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CN113490742A - 膦酰基乙酸酯缺口聚物寡核苷酸 - Google Patents

膦酰基乙酸酯缺口聚物寡核苷酸 Download PDF

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CN113490742A CN202080015889.4A CN202080015889A CN113490742A CN 113490742 A CN113490742 A CN 113490742A CN 202080015889 A CN202080015889 A CN 202080015889A CN 113490742 A CN113490742 A CN 113490742A
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K·布莱谢尔
J·M·A·巴斯蒂安
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Roche Innovation Center Copenhagen AS
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Abstract

本发明涉及一种单链反义缺口聚物寡核苷酸，其包含至少一个式(I)的二核苷，其中(A1)、(A2)和A如说明书和权利要求书中所定义。根据本发明的寡核苷酸可作为药物使用。

Description

膦酰基乙酸酯缺口聚物寡核苷酸
技术领域
本发明特别地涉及一种单链反义缺口聚物寡核苷酸或其药用盐，其包含至少一个式(I)的二核苷
Figure BDA0003222290020000011
其中(A1)和(A2)中的一者为糖修饰的核苷且另一者为糖修饰的核苷或DNA核苷，并且A为氧或硫。
本发明还特别涉及用于制备根据本发明的反义缺口聚物寡核苷酸的新型亚磷酰胺。
背景技术
近年来，合成寡核苷酸作为治疗剂具有可见地显著进展，其形成了通过多种机制发挥作用的广泛的经临床验证的分子系列组合，包括核糖核酸酶H活化缺口聚物、剪接转换寡核苷酸、microRNA抑制剂、siRNA或适配体(S.T.Crooke,Antisense drug technology:principles,strategies,and applications,2nd ed.ed.,Boca Raton,FL:CRC Press,2008)。对于生物系统中的溶核降解，天然寡核苷酸本来就是不稳定的。此外，它们显示出非常不利的药代动力学性质。为了改善这些缺点，近几十年来已经研究了各种各样的化学修饰。可论证地，最成功的修饰之一是引入硫代磷酸酯键，其中非桥接的磷酸氧原子中的一个被硫原子取代(F.Eckstein,Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009,10,117-121)。相比于其未经修饰的磷酸二酯类似物，这种硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸表现出增加的蛋白质结合以及明显更高的对溶核降解的稳定性，因此在血浆、组织和细胞中表现出明显更高的半衰期。这些关键特征已经使得开发了第一代寡核苷酸疗法，并通过诸如锁核酸(LNA)等的后代修饰为寡核苷酸疗法的进一步发展铺平了道路。
发明内容
令人惊讶地发现，根据本发明所述的单链反义寡核苷酸具有良好的耐受性。它们在体外至少与仅包含硫代磷酸酯核苷间键的参考寡核苷酸一样有效，并且在体内比仅包含硫代磷酸酯核苷间键的参考寡核苷酸更有效。同样令人惊讶的是，根据本发明所述的单链反义寡核苷酸在心脏细胞系(体外)和心脏细胞系(体内)中特别有效。
附图说明
图1示出靶向人HeLa细胞系中MALAT1 mRNA的根据本发明所述的寡核苷酸的剂量反应曲线
图2示出靶向体A549细胞系中MALAT1 mRNA的根据本发明所述的寡核苷酸的剂量反应曲线。
图3示出靶向人HeLa细胞系中HIF1A mRNA的根据本发明所述的寡核苷酸的剂量反应曲线。
图4示出靶向体A549细胞系中HIF1A mRNA的根据本发明所述的寡核苷酸的剂量反应曲线。
图5示出靶向小鼠原代肝细胞中ApoB mRNA的根据本发明所述的寡核苷酸的剂量反应曲线。
图6示出经过根据本发明的寡核苷酸治疗的动物心脏中Malat1 mRNA水平的量。
具体实施方式
在本说明书中，术语“烷基”在单独或组合下指具有1至8个碳原子的直链或支链烷基、特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基并且更特别是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链C1-C8烷基的实例是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异构戊基、异构己基、异构庚基和异构辛基，特别是甲基、乙基、丙基、丁基和戊基。烷基的特定实例是甲基、乙基和丙基。
术语“环烷基”在单独或组合下指具有3至8个碳原子的环烷基环、特别是具有3至6个碳原子的环烷基环。环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基，更特别是环丙基和环丁基。“环烷基”的一个特定实例是环丙基。
术语“烷氧基”单独或结合表示式烷基-O-的基团，其中术语“烷基”具有先前给出的含义，诸如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基。特定的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。甲氧基乙氧基是“烷氧基烷氧基”的一个特定实例。
术语“氧基”在单独或组合下指-O-基团。
术语“链烯基”在单独或组合下指包含烯键和多达8个、优选地多达6个、特别优选多达4个碳原子的直链或支链烃残基。链烯基的实例是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和异丁烯基。
术语“炔基”在单独或组合下指包含叁键和多达8个、特别是2个碳原子的直链或支链烃残基。
术语“卤素”或“卤代”在单独或组合下指氟、氯、溴或碘并且特别地指氟、氯或溴，更特别地指氟。术语“卤代”与另一种基团组合，指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至四个卤素(即一个、两个、三个或四个卤素)取代的所述基团。
术语“卤代烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的烷基。卤代烷基的实例包括单氟、二氟或三氟代的甲基、乙基或丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟代甲基或三氟甲基。氟代甲基、二氟甲基和三氟甲基是特定的“卤代烷基”。
术语“卤代环烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的如上定义的环烷基。“卤代环烷基”的特定实例是卤代环丙基，尤其是氟代环丙基、二氟环丙基和三氟环丙基。
术语“羟基”(hydroxyl/hydroxy)在单独或组合下指-OH基团。
术语“氢硫基”和“巯基”在单独或组合下指-SH基团。
术语“羰基”在单独或组合下指-C(O)-基团。
术语“羧基”或“酸性基”在单独或组合下指-COOH基团。
术语“氨基”在单独或组合下指伯氨基(-NH2)、仲氨基(-NH-)或叔氨基(-N-)。
术语“烷基氨基”在单独或组合下指经一个或两个如上文定义的烷基取代的如上文定义的氨基。
术语“磺酰基”在单独或组合下意指-SO2基团。
术语“亚磺酰基”在单独或组合下指-SO-基团。
术语“硫基”在单独或组合下指-S-基团。
术语“氰基”在单独或组合下指-CN基团。
术语“叠氮基”在单独或组合下指-N3基团。
术语“硝基”在单独或组合下指NO2基团。
术语“甲酰基”在单独或组合下指-C(O)H基团。
术语“氨甲酰基”在单独或组合下指-C(O)NH2基团。
术语“脲基”在单独或组合下指-NH-C(O)-NH2基团。
术语“芳基”在单独或组合下指包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环系统或双环系统，所述系统任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。芳基的实例包括苯基和萘基，特别是苯基。
术语“杂芳基”在单独或组合下指5至12个环原子的单价芳族杂环单环系统或双环系统，所述系统包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，剩余环原子是碳，任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂环庚烯基(azepinyl)、二氮杂环庚烯基(diazepinyl)、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、咔唑基或吖啶基。
术语“杂环基”在单独或组合下指4至12个、特别4至9个环原子的单价饱和或部分不饱和单环系统或双环系统，所述系统包含1、2、3或4个选自N、O和S的环杂原子，剩余环原子是碳，任选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。单环饱和杂环基的实例是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢-噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑啉基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基或氧氮杂环庚烷基。双环饱和杂环烷基的实例是8-氮杂-双环[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛基、9-氮杂-双环[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基或3-噻-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基。部分不饱和杂环烷基的实例是二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢噁唑基、四氢吡啶基或二氢吡喃基。
术语“药用盐”是指那些保留游离碱或游离酸的生物学有效性和特性的盐，其并非在生物学上或其它方面所不希望的。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸(特别是盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸形成。此外，可通过无机碱或有机碱与游离酸的加成制备这些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于与下述有机碱形成的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代胺包括天然出现的取代胺、环状胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。本发明的寡核苷酸也可以呈两性离子的形式存在。特别优选的本发明的药用盐是钠盐、锂盐、钾盐和三烷基铵盐。
单独或组合使用的术语“保护基团”表示选择性地封闭多官能化合物中反应位点，从而可以在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应的基团。保护基可以去除。示例性的保护基团是氨基保护基团、羧基保护基团或羟基保护基团。
“磷酸酯保护基团”是磷酸酯基团的保护基团。磷酸酯保护基团的实例是2-氰乙基和甲基。磷酸酯保护基团的一个特定实例是2-氰乙基。
“羟基保护基团”是羟基基团的保护基团并且还用来保护硫醇基团。羟基保护基团的实例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧基苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧甲基醚(MOM)、甲氧三苯甲基[(4-甲氧基苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧苄基醚(PMB)、甲基硫代甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲醚和乙氧乙基醚(EE)。羟基保护基团的特定实例是DMT和TMT，尤其是DMT。
“氢硫基保护基团”是氢硫基基团的保护基团。氢硫基保护基团的实例是“羟基保护基团”的那些基团。
如果本发明的起始材料或化合物之一含有一个或多个在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或有反应性的官能基团，则应用本领域熟知的方法，可以在关键步骤之前引入适宜的保护基(如在例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，1999，Wiley，New York的“有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)”中所述)。可以使用文献中描述的标准方法，在合成的晚期移除这类保护基团。保护基团的实例是叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、苄氧羰基(Cbz)和对甲氧基苄氧羰基(Moz)。
本文所述的化合物可以包含几个非对称中心，并且可以以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物例如外消旋体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体混合物的形式存在。
寡核苷酸
如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。
反义寡核苷酸
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的连续序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(相同寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要内部或之间自我互补性的程度跨寡核苷酸全长小于50％即可
连续核苷酸序列
术语“连续核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“连续核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成连续核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含连续核苷酸序列，诸如F-G-F’缺口聚物区域，并且可以任选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团附接至连续核苷酸序列的核苷酸连接基区域。核苷酸连接基区域可以与靶核酸互补或可以不互补。
核苷酸
核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。
修饰的核苷
如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。如果允许Watson Crick碱基配对，则DNA或RNA核苷的碱基区域中修饰的核苷通常仍称为DNA或RNA。
修饰的核苷间键
如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在连续核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区域内部)以及在修饰的核苷区域(例如，区域F和区域F’)中起到保护免受核酸酶剪切的作用。
在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，例如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键被修饰，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷间键或其连续核苷酸序列都是抗核酸酶核苷间键。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。
用于本发明寡核苷酸中的优选的修饰的核苷间键是硫代磷酸酯。
硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其连续核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，除三硫代磷酸酯核苷间键之外，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的所有核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，除三硫代磷酸酯键之外，本发明的寡核苷酸还包含硫代磷酸酯核苷间键和至少一个磷酸二酯键诸如2、3或4个磷酸二酯键。在缺口聚物寡核苷酸中，当存在时，磷酸二酯键合适地不位于缺口区域G中的连续DNA核苷之间。
抗核酸酶键，诸如硫代磷酸酯键，在与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如缺口聚物的区域G。然而，硫代磷酸酯键也可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，诸如缺口聚物的区域F和F’。在一些实施例中，缺口聚物寡核苷酸可在区域F或F’或区域F和F’两者均包含一个或多个磷酸二酯键合，其中区域G中的核苷间键可以完全是硫代磷酸酯。
有利地，在寡核苷酸的连续核苷酸序列中的全部核苷间键或寡核苷酸的全部核苷间键均是硫代磷酸酯键。
应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间，其根据EP 2 742 135可以例如在另外的DNA硫代磷酸酯的缺口区域中所耐受。
立构无规硫代磷酸酯键
硫代磷酸酯键是其中非桥接氧之一已经被硫取代的核苷间磷酸酯键。硫对非桥接氧之一的取代引入了手性中心并且从而在单一硫代磷酸酯寡核苷酸内部，每个硫代磷酸酯核苷间键将处于S(Sp)或R(Rp)立体异构形式。此类核苷间键称作“手性核苷间键”。相比之下，磷酸二酯核苷间键是非手性的，因为它们具有两个非末端氧原子。
依据首次发表于以下文献中的标准Cahn-Ingold-Prelog规则(CIP优先规则)确定立构中心手性的命名：Cahn,R.S.；Ingold,C.K.；Prelog,V.(1966)“分子手性规范(Specification of Molecular Chirality)”，Angewandte Chemie InternationalEdition 5(4):385–415，doi:10.1002/anie.196603851。
在标准寡核苷酸合成过程中，偶联和后续硫化的立体选择性不受控。出于这个原因，每个硫代磷酸酯核苷间键的立体化学随机地是Sp或Rp，因而通过传统寡核苷酸合成法产生的硫代磷酸酯寡核苷酸实际上可以按多达2X种不同的硫代磷酸酯非对映异构体存在，其中X是硫代磷酸酯核苷间键的数目。此类寡核苷酸在本文中称作立构无规硫代磷酸酯寡核苷酸，并且不含有任何立体定义的核苷间键。因此，立构无规硫代磷酸酯寡核苷酸是源自非立体定义的合成方法的各非对映异构体的混合物。在这一语境下，混合物定义为多达2X种不同的硫代磷酸酯非对映异构体。
立体定义的核苷间键
立体定义的核苷间键是在其两种非对映异构体形式Rp或Sp中的一者中具有非对映异构体过量的手性核苷间键。
应当认识到，本领域中使用的立体选择性寡核苷酸合成方法通常在每个手性核苷间键处提供至少约90％或至少约95％的非对映选择性，因此最高约10％诸如约5％的寡核苷酸分子可能具有非对映异构体的替代形式。
在一些实施例中，每个立体定义的手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约90:10。在一些实施例中，每个手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约95:5。
立体定义的硫代磷酸酯键是立体定义的核苷间键的一个特定实例。
立体定义的硫代磷酸酯键
立体定义的硫代磷酸酯键是在其两种非对映异构体形式Rp或Sp中的一者中具有非对映异构体过量的硫代磷酸酯键。
硫代磷酸酯核苷间键的Rp和Sp构型如下所示
Figure BDA0003222290020000111
其中3’R基团代表相邻的核苷(5’核苷)的3’位置，而5’R基团代表相邻的核苷(3’核苷)的5’位置。
在本文中，Rp核苷间键也可以表示为srP，并且Sp核苷间键可以表示为ssP。
在一个特定实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约90:10或至少95:5。
在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约97:3。在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约98:2。在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约99:1。
在一些实施例中，立体定义的核苷间键在至少97％诸如至少98％诸如至少99％或(基本上)全部的存在于寡核苷酸分子群内的寡核苷酸分子中具有相同的非对映异构形式(Rp或Sp)。
