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CN113528495A - 一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN113528495A CN202110758191.8A CN202110758191A CN113528495A CN 113528495 A CN113528495 A CN 113528495A CN 202110758191 A CN202110758191 A CN 202110758191A CN 113528495 A CN113528495 A CN 113528495A
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bacillus subtilis
dac
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陈坚
吕雪芹
堵国成
李江华
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Abstract

本发明公开了一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过筛选整合位点，提高整合拷贝数，构建了可以稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的食品安全级工程菌株。与现有技术相比，几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活得到了极大的提高，发酵周期大大缩短。本转化方法简单易行，条件温和，高效环保，产物得率高。此法有利于解决传统合成法中污染严重，产率低下等问题，而且此法易于控制，利于推广应用。

Description

一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方 法与应用
技术领域
本发明涉及一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
几丁二糖脱乙酰酶Dac来源于极端嗜热古菌Pyrococcus horikoshii，它对乙酰氨基葡萄糖单体具有很高的催化活性，与化学水解法和微生物催化法生产氨基葡萄糖GlcN相比，酶法催化具有原料来源丰富，且价格低廉，生产工艺简单等优点。几丁二糖脱乙酰酶Dac高效稳定表达体系的建立，可为氨基葡萄糖GlcN的一步生产带来便利。
氨基葡萄糖GlcN是一种氨基己糖，作为一种参与构造人体组织和细胞膜的功能性单糖，它可被应用到多个领域。在免疫调节方面，氨基葡萄糖GlcN参加体内的糖代谢，参与对机体的保护作用；在治疗骨关节炎方面，氨基葡萄糖GlcN是形成人体软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。在抗氧化、抗衰老方面，氨基葡萄糖GlcN能够极好的螯合Fe2+，同时能保护脂质大分子不被羟基自由基氧化损害，具有抗氧化能力。
目前针对几丁二糖脱乙酰酶Dac的生产研究主要集中在基因克隆和异源表达上。为了大量获得胞外表达的几丁二糖脱乙酰酶Dac，研究人员往往采用高拷贝质粒游离表达目的基因。通过表达元件的优化，从转录、翻译以及转运等层面提高几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达，从而间接提高酶活；通过对酶自身分子结构进行半理性改造，将酶与底物结合关键位点上的氨基酸进行突变，提高与底物的结合能力；对酶自身分子结构的半理性改造，不仅用于提高酶与底物的结合能力，还可以通过改变酶表面电荷来改变最适pH，从而提高酶在特定工业生产环境下的催化性能。
例如记载于公开号为CN109777761B的中国发明专利中，公开了一种分泌表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的工程菌及其构建方法，通过融合表达几丁二糖脱乙酰酶Dac与yncM信号肽，并获得了5’端的非翻译区突变体，发酵60h胞外酶活最高为1548.7U/ml。
但是，枯草芽孢杆菌中一些用于基因表达的高拷贝质粒不稳定,在复制过程中容易形成单链DNA中间体,从而导致蛋白质产量低，这些问题在大规模工业发酵过程中尤为显著。在生产目的蛋白时，游离型表达质粒继代过程中容易丢失，导致了细胞的生产性能不稳定。现如今质粒不稳定已经成为工业化应用实现进程中的一大难题。另一方面枯草芽孢杆菌漫长的发酵周期提升了工业化生产成本。所以需要构建整合型表达菌株，提高工程菌株产酶稳定性，并筛选合适的整合位点，缩短发酵周期。
发明内容
为改善异源蛋白游离表达时在继代过程中易丢失，细胞生产性能不稳定的现状，本发明通过基因组整合提供了一种稳定高效持续表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的重组工程菌株及其构建方法；为解决枯草芽孢杆菌发酵周期长，工业化生产成本投入高的问题，本发明通过CRISPER/Cpf1基因编辑手段，缩短发酵周期，提供了一种提前稳定表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的重组工程菌株及其构建方法。
本发明提供了一种几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框，所述表达框的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述的几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框包含优化后的启动子p43、核糖体结合位点RBS1，信号肽突变体NprB5以及几丁二糖脱乙酰酶Dac基因。
