CN113466111A - 一种单细胞分析系统及方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光镊和共聚焦上转换荧光成像相联用的单细胞分析系统，包括沿光路设置的准直器、爬升架、扩束系统、望远镜系统、倒置荧光显微镜、高数值孔径物镜及细胞培养专用小室，还包括耦合有980 nm近红外连续激光器的共聚焦扫描成像模块和基于面阵成像器件的荧光信号采集器，还公开了分析方法，首先通过生物传感策略特异性标记贴壁细胞内的待测生物分子，然后将细胞进行消化处理并分散于样品室内，之后借助光镊捕获单个悬浮细胞并同时实现该细胞的上转换荧光高分辨成像，最后通过特定生化试剂改变细胞的生理状态，监测胞内待测物含量的实时变化情况，本方法具有成像稳定性高、灵敏度高、背景信号低、抗干扰能力强、样品用量少等优点。
Description
技术领域
本发明属于单细胞分析技术领域，特别涉及一种将光镊技术、共聚焦扫描技术、上转换荧光成像相联用的单细胞分析系统，以及其方法和应用。
背景技术
细胞作为生物体结构和功能的基本单位，是了解生命过程的基础研究对象。由于单个细胞内的物质组成含量很低（通常在zmol～fmol之间），所以目前常用的细胞组分分析技术如PCR扩增、流式细胞术等，大多是测定细胞群体所表达的相关化学和生物学信息，也就是只能给出一个稳态的平均结果。但是，细胞在增殖、分化和代谢等生理过程中受到的内外多种因素会造成细胞之间存在明显的个体差异，即使是同源的两个细胞，细胞内的物质组成和含量也会有区别，由此导致这种群体分析在很多时候会掩盖细胞的差异性，从而无法提供更全面的细胞信息。因此，发展有效的单细胞分析技术有利于揭示细胞的异质性和特定生理行为，对探究生命活动的本质与规律具有重要意义。
由于细胞在生长过程中会发生物质交换，即相邻细胞质膜之间产生相互联系协同作用，因此在传统器皿中培养出的细胞存在较明显的“细胞连接”现象。在实际操作中，这种细胞间距的不可控不利于在显微镜平台上对独立的单细胞进行分析。因此，需将细胞进行消化处理以实现其在溶液中的独立分散。对于消化处理后的细胞，其在液相环境中的形貌一般为球形，并且呈悬浮状态，即类似于微米级的透明小球。此时，由于细胞周围液体产生的粘滞力会影响细胞的悬浮状态，使得很多细胞会脱离成像焦面，这样不仅无法形成稳定的荧光激发条件，而且不能保证能始终精准地定位同一个待分析细胞。
自美国科学家Ashkin等提出“光镊”这一概念以来，其在生物系统中的应用就受到了广泛的关注。简单来说，光镊就是通过一束高度聚焦的高斯激光束对微观物体进行捕获和操控的“光学镊子”，其基本原理在于光与微观物体之间发生动量交换所产生的力学效应。由于光镊借助了光的无形性和穿透性，并且产生的梯度力仅为皮牛顿量级，所以该技术可有效克服溶液粘滞力对细胞悬浮状态的干扰并实现对待分析细胞的精准定位，即将单个细胞始终稳定地捕获于激光聚焦焦点处。这样不仅能保证恒定的荧光激发条件，而且不会对细胞造成任何接触性损伤，从而更加有助于对单个细胞进行长时间的研究。因此，将光镊作为辅助成像手段可为单细胞分析领域提供新的技术支持。
上转换荧光能将处于近红外波段的激发光转换为可见光发射，使得其在细胞成像中能有效避免生物组织的背景信号干扰（如自发荧光和散射光）。上转换纳米材料（UCNP）通常是由具有光学惰性的主体基质和具有光学活性的三价稀土离子所形成的发光中心组成。其中，稀土离子4f轨道上丰富的阶梯状亚稳态能级使得上转换荧光是一种“非线性”的连续光学吸收过程，即连续吸收多个低能量的激发光子。此外，UCNP本身的纳米结构和材料组成元素还赋予了它发光光谱窄、反斯托克斯位移大、稳定性好（几乎无光漂白效应）、生物毒性低等优点。
因此，向传统共聚焦荧光显微镜系统内进一步引入上转换荧光成像可显著增强其复杂生物样品中的抗干扰能力。
发明内容
本发明的目的之一是针对现有技术存在的不足，构建一种将光镊和共聚焦上转换荧光成像相联用的分析系统，应用于单个悬浮细胞内各种生物分子的实时原位动态检测。