可以在仅具有非手性骨架(即磷酸二酯)的模型系统中测量非对映体纯度。可通过例如将具有立体定向核苷间键的单体偶联至以下模型系统“5’t-po-t-po-t-po 3’”来测量每个单体的非对映体纯度。该测量的结果随后将给出：可使用HPLC分离的5’DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3’或5'DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3’。通过积分来自两种可能非对映异构体的UV信号并且得到这些非对映异构体的比率(例如98:2、99:1或>99:1)，确定非对映异构体纯度。
应当理解，特定的单一非对映异构体(单一立体定义的寡核苷酸分子)的非对映异构体纯度将随每个核苷间位置处限定的立体中心的偶联选择性和待引入的立体定义的核苷间键的数目而变化。以举例方式而言，如果每个位置处的偶联选择性是97％，则具有15个立体定义的核苷间键的立体定义的寡核苷酸的所得纯度将是0.9715，即如与37％的其他非对映异构体相比，所需的非对映异构体为63％。可以在合成后，通过纯化(例如通过HPLC，诸如离子交换色谱法或反相色谱法)改进定义的非对映异构体的纯度。
在一些实施例中，立体定义的寡核苷酸是指寡核苷酸群的至少约40％诸如至少约50％属于所需非对映异构体的寡核苷酸群。
换言之，在一些实施例中，立体定义的寡核苷酸是指寡核苷酸群的至少约40％诸如至少约50％由所需(特定)的立体定义的核苷间键基序(也称作立体定义的基序)组成的寡核苷酸群。
对于包含立构无规核苷间立体中心和立体定义的核苷间立体中心的立体定义的寡核苷酸，参考保留所需的立体定义的核苷间键基序的寡核苷酸群的百分比(％)，确定立体定义的寡核苷酸的纯度，计算时不考虑立构无规键。
核碱基
术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语“核碱基”也涵盖修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中。
在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2’-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。
核碱基部分可以由每一个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA缺口聚物，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。
修饰的寡核苷酸
术语“修饰的寡核苷酸”描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。
立体定义的寡核苷酸
立体定义的寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定义的核苷间键。
立体定义的硫代磷酸酯寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定义的硫代磷酸酯核苷间键。
互补性
术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。Watson-Crick碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解的是，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。
如本文所用，术语“％互补的”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列内核苷酸的比例，其中在给定位置，所述核苷酸与不同的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列互补(即与之形成Watson Crick碱基对)。通过以下方式计算百分比：(与靶序列5’-3’和寡核苷酸序列从3’-5’对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在这种比较中，未对准(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。优选地，计算连续核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。
术语“完全互补”是指100％的互补性。
同一性
如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中连续核苷酸序列以百分比计的核苷酸数目，其中在给定位置，所述核苷酸与不同的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的连续核苷酸序列(即在其与互补性核苷形成Watson Crick碱基对的能力方面)相同。通过以下方式计算该百分比：计数两个序列之间相同的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。同一性百分比＝(匹配×100)/对齐区域的长度。优选地，计算相邻核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。
杂交
如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链在相反链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体(例如寡核苷酸和靶核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用熔解温度(Tm)来描述，其定义为一半寡核苷酸与靶核酸形成双链体的温度。在生理条件下，Tm不与亲和力严格成正比(Mergny和Lacroix，2003，Oligonucleotides 13:515–537)。标准状态Gibbs自由能ΔG°是结合亲和力的更精确的表述并且与反应的解离常数(Kd)通过ΔG°＝-RTln(Kd)相关，其中R是气体常数并且T是绝对温度。因此，寡核苷酸与靶核酸之间反应的非常低的ΔG°反映了寡核苷酸和靶核酸之间强力杂交。ΔG°是与其中水浓度为1M、pH为7并且温度为37℃的反应相关的能量。寡核苷酸与靶核酸杂交是自发反应，并且对于自发反应，ΔG°小于零。例如，可利用如Hansen等人(1965,Chem.Comm.36–38)和Holdgate等人(2005,Drug Discov Today)中所述的等温滴定量热法(ITC)的方法通过实验测量ΔG°。本领域的技术人员将知道商业设备可用于测量ΔG°。ΔG°的数值也可以通过使用如SantaLucia 1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460–1465所述的最近相邻模型，适当使用Sugimoto等人，1995,Biochemistry 34:11211–11216和McTigue等人，2004,Biochemistry 43:5388–5405描述的推导的热力学参数来估计。为了具有通过杂交调节其预期的核酸靶标的可能性，对于长度为10-30个核苷酸的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸以低于-10kcal的ΔG°估值与靶核酸杂交。在一些实施例中，依据标准状态Gibbs自由能ΔG°测量杂交的程度或强度。对于长度为8-30个核苷酸的寡核苷酸，寡核苷酸可与靶核酸以低于-10kcal，诸如低于-15kcal、诸如低于-20kcal和诸如低于-25kcal的ΔG°估值杂交。在一些实施例中，寡核苷酸与靶核酸以-10kcal至-60kcal诸如-12kcal至-40kcal诸如-15kcal至-30kcal或-16kcal至-27kcal诸如-18kcal至-25kcal的ΔG°估计值杂交。
糖修饰
与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。
已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。
此类修饰包括以下修饰，其中例如通过用以下取代而修饰核糖环结构：己糖环(HNA)或一般在核糖环上C2和C4碳之间具有双基桥的双环状环(LNA)或一般在C2碳和C3碳之间缺少键的非连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO 2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。
糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2’-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2’、3’、4’或5’位置引入取代基。
2’糖修饰的核苷。
2’糖修饰的核苷是一种核苷，其在2’位置具有除H或-OH以外的取代基(2’取代的核苷)的核苷或包含能够在核糖环中2’碳与和第二个碳原子之间形成桥的2’连接双基，诸如LNA(2’-4’双基桥连)核苷。
事实上，人们已花费很多精力开发2’取代的核苷，并且发现许多2’取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2’修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2’取代的修饰的核苷实例是2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。其他实例可参见例如：Freier和Altmann，Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443；Uhlmann，Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213；以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面是一些2’取代的修饰的核苷的示意图。
Figure BDA0003222290020000161
关于本发明，2’取代不包括2’桥接的分子如LNA。
锁定核酸核苷(LNA核苷)
“LNA核苷”是一种2’-修饰的核苷，其包含链接所述核苷的核糖环的C2’和C4’的双基(也称为“2’-4’桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补双链体的熔解温度确定。
非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人(Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76)、Seth等人J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81和Mitsuoka等人(Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238)。
2’-4’桥键包含2至4个桥接原子，并且特别地具有式-X-Y-，其中X与C4’连接并且Y与C2’连接，
其中
X为氧、硫、-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(＝CRaRb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-；-O-NRa-、-NRa-O-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
Y为氧、硫、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
条件是-X-Y-不为-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝N-、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝N-或-Se-Se-；
J为氧、硫、＝CH2或＝N(Ra)；
Ra和Rb独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、巯基、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、杂环基、氨基、烷基氨基、氨甲酰基、烷基氨羰基、氨烷基氨羰基、烷基氨烷基氨羰基、烷基羰氨基、脲基、烷酰氧基、磺酰基、烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、巯基硫化烷基硫基(thiohydroxylsulfidealkylsulfanyl)、芳氧羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、-OC(＝Xa)Rc、-OC(＝Xa)NRcRd和-NReC(＝Xa)NRcRd；
或两个偕Ra和Rb一起形成任选地取代的亚甲基；
或两个偕Ra和Rb与它们所连接的碳原子一起形成环烷基或卤代环烷基，仅含-X-Y-的一个碳原子；
其中取代的烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基是经1至3个取代基取代的烷基、链烯基、炔基和亚甲基，所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基；
Xa为氧、硫或-NRc；
Rc、Rd和Re独立地选自氢和烷基；并且
n为1、2或3。
在本发明的又一个特定实施例中，X为氧、硫、-NRa-、-CRaRb-或-C(＝CRaRb)-，特别地为氧、硫、-NH-、-CH2-或-C(＝CH2)-，更特别地为氧。
在本发明的另一个特定实施例中，Y为-CRaRb-、-CRaRb-CRaRb-或-CRaRb-CRaRb-CRaRb-，特别地为-CH2-CHCH3-、-CHCH3-CH2-、-CH2-CH2-或-CH2-CH2-CH2-。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-(CRaRb)n-、-S-CRaRb-、-N(Ra)CRaRb-、-CRaRb-CRaRb-、-O-CRaRb-O-CRaRb-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(＝CRaRb)-CRaRb-、-N(Ra)CRaRb-、-O-N(Ra)-CRaRb-或-N(Ra)-O-CRaRb-。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb独立地选自由以下项组成的组：氢、卤素、羟基、烷基和烷氧烷基，特别是氢、卤素、烷基和烷氧烷基。
在本发明的另一个特定实施例中，Ra和Rb独立地选自由以下项组成的组：氢、氟、羟基、甲基和-CH2-O-CH3，特别是氢、氟、甲基和-CH2-O-CH3.
有利地，-X-Y-的Ra和Rb中的一者如上文所定义并且另一者全部同时为氢。
在本发明的又一个特定实施例中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。
在本发明的另一个特定实施例中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb中仅有一者为氢。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。
在本发明的一个特定实施例中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-、-S-CH2-、-S-CH(CH3)-、-NH-CH2-、-O-CH2CH2-、-O-CH(CH2-O-CH3)-、-O-CH(CH2CH3)-、-O-CH(CH3)-、-O-CH2-O-CH2-、-O-CH2-O-CH2-、-CH2-O-CH2-、-C(＝CH2)CH2-、-C(＝CH2)CH(CH3)-、-N(OCH3)CH2-或-N(CH3)CH2-；
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-’其中Ra和Rb独立地选自由以下项组成的组：氢、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基和-CH2-O-CH3。
在一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-或-O-CH(CH3)-，特别地为-O-CH2-。
2’-4’桥键可以位于核糖环平面的下方(β-D-构型)，或位于该环平面的上方(α-L-构型)，分别如式(A)和式(B)中所示。
根据本发明所述的LNA核苷特别地具有式(B1)或式(B2)
Figure BDA0003222290020000191
其中
W为氧、硫、-N(Ra)-或-CRaRb-，特别地为氧；
B为核碱基或修饰的核碱基；
Z为至相邻核苷的核苷间键或5’末端基团；
Z*为至相邻核苷的核苷间键或3’末端基团；
R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自氢、卤素、烷基、卤代烷基、链烯基、炔基、羟基、烷氧基、烷氧烷基、叠氮基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基和芳基；并且
X、Y、Ra和Rb如上文所定义。
在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。在又一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb中仅有一者为氢。在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在又一个特定实施例中，在X的定义中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个特定实施例中，在X的定义中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb中仅有一者为氢。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个特定实施例中，在X的定义中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在又一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra为氢或烷基，特别是氢或甲基。在另一个特定实施例中，在Y的定义中，Rb为氢或烷基，特别是氢或甲基。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb中的一者或两者为氢。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb中仅有一者为氢。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb中的一者为甲基并且另一者为氢。在一个特定实施例中，在Y的定义中，Ra和Rb两者同时均为甲基。
在本发明的一个特定实施例中，R1、R2、R3、R5和R5*独立地选自氢和烷基，特别是氢和甲基。
在本发明的又一个特别有利的实施例中，R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。
在本发明的另一个特定实施例中，R1、R2、R3全部同时为氢，R5和R5*中的一者为氢并且另一者如上文定义，特别为烷基，更特别为甲基。
在本发明的一个特定实施例中，R5和R5*独立地选自氢、卤素、烷基、烷氧烷基和叠氮基，特别选自氢、氟、甲基、甲氧基乙基和叠氮基。特别地，在本发明的有利的实施例中，R5和R5*中的一者为氢并且另一者为烷基，特别地为甲基、卤素，特别地为氟、烷氧烷基，特别地为甲氧基乙基或叠氮基；或者R5和R5*同时均为氢或卤素，特别地同时均为氢或氟。在此类特定实施例中，W可有利地为氧，并且-X-Y-有利地为-O-CH2-。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352和WO 2004/046160中，这些专利均据此以引用方式并入本文，并且包括本领域中通常已知的β-D-氧基LNA核苷和α-L-氧基LNA核苷。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-S-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类硫代LNA核苷公开于WO 99/014226和WO 2004/046160中，这些专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-NH-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类氨基LNA核苷公开于WO 99/014226和WO 2004/046160中，这些专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2CH2-或-OCH2CH2CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类LNA核苷公开于WO 00/047599和Morita等人(Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76)，所述文献据此以引用方式并入本文，并且包括本领域通常已知的2’-O-4’C-亚乙基桥接的核酸(ENA)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-，W为氧，R1、R2、R3全部同时为氢，R5和R5*中的一者为氢并且另一者不为氢，诸如为烷基(例如甲基)。此类5’取代的LNA核苷公开于WO 2007/134181中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-，其中Ra和Rb中的一者或两者并非氢，特别地为烷基诸如甲基，W为氧，R1、R2、R3全部同时为氢，R5和R5*中的一者为氢并且另一者不为氢，特别为烷基(例如甲基)。此类双重修饰的LNA核苷公开于WO 2010/077578中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CHRa-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类6'取代的LNA核苷公开于WO 2010/036698和WO 2007/090071中，这些专利据此以引用方式并入本文。在此类6'取代的LNA核苷中，Ra特别为C1-C6烷基诸如甲基。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH2-O-CH3)-(“2’O-甲氧基乙基双环核酸”，Seth等人，J.Org.Chem.2010，第75卷第5期，第1569-81页)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH2CH3)-；