本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体包含了上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pP43NMK质粒为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是在pP43NMKmut-C4-yncM-Dac基础上，采用氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示NprB5信号肽替换yncM信号肽，pP43NMK载体上的RBS序列GTAAGAGAGGAATGTACAC突变为GGAAAGGAGGAATTGAGAC得到的。
所述pP43NMKmut-C4-yncM-Dac载体公开于“几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究，姜竹，江南大学”论文当中。
本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌基因工程菌，将上周几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因中的一个或多个位点；
或，所述基因工程菌将上述重组载体，导入到敲除了基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因中的一个或多个的枯草芽孢杆菌中得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述lytC、sigD、comA基因在NCBI的登录号分别为：936777、938482、937179。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌的宿主细胞为：以Bacillus subtilis 168为出发菌株，使Bacillus subtilis 168基因组上的NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶沉默得到的；命名为Bacillus subtilis C6。
在本发明的一种实施方式中，所述基因NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr在NCBI的登录号分别为：935981、939313、936384、939695、938430、937332。
在本发明的一种实施方式中，将上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的lytC基因位点；命名为Bacillus subtilisC6C::Dac。
在本发明的一种实施方式中，将上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的sigD基因、lytC基因位点；命名为Bacillussubtilis C6CD::Dac。
在本发明的一种实施方式中，将上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因位点；命名为Bacillus subtilis C6CDA::Dac。
本发明还提供了一种提高几丁二糖脱乙酰酶Dac表达量的方法，所述方法为，将上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因中的一个或多个位点。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为，以Bacillus subtilis 168为出发菌株，使Bacillus subtilis 168基因组上的NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶沉默得到的。
本发明还提供了一种制备几丁二糖脱乙酰酶Dac的方法，所述方法为，采用上述枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，以1～6％(v/v)的接种量将枯草芽孢杆菌基因工程菌的种子液接种到TB发酵培养基中，培养条件为：30～45℃、100～280rpm培养36～90h。
本发明还提供了一种稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的枯草芽孢杆菌工程菌株及其构建方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将上述几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6的lytC位点、sigD位点和comA位点中的一个或多个位点。
本发明还提供了一种制备氨基葡萄糖的方法，所述方法为，采用上述重组枯草芽孢杆菌，或，或其发酵上清液为催化剂，以N-乙酰氨基葡糖为底物，制备得到氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为40～200g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述方法的反应条件为：在30-60℃条件下反应1～70min。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为，采用上述重组枯草芽孢杆菌的发酵上清液为催化剂，所述发酵上清液，是将种子培养液按照1～6％(v/v)的接种量接到发酵培养基中，30～45℃培养36～90h，经10000～16000rpm、4℃离心1～5min。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养液为，在30～45℃条件下培养至OD600为1.0～8.0的重组枯草芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基成分：蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油4mL，KH2PO4 2.31g/L和K2HPO412.54 g/L。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌在制备药物或膳食补充剂中的应用。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌在制备氨基葡萄糖或含氨基葡萄糖的产品中的应用。