为实现以上目标，本发明所涉及的一种光镊和共聚焦上转换荧光成像相联用的单细胞分析系统，包括沿光路设置的准直器、爬升架、扩束系统、望远镜系统、内部有二向色镜的倒置荧光显微镜、高数值孔径物镜及细胞培养专用小室，所述的爬升架由平行设置的近红外反射镜一和近红外反射镜二组成，所述的扩束系统由双凸面透镜一和双凸面透镜二组成，所述的望远镜系统由等焦距的透镜三和透镜四组成，所述的细胞培养专用小室设置在电控载物台上，电控载物台上方有白光LED灯；近红外连续高斯激光束经准直器准直后依次经过爬升架上的近红外反射镜一和近红外反射镜二进行轴向高度调整，进入扩束系统进行光斑扩束，再进入望远镜系统进行捕获焦面调节，被二向色镜反射后通过高数值孔径物镜聚焦至细胞培养专用小室内形成光镊，当移动电控载物台使液相环境中游离的单个悬浮细胞落入光阱中，即可实现光学捕获；还包括耦合有980 nm近红外连续激光器的共聚焦扫描成像模块和基于面阵成像器件的荧光信号采集器，扩束系统、望远镜系统以及高数值孔径物镜构成荧光信号采集器光镊的形成部分，共聚焦扫描成像模块发出的含荧光信号扫描激光依次经过分束系统和高数值孔径物镜聚焦至细胞培养专用小室内，利用共聚焦扫描成像模块内的上转换荧光激发光源对细胞内被特异性标记的生物分子进行高分辨成像分析。
所述的一种单细胞分析系统，其近红外连续高斯激光束的波长为1000～1200 nm。
所述的一种单细胞分析系统，其荧光信号采集器为电子倍增CCD或CMOS等器件，优选数码相机。
所述的一种单细胞分析系统，其聚焦扫描成像模块还包括364/488/514 nm三档半导体激光器和电子倍增CCD成像检测器。
所述的一种单细胞分析系统，其细胞培养专用小室为透明高分子材料组成，温度需始终保持在37℃并保持5% CO2气流，容量为微升级。
本发明的目的之二是提供一种单细胞分析方法，基于上述分析系统，包括以下步骤：
步骤一，利用上转换纳米材料对贴壁生长细胞内的待测生物分子进行特异性标记；
步骤二，将一定量的基于换荧光共振能量转移模式设计的生物传感器与贴壁生长的细胞在细胞培养专用小室内孵育2小时，用磷酸缓冲液进行洗涤除去未被细胞内吞的传感器，随后将上述贴壁生长细胞用适量的胰酶进行消化处理，随后进行适当稀释后分散于细胞培养专用小室内；
步骤三，开启近红外连续高斯激光束和白光LED灯，通过在横向方向上移动电控载物台来移动细胞培养专用小室，待在液相环境中的单个悬浮细胞落入激光聚焦焦点处时实现光学捕获；
步骤四，关闭白光LED灯并换至荧光场，同时开启共聚焦扫描成像模块，利用共聚焦扫描成像模块内的980 nm近红外连续激光器对被捕获的细胞进行上转换荧光激发，选择荧光信号采集器对上述光镊捕获的悬浮细胞进行高分辨成像；
步骤五，向细胞培养专用小室内加入核酸、蛋白质、小分子抑制剂或促进剂来改变细胞的生理状态，同时实时采集被测细胞的上转换荧光图像，通过实时采集单个悬浮细胞的上转换荧光照片来有效监测胞内待测生物分子的含量变化；
步骤六，利用Image-J图像分析软件，对上述实时上转换荧光图像的灰度值进行测定，以此监测待测物含量的变化情况。
所述的一种单细胞分析方法，其步骤一中的上转换纳米材料基质采用NaYF4，NaLuF4，或NaGdF4，粒径大小为10～30 nm，采用Yb3+作为激活剂，采用Er3+，Tm3+或Ho3+作为敏化剂。
本发明的目的之三是提供上述单细胞分析方法用于分析核酸、蛋白质或小分子；所述的核酸为microRNA、messenger RNA或DNA；所述的蛋白质为分泌蛋白或水解酶；所述的小分子为ATP或痕量金属离子。
进一步，用于单个HeLa细胞内Ca2+含量的实时检测时，步骤如下
步骤1，采用高温热裂解法，以YCl3、YbCl3和ErCl3为前驱物，油酸为配体，十八烯为溶剂，在300℃下反应得到表面修饰油酸分子的上转换纳米材料，然后利用配体交换法制备得到表面修饰聚丙烯酸分子的上转换纳米材料；