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH2-O-CH3)-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在本领域中，此类LNA核苷也称作环状MOE(cMOE)并且公开于WO2007/090071中。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH3)-(“2’O-乙基双环核酸”，Seth等人，J.Org.Chem.2010，第75卷第5期，第1569-81页)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH2-O-CH2-(Seth等人，J.Org.Chem2010op.cit.)。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH3)-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类6'-甲基LNA核苷在本领域也称作cET核苷并且可以为(S)-cET或(R)-cET非对映异构体，如WO 2007/090071(β-D)和WO 2010/036698(α-L)中所公开，这两件专利均据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-，其中Ra和Rb均非氢，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在一个特定实施例中，Ra和Rb两者同时均为烷基，特别地两者同时均为甲基。此类6'-双取代的LNA核苷公开于WO 2009/006478中，其据此以引用方式并入本文。
在本发明的另一个具体实施例中，-X-Y-为-S-CHRa-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。此类6'-取代的硫代LNA核苷公开于WO 2011/156202中，其据此以引用方式并入本文。在此类6'-取代的硫代LNA的一个特定实施例中，Ra为烷基，特别是甲基。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-C(＝CH2)C(RaRb)-、-C(＝CHF)C(RaRb)-或-C(＝CF2)C(RaRb)-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。Ra和Rb有利地独立选自氢、卤素、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基、氟和甲氧基甲基。Ra和Rb特别地两者同时均为氢或甲基，或者Ra和Rb中的一者为氢，并且另一者为甲基。此类乙烯基碳LNA核苷公开于WO2008/154401和WO 2009/067647中，这些专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-N(ORa)-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在一个特定实施例中，Ra为烷基诸如甲基。此类LNA核苷也称作N取代的LNA并且公开于WO 2008/150729中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-N(Ra)-、-N(Ra)-O-、-NRa-CRaRb-CRaRb-或-NRa-CRaRb-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。Ra及Rb有利的独立地选自氢、卤素、烷基及烷氧基烷基，特别是氢、甲基、氟基及甲氧基甲基。在一个特定实施例中，Ra为烷基(诸如甲基)，Rb为氢或甲基，特别地为氢(Seth等人.,J.Org.Chem 2010op.cit.)。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-N(CH3)-(Seth等人，J.Org.Chem2010op.cit.)。
在本发明的一个特定实施例中，R5和R5*两者同时均为氢。在本发明的另一个特定实施例中，R5和R5*中的一者为氢，并且另一者为烷基诸如甲基。在此类实施例中，R1、R2和R3可特别地为氢，并且-X-Y-可特别地为-O-CH2-或-O-CHC(Ra)3-诸如-O-CH(CH3)-。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-CRaRb-O-CRaRb-诸如-CH2-O-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。在此类特定实施例中，Ra可特别为烷基诸如甲基，Rb为氢或甲基，特别为氢。此类LNA核苷也称作构象限制的核苷酸(CRN)并且公开于WO 2013/036868中，该专利据此以引用方式并入本文。
在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CRaRb-O-CRaRb-诸如-O-CH2-O-CH2-，W为氧，并且R1、R2、R3、R5和R5*全部同时为氢。Ra和Rb有利地独立选自氢、卤素、烷基和烷氧烷基，特别是氢、甲基、氟和甲氧基甲基。在此类特定实施例中，Ra可特别地为烷基诸如甲基，Rb为氢或甲基，特别为氢。此类LNA核苷也称作COC核苷酸并且公开于Mitsuok等人，NucleicAcids Research 2009，37(4)，1225-1238中，该文献据此以引用方式并入本文。
应当认识到，除非另外说明，否则LNA核苷可处于β-D或α-L立体异构形式。
本发明的LNA核苷的特定实例在方案1中给出(其中B如上所定义)。
方案1
Figure BDA0003222290020000241
Figure BDA0003222290020000251
Figure BDA0003222290020000261
特定的LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6’-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和ENA。
核糖核酸酶H活性和募集
反义寡核苷酸的核糖核酸酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集核糖核酸酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定核糖核酸酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集核糖核酸酶H的能力。如果寡核苷酸在提供有互补靶核酸序列的情况下具有的初始速率是使用WO01/23613(通过引用并入本文)示例91至95提供的方法测量的(以pmol/l/min计)具有与所测试修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但仅包含在寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代磷酸酯键合DNA单体的寡核苷酸的初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％，则一般认为该寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H。为了用于确定核糖核酸酶H活性，可从Lubio Science GmbH,Lucerne,Switzerland获得重组人核糖核酸酶H1。
缺口聚物
本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可以是缺口聚物。反义缺口聚物一般用于通过核糖核酸酶H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚物寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，分别为“5->3”方向的5’侧翼、缺口和3’侧翼F-G-F’。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H的连续DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5’侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3’侧翼区域(F’)。区域F和F’中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F’中的一个或多个糖修饰的核苷是2’糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2’糖修饰、诸如独立地选自LNA和2’-MOE。
在缺口聚物设计中，缺口区域的5’和3’最末端核苷是DNA核苷，分别位于5’(F)或3’(F’)区域的糖修饰的核苷附近。这些侧翼区可通过最远离缺口区域的末端(即在5’侧翼区的5’末端和在3’侧翼区的3’末端)处具有至少一个糖修饰的核苷来进一步定义。
区域F-G-F’形成连续核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其连续核苷酸序列可包含式F-G-F’的缺口聚物区域。
缺口聚物设计F-G-F’的总长度可以是例如12个至32个核苷，诸如13个至24个核苷、诸如14个至22个核苷、诸如14个至17个核苷、诸如16个至18个核苷。
举例来说，本发明的缺口聚物寡核苷酸可以由下式表示：
F1-8-G5-16-F’1-8，诸如
F1-8-G7-16-F’2-8
前提条件是缺口聚物区域F-G-F’的总长度至少为12个，诸如至少14个核苷酸。
以下进一步定义了区域F、G和F’，并且可以将其掺入到F-G-F’式中。
缺口聚物-区域G
缺口聚物的区域G(缺口区域)是核苷的区域，其使得寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H诸如人核糖核酸酶H1，通常是DNA核苷。核糖核酸酶H是一种细胞酶，其识别DNA和RNA之间的双链体，并酶切裂解RNA分子。合适的缺口聚物可具有长度至少5个或6个连续DNA核苷、诸如5-16个连续DNA核苷、诸如6-15个连续DNA核苷、诸如7-14个连续DNA核苷、诸如8-12个连续DNA核苷酸、诸如8-12个连续DNA核苷的缺口区域(G)。在一些实施例中，缺口区域G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续DNA核苷组成。在一些实例下，缺口区域中的胞嘧啶(C)DNA可以甲基化，此类残基标记为5-甲基-胞嘧啶(meC或以e代替c)。如果cg二核苷酸存在于缺口中，缺口中胞嘧啶DNA的甲基化有利于降低潜在毒性，该修饰对寡核苷酸的功效无明显影响。
在一些实施例中，缺口区域G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施例中，缺口中的所有核苷间键是硫代磷酸酯键。
尽管常规的缺口聚物具有DNA缺口区域，但是有许多修饰核苷的实例，当所述核苷在缺口区域内使用时，它们可以募集核糖核酸酶H。已报道当包含在缺口区域内时能够募集核糖核酸酶H的修饰的核苷包括，例如，α-L-LNA、C4’烷基化的DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，两者均通过引用并入本文)、阿拉伯糖衍生的核苷例如ANA和2’F-ANA(Mangos等人，2003J.AM.CHEM.SOC.125,654-661)、UNA(非锁定核酸)(如Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039中所述，通过引用并入本文)。UNA是非锁定核酸，通常是核糖的C2和C3之间的键已被去除，形成未锁定的“糖”残基。用于这种缺口聚物中的修饰的核苷可以是当被引入缺口区域时采用2’内式(类DNA)结构的核苷，即允许核糖核酸酶H募集的修饰)。在一些实施例中，本文所述的DNA缺口区域(G)可以任选地包含1个至3个糖修饰的核苷，所述核苷当被引入缺口区域时采用2’内式(类DNA)结构。
区域G-“缺口破坏者”
另选地，存在向缺口聚物的缺口区域插入赋予3’内式构象的修饰的核苷，同时保留某种核糖核酸酶H活性的众多报告。此类具有以下缺口区域的缺口聚物称作“缺口破坏者(gap-breaker)”或“妨碍缺口的(gap-disrupted)”缺口聚物，该缺口区域包含一个或多个3’内式修饰的核苷，参见例如WO2013/022984。缺口破坏者寡核苷酸在缺口区域内部保留足够的DNA核苷区域以允许募集核糖核酸酶H。缺口破坏者寡核苷酸设计募集核糖核酸酶H的能力一般具有序列特异性或甚至化合物特异性–参见Rukov等人2015Nucl.AcidsRes.Vol.43pp.8476-8487，该文献公开了在一些情况下提供更特异的靶RNA切割作用的募集核糖核酸酶H的“缺口破坏者”寡核苷酸。用于缺口破坏者寡核苷酸的缺口区域内部的修饰的核苷可例如为赋予3’内式构象的修饰的核苷诸如2’-O-甲基(OMe)或2’-O-MOE(MOE)核苷或β-D LNA核苷(核苷的核糖糖环的C2’和C4’之间的桥处于β构象)诸如β-D-氧基LNA或ScET核苷。
与包含上述区域G的缺口聚物一样，缺口破坏者缺口聚物或妨碍缺口的缺口聚物的缺口区域在缺口的5’末端具有DNA核苷(与区域F的3’核苷相邻)并且在缺口的3’末端具有DNA核苷(与区域F’的5’核苷相邻)。包含妨碍缺口的缺口聚物一般在缺口区域的5’末端或3’末端保留至少3或4个连续DNA核苷的区域。
缺口破坏者寡核苷酸的示例性设计包括
F1-8-[D3-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D1-4-E1-D3-4]-F’1-8
F1-8-[D3-4-E1-D1-4]-F’1-8
其中区域G在括号[Dn-Er-Dm]内，D是DNA核苷的连续序列，E是经修饰的核苷(缺口中断者或缺口中断核苷)，并且F和F’是如本文所定义的侧翼区域，并且条件是缺口聚物区域F-G-F’的整体长度为至少12、诸如长度为至少14个核苷酸。
在一些实施例中，妨碍缺口的缺口聚物的区域G包含至少6个DNA核苷，诸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个DNA核苷。如前文所述，DNA核苷可以是连续的或者可以任选地散布有一个或多个经修饰的核苷，条件是缺口区域G能够介导核糖核酸酶H募集。
缺口聚物-侧翼区域，F和F’
区域F紧邻区域G的5’DNA核苷。区域F的3’最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2’取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。
区域F’紧邻区域G的3’DNA核苷。区域F’的5’最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2’取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。
区域F的长度为1-8个连续核苷酸，诸如长度为2-6个诸如3-4个连续核苷酸。优选地，区域F的5’最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的两个5’最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的5’最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5’最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5’最末端核苷是2’取代的核苷，诸如两个3’MOE核苷。在一些实施例中，区域F的5’最末端核苷是2’取代的核苷，诸如MOE核苷。
区域F’的长度为2-8个连续核苷酸，诸如长度为3-6个诸如4-5个连续核苷酸。优选地的是，在实施例中，区域F’的3’最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F’的两个3’最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F’的两个3’最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F’的3’最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F’的两个3’最末端核苷是2’取代的核苷，诸如两个3’MOE核苷。在一些实施例中，区域F’的3’最末端核苷是2’取代的核苷，诸如MOE核苷。
应当注意，当区域F或F’的长度为一时，优选地，它是LNA核苷。
在一些实施例中，区域F和F’独立地由糖修饰的核苷的连续序列组成或包含糖修饰的核苷的连续序列。在一些实施例中，区域F的糖修饰的核苷可独立地选自2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元。
在一些实施例中，区域F和F’独立地包含LNA和2′取代的修饰核苷两者(混合型翼设计)。
在一些实施例中，区域F和F’仅由一种类型的糖修饰的核苷组成，诸如仅由MOE组成或仅由β-D-氧基LNA组成或仅由ScET组成。这样的设计也称为均匀侧翼或均匀缺口聚物设计。
在一些实施例中，区域F或F’或者F和F’的所有核苷均为LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些实施例中，区域F由1-5个，诸如2-4个、诸如3-4个、诸如1个、2个、3个、4个或5个连续LNA核苷组成。在一些实施例中，区域F和F’的所有核苷都是β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施例中，区域F或F’或者F和F’的所有核苷都是2’取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷。在一些实施例中，区域F由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个连续OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，仅一个侧翼区域可以由2′取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，5’(F)侧翼区域由2’取代的核苷诸如OMe或MOE核苷组成，而3’(F’)侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施例中，3’(F’)侧翼区域由2’取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成，而5’(F)侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。
在一些实施例中，区域F和F’的所有修饰的核苷都是LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区域F或F’或者F和F’可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。在一些实施例中，区域F和F’的所有修饰核苷均为β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F’或者F和F’可以任选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。
在一些实施例中，区域F和F’的5’和3’最末端核苷是LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。
在一些实施例中，区域F和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，区域F’和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，区域F或F’、F和F’的核苷之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
其他缺口聚物设计公开于WO 2004/046160、WO 2007/146511和WO 2008/113832中，这些专利据此以引用方式并入本文。
LNA缺口聚物