本发明还提供了一种稳定高效表达几丁二糖脱乙酰酶Dac的方法。
本发明还提供了一种缩短几丁二糖脱乙酰酶Dac工程菌株发酵周期的方法。
本发明还提供了一种Bacillus subtilis C6CDA::Dac工程菌株的构建方法及其应用。
有益效果
(1)本发明通过对枯草芽孢杆菌中表达几丁二糖脱乙酰酶Dac可能的受限基因进行敲除，验证不同整合位点基因缺失，对几丁二糖脱乙酰酶Dac表达带来的影响，构建了Bacillus subtilis C6C、Bacillus subtilis C6D、Bacillus subtilis C6A等几种利于几丁二糖脱乙酰酶Dac表达的枯草底盘细胞。与现有技术相比，几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活得到了极大的提高。
(2)本发明通过将几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达框整合至枯草芽孢杆菌基因组，通过提高拷贝数，构建了几丁二糖脱乙酰酶Dac不同拷贝数的重组菌株Bacillus subtilisC6C::Dac、Bacillus subtilis C6CD::Dac、Bacillus subtilis C6CDA::Dac，提高了几丁二糖脱乙酰酶Dac的表达稳定性，并极大缩短了几丁二糖脱乙酰酶Dac的发酵周期，与现有技术相比，几丁二糖脱乙酰酶胞外酶活最高可达6537.38U/mL，发酵时间缩短至48h。
(3)本发明提供的重组枯草芽孢杆菌的构建方法简便易行，菌株构建完成后生产性能稳定，具有很好的应用前景，为酶法催化实现氨基葡萄糖的工业化生产奠定了基础。本发明中的催化方法条件温和，对环境污染小，而且底物选择性高，目标产物专一，反应速率快，产物得率高。此法有利于解决化学合成法中污染严重，步骤繁琐等问题，而且工艺简单，方便推广应用。
附图说明
图1：本发明中CRISPER/Cpf1系统应用示意图。
图2：本发明实施例中以分别敲除lytC、sigD、comA基因构建的3株不同底盘细胞Bacillus subtilis C6C、Bacillus subtilis C6D、Bacillus subtilis C6A为表达宿主时，几丁二糖脱乙酰酶Dac胞外酶活的比较。
图3：本发明实施例中不同拷贝数的重组菌株Bacillus subtilis C6C::Dac、Bacillus subtilis C6CD::Dac和Bacillus subtilis C6CDA::Dac产几丁二糖脱乙酰酶Dac胞外酶活的比较。
图4：本发明实施例中所构建Bacillus subtilis C6CDA::Dac与不产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillus subtilis C6/p43NMK及原始生产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillussubtilis WB600/p43NMKmut-C4-YncM-Dac的发酵上清液的SDS-PAGE分析情况；其中，泳道1，Bacillus subtilis C6/p43NMK的发酵上清液；泳道2，Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-YncM-Dac的发酵上清液；泳道3：Bacillus subtilis C6CDA::Dac的发酵上清液；M：protein marker。
图5：重组载体pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac的质粒图谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。
下述实施例中所涉及的载体pcrF17NM的构建方法公开于CAMERS-B:CRISPR/Cpf1assisted multiple-genes editing and regulation system for Bacillus subtilis,Yaokang Wu,Jiangnan University论文中。
下述实施例中所涉及的Bacillus subtilis C6的构建方法公开于CAMERS-B:CRISPR/Cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation system forBacillus subtilis,Yaokang Wu,Jiangnan University论文中，是一株以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，使NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶沉默，构建的一株6种胞外蛋白酶失活的枯草芽孢杆菌底盘细胞。
下述实施例中所涉及的质粒pHT-XCR6的构建方法公开CAMERS-B:CRISPR/Cpf1assisted multiple-genes editing and regulation system for Bacillussubtilis,Yaokang Wu,Jiangnan University论文中。
下述实施例中所涉及的pP43NMKmut-C4-yncM-Dac载体、Bacillus subtilisWB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac重组菌株公开于“几丁二糖脱乙酰酶的克隆表达与生物转化合成氨基葡萄糖的研究，姜竹，江南大学”论文当中。