步骤2，通过EDC/NHS活化反应，在室温下将末端修饰氨基基团的DNAzyme共价结合至上转换纳米材料表面；
步骤3，将表面偶联有DNAzyme的上转换纳米材料与末端修饰BHQ-1分子的底物链在95℃下进行退火处理，使底物链和DNAzyme发生杂交形成双链结构，通过980 nm激光激发猝灭上转换纳米材料的绿光发射；
步骤4，通过引入不同浓度的Ca2+来引发DNAzyme对于底物链的切割反应，使得BHQ-1分子远离上转换纳米材料表面，恢复之前被猝灭的上转换荧光，同时借助荧光分光光度计测定相应的上转换荧光变化情况，绘制工作曲线并计算灵敏度；
步骤5，将上述传感器与贴壁生长的HeLa细胞进行充分孵育后，除去未被细胞内吞的传感器，然后用胰酶进行消化处理，得到悬浮细胞，之后分散于细胞培养专用小室内，用光镊捕获单个HeLa细胞，并进行上转换荧光成像分析，以获取细胞内原始Ca2+含量，随后向细胞培养专用小室内加入ATP和胡萝卜素作为协同促进剂，实时采集后续的细胞荧光图像来跟踪细胞溶质内Ca2+的含量变化情况，实现单个悬浮细胞内Ca2+含量变化的实时监测。
进一步，用于单个MCF-7细胞内TK1 messengerRNA含量的实时检测时，步骤如下
步骤1，采用高温热裂解法，以LuCl3、YbCl3和HoCl3为前驱物，油酸为配体，十八烯为溶剂，在300℃下反应得到表面修饰油酸分子的上转换纳米材料，利用配体交换法制备表面修饰聚丙烯酸分子的上转换纳米材料；
步骤2，通过EDC/NHS活化反应，在室温下将两个末端分别修饰氨基基团和BHQ-2的发夹结构DNA链共价结合至上转换纳米材料表面，通过在980 nm激光激发猝灭上转换纳米材料的红光发射；
步骤3，引入不同浓度的TK1 messengerRNA，在95℃下进行退火，使得待测目标物与发夹结构DNA中的环结构进行杂交形成双链结构，使得BHQ-2分子远离上转换纳米材料表面，恢复之前被猝灭的上转换荧光，同时借助荧光分光光度计测定相应的上转换荧光变化情况，绘制工作曲线并计算灵敏度；
步骤4，将上述传感器与贴壁生长的MCF-7细胞进行充分孵育后，除去未被细胞内吞的传感器，然后用胰酶进行消化处理，得到悬浮细胞，之后分散于细胞培养专用小室内，用光镊捕获单个MCF-7细胞，并进行上转换荧光成像分析，以获取细胞内原始TK1messengerRNA含量，随后向细胞培养专用小室内加入β-雌二醇和它莫西芬，实时采集后续的细胞荧光图像来跟踪细胞溶质内TK1 messengerRNA的含量变化情况，实现单个悬浮细胞内TK1 messengerRNA含量变化的实时监测。
与现有单细胞分析方法相比，本发明具有如下特点和有益效果：
1，本发明将光镊技术引入共聚焦扫描成像系统，通过光镊产生的光阱梯度力来克服液体粘滞力，可对单个悬浮细胞实现一种非机械接触式的“无损”捕获，从而将待测细胞始终稳定于激光聚焦焦点，最终有效精准定位单个待分析细胞。
2，本发明在传统共聚焦扫描成像模块内进一步耦合上转换荧光成像，不仅拓展了现有共聚焦荧光显微镜的成像功能，还能有效避免细胞成像中的背景信号干扰，即实现一种“零背景”检测。
3，本发明通过生物传感策略，可实现细胞内待测生物分子的高灵敏特异性标记。
4，本发明选用灵敏度极高的成像器件作为荧光信号采集器，可进一步避免在生物传感设计上使用繁琐的信号放大策略。
5，本发明选用简单的白光LED灯实现明场照明并使用便利的数码相机进行明场记录，可进一步简化显微镜明场照明模块的构建。
附图说明
图1为本发明分析系统的构建示意图；
图2为基于工作曲线法的定量分析示意图；
图3为检测Ca2+的传感原理示意图；
图4为检测TK1mRNA的传感原理示意图。
各附图标记为：1—近红外连续高斯激光束，2—准直器，3—爬升架，4—扩束系统，5—望远镜系统，6—显微镜，7—高数值孔径物镜，8—细胞培养专用小室，9—白光LED灯，10—共聚焦扫描成像模块，11—电控载物台，12—分束系统，13—荧光信号采集器。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
