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CN113454111A - 抗体配制剂 - Google Patents

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CN113454111A
CN113454111A CN201980079282.XA CN201980079282A CN113454111A CN 113454111 A CN113454111 A CN 113454111A CN 201980079282 A CN201980079282 A CN 201980079282A CN 113454111 A CN113454111 A CN 113454111A
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antibody
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I.阿尔汀塔斯
D.萨蒂恩
R.拉德马克
P.帕伦
U.萨辛
F.吉塞克
A.穆伊克
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Debiotech SA
Genmab AS
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Abstract

本发明涉及结合剂的药物配制剂及其在药物中的用途。特别地，本发明涉及结合剂，例如结合人PD‑L1和结合人CD137的双特异性抗体的药物配制剂。此外，本发明涉及本发明的药物配制剂的用途以及生成药物配制剂的方法。

Description

抗体配制剂
发明领域
本发明涉及与PD-L1和CD137(4-1BB)结合的双特异性抗体。本发明提供了包含抗体的药物组合物以及该制剂在治疗中的用途。
发明背景
CD137(4-1BB，TNFRSF9)是肿瘤坏死因子(TNF)受体(TNFR)家族的成员。CD137是CD8+和CD4+T细胞、调节性T细胞(Treg)、自然杀伤(NK)和NKT细胞、B细胞和嗜中性粒细胞上的共刺激分子。在T细胞上，CD137不是组成型表达，而是在T细胞受体(TCR)激活后诱导。经由其天然配体4-1BBL或激动剂抗体的刺激导致使用TNFR相关因子(TRAF)-2和TRAF-1作为衔接物的信号传导。通过CD137的早期信号传导涉及K-63多泛素化反应，其最终导致核因子(NF)-κB和丝裂原激活蛋白(MAP)-激酶途径的激活。信号传导导致增加的T细胞共刺激、增殖、细胞因子产生、成熟和延长的CD8+T细胞存活。已显示针对CD137的激动性抗体在各种临床前模型中促进T细胞的抗肿瘤控制(Murillo et al.2008Clin.Cancer Res.14(21):6895-6906)。刺激CD137的抗体可以诱导T细胞的存活和增殖，从而增强抗肿瘤免疫应答。刺激CD137的抗体已在现有技术中公开，包括乌瑞鲁单抗(urelumab)，一种人IgG4抗体(WO2005035584)和乌托鲁单抗(utomilumab)，一种人IgG2抗体(Fisher et al.2012CancerImmunol.Immunother.61:1721-1733)。
程序性死亡配体1(PD-L1、PDL1、CD274、B7H1)是一种33kDa的单通过I型膜蛋白。基于可变剪接，已经描述了PD-L1的三种同等型。PD-L1属于免疫球蛋白(Ig)超家族，并且含有一个Ig样C2型域和一个Ig样V型域。新鲜分离的T和B细胞表达的PD-L1量可忽略不计，并且一定分数(约16％)的CD14+单核细胞组成性表达PD-L1。然而，已知干扰素-γ(IFNγ)上调肿瘤细胞上的PD-L1。
PD-L1通过以下方式阻碍抗肿瘤免疫性：1)通过与其在活化的T细胞上的受体，即程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)(CD279)结合来耐受肿瘤反应性T细胞；2)通过经由肿瘤细胞表达的PD-L1的PD-1信号转导使肿瘤细胞对CD8+T细胞和Fas配体介导的裂解有抗性；3)通过经由T细胞表达的CD80(B7.1)的反向信号传导耐受T细胞；和4)促进诱导的T调节细胞的发育和维持。PD-L1在许多人癌症中表达，包括黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和结肠癌(Latchmanet al.,2004Proc Natl Acad Sci USA 101,10691-6)。
PD-L1阻断抗体已在几种已知过表达PD-L1的癌症(包括黑色素瘤，NSCLC)中显示出临床活性。例如，阿特珠单抗(atezolizumab)是针对PD-L1的人源化IgG1单克隆抗体。目前它在临床试验中作为针对多种适应症的免疫疗法，包括各种类型的实体瘤(参见例如Rittmeyer等，2017Lancet389:255-265)并且已批准用于非小细胞肺癌和膀胱癌适应症。FDA已经批准阿利库单抗(Avelumab)(一种PD-L1抗体)(Kaufman et al LancetOncol.2016；17(10):1374-1385)用于治疗12岁及以上的具有转移性Merkel细胞癌的成人和儿童患者，并且目前在针对多种癌症适应症的临床试验中，包括膀胱癌、胃癌、头颈癌、间皮瘤、NSCLC、卵巢癌和肾癌。德瓦鲁单抗(Durvalumab)(一种PD-L1抗体)批准用于局部晚期或转移性尿路上皮癌适应症，并且在多种实体瘤和血液癌中的临床开发中(参见例如Massard et al.,2016J Clin Oncol.34(26):3119-25)。已经在WO2004004771、WO2007005874、WO2010036959、WO2010077634、WO2013079174、WO2013164694、WO2013173223和WO2014022758中描述了其他抗PD-L1抗体。
Horton等人(J Immunother Cancer.2015；3(Suppl 2):O10)公开了激动性4-1BB抗体与中和性PD-L1抗体的组合。