LNA缺口聚物是其中区域F和F’中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚物。β-D-氧基缺口聚物是其中区域F和F’中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚物。
在一些实施例中，LNA缺口聚物具有下式：[LNA]1-5-[区域G]-[LNA]1-5，其中区域G如在缺口聚物区域G定义中的定义。
MOE缺口聚物
MOE缺口聚物是其中区域F和F’由MOE核苷组成的缺口聚物。在一些实施例中，MOE缺口聚物设计为[MOE]1-8-[区域G]-[MOE]1-8，诸如[MOE]2-7-[区域G]5-16-[MOE]2-7、诸如[MOE]3-6-[区域G]-[MOE]3-6，其中区域G如缺口聚物定义中的定义。具有5-10-5设计的MOE缺口聚物(MOE-DNA-MOE)已在本领域中广泛使用。
混合型翼缺口聚物
混合型翼缺口聚物为以下LNA缺口聚物，其中区域F和区域F’中的一者或两者包含2’取代的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组中的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA单元、2’-O-甲基-RNA、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、2’-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2’-氟-ANA单元诸如MOE核苷。在其中区域F和F’中的至少一者或区域F和F’两者都包含至少一个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F’的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在其中区域F和F’中的至少一者或区域F和F’两者都包含至少两个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F’的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些混合型翼的实施例中，区域F和F’中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。
混合型翼缺口聚物设计公开于WO 2008/049085和WO 2012/109395中，这两件专利均据此以引用方式并入本文。
交替性侧翼缺口聚物
侧翼区域可以包含LNA和DNA核苷两者，并被称为“交替侧翼”，因为它们包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序。包括这样的交替侧翼的缺口聚物被称为“交替侧翼缺口聚物”。因此，“交替性侧翼缺口聚物”是LNA缺口聚物寡核苷酸，其中至少一个侧翼(F或F’)除LNA核苷以外还包含DNA。在一些实施例中，区域F或F’中的至少一者或区域F和F’两者既包含LNA核苷又包含DNA核苷。在这样的实施例中，侧翼区域F或F’，或F和F’两者都包含至少三个核苷，其中F和/或F’区域的5’和3’最末端核苷是LNA核苷。
交替性侧翼LNA缺口聚物公开于WO 2016/127002中。
交替侧翼区域可包含最多3个连续DNA核苷，例如1至2个或1个或2个或3个连续DNA核苷。
可以将交替性侧翼标记为一系列整数，其代表LNA核苷(L)的数目，随后是DNA核苷(D)的数目，例如
[L]1-3-[D]1-4-[L]1-3
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2
在寡核苷酸设计中，这些将经常表示为数字，使得2-2-1代表5’[L]2-[D]2-[L]3’，并且1-1-1-1-1代表5’[L]-[D]-[L]-[D]-[L]3’。具有交替性侧翼的寡核苷酸中侧翼(区域F和区域F’)的长度可独立地为3至10个核苷、诸如4至8个核苷、诸如5至6个核苷、诸如4、5、6或7个修饰的核苷。在一些实施例中，缺口聚物寡核苷酸中的仅侧翼之一具有交替性，而另一者由LNA核苷酸构成。可以有利的是在3’侧翼(F’)的3’末端具有至少两个LNA核苷，以赋予额外的核酸外切酶抗性。一些具有交替性侧翼的寡核苷酸的实例是：
[L]1-5-[D]1-4-[L]1-3-[G]5-16-[L]2-6
[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[D]1-2-[L]1-2-[G]5-16-[L]1-2-[D]1-3-[L]2-4
[L]1-5-[G]5-16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
条件是缺口聚物的总体长度为至少12个诸如至少14个核苷酸。
寡核苷酸中的区域D’或D’'
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以包含以下项或由其组成：与靶核酸互补的寡核苷酸的连续核苷酸序列，诸如缺口聚物F-G-F’，以及另外的5’和/或3’核苷。另外的5’和/或3’核苷可以与靶核酸完全互补或可以不与靶核酸完全互补。这种另外的5’和/或3’核苷在本文中可以称为区域D’和D’'。
出于将连续核苷酸序列(诸如缺口聚物)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D’或D’'。当用于将连续核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的连接基。备选地，其可用于提供核酸外切酶保护或促进合成或制造。
可以将区域D’和D’'分别附接于区域F的5’端或区域F’的3’端，以生成下式D’-F-G-F’、F-G-F’-D’'或
D’-F-G-F’-D’'的设计。在这种情况下，F-G-F’是寡核苷酸的缺口聚物部分，而区域D’或D’'构成寡核苷酸的单独部分。
区域D’或D’'可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F’区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D’或D’'区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的连接基(参见连接基的定义)。在一些实施例中，另外的5’和/或3’端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是DNA或RNA。WO 2014/076195中公开了适合用作区域D’或D’'的基于核苷酸的生物可切割连接基，其以举例方式包括磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO 2015/113922中公开了生物可切割连接基在多-寡核苷酸构建体中的用途，其中它们用来连接单个寡核苷酸内部的多个反义构建体(例如缺口聚物区域)。
在一个实施例中，本发明的寡核苷酸除构成缺口聚物的连续核苷酸序列外还包含区域D’和/或D’'。
在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以由下式表示：
F-G-F’，特别是F1-8-G5-16-F’2-8
D’-F-G-F’，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D’'，特别是F1-8-G5-16-F’2-8-D’'1-3
D’-F-G-F’-D’'，特别是D’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D’'1-3
在一些实施例中，位于区域D’和区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域F’和区域D’之间的核苷间键是磷酸二酯键。
全聚物
在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷均为糖修饰的核苷。此类寡核苷酸在本文中称为全聚物。
在一些实施例中，全聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是LNA核苷，或可以全部是2’O-MOE核苷。在一些实施例中，全聚物的糖修饰的核苷可独立地选自LNA核苷和2’取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’-O-MOE核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷和2’-O-MOE核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的每个核苷单元为2’取代的核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的每个核苷单元为2’-O-MOE核苷。
在一些实施例中，寡核苷酸或其连续核苷酸序列的全部核苷是LNA核苷，诸如β-D-氧基-LNA核苷和/或(S)cET核苷。在一些实施例中，此类LNA全聚物寡核苷酸的长度介于7和12个核苷(参见例如WO 2009/043353)。此类短的完整LNA寡核苷酸在抑制microRNA方面特别有效。
多种全聚物化合物作为治疗用寡聚物时非常有效，特别是在靶向microRNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。
在一些实施例中，全聚物包含至少一个XYX或YXY序列基序诸如重复序列XYX或YXY或由其组成，其中X是LNA并且Y是替代(即非LNA)核苷酸类似物，诸如2’-OMe RNA单元和2’-氟DNA单元。在一些实施例中，以上序列基序可为例如XXY、XYX、YXY或YYX。
在一些实施例中，全聚物可包含介于7个和24个核苷酸之间诸如7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些实施例中，全聚物的连续核苷酸序列包含至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％、诸如95％、诸如100％的LNA单元。对于完全LNA化合物，有利的是它们的长度小于12个诸如7-10个核苷酸。
剩余单元可选自本文中提及的非LNA核苷酸类似物，诸如选自由以下项组成的组中的那些：2’-O-烷基-RNA单元、2’-OMe-RNA单元、2’-氨基-DNA单元、2’-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元和2’MOE RNA单元或2’-OMe RNA单元和2’-氟DNA单元。
混聚物
术语“混聚物”是指包含DNA核苷和糖修饰的核苷二者的寡聚物，其中存在募集核糖核酸酶H的不足长度的连续DNA核苷。合适的混聚物可包含多达3个或多达4个连续DNA核苷。在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列包含交替的糖修饰的核苷区域和DNA核苷区域。通过并入寡核苷酸时与短DNA核苷区域形成RNA样(3’内式)构象的糖修饰的核苷的交替区域，可以制备不募集核糖核酸酶H的寡核苷酸。有利地，糖修饰的核苷是增强亲和力的糖修饰的核苷。
寡核苷酸混聚物通常用于提供基于占据对靶基因(诸如剪接调节物或microRNA抑制物)的调节作用。
在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列中的糖修饰的核苷包含或全部是LNA核苷，诸如(S)cET或β-D-氧基LNA核苷。
在一些实施例中，混聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是LNA核苷，或可以全部是2’O-MOE核苷。在一些实施例中，混聚物的糖修饰的核苷可独立地选自LNA核苷和2’取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2’取代的核苷：2’-O-烷基-RNA、2’-O-甲基-RNA、2’-烷氧基-RNA、2’-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA和2’-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2’-O-MOE核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷和2’-O-MOE核苷。
在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列仅包含LNA和DNA核苷，此类LNA混聚物寡核苷酸的长度可介于例如8个和24个核苷之间(参见例如WO2007112754，其公开了microRNA的LNA抗miR抑制剂)。
多种混聚物化合物作为治疗用寡聚物时非常有效，特别是在靶向microRNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。
在一些实施例中，混聚物包含以下基序
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或
…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…
其中L代表糖修饰的核苷诸如LNA或2’取代的核苷(例如2’-O-MOE)，D代表DNA核苷，并且其中每个m独立地选自1-6，并且每个n独立地选自1、2、3和4，诸如1-3。在一些实施例中，每个L为LNA核苷。在一些实施例中，至少一个L为LNA核苷，并且至少一个L为2’-O-MOE核苷。在一些实施例中，每个L独立地选自：LNA和2’-O-MOE核苷。
在一些实施例中，混聚物可包含介于10个和24个核苷酸之间诸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的连续核苷酸序列或由其组成。
在一些实施例中，混聚物的连续核苷酸序列包含至少30％诸如至少40％诸如至少50％的LNA单元。
在一些实施例中，混聚物包含核苷酸类似物和天然存在的核苷酸重复模式的连续核苷酸序列或一种类型的核苷酸类似物和第二类型的核苷酸类似物或由其组成。该重复模式可例如为：每个第二或每个第三核苷酸为核苷酸类似物诸如LNA，并且剩余核苷酸为天然存在的核苷酸诸如DNA，或可以为2’取代的核苷酸类似物，如本文所提及的2’氟类似物的2’MOE，或在一些实施例中，选自本文中提及的核苷酸类似物群组。应当认识到，核苷酸类似物诸如LNA单元的重复模式可与固定位置处(例如5’或3’末端)的核苷酸类似物组合。
在一些实施例中，从3’末端计数，寡聚物的第一核苷酸为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2’-O-MOE核苷。
在可以相同或不同的一些实施例中，从3’末端计数，寡聚物的第二核苷酸为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2’-O-MOE核苷。
在可以相同或不同的一些实施例中，寡聚物的5’末端为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2’-O-MOE核苷。
在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少两个连续核苷酸类似物单元诸如至少两个连续LNA单元。
在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少三个连续核苷酸类似物单元诸如至少三个连续LNA单元。
缀合物
如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以改善该寡核苷酸的药理学，例如，通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞吸收或稳定性实现。在一些实施例中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄取来修饰或增强寡核苷酸的药代动力学性质。特别地，缀合物可使寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。
WO 93/07883和WO 2013/033230提供了合适的缀合物部分，这两件专利据此以引用方式并入本文。其他合适的缀合物部分是那些能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的缀合物部分。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合物部分适用于与ASGPR结合，参见例如WO2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620(通过引用并入本文)。此类缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的摄取，同时减少寡核苷酸在肾脏中的存在，从而与相同寡核苷酸的非缀合形式相比，增加缀合寡核苷酸的肝脏/肾脏比率。
寡核苷酸缀合物及其合成也在Manoharan于Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke编辑，第16章，Marcel Dekker,Inc.,2001中所作综述和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103中报导，上述文献各自通过引用整体并入本文。
在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下项组成的组：糖、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或它们的组合。
连接基
键或连接基是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过联接部分(例如连接基或系链)附接于寡核苷酸。连接基用于将第三区域诸如缀合物部分(区域C)与第一区域共价连接，该第一区域例如与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A)。
在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以任选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或连续核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的连接基区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。
区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的连接基，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的连接基经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的连接基对S1核酸酶裂解敏感。在一个优选的实施例中，对核酸酶敏感的连接基包含介于1个至10个核苷，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷，更优选地包含介于2个至6个核苷，并且最优选地包含介于2个至4个联接的核苷，该核苷包含至少两个连续的磷酸二酯键，诸如至少3个或4个或5个连续的磷酸二酯键。优选地，核苷是DNA或RNA。包含磷酸二酯的可生物裂解的连接基更加详细地描述于WO2014/076195(通过引用并入本文)中。
区域Y是指不必为可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域)的连接基。区域Y连接基可包含重复单元诸如乙二醇单元、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，连接基(区域Y)为氨基烷基诸如C2-C36氨基烷基，包括例如C6至C12氨基烷基。在优选的实施例中，连接基(区域Y)是C6氨基烷基基团。
因此，本发明特别地涉及：
根据本发明所述的寡核苷酸，其中(A1)和(A2)中的一者为糖修饰的核苷且另一者为DNA；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中(A1)和(A2)两者同时都为糖修饰的核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中糖修饰的核苷为独立地2’糖修饰的核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中2’糖修饰的核苷独立地选自：2’-烷氧基-RNA、特别是2’-甲氧基-RNA、2’-烷氧基烷氧基-RNA、特别是2’-甲氧基乙氧基-RNA、2’-氨基-DNA、2’-氟-RNA或2’-氟-ANA；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中2’糖修饰的核苷为2’-烷氧基烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基乙氧基-RNA；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中2’糖修饰的核苷为LNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中LNA核苷独立地选自β-D-氧基LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA和ENA，特别是β-D-氧基LNA；
根据本发明所述的寡核苷酸，其包含选自磷酸二酯核苷间键、硫代磷酸酯核苷间键以及如式(I)中所定义的核苷间键中的另外的核苷间键；
根据本发明所述的寡核苷酸，其包含选自硫代磷酸酯核苷间键以及如式(I)中所定义的核苷间键的另外的核苷间键；