参照图1所示，本发明公开的一种光镊和共聚焦上转换荧光成像相联用的单细胞分析系统，包括近红外连续高斯激光束1、准直器2、平行设置在爬升架3上的近红外双反射镜、光镊形成模块、内部有二向色镜的倒置荧光显微镜6、耦合有上转换荧光激发光源的共聚焦扫描成像模块10、明场照明模块以及荧光信号采集器13。分析仪器构建系统包括近红外连续高斯激光束1、可实现上转换荧光激发的共聚焦扫描成像模块10、显微镜6、荧光信号采集器13以及明场照明模块。其中，近红外连续高斯激光束1作为单光阱光镊的捕获光源，光镊形成模块主要包括扩束系统4、望远镜系统5以及高数值孔径物镜7，扩束系统4由双凸面透镜一和双凸面透镜二组成，望远镜系统5由等焦距的透镜三和透镜四组成，显微镜6用于集成各类模块，共聚焦扫描成像模块10用于荧光信号的激发，需耦合980 nm近红外连续激光器以实现上转换荧光的激发，明场照明模块用于细胞光学捕获的实时观察，优选白光LED灯9，荧光信号采集器13用于细胞内部上转换荧光的实时记录，可以为电子倍增CCD或CMOS等器件，优选数码相机。图1为本发明分析仪器装置的具体构建示意图，下面结合图1对本装置作进一步说明。
波长为1000～1200 nm的近红外连续高斯激光束1首先经过准直器2准直后形成平行光，然后经过爬升架3上的近红外反射镜一和近红外反射镜二进行轴向高度调整，使得光束的高度能匹配显微镜平台。
扩束系统4、望远镜系统5以及高数值孔径物镜7构成荧光信号采集器13光镊的形成部分。上述调整的激光束随后经过由双凸面透镜一和双凸面透镜二组成的扩束系统4进行光斑扩束，使得激光光斑大小可以刚好充满显微镜6后方的高数值孔径物镜7的后瞳，以实现最佳的聚焦效果。
该激光束依次经过由等焦距的透镜三和透镜四组成的望远镜系统5进行轴向位置精密调节（以保证成像焦面与捕获焦面的一致性）再进入望远镜系统5进行捕获焦面调节，被倒置荧光显微镜6内部的二向色镜反射后通过高数值孔径物镜7高度聚焦至细胞培养专用小室8内，可借助光镊将单个悬浮细胞稳定地固定于激光聚焦焦点处。可使用特定生化试剂来改变细胞的生理状态，从而实现胞内生物分子含量的调控，当移动电控载物台11使液相环境中游离的单个悬浮细胞落入光阱中，即可实现光学捕获。其中细胞培养专用小室8为透明高分子材料组成，室内温度37℃并保持5%的CO2气流，容量为微升级。
共聚焦扫描成像模块10发出的含荧光信号扫描激光依次经过分束系统12和高数值孔径物镜7聚焦至细胞培养专用小室8内，利用共聚焦扫描成像模块10内的上转换荧光激发光源对细胞内被特异性标记的生物分子进行高分辨成像分析。
为进一步实现上转换荧光扫描成像，需在共聚焦扫描成像模块10内耦合上转换荧光激发光源。对于明场图像的观察，采用经聚焦的白光LED灯9作为照明场，为提高荧光信号的检测灵敏度，荧光信号采集器13可选用极为灵敏的面阵成像器件如电子倍增CCD或CMOS器件（将光信号转换为电信号）作为信号采集器，本实施例采用数码相机进行拍摄记录。
本发明采用高度聚焦的近红外连续高斯激光束1产生单光阱梯度力势阱，以此对单个悬浮细胞实现光学捕获。光纤耦合的1064 nm激光束首先经过准直器2准直形成光斑直径大小约为1 mm的平行光，然后经过爬升架3进行高度调节，随后经过扩束系统4进行扩束使得激光光斑大小可以刚好充满显微镜6的40倍油浸物镜（数值孔径为1.35）的后瞳，以实现最佳的聚焦效果。最后，该激光束依次经过望远镜系统5进行轴向位置精密调节以保证成像焦面与捕获焦面的一致性，然后经过二向色镜反射（反射波段为950～1250 nm），最后经过高数值孔径物镜7聚焦至细胞培养专用小室8内，即可形成光阱（衍射极限光斑大小约为1μm）。
对于共聚焦扫描成像部分，需在共聚焦扫描成像模块10内（已配备364 nm、488nm、514 nm三档半导体激光器、电子倍增CCD成像检测器以及相应的荧光信号采集模块）进一步耦合980 nm连续激光器来实现上转换荧光的激发。对于明场图像的观察，采用经透镜五聚焦的白光LED灯9作为照明场，并用数码相机进行拍摄记录。