下述实施例中所涉及的检测方法：
几丁二糖脱乙酰酶酶活力定义
在40℃反应条件下，1h能转化1μmol底物N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc为1μmol产物氨基葡萄糖GlcN所需的酶量，称为一个酶活力单位，即1U＝1μmol/h。
检测试剂
底物N-乙酰氨基葡萄糖溶液(100g/L)：5g N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc溶于PB1中，用PB1定容至50mL。
PB1磷酸钠缓冲液(200mmol/L，pH 8.0)：配制浓度为200mmol/L的NaH2PO4溶液和Na2HPO4溶液。18mL NaH2PO4溶液与390mL Na2HPO4溶液混匀。用pH测定仪测定pH值，确定pH8.0，室温储存。
PB2碳酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 10.5)：配制浓度为100mmol/L的NaCO3溶液和NaHCO3溶液。18mL NaH2PO4溶液与390mL Na2HPO4溶液混匀。用pH测定仪测定pH值，确定pH10.5，室温储存。
DTT二硫苏糖醇(2mol/L)：称取308.5mg二硫苏糖醇于1mL dd H2O中，混合均匀，密封低温保存。
10×OPA检测试剂：500mg邻苯二甲醛OPA加入100mL PB2中，混合均匀，密封低温避光保存。
1×OPA检测试剂：3mL 10×OPA，300μL无水乙醇，15μLDTT，加PB2定容到30mL，混匀后，密封低温避光保存；现用现配。
HCl终止剂(0.5mol/L)：取1800μL盐酸于40mL dd H2O中。
几丁二糖脱乙酰酶酶酶活力检测方法：邻苯二甲醛显色法
待测粗酶液与底物各100μL分装于1.5mL EP管中，40℃预热5min。将预热后的100μL粗酶液加入100μL底物中，40℃震荡反应2min，精确计时，加入0.5mol/L HCl终止剂终止反应。以1200rpm，2min条件离心，取上清50μL于950μL PB1中，稀释20倍，混合均匀后取5μL加入100μL 1×OPA检测试剂中，震荡2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值。以失活后的酶液为反应空白对照。
GlcN的标准曲线绘制，精确称取标准品(精确到0.0001g)配制0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L GlcN溶液，取5μL加入100μL OPA检测试剂中，震荡1min，30℃保温2min。利用酶标仪检测其在330nm处的吸光值，绘制标准曲线。
酶活力计算公式如下所示：
Figure BDA0003148620700000061
式中：
X：粗酶液酶活力(U/mL)；
A：粗酶液体积0.1(mL)；
B：底物溶液体积0.1(mL)；
M：加入终止剂后样品稀释倍数1.5；
C：反应液GlcN浓度(g/L)；
D：空白液GlcN浓度(g/L)。
T：反应时间2(min)；
60：1h为60min；
215.6：标准样品氨基葡萄糖盐酸盐摩尔质量(g/mol)；
0.1：底物溶液体积数(mL)
x：酶液稀释倍数20。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，121℃灭菌15min。
LB固体培养基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，琼脂粉20，121℃灭菌15min。
TB发酵培养基(g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4，KH2PO4 2.31，K2HPO4 12.54，115℃灭菌20min。
实施例1：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis底盘细胞重构
具体步骤如下：
通过Cas蛋白Cpf1的DNA内切酶活性实现CRISPR编辑，在引导RNA(crRNA)的介导下Cpf1蛋白会在基因组的特定位点进行切割，造成双链断裂(CRISPER/Cpf1系统应用示意图如图1所示)。
1、crRNA载体构建
借助crRNA在线设计网站CRISPR-DT设计特异性高的crRNA，以减少脱靶现象的发生。以表1所列引物扩增待敲除基因comA、sigD、lytC(所述lytC、sigD、comA基因在NCBI的登录号分别为：936777、938482、937179)的crRNA片段，序列如SEQ ID NO.2～4所示，然后与载体pcrF17NM分别进行golden gate组装，转化至Escherichia coli DH5α，测序验证后表明成功构建3种crRNA载体。
表1：crRNA引物序列
Figure BDA0003148620700000071
2、基因敲除同源修复模板载体构建
以表2所列引物扩增待敲除基因comA、sigD、lytC的上下游同源臂，借助碧云天一步克隆连接酶将上下游同源臂与步骤1中构建的对应crRNA载体相连，构建敲除基因comA、sigD、和lytC的同源修复模板载体，转化至Escherichia coli DH5α，测序验证。
表2：comA、sigD、lytC基因敲除上下游同源臂
Figure BDA0003148620700000072
Figure BDA0003148620700000081
3、Cas蛋白Cpf1感受态细胞制备
质粒pHT-XCR6为Cas蛋白Cpf1表达载体，其中Cpf1受木糖的诱导调控。
将质粒pHT-XCR6转化至Bacillus subtilis C6，然后再将阳性转化子制成感受态，具体步骤为：接种环挑取单菌落于1～10mL含有氯霉素(5mg/mL)抗性的液体LB培养基中，抗生素的添加体积为液体培养基体积的1‰，30～45℃，100～280rpm培养6～18h；测量OD600，以液体培养基LB和木糖稀释至OD600＝0.3～1.8，木糖终浓度控制在1～5％(质量分数)，30～45℃，100～280rpm培养1～6h；此时菌株呈感受态状态，添加终浓度为5～30％(体积分数)的甘油后存于-80℃备用。