根据本发明所述的寡核苷酸，其包含介于1个和15个之间、特别地介于1个和5个之间、更特别地为1个、2个、3个、4个或5个的如式(I)中所定义的式(I)的二核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中所述另外的核苷间键全部为式-P(＝S)(OR)O2-的硫代磷酸酯核苷间键，其中R为氢或磷酸酯保护基团；
根据本发明所述的寡核苷酸，其包含选自DNA核苷、RNA核苷和糖修饰的核苷的其他核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中一个或多个核苷为核碱基修饰的核苷，诸如包含5-甲基胞嘧啶核碱基的核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中至少一个式(I)的二核苷在反义缺口聚物寡核苷酸的侧翼区域内或位于反义缺口聚物寡核苷酸的缺口区域和侧翼区域之间，即(A1)和(A2)同时都是糖修饰的核苷，或者(A1)和(A2)中的一者是DNA核苷或RNA核苷且另一者是糖修饰的核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中缺口聚物寡核苷酸为LNA缺口聚物、混合型翼缺口聚物或2’-取代的缺口聚物，特别是2’-O-甲氧基乙基缺口聚物；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中A为硫。
根据本发明所述的寡核苷酸，其中反义缺口聚物寡核苷酸包含式5’-F-G-F’-3’的连续核苷酸序列，其中G为能够募集核糖核酸酶H的5个至18个核苷的区域，并且所述区域G在5’和3’旁侧分别是侧翼区域F和F’，其中区域F和F’独立地包含1个至7个2’-糖修饰的核苷酸或由其组成，其中与区域G相邻的区域F的核苷为2’-糖修饰的核苷并且其中与区域G相邻的区域F’的核苷为2’-糖修饰的核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中所述至少一个式(I)的二核苷定位在区域F或F’内，或定位在区域G和区域F之间，或定位在区域G和区域F’之间；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中在区域F或区域F’内或在区域F和F’两者内的2’-糖修饰的核苷独立地选自：2’-烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基-RNA；2’-烷氧基烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基乙氧基-RNA；2’-氨基-DNA；2’-氟-RNA；2’-氟-ANA；和LNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中在区域F或区域F’内或在区域F和F’两者内的所有2’-糖修饰的核苷都为LNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中在区域F或区域F’内或在于区域F和F’两者内的2’-糖修饰的核苷全部为2’-烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基-RNA；全部为2’-烷氧基烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基乙氧基-RNA；全部为2’-氨基-DNA；全部为2’-氟-RNA；全部为2’-氟-ANA；或全部为LNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中区域F或区域F’或区域F和F’两者包含至少一个LNA核苷和至少一个DNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中区域F或区域F’或区域F和F’两者包含至少一个LNA核苷和至少一个非LNA 2’-糖修饰的核苷，诸如至少一个2’-甲氧基乙氧基-RNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中缺口区域G包含5个至16个，特别地包括8个至16个，更特别包含8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个连续DNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中区域F和区域F’的长度独立地为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中区域F和区域F’各自独立地包含1个、2个、3个或4个LNA核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中所述LNA核苷独立地选自β-D-氧基LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA和ENA；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中LNA核苷为β-D-氧基LNA；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列(F-G-F’)的长度为10个到30个核苷酸，长度特别地为12个至22个核苷酸，更特别地为14个至20个寡核苷酸；
根据本发明所述的寡核苷酸，其中所述缺口聚物寡核苷酸包含式5’-D’-F-G-F’-D”-3’的连续核苷酸序列，其中F、G和F’如权利要求17至28中任一项所定义的，并且其中区域D’和区域D”各自独立地由0个至5个核苷酸组成，特别地由2个、3个或4个核苷酸组成，所述核苷酸特别是DNA核苷酸，诸如磷酸二酯连接的DNA核苷；
根据权利要求17至29中任一项所述的寡核苷酸，其中每个侧翼区域F和区域F’独立地包含1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个，特别地包含式(I)的一个二核苷；
根据本发明所述的寡核苷酸，其总计包含式(I)的一个二核苷，且特别地包含定位在区域F’内或定位在区域G和区域F’之间的式(I)的一个二核苷。
根据本发明所述的寡核苷酸，其中该寡核苷酸能够募集人核糖核酸酶H1；
根据本发明所述的寡核苷酸的药用盐，特别是钠盐、钾盐或铵盐；
一种缀合物，其包含根据本发明所述的寡核苷酸或药用盐以及与所述寡核苷酸或所述药用盐共价连接的至少一个缀合物部分，任选地经连接基部分连接；
一种药物组合物，其包含根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物以及治疗惰性载体；和
根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物，其作为治疗活性物质使用。
本发明特别地涉及式(I-a)化合物
Figure BDA0003222290020000441
其中
R2为烷氧基、烷氧基烷氧基或氨基；且
R4为氢；或
R4和R2一起形成X-Y；
X为氧、硫、-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(＝CRaRb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-；-O-NRa-、-NRa-O-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
Y为氧、硫、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
条件是-X-Y-不为-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝N-、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝N-或-Se-Se-；
J为氧、硫、＝CH2或＝N(Ra)；
Ra和Rb独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、巯基、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、杂环基、氨基、烷基氨基、氨甲酰基、烷基氨羰基、氨烷基氨羰基、烷基氨烷基氨羰基、烷基羰氨基、脲基、烷酰氧基、磺酰基、烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、巯基硫化烷基硫基(thiohydroxylsulfidealkylsulfanyl)、芳氧羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、-OC(＝Xa)Rc、-OC(＝Xa)NRcRd和-NReC(＝Xa)NRcRd；
或两个偕Ra和Rb一起形成任选地取代的亚甲基；
或两个偕Ra和Rb与它们所连接的碳原子一起形成环烷基或卤代环烷基，仅含-X-Y-的一个碳原子；
其中取代的烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基是经1至3个取代基取代的烷基、链烯基、炔基和亚甲基，所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基；
Xa为氧、硫或-NRc；
Rc、Rd和Re独立地选自氢和烷基；
R5为羟基保护基团；
Rx为氰烷基或烷基；
Ry为二烷基氨基或吡咯烷基；
Nu为核碱基或受保护的核碱基；并且
n为1、2或3。
根据本发明所述的寡核苷酸可例如根据以下方案进行制备。
方案2
Figure BDA0003222290020000451
在方案2中，B1和B2为核碱基，且A如上文述所定义。
包含膦酰基乙酸酯或硫代膦酰基乙酸酯修饰的寡核苷酸可以使用固相寡核苷酸化学方法合成。DMT保护的脱氧核糖核苷3’-O-二异丙基氨基膦基乙酸二甲基-β-氰乙基酯缩合为与固体支持物连接的脱氧核糖核苷。然后使用例如低氧化剂试剂(0.02M的THF/吡啶/H2O:88/10/2中的I2)氧化次膦酸酯键或使用例如0.1M的3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶的中溶液硫化次膦酸酯键。随后用乙酸酐封端并用二氯乙酸处理以去除5’-O-二甲氧基三基后，重复该循环适当次数，以得到含有膦酰基乙酸酯修饰的寡核苷酸。
用于制备根据本发明所述的寡核苷酸的单体结构单元可例如根据以下方案进行制备。
二甲基氰乙基溴乙酸乙酯是通过使用在甲苯中的3-羟基-3-甲基丁腈在回流条件下将溴乙酰溴缩合过夜来合成。然后通过与二异丙基氨基氯化膦的Reformatsky反应制备亚磷酸酯衍生物。使用四唑将该反应物与受保护的2’-脱氧核苷进一步缩合，生成LNA PACE亚磷酰胺。
方案3
Figure BDA0003222290020000461
在方案3中，R5、Rx、Ry和Nu如上文所定义。
单体可以特别地根据以上程序之后的以下方案来制备。
方案4
Figure BDA0003222290020000471
在方案4中，Nu如上文所定义。
本发明因此还涉及式(II)化合物
Figure BDA0003222290020000472
其中
X为氧、硫、-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(＝CRaRb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-；-O-NRa-、-NRa-O-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
Y为氧、硫、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(＝J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-或-O-CRaRb-；
条件是-X-Y-不为-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝N-、-C(Ra)＝N-C(Ra)＝C(Rb)、-C(Ra)＝C(Rb)-C(Ra)＝N-或-Se-Se-；
J为氧、硫、＝CH2或＝N(Ra)；
Ra和Rb独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、巯基、烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、芳基、杂环基、氨基、烷基氨基、氨甲酰基、烷基氨羰基、氨烷基氨羰基、烷基氨烷基氨羰基、烷基羰氨基、脲基、烷酰氧基、磺酰基、烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、巯基硫化烷基硫基(thiohydroxylsulfidealkylsulfanyl)、芳氧羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、-OC(＝Xa)Rc、-OC(＝Xa)NRcRd和-NReC(＝Xa)NRcRd；
或两个偕Ra和Rb一起形成任选地取代的亚甲基；
或两个偕Ra和Rb与它们所连接的碳原子一起形成环烷基或卤代环烷基，仅含-X-Y-的一个碳原子；
其中取代的烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基是经1至3个取代基取代的烷基、链烯基、炔基和亚甲基，所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基；
Xa为氧、硫或-NRc；
Rc、Rd和Re独立地选自氢和烷基；
R5为羟基保护基团；
Rx为氰烷基或烷基，特别是氰烷基；
Ry为二烷基氨基或吡咯烷基；且
Nu为核碱基或受保护的核碱基；并且
n为1、2或3；
或其药用盐。
本发明进一步特别地涉及：
根据本发明所述的化合物，其中-X-Y-为-CH2-O-、-CH(CH3)-O-或-CH2CH2-O-；
式(III)或式(IV)的根据本发明的化合物
Figure BDA0003222290020000491
其中R5、Rx、Ry和Nu如上文所定义；
根据本发明所述的化合物，其中Rx为2-氰基-1,1-二甲基-乙基、甲基、乙基、丙基或叔丁基；
根据本发明所述的化合物，其中Rx为2-氰基-1,1-二甲基-乙基；
根据本发明所述的化合物，其中Ry为二异丙基氨基或吡咯烷基；
根据本发明所述的化合物，其中Ry为二烷基氨基；
根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中Ry为二异丙基氨基；
式(V)的根据本发明所述的化合物
Figure BDA0003222290020000492
其中R5和Nu如上文所定义；
根据本发明所述的化合物，其中Nu是胸腺嘧啶、受保护的胸腺嘧啶、腺苷、受保护的腺苷、胞嘧啶、受保护的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、受保护的5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、受保护的鸟嘌呤、尿嘧啶或受保护的尿嘧啶。
根据本发明所述的化合物，其选自
Figure BDA0003222290020000501
Figure BDA0003222290020000511
一种用于制备根据本发明所述的式(II)化合物的方法，该方法包括：在偶联剂和碱存在下，使式(C)化合物
Figure BDA0003222290020000512
与式P(Ry)2(CH2)COO(Rx)化合物反应，其中X、Y、R5、Nu、Rx和Ry如上文所定义；
根据本发明的方法，其中偶联剂为1H-四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苄基硫代四唑或4,5-二氰基咪唑(DCI)，特别是四唑；和
根据本发明所述的化合物的用途，其用于制备寡核苷酸。
在根据本发明所述的方法中，可以方便地用碱猝灭，例如用三乙胺、吡啶、二异丙基胺或N,N-二异丙基乙基胺。
根据本发明，包含2’-烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基-RNA、2’-烷氧基烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基乙氧基-RNA的寡核苷酸可以按照以下程序合成。
方案5
Figure BDA0003222290020000521
在方案5中，B1和B2为核碱基，且A如上文述所定义。
包含MOE(或其他2’取代基)膦酰基乙酸酯或硫代膦酰基乙酸酯修饰的寡核苷酸可以使用固相寡核苷酸化学方法合成。DMT保护的脱氧核糖核苷3’-O-二异丙基氨基膦基乙酸二甲基-β-氰乙基酯缩合为与固体支持物连接的脱氧核糖核苷。然后使用例如低氧化剂试剂(0.02M的THF/吡啶/H2O:88/10/2中的I2)氧化次膦酸酯键或使用例如0.1M的3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶的中溶液硫化次膦酸酯键。随后用乙酸酐封端并用二氯乙酸处理以去除5’-O-二甲氧基三基后，重复该循环适当次数，以得到含有膦酰基乙酸酯修饰的寡核苷酸。
用于制备根据本发明所述的寡核苷酸的单体结构单元可例如根据以下方案进行制备。
二甲基氰乙基溴乙酸乙酯是通过使用在甲苯中的3-羟基-3-甲基丁腈在回流条件下将溴乙酰溴缩合过夜来合成。然后通过与二异丙基氨基氯化膦的Reformatsky反应制备亚磷酸酯衍生物。使用4,5-DCI将该反应物与受保护的2’-脱氧核苷进一步缩合，生成MOEPACE亚磷酰胺。
方案6
Figure BDA0003222290020000531
在方案6中，R5、Rx、Ry和Nu如上文所定义。
单体可以特别地根据以上程序之后的以下方案来制备。
方案7
Figure BDA0003222290020000532
在方案7中，Nu如上文所定义。
本发明因此还涉及式(VI)化合物
Figure BDA0003222290020000541
其中
R2为烷氧基、烷氧基烷氧基或氨基，特别是烷氧基或烷氧基烷氧基；
R5为羟基保护基团；
Rx为氰烷基或烷基，特别是氰烷基；
Ry为二烷基氨基或吡咯烷基；且
Nu为核碱基或受保护的核碱基；并且
或其药用盐。
本发明进一步特别地涉及：
根据本发明所述的化合物，其中R2为甲氧基、甲氧基乙氧基或氨基，特别是甲氧基或甲氧基乙氧基；
式(VII)的根据本发明所述的化合物
Figure BDA0003222290020000542
其中R5、Rx、Ry和Nu如上文所定义；
根据本发明所述的化合物，其中Rx为2-氰基-1,1-二甲基-乙基、甲基、乙基、丙基或叔丁基；
根据本发明所述的化合物，其中Rx为2-氰基-1,1-二甲基-乙基；
根据本发明所述的化合物，其中Ry为二异丙基氨基或吡咯烷基；
根据本发明所述的化合物，其中Ry为二烷基氨基；
根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中Ry为二异丙基氨基；
式(VIII)的根据本发明所述的化合物
Figure BDA0003222290020000551
其中R5和Nu如上文所定义；
根据本发明所述的化合物，其中Nu是胸腺嘧啶、受保护的胸腺嘧啶、腺苷、受保护的腺苷、胞嘧啶、受保护的胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、受保护的5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、受保护的鸟嘌呤、尿嘧啶或受保护的尿嘧啶。
根据本发明所述的化合物，其选自
Figure BDA0003222290020000552
Figure BDA0003222290020000561
一种用于制备根据本发明所述的式(VI)化合物的方法，该方法包括：在偶联剂和碱存在下，使式(D)化合物
Figure BDA0003222290020000562
与式P(Ry)2(CH2)COO(Rx)化合物反应,其中R2、R5、Nu、Rx和Ry如上文所定义；
根据本发明所述的方法，其中偶联剂为1H-四唑、5-乙硫基-1H-四唑、2-苄基硫代四唑、4,5-二氰基咪唑(DCI)，特别是DCI；和
根据本发明所述的化合物的用途，其用于制备寡核苷酸。
在根据本发明所述的方法中，可以方便地用碱猝灭，例如用三乙胺、吡啶、二异丙基胺或N,N-二异丙基乙基胺。
现在将通过以下实例说明本发明，所述实例不具有限制性。
实例
缩写：
A 腺嘌呤
G 鸟嘌呤
mC 甲基胞嘧啶
T 胸腺嘧啶
LNA 锁核酸
RNA 核糖核酸
DMT 二甲氧基三苯甲基
DCA 二氯乙酸
DCM 二氯甲烷
THF 四氢呋喃
Anh. 无水
TLC 薄层色谱法
NMR 核磁共振
CPG 受控孔玻璃
RT 逆转录
qPCR 定量聚合酶链反应
ds 双链
Tm 热熔解
实例1：单体合成
1.1.1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-溴乙酸酯
Figure BDA0003222290020000581
向2-溴乙酰溴(14.7g,6.31mL,72.6mmol,1.2eq)在甲苯(67.2mL)中的溶液中，一边搅拌一边缓慢添加3-羟基-3-甲基丁腈(6g,6.28ml,60.5mmol,1eq)。圆底烧瓶装有Friedrich冷凝器和通向分酸器(含有NaOH水溶液)的干燥管。将反应混合物加热至回流并过夜。使反应冷却至室温，然后在真空中浓缩混合物，以得到无色油。通过Combiflash色谱法使用乙酸乙酯/己烷作为梯度对粗产物进行纯化，产物在30％乙酸乙酯的己烷溶液中洗脱，得到1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(8.14g，37mmol，58％产率)。1H NMR(CHLOROFORM-d,300MHz)δ3.8(s,2H),2.9(s,2H),1.6(s,6H).