乌托鲁单抗和阿利库单抗的组合疗法目前正在临床中进行测试(Chen et al.,JClin Oncol 35,2017suppl；abstr TPS7575以及临床试验NCT02554812)。
然而，尽管本领域取得了进步，但仍需要能够结合PD-L1和CD137两者的多特异性抗体及其药物配制剂。
发明概述
本发明的一个目的是提供药物配制剂，其包含
a.结合剂，所述结合剂包含结合人CD137(4-1BB)的第一抗原结合区和结合人PD-L1(CD274)的第二抗原结合区，
-所述第一抗原结合区，其包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，所述第一重链可变区包含存在于以SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述第一轻链可变区包含存在于以SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，和
-所述第二抗原结合区，其包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述第二重链可变区包含存在于以SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述第二轻链可变区包含存在于以SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；
b.组氨酸缓冲剂
c.约100至约400mM的糖，和
d.约0.001至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂；
并且具有约4.5至约6.5之间的pH。
在另一方面，本发明涉及如上所定义的药物配制剂，用作药物。
在另一方面，本发明涉及如上所定义的药物配制剂，用于治疗癌症。
在另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如上所定义的药物配制剂。
在另一方面，本发明涉及诱导表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞死亡或抑制其生长和/或增殖的方法，该方法包括向有此需要和/或带有所述肿瘤细胞的受试者施用有效量的如上定义的药物配制剂。
提供以上定义的药物配制剂在制备药物如治疗癌症的药物的用途也在本发明的范围内，例如以实体瘤的存在为特征的癌症或选自下组的癌症：黑素瘤，卵巢癌，肺癌，结肠癌和头颈癌。
最后，本发明提供了生成本发明药物配制剂的方法，该方法包括提供如本文所定义的结合剂并将其与以下物质组合：
a.组氨酸缓冲剂
b.约100至约400mM的糖，以及
c.约0.001至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂；
在约4.5至约6.5之间的pH。
附图简述
图1：人、非洲象和野猪CD137的序列比对。非洲象和野猪CD137中与人序列中的氨基酸不同的氨基酸以黑色突出显示。
图2：CD137改组构建体，其含有非洲象(改组5)或野猪(改组1-4、6)CD137域。
图3：在HEK293-T17细胞上的CD137改组构建体表达。
用CD137改组构建体转染HEK293-T17细胞。使用识别人、野猪和非洲象CD137的多克隆抗CD137抗体，通过流式细胞术测量构建体的细胞表面表达。
图4：抗体CD137-009与HEK293-T17细胞上表达的CD137改组构建体的结合。用CD137改组构建体和用人CD137(hCD137 wt)、非洲象或野猪CD137转染HEK293-T17细胞。通过流式细胞术测量抗体CD137-009与HEK293-T17细胞上表达的这些构建体的结合。用多克隆抗CD137抗体染色显示为对照。
图5：单价抗体b12-FEALxPD-L1-547-FEAR对PD-1/PD-L1相互作用的作用。在PD-1/PD-L1抑制生物测定法中确定了b12-FEALxPD-L1-547-FEAR的作用。显示的数据是一个代表性实验的相对于对照(不添加抗体)的诱导倍数。
图6：CD137xPD-L1双特异性抗体的预期作用模式的示意图。(A)PD-L1在抗原呈递细胞(APC)以及肿瘤细胞上表达。PD-L1与表达负调节分子PD-1的T细胞结合有效地超越了T细胞活化信号，并最终导致T细胞抑制。(B)添加CD137xPD-L1双特异性抗体后，经由PD-L1特异性臂阻断抑制性PD-1:PD-L1相互作用，并且同时双特异性抗体通过细胞间相互作用提供对T细胞上表达的CD137的激动性信号传导，导致强烈的T细胞共刺激。
图7：在具有活性PD-1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定法中通过CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR对PD-1/PD-L1介导的T细胞抑制的释放和另外的CD8+T细胞增殖的共刺激。在存在0.1μg/mL和0.02μg/mL CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR、b12-FEALxPD-L1-547-FEAR或b12对照抗体的情况下，将用密蛋白(claudin)-6特异性TCR-和PD-1-体外翻译(IVT)-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞与经密蛋白-6-IVT-RNA电穿孔的未成熟树突细胞一起温育5天。通过流式细胞术测量CD8+T细胞增殖。显示的数据是(A和C)来自两个不同供体的代表性CFSE直方图，以及(B和D)如使用FlowJo软件计算的相应的分裂细胞百分比和增殖指数。(B)显示对来自(A)中代表性显示的供体1的数据的分析。(D)显示对来自(C)中代表性显示的供体2的数据的分析。误差条(SD)表示实验中的变化(三次重复，使用来自一个供体的细胞)。