4、同源修复模板质粒转化
将步骤2中同源修复模板载体加入到步骤3中制备得到的Cas蛋白Cpf1感受态细胞中，30～45℃，100～280rpm培养1～6h；将菌液离心重悬于含有氯霉素、卡那霉素和1～5％木糖的LB液体培养基中，30～45℃，100～280rpm培养6～18h，然后离心浓缩涂布添加有氯霉素、卡那霉素和1～5％木糖的LB固体培养基中，待LB固体培养基长出单菌落后进行菌落PCR验证是否完成基因编辑。
5、质粒的消除
以接种环挑取步骤4中制备得到的阳性菌落到添加十二烷基硫酸钠的无抗LB液体培养基中，30～45℃，100～280rpm培养1～10h后，进行无抗LB固体培养基划线，置于37℃培养箱培养12h后，挑取单菌落于含有氯霉素和卡那霉素的LB固体培养基上，进行质粒消除验证。
质粒成功消除后获得新的3株枯草芽孢杆菌底盘细胞Bacillus subtilis C6C、Bacillus subtilis C6D、Bacillus subtilis C6A；
所述Bacillus subtilis C6C、Bacillus subtilis C6D、Bacillus subtilis C6A菌株是以枯草芽孢杆菌168为出发菌株，使NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶沉默，并分别对应敲除lytC、sigD、comA基因。
实施例2：采用异源蛋白游离表达的方法制备几丁二糖脱乙酰酶Dac
1、宿主细胞感受态的制备
将实施例1中获得的枯草芽孢杆菌宿主细胞Bacillus subtilis C6C、Bacillussubtilis C6D、Bacillus subtilis C6A，参照实施例1的步骤3中Cas蛋白Cpf1感受态细胞制备方法，制备成感受态。
2、重组载体的构建
(1)在pP43NMKmut-C4-yncM-Dac基础上，采用氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示NprB5信号肽替换yncM信号肽，pP43NMK载体上的RBS序列GTAAGAGAGGAATGTACAC突变为R1～R9，其中，R1～R9序列如表3所示，涉及到的引物序列如表4所示：
表3：突变后的RBS序列
Figure BDA0003148620700000091
表4：引物序列
Figure BDA0003148620700000092
进行PCR扩增，分别得到重组载体pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac(质粒图谱如图5所示)，pP43NMKmut-C4-NprB5-R2-Dac，pP43NMKmut-C4-NprB5-R3-Dac，pP43NMKmut-C4-NprB5-R4-Dac，pP43NMKmut-C4-NprB5-R5-Dac，pP43NMKmut-C4-NprB5-R6-Dac，pP43NMKmut-C4-NprB5-R7-Dac，pP43NMKmut-C4-NprB5-R8-Dac，pP43NMKmut-C4-NprB5-R9-Dac。
(2)分别将上述重组载体导入Bacillus subtilis C6中，分别得到重组菌株，将上述重组菌株按照下述方法，进行发酵培养并进行酶活检测。
种子液的制备：取平板上阳性转化子接种于50mL离心管中进行种子培养。每管含有1～10mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体LB培养基，于30～45℃弹簧摇床培养6～18h得到种子液。
粗酶液的制备：在500mL锥形瓶中，将种子液以4％(v/v)的接种量转接至96mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体TB培养基进行发酵培养，培养条件为：30～45℃，100～280rpm，发酵36～90h后，制备得到发酵液，取1mL发酵液以12000rpm，4℃，2min条件离心，上清液过膜，得到粗酶液。
分别检测发酵粗酶液当中的几丁二糖脱乙酰酶的酶活及相应的氨基葡萄糖(简称氨糖)的产量，经检测，发酵60h的酶活数据最高，结果表5所示，其中Control代表Bacillussubtilis WB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac的重组菌的实验数据。
表5：含有不同RBS序列的重组菌发酵制备得到几丁二糖脱乙酰酶的酶活及采用含有不同RBS序列的重组菌株制备氨基葡萄糖(简称氨糖)的产量
Figure BDA0003148620700000101
结果显示，重组菌株Bacillus subtilis C6/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac发酵60h胞外酶活最高，达4807.6U/mL，氨糖的产量高达240.38mol/L。
(3)根据步骤(2)的结果，后续实施例以含有R1的重组载体pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac进行实验。
3、发酵制备几丁二糖脱乙酰酶Dac