1.2.1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯
Figure BDA0003222290020000591
将1-氯-N,N,N',N’-四异丙基磷烷二胺(7.75g，29mmol，1eq)溶解在无水THF(69.4ml)中。另外添加41.6ml无水乙醚。将在无水THF(34.7ml)中的1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-溴乙酸酯(7.03g,32mmol,1.1eq)置于圆底烧瓶中。将锌(2.85g,43.6mmol,1.5eq)、无水乙醚(22.2ml)和磁力搅拌棒置于装有Friedrich冷凝器的500mL三颈圆底烧瓶中。将膦(36mL)和溴乙酸溶液(10mL)同时且非常缓慢地添加到三颈圆底烧瓶中。然后将反应混合物在回流条件下加热直到发生明显的放热反应(稍微混浊的无色反应物变得澄清和呈淡黄色)。通过添加剩余的膦和溴乙酸溶液在回流条件下继续反应。添加之后，反应通过加热在回流条件下保持45分钟，使反应冷却至室温并通过31P NMR分析完成情况。在δ＝135ppm处的起始材料转化为在δ＝48ppm处的单一产物。冷却的反应混合物在真空中浓缩，以得到粘性油状物。所得物质用无水庚烷和少量乙腈溶解，以充分溶解粗产物。该溶液用无水庚烷萃取两次。通过31P NMR分析乙腈层中在δ＝48ppm处的产物缺失并丢弃。合并所有庚烷馏分并在真空中浓缩，以得到淡黄色油状物。然后在高真空下干燥过夜，得到白色固体(7.096g，19mmol，62％产率)。1H NMR(CHLOROFORM-d,300MHz)δ3.3-3.5(m,4H),2.9(s,2H),2.7(d,2H),1.60(s,6H),1.3(m,24H).
1.3.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[[外消旋-(1R,3R)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-3-(5-甲基-2,4-二氧代嘧啶-1-基)-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-7-基]氧基]膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000601
1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-6-基]-5-甲基-嘧啶-2,4-二酮(0.7g，1.22mmol，1eq)溶解在无水DCM(15.3ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(545mg,1.47mmol,1.2eq)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将四唑(2.17ml,978μmol,0.8eq)添加到反应混合物中，作为0.45M无水CH3CN的溶液。然后将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31PNMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)进行分析。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(99mg,136μl,978μmol,0.8eq)猝灭反应。5分钟后，将反应混合物在真空中浓缩，得到粘稠的无色油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对产物进行再溶解并通过柱色谱法(80/20：乙酸乙酯/庚烷)进行纯化。合并含有产物的馏分并浓缩，得到泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解。逐滴添加庚烷以快速搅拌。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到743mg白色固体状的目标化合物(743mg，0.88mmol，69％产率)。31P NMR(CHLOROFORM-d,121MHz)δ126.91(s,1P),122.25(s,1P).1HNMR(600MHz,ACETONITRILE-d3)δppm 8.89-9.22(m,1H),7.57-7.59(m,1H),7.50(d,J＝7.6Hz,1H),7.33-7.39(m,3H),7.33-7.37(m,2H),7.26-7.31(m,1H),6.88-6.95(m,4H),5.58(s,1H),4.62(s,1H),4.14(dJ,＝6.8Hz,1H),3.79-3.81(m,5H),3.79-3.85(m,2H),3.47-3.50(m,2H),3.42-3.50(m,1H),2.92-2.95(m,1H),2.67-2.71(m,1H),2.61-2.66(m,1H),1.72(s,2H),1.52(d,J＝5.2Hz,4H),1.09(d,J＝6.7Hz,4H),1.01(br d,J＝6.7Hz,4H).LCMS(ES+)发现：843.37g/mol。
1.4.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[[外消旋-(1R,3R)-3-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-甲基)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-7-基]氧基]膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000611
N-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-6-基]嘌呤-6-基]苯甲酰氨基(3g，4.37mmol，1eq)溶解在无水DCM(54.7ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(1.95g，5.25mmol，1.2eq)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将四唑(7.78ml,3.5mmol,0.8eq)添加到反应混合物中，作为0.45M无水CH3CN的溶液。将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31P NMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)进行分析。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(354mg,488μl,3.5mmol,0.8eq)猝灭反应。5分钟后，将反应混合物在真空中浓缩，得到粘稠的无色油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对产物进行再溶解并通过柱色谱法(80/20：乙酸乙酯/庚烷)进行纯化。合并含有产物的馏分并浓缩，得到泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解。逐滴添加庚烷以快速搅拌。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到1.86g白色固体状的目标化合物(1.86g，1.9mmol，45％产率)。31P NMR(ACETONITRILE-d3,121MHz)δ125.2(s,1P),120.9(s,1P).LCMS(ES+)发现：956.40g/mol。
1.5.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[[外消旋-(1R,3R)-3-(4-苯甲酰胺基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1-基)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-7-基]氧基]膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000621
N-[1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-6-基]-5-甲基-2-氧代-嘧啶-4-基]苯甲酰氨基(2.8g，4.14mmol，1eq)溶解在无水DCM(59.2ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(1.85g，4.97mmol，1.2eq)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将四唑(7.37ml,3.31mmol,0.8eq)添加到反应混合物中，作为0.45M无水CH3CN的溶液。将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31P NMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)进行分析。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(335mg,462μl,3.31mmol,0.8eq)猝灭反应。5分钟后，将反应混合物在真空中浓缩，得到粘稠的淡黄色油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对产物进行再溶解并通过柱色谱法(50/50：乙酸乙酯/庚烷)进行纯化。合并含有产物的馏分并浓缩，得到泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解。逐滴添加庚烷以快速搅拌。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到2.35g淡黄色固体状的目标化合物(2.35g，2.22mmol，46％产率)。31P NMR(ACETONITRILE-d3,121MHz)δ126.78(s,1P),122.73(s,1P).LCMS(ES+)发现：947.41g/mol。
1.6.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[[外消旋-(1R,3R)-1-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-3-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H—嘌呤-9-基]-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-7-基]氧基]膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000631
N'-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基-甲氧基]甲基]-7-羟基-2,5-二氧杂双环[2.2.1]庚烷-6-基]-6-氧代-1H-嘌呤-2-基]-N,N-二甲基-甲脒(2.6g，3.89mmol，1eq)溶于DCM(55.6ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(1.74g，4.67mmol，1.2eq)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将四唑(6.92ml,3.12mmol,Eq:0.8)添加到反应混合物中，作为0.45M无水CH3CN的溶液。将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31P NMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)进行分析。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(315mg,434μl,3.12mmol,0.8eq)猝灭反应。5分钟后，将反应混合物在真空中浓缩，得到粘稠的无色油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对产物进行再溶解并通过柱色谱法(100％乙酸乙酯)进行纯化。合并含有产物的馏分并浓缩，得到泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解。逐滴添加庚烷以快速搅拌。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到1.4g白色固体状的目标化合物(1.4g，1.4mmol，38％产率)。31P NMR(ACETONITRILE-d3,121MHz)δ126.48(s,1P),121.3(s,1P).LCMS(ES+)发现：938.42g/mol。
实例2：寡核苷酸合成
使用Bioautomation的MerMade 12自动化DNA合成仪合成寡核苷酸。使用带有通用连接基的受控孔玻璃支持物
Figure BDA0003222290020000632
以1μmol的规模进行合成。
在用于偶联标准DNA和LNA亚磷酰胺的标准循环程序中，用3％(w/v)二氯乙酸的CH2Cl2溶液按230μL三次施加进行DMT去保护105秒。用95μL的0.1M乙腈溶液(或对于LNA-MeC结构单元，为在乙腈/CH2Cl2 1:1中的溶液)和110μL的0.25M 5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-2H-四唑溶液(作为活化剂)偶联相应的亚磷酰胺三次并且偶联时间为180秒。使用0.1M 3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶中的溶液以200μL施加一次进行硫化3分钟。使用THF/pyr/H2O:88/10/2中的0.02M I2施加一次进行3分钟的氧化。使用THF/二甲基吡啶/Ac2O8:1:1(CapA,75μmol)和THF/N-甲基咪唑8:2(CapB,75μmol)处理70秒，进行封端。
用于引入PACE LNA的合成循环包括使用3％(w/v)二氯乙酸的CH2Cl2溶液按230μL三次施加进行DMT去保护105秒。新制备的LNA PACE与95μL的0.1M乙腈溶液和110μL的5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-2H-四唑的0.25M溶液(作为活化剂)偶联两次并且偶联时间为15分钟。使用0.1M的3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶中的溶液施加一次进行3分钟的硫化。使用THF/pyr/H2O:88/10/2中的0.02M I2施加一次进行3分钟的氧化。使用THF/二甲基吡啶/Ac2O 8:1:1(CapA,75μmol)和THF/N-甲基咪唑8:2(CapB,75μmol)处理70秒，进行封端。
合成后，使1.5％DBU在无水CH3CN中的溶液小心地数次通过色谱柱，以对二甲基氰乙基保护基团进行去保护并防止在去保护期间碱基的烷基化。然后使其在室温静置60分钟。然后，弃去溶液，并且用2-3mL无水CH3CN冲洗色谱柱。然后在氩气流下干燥。随后，将CPG小心地转移到4mL小瓶中，向小瓶中添加1mL的7N NH3的甲醇溶液，并在55℃搅拌24小时。
使用C18色谱柱通过RP-HPLC纯化对粗制DMT-on寡核苷酸进行纯化，随后用80％乙酸水溶液和乙醇沉淀或通过小柱纯化来去除DMT。PACE LNA亚磷酰胺在Basel合成。标准的亚磷酰胺以及用于固相合成的所有试剂是从Sigma Aldrich订购。
