株。当希望将所产生的CAR表达细胞或分化自所产生的CAR表达细胞的细胞移植到活体中时，优选将核酸引入采集自该活体本身或其同种活体的细胞中。
根据本发明的再一方面，还涉及药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。
所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫系统不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro编,Mack PublishingCo.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice ofPharmacy,第21版,Mack Publishing,2005)。
根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的宿主细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
肿瘤可以为如上所定义的肿瘤。
根据本发明的再一方面，还涉及一种治疗有需要的患者的癌症的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如上所述的宿主细胞，从而治疗该癌症。
肿瘤可以为如上所定义的肿瘤。
应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。
“患者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1嵌合抗原受体设计
本实施例采用抗CD19的抗体FMC63的单链抗体(scFv)作为抗原结合域，结合CD8α信号肽、CD8α铰链区和跨膜区、共刺激域和CD3ζ信号传导结构域，构建靶向CD19的CAR，常见的共刺激域包括4-1BB、CD28、DAP10等。本实例还构建了同时表达sIL15(N72D)和CD19 CAR的载体。
BE：FMC63-CD8HTM-4-1BB-CD3z(486aa)
//MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR//
BED3：FMC63-CD8HTM-DAP10-CD3z(468aa)
//MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR//
BE415:FMC63-CD8HTM-4-1BB-CD3z-P2A-sIL15(670aa)
//MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS//
BED15:FMC63-CD8HTM-DAP10-CD3z-P2A-sIL15(652aa)
//MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANDSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS//
表1 载体结构
名称 靶点 共刺激域 是否表达sIL15 氨基酸数量
BE CD19 4-1BB 否× 486aa
BED3 CD19 DAP10 否× 468aa
BE415 CD19 4-1BB 是√ 670aa
BED15 CD19 DAP10 是√ 652aa
实施例2制备CAR-γδT细胞以及CAR表达检测
利用外周血淋巴细胞分离液Ficoll分离健康人外周血中单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell，PBMC)，并置于含10％胎牛血清、1％双抗和1000IU/mL IL-2的GT-T551 H3 Culture medium(Takara)完全培养基中，同时添加终浓度为5uM的唑来膦酸(ZOL)，调整细胞密度为2×106个/mL。培养2天(Day 2)后，用完全培养基调整细胞密度为(1～2)×106个/mL。Day 4或者Day5，离心收集细胞，进行病毒感染。
Day4，使用RetroNectin包被非组织培养处理的24孔板，将RetroNectin母液用PBS液稀释至40ug/mL，添加1mL至24孔板中；用封口膜封闭，4℃过夜孵育。Day5，吸弃RetroNectin，用2％人血清白蛋白室温封闭30min，然后用PBS洗一遍；将逆转录病毒加至包被的孔中，培养板于32℃，1500g离心2h；然后吸弃病毒，用PBS洗一遍孔。将离心收集的γδT细胞，用新鲜的完全培养基重悬至1×106cells/mL；前后左右晃匀细胞，将孔板于32℃1500g离心30min-2h，然后在37℃培养箱中继续过夜培养。
Day 6，再次进行一遍上述操作：包被，负载，感染。
Day 7，收集每孔的细胞，离心，然后用PBS洗一遍，用完全培养基重悬，接种至新的孔板中，接种密度为(1～1.5)×106个细胞/mL。
每2-3天进行补液，调整细胞密度为(1～1.5)×106个细胞/mL，连续培养至Day14～16。
在Day10、Day12和Day16时，取部分细胞进行抗体染色，检测CAR的表达情况。离心收集细胞，用含1％BSA的PBS洗一遍，接着用FITC-Protein L配制染色液于室温下避光孵育40min，然后用含1％BSA的PBS洗两遍，最后用200uL含1％BSA的PBS重悬细胞进行流式检测。
结果如图1所示，各组均成功表达CD19-CAR。其中BE组和BED3组CAR阳性率比BE415和BED15组的高。
实施例3 IL15的分泌检测
使用IL15 ELISA检测试剂盒(4A Biotech)进行半定量检测。培养24h后，取上清进行ELISA检测。设置阳性对照孔(1000pg/mL)，培养基空白对照组，BED3上清组，BED15上清组，按照试剂盒的说明进行IL15检测。
从表可知，BED15细胞上清样品的检测读值与阳性对照接近(1000pg/mL)，BED3上清的读值均与阴性对照相近。这提示BED15可分泌大量的IL15。
表2 多功能酶标仪检测各组IL15的读值
Figure BDA0003169399410000121