将重组载体pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac，分别转化至Bacillus subtilis C6、Bacillus subtilis C6C、Bacillus subtilis C6D、Bacillus subtilis C6A，获得Bacillus subtilis C6/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac、Bacillus subtilis C6C/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac、Bacillus subtilis C6D/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac、Bacillus subtilis C6A/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac重组菌株；以Bacillus subtilisC6/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac为对照菌株。按照下述方法，进行酶活检测：
(1)种子液的制备：取平板上阳性转化子接种于50mL离心管中进行种子培养。每管含有1～10mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体LB培养基，于30～45℃弹簧摇床培养6～18h得到种子液。
(2)粗酶液的制备：在500mL锥形瓶中，将种子液以4％(v/v)的接种量转接至96mL添加卡那抗生素(10mg/mL)的液体TB培养基进行发酵培养，培养条件为：30～45℃，100～280rpm，发酵36～90h后制备得到发酵液；取1mL发酵液以12000rpm，4℃，2min条件离心，上清液过膜，得到粗酶液。
(3)酶活检测：通过邻苯二甲醛显色法对制备得到的不同时间点粗酶液进行酶活检测。结果如图2所示；同时，将发酵60h的粗酶液的酶活数据列在表6当中；其中Control-1为Bacillus subtilis WB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac重组菌；Control-2为Bacillussubtilis C6/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac重组菌△lytC为Bacillus subtilis C6C/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac、△sigD为Bacillus subtilis C6D/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac、△comA为Bacillus subtilis C6A/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac。
表6：不同的重组枯草芽孢杆菌发酵60h胞外几丁二糖脱乙酰酶的酶活及氨基葡萄糖(简称氨糖)的产量
Figure BDA0003148620700000111
经验证3株菌60h粗酶液酶活达到最高，分别为5532.6U/mL、5590.2U/mL、5956.8U/mL，较菌株Bacillus subtilis WB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac(图2中的空白对照1，其酶活为1548.7U/mL)分别提升了2.57、2.61、2.85倍，较本实施例中的对照菌株Bacillussubtilis C6/p43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac(图2中的空白对照2，其酶活为4807.6U/mL)提升了15.08％、16.27％、23.90％。
实施例3：几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框的构建
具体步骤如下：
以质粒pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac为模板，使用Dac-F和Dac-R进行PCR扩增。
几丁二糖脱乙酰酶Dac基因上游引物Dac-F：
5’-TGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAAC-3’；
几丁二糖脱乙酰酶Dac基因下游引物Dac-R：
5’-TCAGTGATGGTGATGGTGATGGTG-3’。
制备得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的几丁二糖脱乙酰酶Dac整合表达框。
实施例4：枯草芽孢杆菌整合表达几丁二糖脱乙酰酶Dac基因
具体步骤如下：
1、几丁二糖脱乙酰酶Dac整合表达框(SEQ ID NO.1)的构建：按照实施例3的方法构建。
2、crRNA载体的构建
参照实施例1中所述的方法进行构建。
3、Dac基因整合同源修复模板的构建
参照实施例1中所述的方法，以表7所列引物进行扩增。
表7：Dac基因整合上下游同源臂
Figure BDA0003148620700000121
4、Cas蛋白Cpf1感受态细胞制备、同源修复模板质粒转化和后续质粒的消除参照实施例1中所述的方法。
按照上述方法完成几丁二糖脱乙酰酶Dac基因在sigD、comA、lytC基因3个位点的整合，即将几丁二糖脱乙酰酶Dac整合表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因3个位点中的一个或多个：
将几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的lytC基因位点，获得单拷贝菌株Bacillus subtilis C6C::Dac；
将几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的sigD基因位点，获得单拷贝菌株Bacillus subtilis C6D::Dac；
将上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的sigD基因、lytC基因位点，获得双拷贝菌株Bacillus subtilis C6CD::Dac；