以下分子已按照上述程序制备。
Figure BDA0003222290020000641
Figure BDA0003222290020000651
*相邻的核苷酸之间的PACE硫代磷酸酯修饰
A、G、mC、T代表LNA核苷酸
a、g、c、t代表DNA核苷酸
所有其他键均制备为硫代磷酸酯
实例3：就剂量反应曲线而言，不同浓度的靶向人HeLa和A549细胞中HIF1a mRNA的寡核苷酸的体外功效。
HeLa和A549细胞系购自ATCC，并按照供应商的建议在37℃用5％CO2在加湿培养箱中保存。对于测定，将3000个细胞/孔(HeLa)和3500个细胞/孔(A549)接种在培养基中的96孔板中。在添加溶解于PBS中的寡核苷酸之前，将细胞培养24小时。寡核苷酸的浓度范围：最高浓度25μM，分8个步骤按照1:1稀释。添加寡核苷酸后三天，收获细胞。根据制造商的说明，使用PureLink Pro 96RNA Purification试剂盒(Thermo Fisher Scientific)萃取RNA，并在50μl水中洗脱。随后将RNA用无DNase/RNase的水(Gibco)稀释10倍并加热至90℃且持续一分钟。
对于基因表达分析，使用qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR
Figure BDA0003222290020000662
LowROXTM(Quantabio)在双重复模式设置中进One Step RT-qPCR。以下TaqMan引物测定法用于qPCR：HIF1A、以内源性GUSB对照品进行的Hs00936368_m1、Hs99999908_m1(VIC-MGB)。所有引物集均购自Thermo Fisher Scientific。HIF1A mRNA的相对表达水平显示为对照品(经PBS处理的细胞)的百分比，IC50值已使用GraphPad Prism7根据来自n＝2个生物学副本的数据确定。
结果示在下表以及图1中。
Figure BDA0003222290020000661
Figure BDA0003222290020000671
图1的图表中描绘的数据报告在下表中。
HeLa中的HIF1A表达(生物学副本的平均值)
#1 #2 #3 #4 #5 #6 参考
25,00μM 16 17 13 25 16 20 16
12,50μM 23 26 20 39 24 27 23
6,25μM 36 42 28 55 37 43 34
3,13μM 55 66 41 69 52 58 52
1,56μM 70 78 61 80 72 64 66
0,78μM 78 77 76 84 76 79 74
0,39μM 83 95 82 90 85 94 81
0,20μM 91 92 84 88 103 91 84
A549中的HIF1A表达(生物学副本的平均值)
Figure BDA0003222290020000672
Figure BDA0003222290020000681
实例4：就剂量反应曲线而言，不同浓度的靶向人HeLa和A549细胞中MALAT1 mRNA的寡核苷酸的体外效价和功效。
HeLa和A549细胞系购自ATCC，并按照供应商的建议在37℃用5％CO2在加湿培养箱中保存。对于测定，将3000个细胞/孔(HeLa)和3500个细胞/孔(A549)接种在培养基中的96孔板中。在添加溶解于PBS中的寡核苷酸之前，将细胞培养24小时。寡核苷酸的浓度范围：最高浓度25μM，分8个步骤按照1:1稀释。添加寡核苷酸后三天，收获细胞。根据制造商的说明，使用PureLink Pro 96RNA Purification试剂盒(Thermo Fisher Scientific)萃取RNA，并在50μl水中洗脱。随后将RNA用无DNase/RNase的水(Gibco)稀释10倍并加热至90℃且持续一分钟。
对于基因表达分析，使用qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR
Figure BDA0003222290020000683
LowROXTM(Quantabio)在双重复模式设置中进One Step RT-qPCR。以下TaqMan引物测定法用于qPCR：MALAT1、以内源性GAPDH对照品进行的Hs00273907_s1(FAM-MGB)。所有引物集均购自Thermo Fisher Scientific。MALAT1 mRNA的相对表达水平显示为对照品(经PBS处理的细胞)的百分比，IC50值已使用GraphPad Prism7根据来自n＝2个生物学副本的数据确定。
结果示在下表以及图2中。
Figure BDA0003222290020000682
Figure BDA0003222290020000691
图2的图表中描绘的数据报告在下表中。
HeLa中的MALAT1表达(生物学副本的平均值)：
#7 #8 #9 #10 #11 #12 参考
25,00μM 5 4 3 3 3 3 6
12,50μM 6 5 4 3 3 4 7
6,25μM 9 7 7 5 4 5 9
3,13μM 13 13 8 7 7 8 15
1,56μM 23 22 14 10 12 13 22
0,78μM 29 27 32 19 19 20 37
0,39μM 49 40 35 32 40 37 64
0,20μM 73 65 77 64 67 70 79
A549HeLa中的MALAT1表达(生物学副本的平均值)
Figure BDA0003222290020000692
Figure BDA0003222290020000701
实例5：靶向小鼠原代肝细胞中ApoB mRNA的寡核苷酸的体外效价和功效
根据文献(Berry and Friend,1969,J.Cell Biol；Paterna et al.,1998,Toxicol.Appl.Pharmacol.)，在执行两步灌注程序之后，从用戊巴比妥麻醉的C57BL/6J小鼠的肝脏中分离出原代小鼠肝细胞。第一步是用HBSS+15mM HEPES+0.4mM EGTA进行5分钟，随后是用HBSS+20mM NaHCO 3+0.04％BSA(Sigma#A7979)+4mM CaCL 2(Sigma#21115)+0,2mg/ml Collagenase Type 2(Worthington#4176)进行12分钟。在冰上的5ml冷的Williams培养基E(WME)(Sigma#W1878，辅以1x青霉素/链霉素/谷氨酰胺，10％(v/v)FBS(ATCC#30-2030))中捕获肝细胞。使粗制的细胞悬液过滤通过70μm的细胞过滤网，随后通过40μm的细胞过滤网(Falcon#352350和#352340)，用WME填充至25ml，并在室温以50x g离心5分钟以沉淀肝细胞。去除上清液，将肝细胞重悬于25ml WME中。添加25ml 90％Percoll溶液(Sigma#P4937；pH＝8.5-9.5)并在25℃50x g离心10分钟后，去除上清液和漂浮细胞。为了去除剩余的Percoll，将沉淀物重悬于50mL WME培养基中，在25℃以50x g离心3分钟，弃去上清液。将细胞沉淀物重悬于20mL WME中，测定细胞数量和活力(Invitrogen,Cellcount)并稀释至250,000个细胞/ml。以25,000个细胞/孔的量接种在涂有胶原蛋白的96孔板(PD BiocoatCollagen I#356407)上，并于37℃在5％CO2下培养。3小时后，用WME清洗细胞以去除未附着的细胞并更换培养基。接种后24小时，以一定范围内的浓度添加寡核苷酸：最高浓度3,125μM，分8个步骤进行半对数稀释。添加寡核苷酸后三天，收获细胞。根据制造商的说明，使用PureLink Pro 96RNA Purification试剂盒(Thermo Fisher Scientific)萃取RNA，并在50μl水中洗脱。随后将RNA用无DNase/RNase的水(Gibco)稀释10倍并加热至90℃且持续一分钟。
对于基因表达分析，使用qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR
Figure BDA0003222290020000702
LowROXTM(Quantabio)在双重复模式设置中进One Step RT-qPCR。以下TaqMan引物测定法用于qPCR：用内源性Gapdh对照品进行的Apob Mm_01545150_m1(FAM-MGB)、Mm99999915_g1(VIC-MGB)。所有引物集均购自Thermo Fisher Scientific。ApoB mRNA的相对表达水平显示为对照品(经PBS处理的细胞)的百分比，IC50值已使用GraphPad Prism7确定。
结果示在下表以及图3中。
化合物ID编号 IC<sub>50</sub>(uM,N＝2)
对照 0.07
#13 0.10
#14 0.23
#15 0.23
#16 0.21
#17 0.39
#18 0.39
#19 0.29
#20 0.19
#21 0.17
#22 0.21
#23 0.75
图3的图表中描绘的数据报告在下表中。
ApoB mRNA在原代小鼠肝细胞中的相对表达
Figure BDA0003222290020000711
Figure BDA0003222290020000721
实例6：含有与RNA和DNA杂交的膦酰基乙酸核苷间键的寡核苷酸的热熔解(Tm)
根据以下程序测量dsLNA/DNA或dsLNA/RNA异源双链体的变性点(热熔解＝Tm)：
等摩尔量的RNA或DNA和LNA寡核苷酸(对于ApoB，为20μM；对于Malat-1，为10μM)的溶液在缓冲液(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，pH 7.4))中产生10μM ds寡核苷酸(ApoB)和5μM ds寡核苷酸(Malat-1)。将溶液加热至95℃达2分钟(杂交)，然后冷却至室温达15分钟。使用来自Thermo Scientific的Evolution 600UV-Vis分光光度计记录在260nm的紫外吸光度(加热速率为1℃每分钟；读取速率为每分钟20次)。为了确定变性点(即熔点，Tm)，将熔解转换与LOWESS曲线拟合，并且拐点(＝Tm)由描述性拟合的一阶导数的峰位置确定。
ApoB寡核苷酸的Tm测量值(RNA和DNA)如下表所示。
Figure BDA0003222290020000722
Figure BDA0003222290020000731
根据本发明所述的化合物保留了对对照品的RNA和DNA的高亲和力。
实例7：靶向LTK细胞(成纤维细胞)中MALAT1 mRNA的选定寡核苷酸的体外效价和功效
已生成并相应测试了以下寡核苷酸：
化合物ID编号 序列 计算质量 测得质量
#24 GAGttacttgcca*A<sup>m</sup>CT 5321.3 5321.7
#25 GAGt*tacttgcca*A<sup>m</sup>CT 5363.3 5363.4
#26 GAGt°tacttgcca°A<sup>m</sup>CT 5331.3 5331.9
#27 GAGttacttgcca°A<sup>m</sup>CT 5305.2 5304.9
*相邻的核苷酸之间的PACE硫代磷酸酯修饰
°相邻的核苷酸之间的PACE磷酸二酯修饰
A、G、mC、T代表LNA核苷酸
a、g、c、t代表DNA核苷酸
所有其他键均制备为硫代磷酸酯
Figure BDA0003222290020000732
Figure BDA0003222290020000741
以一定范围内的浓度，利用gymnotic摄取在小鼠成纤维细胞(LTK细胞)中对靶向Malat-1的上述化合物进行测试72小时，以确定化合物效价(IC50)。
LTK细胞的浓度范围：50μM，1/2log稀释，8个浓度。
使用qPCR(标准化至GAPDH水平)量化Malat1的RNA水平并确定IC50值。
IC50结果如上表中所示，表明这种化学修饰在靶标敲低方面具有良好的耐受性(如此处针对疾病相关骨骼肌细胞所举例说明的)。
实例8：以15mg/kg的剂量测量心脏中的目标mRNA水平(Malat1)
在第1、2和3天(n＝5)以三剂皮下给予小鼠(C57/BL6)15mg/kg剂量的寡核苷酸。在第8天处死小鼠，并测量心脏的MALAT-1RNA减少。以3*15mg/kg和3*30mg/kg的两种剂量施用母体化合物。
结果在图4中示出。
体内结果表明，Thio-PACE修饰的化合物#24在敲低心脏中的MALAT-1方面的效价上是参考化合物的大约两倍(15mg/kg剂量与参考化合物的30mg/kg剂量的功效相同)。具有在位置12引入的另外的硫代-PACE修饰的化合物#25显示出低于#24的功效，但仍优于参考化合物。相应的Oxo-PACE类似物(#26)显示出显著降低的活性。
观察到根据本发明所述的单链反义寡核苷酸在体内对功效的重大影响。应当注意，根据本发明所述的寡核苷酸的剂量仅为参考剂量的50％。
实例9：MOE PACE单体合成
9.1.1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-溴乙酸酯
Figure BDA0003222290020000742
将2-溴乙酰溴(14.7g,6.31mL,72.6mmol,Eq:1.2)添加到含有甲苯(67.2mL)的250mL圆底烧瓶中。一边搅拌，一边缓慢添加3-羟基-3-甲基丁腈(6g,6.28ml,60.5mmol,Eq:1)。圆底烧瓶装有Friedrich冷凝器和通向分酸器(含有NaOH水溶液)的干燥管。将反应混合物加热至回流并回流过夜。使反应冷却至室温，然后混合物在真空中浓缩，得到油状物。通过Combiflash色谱法使用通过以乙酸乙酯/己烷作为梯度对油状粗产物进行纯化，产物在30％乙酸乙酯的己烷溶液中洗脱，得到1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(8.14g，37mmol，58％产率)。1H NMR(CHLOROFORM-d,300MHz)δ3.8(s,2H),2.9(s,2H),1.6(s,6H).
9.2.1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯
Figure BDA0003222290020000751
无水THF(69.4ml)、1-氯-N,N,N',N’-四异丙基磷烷二胺(7.75g,29mmol,Eq:1)和磁力搅拌棒添加到250mL圆底烧瓶(处于已塞住的状态)中，搅拌溶液直至膦溶解。溶解后，添加无水乙醚(41.6ml)。将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-溴乙酸酯(7.03g,32mmol,Eq:1.1)置于100mL圆底烧瓶中，然后添加无水THF(34.7ml)。将锌(2.85g,43.6mmol,Eq:1.5)、无水乙醚(22.2ml)和磁力搅拌棒置于装有Friedrich冷凝器的500mL三颈圆底烧瓶中。将膦(36mL)和溴乙酸溶液(10mL)添加到三颈圆底烧瓶中。然后将反应混合物在回流条件下加热直到发生明显的放热反应(稍微混浊的无色反应物变得澄清和呈淡黄色)。通过添加剩余的膦和溴乙酸溶液在回流条件下继续反应。添加之后，反应通过加热在回流条件下保持45分钟，使反应冷却至室温并通过31P NMR分析完成情况。在δ＝135ppm处的起始材料转化为在δ＝48ppm处的单一产物。冷却的反应混合物在真空中浓缩，以得到粘性油状物。用无水庚烷溶解所得粘性油状物。然后将形成的固体溶解在乙腈中，并且将该溶液用无水庚烷萃取两次。通过31P NMR分析乙腈溶液在δ＝48ppm处的产物缺失并丢弃。合并所有庚烷馏分(顶层)并在真空中浓缩，以得到淡黄色油状物。然后在高真空下干燥过夜。干燥过夜后，所得产物为良好的白色固体(7.096g，19mmol，62％产率)。1H NMR(CHLOROFORM-d,300MHz)δ3.3-3.5(m,4H),2.9(s,2H),2.7(d,2H),1.60(s,6H),1.3(m,24H).