本发明将光镊技术、共聚焦扫描技术、上转换荧光成像技术以及生物传感技术相结合，通过单光阱光镊将溶液中游离的单个悬浮细胞稳定地捕获于激光聚焦焦点处，同时借助耦合有上转换荧光成像功能的共聚焦扫描系统对该细胞内的各种生物分子进行高分辨实时原位分析。
使用上述光镊和共聚焦上转换荧光成像相结合的单细胞分析方法，包括以下步骤。
步骤一，利用UCNP对贴壁生长细胞内的待测生物分子进行特异性标记（通过简单的孵育方式即可）。采用生物传感策略特异性标记细胞内待检测的生物分子。上述UCNP的基质可为多种（如NaYF4，NaLuF4, NaGdF4等），其粒径大小为10～30 nm。同时，可选择Yb3+作为激活剂，Er3+、Tm3+或Ho3+作为敏化剂。
上述生物分子的特异性标记过程可通过生物传感策略（如基于UCNP的上转换荧光共振能量转移模式）来实现。
步骤二，将一定量的基于上转换荧光共振能量转移模式设计的生物传感器与贴壁生长的细胞在细胞培养专用小室8内孵育2小时，用磷酸缓冲液进行洗涤除去未被细胞内吞的传感器，随后将上述贴壁细胞用适量的胰酶进行消化处理，随后进行适当稀释后分散于样品室内。
步骤三，开启近红外连续高斯激光束1和白光LED灯9，通过电控载物台11来移动样品室，使悬浮细胞进入光镊形成的光阱中心，从而实现单细胞的光学捕获。
步骤四，关闭白光LED灯9并换至荧光场，同时开启共聚焦扫描成像模块10（选择上转换荧光激发光源）和荧光信号采集器13，以此对上述光镊捕获的悬浮细胞进行高分辨成像。
步骤五，向样品室内加入一定量的特定生化调控试剂（即核酸、蛋白质、小分子抑制剂或促进剂，改变细胞的生理状态），并同时实时采集被测细胞的上转换荧光图像，通过实时采集单个悬浮细胞的上转换荧光照片来有效监测胞内待测生物分子的含量变化。
步骤六，利用Image-J图像分析软件，对上述实时荧光图像的灰度值进行测定，以此监测待测物含量的实时变化情况。
上述单细胞分析方法的应用中，细胞内待测生物分子可为核酸、蛋白质、小分子等。上述胞内检测物可以为核酸（如microRNA、messenger RNA、DNA等）、蛋白质（各种分泌蛋白和水解酶等）、小分子（ATP、痕量金属离子等）等。
本发明中胞内待测物的高灵敏特异性标记可采用基于UCNP的上转换荧光共振能量转移模式来设计相应的生物传感器。其中，选用UCNP作为能量供体，而能量受体可选用常见的荧光猝灭基团（比如BHQ-1、BHQ-2等）。为考察上述荧光传感器的分析性能，可将标准物作为目标模型，评估其在灵敏度、特异性、稳定性、重现性等方面的参数。其中，灵敏度可通过发生能量转移过程前后的工作曲线（横坐标为目标物浓度，纵坐标为上转换荧光信号回升比率）来计算，特异性可选择其余非特异性生物分子作为研究对象，稳定性主要考察该传感器在复杂介质中的抗干扰能力，重现性可用日内和日间实验结果来验证。
图2为基于工作曲线法的定量分析示意图，共测量包括空白组在内的10个不同浓度待测物下的上转换荧光信号回升比率（每个浓度组需平行测定3次并计算其标准偏差）。回升比率会随着待测物浓度的增加而上升，并在一定浓度范围内得到一个良好的线性关系曲线。根据检出限的计算原理（3σ/k，其中σ表示空白组7次测量结果的标准偏差，k表示线性曲线的斜率），即可估算出该传感器的检出限。
待考察完外胞外分析性能之后，将一定量的传感器与贴壁生长的细胞在37°下孵育2小时，然后用磷酸缓冲液进行洗涤，除去未被细胞内吞的传感器。随后，用胰酶将上述细胞进行消化处理以得到悬浮细胞，并将一定数量的细胞分散于样品室内。最后，通过在横向方向上移动电控载物台11，使在液相环境中的悬浮细胞进入光镊形成的光阱中心，从而实现单细胞的光学捕获。与此同时，利用共聚焦扫描成像模块10内的980 nm连续激光对被捕获的细胞进行上转换荧光激发，并用Image-J软件来对能量供体的信号强度进行测定。对于目标待测物含量的调控，可向样品室内加入一定量的生化试剂以改变细胞的生理状态，并持续拍摄细胞上转换荧光图像，以此实现对胞内生物分子的动态原位监测。