*阳性对照IL15的浓度为1000pg/mL。
实施例4体外存续时间和扩增
在Day10离心收集各组CAR-γδT细胞，计数，用完全培养基稀释至1*106个/mL，接种至48孔板中(200uL/孔)。CAR-γδT在D17天用抗原刺激一次(反复冻融后的Raji细胞)或者不刺激，连续培养至Day25，记录细胞数量。从图2中可知，在有/无抗原的刺激时，分泌IL15的CAR-γδT(BED15和BE415)都具有更多的细胞数。另外，无抗原刺激时，分泌IL15的CAR-γδT(BED15和BE415)的体外存续时间显著长于不分泌IL15的CAR-γδT(BE和BED3)。
实施例5分泌IL15的CAR-γδT(CAR-sIL15-γδT)的体外杀伤功能
在Day16分别将未经转导的对照γδT细胞、BE-γδT细胞、BE415-γδT细胞BED3-γδT细胞和BED15-γδT与肿瘤细胞(Raji-luc和K652-luc)共培养，效靶比分别为10：1、3：1和1：1，接种至黑色96孔板中，共孵育4-6h后，加入荧光素酶底物(Promega，Bright-GloTMLuciferase Assay System)，于多功能酶标仪上检测荧光值，根据公式计算杀伤率：(1-RLU实验组/RLUTarget only组)×100％。
如图3和图4所示，共孵育4-6h后，各CAR-γδT均可特异性杀伤肿瘤细胞。在Day16时，共刺激域为DAP10的CAR-γδT细胞(BED3和BED15)相比于共刺激域为4-1BB的CAR-γδT具有更强的杀伤能力。相对于不表达IL15的CAR-γδT细胞，分泌IL15的CAR-γδT细胞(BED15和BE415)具有更强的杀伤能力。这些结果提示在构建CAR-γδT时，共刺激域DAP10比共刺激域4-1BB更适合。此外，IL15与CAR同时表达，增加了CAR-γδT细胞存续持久性，维持了CAR-γδT细胞的功能。
在Day20时，相对于不表达IL15的CAR-γδT细胞，分泌IL15的CAR-γδT细胞(BED15和BE415)具有更强的杀伤能力。
由上述实施例可知：
1.本发明构建同时表达CAR和分泌性IL15的单顺反子载体，转导修饰得到的CAR-sIL15-γδT细胞具有更强的扩增能力和更长的存续持久性。
2.突变的IL15(N72D)增加了人IL15与人IL-15β受体的结合亲和力，同时提高了IL-15的抗凋亡信号的转导活性。
3.为了使sIL15与CAR能够同时表达，本发明选择在T细胞中具有最高剪切活性的P2A linker用于CAR-sIL15(N72D)单顺反子的构建。
综上所述，这些结果提示在构建CAR-γδT时，共刺激域DAP10比共刺激域4-1BB显示出更强的抗肿瘤活性。此外，IL15与CAR同时表达，增加了CAR-γδT细胞存续持久性，维持了CAR-γδT细胞的功能。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州百暨基因科技有限公司
<120> 包含突变型IL15以及嵌合抗原受体的融合蛋白
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 162
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asp Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 4
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 5
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 6
<211> 42
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 6
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 7
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 8
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20

Claims (8)

1.分离的γδT细胞，其特征在于，含有融合蛋白，所述融合蛋白包括依次串联的嵌合抗原受体、2A肽和突变型IL15；
所述突变型IL15的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
所述嵌合抗原受体包含A）sc-Fv区、B）铰链区、C）跨膜域和D）胞内信号传导区；
所述sc-Fv区为来自FMC63的抗体区段，所述sc-Fv区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
所述铰链区选自CD8α的hinge区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；
所述跨膜域为CD8α跨膜区，所述跨膜域的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示；
所述胞内信号传导区包含CD3ζ信号传导域，所述胞内信号传导区的氨基酸序列如SEQID NO：5所示；
所述胞内信号传导区包含DAP10共刺激域，DAP10的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
2.根据权利要求1所述的γδT细胞，其特征在于，所述2A肽为P2A。
3.权利要求1或2所述的γδT细胞含有的融合蛋白。
4.分离的核酸，表达得到权利要求3所述的融合蛋白。
5.含有权利要求4所述核酸的载体。
6.药用组合物，其包含权利要求1或2所述的γδT细胞。
7.权利要求1或2所述的γδT细胞在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述sc-Fv区特异性识别CD19。
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