9.3.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[外消旋-(2R,5R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-(2-甲氧基乙氧基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代嘧啶-1-基)氧戊环-3-基]氧基膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000761
将5-甲基-1-[外消旋-(2R,5R)-4-羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)-5-[[外消旋-(2E)-1,1-双(4-甲氧基苯基)-2-[外消旋-(Z)-丙-1-烯基]戊-2,4-二烯酰氧基]甲基]氧戊环-2-基]嘧啶-2,4-二酮(800mg,1.29mmol,Eq:1)溶解于无水DCM(16.2ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(721mg,1.94mmol,Eq:1.5)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将4,5-DCI(122mg,1.03mmol,Eq:0.8)添加到反应混合物中。然后将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31P NMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)分析反应程度。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(105mg,144μl,1.03mmol,Eq:0.8)猝灭反应。5分钟后，使用旋转蒸发器将反应混合物在真空中浓缩成粘性油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对粘性油状物进行再溶解，然后添加到用80/20:乙酸乙酯/庚烷预平衡的硅胶柱的顶部以收集产物。合并含有产物的馏分，在旋转蒸发器上真空浓缩成泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解，然后逐滴添加到快速搅拌的无水庚烷中。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到736mg白色固体状的目标化合物(736mg，61％产率)。LCMS(ES+)发现：889.5g/mol。
9.4.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[外消旋-(2R,5R)-5-(6-苯甲酰胺基嘌呤-9-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-(2-甲氧基乙氧基)氧戊环-3-基]氧基膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000771
将外消旋-N-(9-((2R,5R)-5-((双(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)四氢呋喃-2-基)-9H-嘌呤-6-基)苯甲酰氨基(600mg,0.82mmol,Eq:1)溶解于无水DCM(10.2ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(457mg,1.23mmol,Eq:1.5)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将4,5-DCI(77.5mg,0.66mmol,Eq:0.8)添加到反应混合物中。然后将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31P NMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)分析反应程度。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(66.4mg,91.4μl,0.65mmol,Eq:0.8)猝灭反应。5分钟后，使用旋转蒸发器将反应混合物在真空中浓缩成粘性油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对粘性油状物进行再溶解，然后添加到用80/20:乙酸乙酯/庚烷预平衡的硅胶柱的顶部以收集产物。合并含有产物的馏分，在旋转蒸发器上真空浓缩成泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解，然后逐滴添加到快速搅拌的无水庚烷中。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到260mg白色固体状的目标化合物(260mg，32％产率)。LCMS(ES+)发现：1002.5g/mol。
9.5.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[外消旋-(2R,5R)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-(2-甲氧基乙氧基)-5-[2-(2-甲基丙酰基氨基)-6-氧代-1H-嘌呤-9-基]氧戊环-3-基]氧基膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000781
将2-甲基-N-[6-氧代-9-[外消旋-(2R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)氧戊环-2-基]-1H-嘌呤-2-基]丙酰胺(700mg,0.98mmol,Eq:1)溶解于无水DCM(12.3ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(546mg,1.47mmol,Eq:1.5)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将4,5-DCI(93mg,0.79mmol,Eq:0.8)添加到反应混合物中。然后将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31PNMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)分析反应程度。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(80mg,109μl,0.79mmol,Eq:0.8)猝灭反应。5分钟后，使用旋转蒸发器将反应混合物在真空中浓缩成粘性油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对粘性油状物进行再溶解，然后添加到用乙酸乙酯预平衡的硅胶柱的顶部以收集产物。合并含有产物的馏分，在旋转蒸发器上真空浓缩成泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解，然后逐滴添加到快速搅拌的无水庚烷中。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到520mg白色固体状的目标化合物(520mg，49％产率)。LCMS(ES+)发现：984.5g/mol。
9.6.(1-氰基-2-甲基丙烷-2-基)2-[[二(丙烷-2-基)氨基]-[外消旋-(2R,5R)-5-(4-苯甲酰胺基-5-甲基-2-氧代嘧啶-1-基)-2-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-(2-甲氧基乙氧基)氧戊环-3-基]氧基膦基]乙酸酯
Figure BDA0003222290020000782
将N-[5-甲基-2-氧代-1-[外消旋-(2R,5R)-5-[[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]甲基]-4-羟基-3-(2-甲氧基乙氧基)氧戊环-2-基]嘧啶-4-基]苯甲酰氨基(950mg,1.32mmol,Eq:1)溶解于无水DCM(16.5ml)中，然后将1-氰基-2-甲基丙烷-2-基2-(双(二异丙基氨基)膦基)乙酸酯(733mg,1.97mmol,Eq:1.5)添加到反应混合物中。在反应组分完全溶解后，将4,5-DCI(124mg,1.05mmol,Eq:0.8)添加到反应混合物中。然后将反应混合物于室温在氩气下搅拌过夜，并通过31PNMR和硅胶TLC(用乙酸乙酯洗脱)分析反应程度。通过在TLC上点对点转化为更快洗脱的产物，并且通过乙酸膦基二胺31P NMR信号的完全丧失，确定反应已完成。完成后，通过添加三乙胺(107mg,147μl,1.05mmol,Eq:0.8)猝灭反应。5分钟后，使用旋转蒸发器将反应混合物在真空中浓缩成粘性油状物。在最小体积的乙酸乙酯中对粘性油状物进行再溶解，然后添加到用80/20:乙酸乙酯/庚烷预平衡的硅胶柱的顶部以收集产物。合并含有产物的馏分，在旋转蒸发器上真空浓缩成泡沫状物，在最少量的无水DCM中对该泡沫状物进行再溶解，然后逐滴添加到快速搅拌的无水庚烷中。通过过滤分离出固态沉淀物并在真空中干燥过夜，得到722mg淡黄色固体状的目标化合物(722mg，55％产率)。LCMS(ES+)发现：992.4g/mol。
实例10：寡核苷酸合成
使用Bioautomation的MerMade 12自动化DNA合成仪合成寡核苷酸。使用带有通用连接基的受控孔玻璃支持物
Figure BDA0003222290020000791
以1μmol的规模进行合成。
在用于偶联标准DNA和LNA亚磷酰胺的标准循环程序中，用3％(w/v)二氯乙酸的CH2Cl2溶液按230μL三次施加进行DMT去保护105秒。用95μL的0.1M乙腈溶液(或对于LNA-MeC结构单元，为在乙腈/CH2Cl2 1:1中的溶液)和110μL的0.25M 5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-2H-四唑溶液(作为活化剂)偶联相应的亚磷酰胺三次并且偶联时间为180秒。使用0.1M 3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶中的溶液以200μL施加一次进行硫化3分钟。使用THF/pyr/H2O:88/10/2中的0.02M I2施加一次进行3分钟的氧化。使用THF/二甲基吡啶/Ac2O8:1:1(CapA,75μmol)和THF/N-甲基咪唑8:2(CapB,75μmol)处理70秒，进行封端。
用于引入MOE PACE的合成循环包括使用3％(w/v)二氯乙酸的CH2Cl2溶液按230μL施加三次进行DMT去保护105秒。新制备的MOE PACE亚磷酰胺与95μL 0.1M乙腈溶液和110μL的5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-2H-四唑的0.25M溶液(作为活化剂)偶联两次并且偶联时间为15分钟。使用0.1M的3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶中的溶液施加一次进行3分钟的硫化。使用THF/pyr/H2O:88/10/2中的0.02M I2施加一次进行3分钟的氧化。使用THF/二甲基吡啶/Ac2O 8:1:1(CapA,75μmol)和THF/N-甲基咪唑8:2(CapB,75μmol)处理70秒，进行封端。
合成后，使1.5％DBU在无水CH3CN中的溶液小心地数次通过色谱柱，以对二甲基氰乙基保护基团进行去保护并防止在去保护期间碱基的烷基化。然后使其在室温静置60分钟。然后，弃去溶液，并且用2-3mL无水CH3CN冲洗色谱柱。然后在氩气流下干燥。然后，将CPG小心地转移到4mL小瓶中，向小瓶中添加1mL的40％MeNH2的水溶液，并在55℃搅拌15分钟。
使用C18色谱柱通过RP-HPLC纯化对粗制DMT-on寡核苷酸进行纯化，随后用80％乙酸水溶液和乙醇沉淀或通过小柱纯化来去除DMT。MOE PACE亚磷酰胺在Basel合成。标准的亚磷酰胺以及用于固相合成的所有试剂是从Sigma Aldrich订购。
实例11：就剂量反应曲线而言，不同浓度的靶向人HeLa细胞中MALAT1 mRNA的寡核苷酸的体外效价和功效。
HeLa细胞系购自ATCC，并按照供应商的建议在37℃用5％CO2在加湿培养箱中保存。对于测定，以3000个细胞/孔的量接种在培养基中的96孔板中。在添加溶解于PBS中的寡核苷酸之前，将细胞培养24小时。寡核苷酸的浓度范围：最高浓度25μM，分8个步骤按照1:1稀释。添加寡核苷酸后三天，收获细胞。根据制造商的说明，使用PureLink Pro 96RNAPurification试剂盒(Thermo Fisher Scientific)萃取RNA，并在50μl水中洗脱。随后将RNA用无DNase/RNase的水(Gibco)稀释10倍并加热至90℃且持续一分钟。
对于基因表达分析，使用qScriptTMXLT One-Step RT-qPCR
Figure BDA0003222290020000801
LowROXTM(Quantabio)在双重复模式设置中进One Step RT-qPCR。以下TaqMan引物测定法用于qPCR：MALAT1、以内源性GAPDH对照品进行的Hs00273907_s1(FAM-MGB)。所有引物集均购自Thermo Fisher Scientific。MALAT1 mRNA的相对表达水平显示为对照品(经PBS处理的细胞)的百分比，IC50值已使用GraphPad Prism7根据来自n＝2个生物学副本的数据确定。
结果在下表中提供。
Figure BDA0003222290020000811
Figure BDA0003222290020000812
Figure BDA0003222290020000821
Figure BDA0003222290020000822
粗体字母t、a、g、c代表MOE修饰。
相邻的核苷酸之间的(ps)硫代磷酸酯修饰
相邻的核苷酸之间的(po)磷酸二酯修饰
*相邻的核苷酸之间的PACE硫代磷酸酯修饰
°相邻的核苷酸之间的PACE磷酸二酯修饰
A、G、mC、T代表LNA核苷酸
a、g、c、t代表DNA核苷酸
所有其他键均制备为硫代磷酸酯。
Figure IDA0003222290060000011

Claims (37)

1.一种单链反义缺口聚物寡核苷酸或其药用盐，其包含至少一个式(I)的二核苷
Figure FDA0003222290010000011
其中(A1)和(A2)中的一者为糖修饰的核苷且另一者为糖修饰的核苷或DNA核苷，并且A为氧或硫。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中(A1)和(A2)中的一者为糖修饰的核苷且另一者为DNA。
3.根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中(A1)和(A2)两者同时都为糖修饰的核苷。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的寡核苷酸，其中所述糖修饰的核苷独立地为2’糖修饰的核苷。
5.根据权利要求4所述的寡核苷酸，其中所述2’糖修饰的核苷独立地选自：2’-烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基-RNA；2’-烷氧基烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基乙氧基-RNA；2’-氨基-DNA；2’-氟-RNA；或2’-氟-ANA。
6.根据权利要求4所述的寡核苷酸，其中所述2’糖修饰的核苷是LNA核苷。
7.根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中所述LNA核苷独立地选自β-D-氧基LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA和ENA，特别是β-D-氧基LNA。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的寡核苷酸，其包含选自磷酸二酯核苷间键、硫代磷酸酯核苷间键以及如权利要求1中所定义的核苷间键的另外的核苷间键。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的寡核苷酸，其包含选自硫代磷酸酯核苷间键以及如权利要求1中所定义的核苷间键的另外的核苷间键。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的寡核苷酸，其包含介于1个和15个之间、特别地介于1个和5个之间、更特别地为1个、2个、3个、4个或5个的如权利要求1中所定义的式(I)的二核苷。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述另外的核苷间键全部为式-P(＝S)(OR)O2-的硫代磷酸酯核苷间键，其中R为氢或磷酸酯保护基团。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的寡核苷酸，其包含选自DNA核苷、RNA核苷和糖修饰的核苷的另外的核苷。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的寡核苷酸，其中一个或多个核苷为核碱基修饰的核苷，诸如包含5-甲基胞嘧啶核碱基的核苷。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的寡核苷酸，其中至少一个如权利要求1中所定义的式(I)的二核苷在所述反义缺口聚物寡核苷酸的侧翼区域内或位于所述反义缺口聚物寡核苷酸的缺口区域与所述侧翼区域之间。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的寡核苷酸，其中所述缺口聚物寡核苷酸为LNA缺口聚物、混合型翼缺口聚物或2’-取代的缺口聚物，特别是2’-O-甲氧基乙基缺口聚物。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义缺口聚物寡核苷酸包含式5’-F-G-F’-3’的连续核苷酸序列，其中G为能够募集核糖核酸酶H的5个至18个核苷的区域，并且所述区域G在5’和3’旁侧分别是侧翼区域F和F’，其中区域F和F’独立地包含1个至7个2’-糖修饰的核苷酸或由其组成，其中与区域G相邻的区域F的核苷为2’-糖修饰的核苷并且其中与区域G相邻的区域F’的核苷为2’-糖修饰的核苷。
17.根据权利要求16所述的寡核苷酸，其中所述至少一个如权利要求1中所定义的式(I)的二核苷定位在区域F或F’内，或定位在区域G和区域F之间，或定位在区域G和区域F’之间。
18.根据权利要求16或17所述的寡核苷酸，其中在区域F或区域F’内或在区域F和F’两者内的所述2’-糖修饰的核苷独立地选自：2’-烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基-RNA；2’-烷氧基烷氧基-RNA，特别是2’-甲氧基乙氧基-RNA；2’-氨基-DNA；2’-氟-RNA；2’-氟-ANA；和LNA核苷。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的寡核苷酸，其中在区域F或区域F’内或在区域F和F’两者内的全部的所述2’-糖修饰的核苷都是LNA核苷。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的寡核苷酸，其中区域F或区域F’或区域F和F’两者包含至少一个LNA核苷和至少一个DNA核苷。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的寡核苷酸，其中区域F或区域F’或区域F和F’两者包含至少一个LNA核苷和至少一个非LNA 2’-糖修饰的核苷，诸如至少一个2’-甲氧基乙氧基-RNA核苷。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的寡核苷酸，其中所述缺口区域G包含5个至16个，特别地包含8个至16个，更特别地包含8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个连续DNA核苷。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的寡核苷酸，其中区域F和区域F’的长度独立地为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个核苷。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的寡核苷酸，其中区域F和区域F’各自独立地包含1个、2个、3个或4个LNA核苷。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的寡核苷酸，其中所述LNA核苷独立地选自β-D-氧基LNA、6’-甲基-β-D-氧基LNA和ENA。
26.根据权利要求16至25中任一项所述的寡核苷酸，其中所述LNA核苷为β-D-氧基LNA。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸或其连续核苷酸序列(F-G-F’)的长度为10个至30个核苷酸，长度特别地为12个至22个核苷酸，更特别地为14个至20个寡核苷酸。
28.根据权利要求16至27中任一项所述的寡核苷酸，其中所述缺口聚物寡核苷酸包含式5’-D’-F-G-F’-D”-3’的连续核苷酸序列，其中F、G和F’如权利要求17至28中任一项所定义，并且其中区域D’和区域D”各自独立地由0个至5个核苷酸组成，特别地由2个、3个或4个核苷酸组成，所述核苷酸特别是DNA核苷酸，诸如磷酸二酯连接的DNA核苷。
29.根据权利要求16至28中任一项所述的寡核苷酸，其中每个侧翼区域F和F’独立地包含1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个，特别地一个如权利要求1中所定义的二核苷。
30.根据权利要求16至29中任一项所述的寡核苷酸，其包含总计一个如权利要求1中所定义的二核苷。
31.根据权利要求30所述的反义缺口聚物寡核苷酸，其中如权利要求1中所定义的二核苷定位在区域F’内或定位在区域G与区域F’之间。
32.根据权利要求1至32中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸能够募集人核糖核酸酶H1。
33.一种根据权利要求1至32中任一项所述的寡核苷酸的药用盐，特别是钠盐、钾盐或铵盐。
34.一种缀合物，所述缀合物包含根据权利要求1至33中任一项所述的寡核苷酸或药用盐以及与所述寡核苷酸或所述药用盐共价连接的至少一个缀合物部分，任选地经由连接基部分连接。
35.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至34中任一项所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物以及治疗惰性载体。
36.一种根据权利要求1至35中任一项所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物，其作为治疗活性物质使用。
37.如前所述的本发明。
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RICHARD N. THRELFALL 等: ""Synthesis and biological activity of phosphonoacetate- and thiophosphonoacetate-modified 2\'-O-methyl oligoribonucleotides"", 《ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY》, vol. 10, 31 December 2012 (2012-12-31), pages 747 *
付洁 等: ""反义寡核苷酸药动学研究进展"", 《中国新药杂志》, vol. 27, no. 21, 31 December 2018 (2018-12-31), pages 2534 - 2543 *

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