下面列举实施例1～2对本发明提出的单细胞分析方法作进一步说明。
实施例1
单个HeLa细胞内Ca2+含量的实时检测：将NaYF4掺杂Yb3+和Er3+的UCNP（绿光发射）作为能量供体，BHQ-1分子作为能量受体，利用能特异性识别Ca2+的DNAzyme在UCNP表面构建荧光共振能量转移模式。具体如图3所示。
第一步，制备表面修饰聚丙烯酸分子（PAA）的UCNP。首先，采用高温热裂解法，以三种稀土氯化物（YCl3、YbCl3和ErCl3）为前驱物，油酸为配体，十八烯为溶剂，在300℃下反应得到表面修饰油酸分子的UCNP。然后，利用配体交换法，制备表面修饰PAA的UCNP。
第二步，UCNP表面共价偶联DNAzyme。通过EDC/NHS活化反应，在室温下将末端修饰氨基基团的DNAzyme共价结合至UCNP表面。
第三步，DNAzyme结合底物链。将上述表面偶联有DNAzyme的UCNP与末端修饰BHQ-1分子的底物链在95℃下进行退火处理，使底物链和DNAzyme发生杂交形成双链结构。此时，在980 nm激光激发下，UCNP和BHQ-1之间会发生荧光共振能量转移现象，从而猝灭UCNP的绿光发射。
第四步，评估上述生物传感器的胞外分析性能。通过引入不同浓度的Ca2+来引发DNAzyme对于底物链的切割反应，使得BHQ-1分子远离UCNP表面，从而恢复之前被猝灭的上转换荧光，同时借助荧光分光光度计测定相应的上转换荧光变化情况，绘制工作曲线并计算灵敏度。对于特异性的考察，可选择不同的金属离子以及其它生物分子作为研究对象。
第五步，单个悬浮细胞内Ca2+含量变化的实时监测。将上述传感器与贴壁生长的HeLa细胞进行充分孵育后，除去未被细胞内吞的传感器，然后用胰酶进行消化处理，得到悬浮细胞。之后，将上述悬浮细胞分散于样品室内，用光镊捕获单个HeLa细胞，并进行上转换荧光成像分析，以获取细胞内原始Ca2+含量。随后，向样品室内同时加入ATP和胡萝卜素作为协同促进剂，并实时采集后续的细胞荧光图像来跟踪细胞溶质内Ca2+的含量变化情况。此外，为研究不同细胞内目标分析物含量的差异性，可采用上述步骤对60个细胞分别进行单细胞荧光成像分析。
实施例2
单个MCF-7细胞内TK1 messengerRNA含量的实时检测：将NaLuF4掺杂Yb3+和Ho3+的UCNP（红光发射）作为能量供体，BHQ-2分子作为能量受体，利用发夹结构DNA链在UCNP表面构建荧光共振能量转移模式。具体如图4所示。
第一步，制备表面修饰PAA的UCNP。首先，采用高温热裂解法，以三种稀土氯化物（LuCl3、YbCl3和HoCl3）为前驱物，油酸为配体，十八烯为溶剂，在300℃下反应得到表面修饰油酸分子的UCNP。然后，利用配体交换法，制备表面修饰PAA的UCNP。
第二步，UCNP表面共价偶联发夹结构DNA。通过EDC/NHS活化反应，在室温下将两个末端分别修饰氨基基团和BHQ-2的发夹结构DNA链共价结合至UCNP表面。此时，在980 nm激光激发下，UCNP和BHQ-2之间会发生荧光共振能量转移现象，从而猝灭UCNP的红光发射。
第三步，评估上述生物传感器的胞外分析性能。通过引入不同浓度的TK1messengerRNA，在95℃下进行退火，使得待测目标物与发夹结构DNA中的环结构进行杂交形成双链结构。此时，BHQ-2分子会远离UCNP表面，以此恢复之前被猝灭的上转换荧光。同时，借助荧光分光光度计测定相应的上转换荧光变化情况，绘制工作曲线并计算灵敏度。对于特异性的考察，可选择不同生物分子作为研究对象。