将上述几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C6基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因，获得三拷贝菌株Bacillus subtilis C6CDA::Dac。
实施例5：不同拷贝数的基因组整合菌株发酵验证
将冻存在-80℃甘油管中的单拷贝菌株Bacillus subtilis C6C::Dac、Bacillussubtilis C6D::Dac；双拷贝菌株Bacillus subtilis C6CD::Dac和三拷贝菌株Bacillussubtilis C6CDA::Dac进行平板活化，按照实施例2中的步骤3所述方法进行发酵验证；Bacillus subtilis C6CDA::Dac与不产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillus subtilis C6/p43NMK(将p43NMK质粒转化至Bacillus subtilis C6中制备得到)及原始生产几丁二糖脱乙酰酶Dac的Bacillus subtilis WB600/p43NMKmut-C4-YncM-Dac的发酵上清液的SDS-PAGE分析情况如图4所示。
发酵的结果如图3(图中Bacillus subtilis C6C::Dac、Bacillus subtilisC6D::Dac、Bacillus subtilis C6CD::Dac、Bacillus subtilis C6CDA::Dac分别简写为Bacillus subtilis C6C、Bacillus subtilis C6-D、Bacillus subtilis C6CD、Bacillussubtilis C6CDA)，如图3所示，经检测，Bacillus subtilis C6D::Dac是发酵60h酶活达到最高，而Bacillus subtilis C6C::Dac、Bacillus subtilis C6CD::Dac、Bacillussubtilis C6CDA::Dac菌株均是在发酵48h粗酶液酶活达到最高。
Bacillus subtilis C6C::Dac、Bacillus subtilis C6CD::Dac、Bacillussubtilis C6CDA::Dac菌株发酵48h后粗酶液的酶活及氨基葡萄糖的含量如表8所示，其中，Control是指Bacillus subtilis C6/pP43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac。
表8：整合不同拷贝数菌株胞外几丁二糖脱乙酰酶的最高酶活及制备氨基葡萄糖(简称氨糖)的最高产量
Figure BDA0003148620700000131
经验证3株菌(Bacillus subtilis C6C::Dac、Bacillus subtilis C6CD::Dac、Bacillus subtilis C6CDA::Dac)发酵48h粗酶液酶活达到最高，分别为4293.13U/mL、5423.93U/mL、6357.38U/mL。
本实施例中的双拷贝菌株Bacillus subtilis C6CD::Dac和三拷贝菌株Bacillussubtilis C6CDA::Dac胞外酶活较游离型表达菌株Bacillus subtilis C6/p43NMKmut-C4-NprB5-R1-Dac胞外酶活分别提升了12.46％、31.81％，其中三拷贝菌株Bacillus subtilisC6CDA::Dac胞外酶活较原始菌株Bacillus subtilis WB600/pP43NMKmut-C4-yncM-Dac胞外酶活提升了3.10倍。
通过选定特殊位点进行整合表达，不仅使几丁二糖脱乙酰酶Dac表达水平提升，而且还将大量表达的时间提前至48h。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种稳定表达几丁二糖脱乙酰酶的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用
<130> BAA210907A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1321
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacagc cattgaacat acggttgatt 60
taataactga caaacatcac cctcttgcta aagcggccaa ggacgctgcc gccggggctg 120
tttgcgtttt tgccgtgatt tcgtgtatca ttggtttact tatttttttg ccaaagctgt 180
aatggctgaa aattcttaca tttattttac atttttagaa atgggcgtga aaaaaagcgc 240
gcgattatgt aaaatataaa gtgatagcgg taccattata ggtaagagag gaatgtacac 300
atggtcgtca acatgttcga ggacatcgac acgttcgagg aggtaccatt atagggaaag 360
gaggaattga gacatgaaaa aaatcacaac aaacgaacaa tttaatgaac tgattcaaaa 420
acgcaaattg aaaaagacat ctcagttaga cgccggctta tgcacagcgg cccaaatggt 480
ttttgtaaca catgcctcag ctatggtcgt caacatgttc gaggacatcg acacgttcga 540
ggaagcgttt aacaagctgc tgcgcgaagt cctggaattt gatctgcaaa atccgttcaa 600
agacgcgaag aaagtccttt gcatcgaacc gcatccggac gattgcgtta ttggaatggg 660