第四步，单个悬浮细胞内TK1 messengerRNA含量变化的实时监测。将上述传感器与贴壁生长的MCF-7细胞进行充分孵育后，除去未被细胞内吞的传感器，然后用胰酶进行消化处理，得到悬浮细胞。之后，将上述悬浮细胞分散于样品室内，用光镊捕获单个MCF-7细胞，并进行上转换荧光成像分析，以获取细胞内原始TK1 messengerRNA含量。随后，向样品室内加入β-雌二醇和它莫西芬作为抑制剂或促进剂，并实时采集后续的细胞荧光图像来跟踪细胞溶质内TK1 messengerRNA的含量变化情况。此外，为研究不同细胞内目标分析物含量的差异性，可采用上述步骤对60个细胞分别进行单细胞荧光成像分析。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，以及部分运用的实施例，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种单细胞分析系统，其特征在于：包括沿光路设置的准直器（2）、爬升架（3）、扩束系统（4）、望远镜系统（5）、内部有二向色镜的倒置荧光显微镜（6）、高数值孔径物镜（7）及细胞培养专用小室（8），所述的爬升架（3）由平行设置的近红外反射镜一和近红外反射镜二组成，所述的扩束系统（4）由双凸面透镜一和双凸面透镜二组成，所述的望远镜系统（5）由等焦距的透镜三和透镜四组成，所述的细胞培养专用小室（8）设置在电控载物台（11）上，电控载物台（11）上方有白光LED灯（9）；近红外连续高斯激光束（1）经准直器（2）准直后依次经过近红外反射镜一和近红外反射镜二进行轴向高度调整，进入扩束系统（4）进行光斑扩束，再进入望远镜系统（5）进行捕获焦面调节，被二向色镜反射后通过高数值孔径物镜（7）聚焦至细胞培养专用小室（8）内形成光镊；还包括耦合有980 nm近红外连续激光器的共聚焦扫描成像模块（10）和基于面阵成像器件的荧光信号采集器（13），共聚焦扫描成像模块（10）发出的含荧光信号扫描激光依次经过分束系统（12）和高数值孔径物镜（7）聚焦至细胞培养专用小室（8）内，对细胞内被特异性标记的生物分子进行高分辨成像分析。
2.根据权利要求1所述的一种单细胞分析系统，其特征在于，所述近红外连续高斯激光束（1）的波长为1000～1200 nm。
3.根据权利要求1所述的一种单细胞分析系统，其特征在于，所述的荧光信号采集器（13）为电子倍增CCD或CMOS器件。
4.根据权利要求1所述的一种单细胞分析系统，其特征在于，所述的共聚焦扫描成像模块（10）还包括364/488/514 nm三档半导体激光器和电子倍增CCD成像检测器。
5.根据权利要求1所述的一种单细胞分析系统，其特征在于，所述的细胞培养专用小室（8）为透明高分子材料组成，室内温度37℃并保持5%的CO2气流，容量为微升级。
6.一种单细胞分析方法，基于权利要求1所述的分析系统，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，利用上转换纳米材料对贴壁生长细胞内的待测生物分子进行特异性标记；
步骤二，将基于换荧光共振能量转移模式设计的生物传感器与贴壁生长的细胞在细胞培养专用小室（8）内孵育2小时，用磷酸缓冲液进行洗涤除去未被细胞内吞的传感器，随后将上述贴壁生长细胞用胰酶进行消化处理以得到悬浮细胞，稀释后分散于细胞培养专用小室（8）内；
步骤三，开启近红外连续高斯激光束（1）和白光LED灯（9），通过电控载物台（11）来移动细胞培养专用小室（8），待单个悬浮细胞落入激光聚焦焦点处时实现光学捕获；
步骤四，关闭白光LED灯（9）并换至荧光场，同时开启共聚焦扫描成像模块（10），利用980 nm近红外连续激光器对被捕获的细胞进行上转换荧光激发，选择荧光信号采集器（13）对上述光镊捕获的悬浮细胞进行高分辨成像；
步骤五，向细胞培养专用小室（8）内加入核酸、蛋白质、小分子抑制剂或促进剂来改变细胞的生理状态，并实时采集被测细胞的上转换荧光图像；
步骤六，利用Image-J图像分析软件，对上述实时上转换荧光图像的灰度值进行测定，以此监测待测物含量的变化情况。