cggcacaatc aaaaaactga gcgatatggg cgtcgaagtc atctacgttt gcatgacaga 720
cggctatatg ggcacaacag acgaaagcct gtcaggacac gaattagcag caatccgccg 780
caaagaagaa gaagaaagcg cacgcctgct gggcgttaaa aagatctatt ggctgaacta 840
ccgcgataca gaactgccgt attcacgcga agtccgcaaa gatctgacga aaattctgcg 900
caaagaacaa ccggacggag tttttgcacc agatccttgg cttccgtacg aatcacatcc 960
ggatcataga cgcacaggct ttctggcgat tgaatcagtt gcgtttagcc agctgccgaa 1020
ttttagcaac acggatctgg acattggcct gaatccgtat aacagcggaa gctttatcgc 1080
gctgtactac acgcacaaac cgaactacat cgtcgacatc acggacctga tggaactgaa 1140
actgaaggcg attcgcgtcc atagaagcca gtttccggac gatatttggg agaaatggga 1200
accgttcctg agaacaatcg cgatgttcta cggcgaaaaa atcggcgttc gctacggaga 1260
aggctttaga attatgccgg gcctgttcta ccacatcaca ccgtttacgg acctgatctg 1320
a 1321
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaatcaaaa ccgcttccgt ccg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gacgcgctgg aaagagtgga aag 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttgcatctg atgcattagt gat 23
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Arg Lys Leu Thr Lys Thr Ser Gln Leu Asp Ala Gly Leu Cys Thr
1 5 10 15
Ala Ala Gln Met Val Phe Val Thr His Ala Ser Ala
20 25

Claims (10)

1.一种几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框，其特征在于，所述表达框的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含了权利要求1所述的几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，以pP43NMK质粒为表达载体。
4.一种枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，将权利要求1所述的几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因中的一个或多个位点；
或，所述基因工程菌将权利要求2或3所述的重组载体，导入到敲除了基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因中的一个或多个的枯草芽孢杆菌中得到的。
5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌基因工程菌的宿主细胞为：以Bacillus subtilis 168为出发菌株，使Bacillus subtilis 168基因组上的NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶沉默得到的。
6.一种提高几丁二糖脱乙酰酶Dac表达量的方法，其特征在于，将权利要求1所述的几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框整合至枯草芽孢杆菌基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因中的一个或多个位点；
或将含有权利要求1所述的几丁二糖脱乙酰酶Dac表达框的重组载体，导入到敲除了基因组上的comA基因、sigD基因、lytC基因中的一个或多个的枯草芽孢杆菌中。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为，以Bacillus subtilis168为出发菌株，使Bacillus subtilis 168基因组上的NprE、AprE、NprB、Bpr、Mpr、Epr 6个胞外蛋白酶沉默得到的。
8.一种制备几丁二糖脱乙酰酶Dac的方法，其特征在于，采用权利要求4或5所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵制备得到。
9.一种制备氨基葡萄糖的方法，其特征在于，采用权利要求4或5所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌，或其发酵上清液为催化剂，以N-乙酰氨基葡糖为底物，制备得到氨基葡萄糖。
10.权利要求4或5所述的枯草芽孢杆菌基因工程菌，或其发酵上清液在制备氨基葡萄糖，或含有氨基葡萄糖的产品中的应用。
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