7.根据权利要求6所述的一种单细胞分析方法，其特征在于，所述步骤一中的上转换纳米材料基质采用NaYF4，NaLuF4或NaGdF4，粒径大小为10～30 nm；采用Yb3+作为激活剂；采用Er3+，Tm3+或Ho3+作为敏化剂。
8.权利要求6或7所述单细胞分析方法的应用，其特征在于，用于分析核酸、蛋白质或小分子；所述的核酸为microRNA、messenger RNA或DNA；所述的蛋白质为分泌蛋白或水解酶；所述的小分子为ATP或痕量金属离子。
9.根据权利要求8所述单细胞分析方法的应用，其特征在于，用于单个HeLa细胞内Ca2+含量的实时检测时，步骤如下
步骤1，采用高温热裂解法，以YCl3、YbCl3和ErCl3为前驱物，油酸为配体，十八烯为溶剂，在300℃下反应得到表面修饰油酸分子的上转换纳米材料，然后利用配体交换法制备得到表面修饰聚丙烯酸分子的上转换纳米材料；
步骤2，通过EDC/NHS活化反应，在室温下将末端修饰氨基基团的DNAzyme共价结合至上转换纳米材料表面；
步骤3，将表面偶联有DNAzyme的上转换纳米材料与末端修饰BHQ-1分子的底物链在95℃下进行退火处理，使底物链和DNAzyme发生杂交形成双链结构，通过980 nm激光激发猝灭上转换纳米材料的绿光发射；
步骤4，通过引入不同浓度的Ca2+来引发DNAzyme对于底物链的切割反应，使得BHQ-1分子远离上转换纳米材料表面，恢复之前被猝灭的上转换荧光，同时借助荧光分光光度计测定相应的上转换荧光变化情况，绘制工作曲线并计算灵敏度；
步骤5，将上述传感器与贴壁生长的HeLa细胞进行充分孵育后，除去未被细胞内吞的传感器，然后用胰酶进行消化处理，得到悬浮细胞，之后分散于细胞培养专用小室（8）内，用光镊捕获单个HeLa细胞，并进行上转换荧光成像分析，以获取细胞内原始Ca2+含量，随后向细胞培养专用小室（8）内加入ATP和胡萝卜素作为协同促进剂，实时采集后续的细胞荧光图像来跟踪细胞溶质内Ca2+的含量变化情况，实现单个悬浮细胞内Ca2+含量变化的实时监测。
10.根据权利要求8所述单细胞分析方法的应用，其特征在于，用于单个MCF-7细胞内TK1 messengerRNA含量的实时检测时，步骤如下
步骤1，采用高温热裂解法，以LuCl3、YbCl3和HoCl3为前驱物，油酸为配体，十八烯为溶剂，在300℃下反应得到表面修饰油酸分子的上转换纳米材料，利用配体交换法制备表面修饰聚丙烯酸分子的上转换纳米材料；
步骤2，通过EDC/NHS活化反应，在室温下将两个末端分别修饰氨基基团和BHQ-2的发夹结构DNA链共价结合至上转换纳米材料表面，通过在980 nm激光激发猝灭上转换纳米材料的红光发射；
步骤3，引入不同浓度的TK1 messengerRNA，在95℃下进行退火，使得待测目标物与发夹结构DNA中的环结构进行杂交形成双链结构，使得BHQ-2分子远离上转换纳米材料表面，恢复之前被猝灭的上转换荧光，同时借助荧光分光光度计测定相应的上转换荧光变化情况，绘制工作曲线并计算灵敏度；
步骤4，将上述传感器与贴壁生长的MCF-7细胞进行充分孵育后，除去未被细胞内吞的传感器，然后用胰酶进行消化处理，得到悬浮细胞，之后分散于细胞培养专用小室（8）内，用光镊捕获单个MCF-7细胞，并进行上转换荧光成像分析，以获取细胞内原始TK1messengerRNA含量，随后向细胞培养专用小室（8）内加入β-雌二醇和它莫西芬，实时采集后续的细胞荧光图像来跟踪细胞溶质内TK1 messengerRNA的含量变化情况，实现单个悬浮细胞内TK1 messengerRNA含量变化的实时监测。
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- 2021-07-29 CN CN202110860325.7A patent/CN113466111B/zh active Active
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