图8：在具有活性PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定法中，双特异性抗体CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR的EC50值的分析。在存在CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR(从1至0.00015μg/mL的3倍连续稀释液)的情况下，将用密蛋白-6特异性TCR-和PD-1-IVT-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞与经密蛋白-6-IVT-RNA电穿孔的未成熟树突细胞一起温育5天。通过流式细胞术测量CD8+T细胞增殖。显示的数据是分裂细胞的百分比(空心菱形)和增殖指数(实心三角形)作为抗体浓度的函数。误差条(SD)表示实验中的变化(六次重复，使用来自一个供体的细胞)。通过非线性回归拟合曲线，并使用GraphPad Prism软件确定EC50值。
图9：在具有活性PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定法中，CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR与两种单价结合CD137抗体(CD137-009-FEALxb12-FEAR+b12-FEALxPD-L1-547-FEAR)或两种亲本抗体(CD137-009+PD-L1-547)的组合的比较。在存在0.25μg/mL(i)CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR，(ii)CD137-009-FEALxb12+b12-FEALxPD-L1-547-FEAR，(iii)CD137-009-FEALxb12，(iv)b12-FEALxPD-L1-547-FEAR，(v)CD137-009+PD-L1-547，(vi)CD137-009，(vii)PD-L1-547或(viii)b12对照抗体的情况下，将用密蛋白-6特异性TCR-和PD1-IVT-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞与经密蛋白-6-IVT-RNA电穿孔的未成熟树突细胞一起温育五天。通过流式细胞术测量CD8+T细胞增殖。显示的数据为(A)代表性CFSE直方图，以及(B和C)如使用FlowJo软件计算的相应的分裂细胞百分比平均值和增殖指数。误差条(SD)表示实验中的变化(三次重复，使用来自一个供体的细胞)。
图10：通过CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR进行来自人非小细胞肺癌组织切除的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的离体扩增。将来自切除组织的肿瘤片与10U/mL IL-2和指定浓度的CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR一起培养。培养10天后，收获细胞并通过流式细胞术分析。(A)TIL计数为与未处理对照相比的倍数扩增；(B)CD3+CD8+T细胞计数为与未处理对照相比的倍数扩增；(C)CD3+CD4+T细胞计为与未处理对照相比的倍数扩增；(D)CD3-CD56+NK细胞计数为与未处理对照相比的倍数扩增。条代表n＝5个单独孔的平均值±SD，其中每孔两个肿瘤片作为起始材料。
图11：在OT-1过继细胞转移设置中，mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A小鼠替代抗体对抗原特异性T细胞增殖的作用。从供体小鼠分离的卵清蛋白(OVA)特异性OT1+Thy1.1+双阳性细胞毒性T细胞经眶后(r.o.)注射入原生C57BL/6受体小鼠中。过继细胞转移后次日，用100μg OVA作为抗原刺激物对受体小鼠进行r.o注射，随后每小鼠进行r.o.注射100μg或20μgmCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A、mCD137-3H3xb12或mPD-L1-MPDL3280Axb12抗体。注射PBS(在图中表示为单独的OVA)用作基线参考，且未处理的动物用作阴性对照。6天后，经由r.o.路径抽取100μL血液并针对Thy1.1+CD8+T细胞进行分析。显示的数据是(A)OT-1过继细胞转移实验概述的示意图，以及(B)第6天每个治疗组的Thy1.1+CD8+T细胞频率。正方形代表单个动物并且误差条(SD)表示实验中的变化(每组n＝5只小鼠)。使用单向方差分析与Tukey的多重比较检验进行统计分析；ns＝组之间无显著差异，***＝P<0.001。
图12：mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A小鼠替代抗体在皮下同基因CT26小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效。在肿瘤达到≥30mm3的体积后，用每肿瘤腹腔内注射20μg(i)mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A、(ii)mCD137-3H3xb12或(iii)mPD-L1-MPDL3280Axb12抗体或(iv)PBS处理带有皮下CT26肿瘤的雌性BALB/c小鼠。给药时间表为：前八次注射每2-3天一次，随后每7天注射一次，直到实验结束。在第29天，经由r.o.路径抽取100μL血液并对gp70特异性CD8+T细胞进行分析。显示的数据是(A)肿瘤生长曲线，其中每条线代表一只小鼠，(B)所得的Kaplan-Meier生存分析，以及(C)植入后第29天每个治疗组的gp70特异性CD8+T细胞频率。PFS＝无进展生存。
图13：单特异性二价PD-L1抗体和单价b12xPD-L1抗体与肿瘤细胞的结合。PD-L1-547和b12-FEALxPD-L1-547-FEAR与MDA-MB-231(A)、PC-3(B)和SK-MES-1(C)细胞的结合。显示的数据是如通过流式细胞术测定的平均荧光强度(MFI)。包括单特异性二价b12抗体作为阴性对照。
图14：在非抗原特异性T细胞增殖测定法中，PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR与两种单价对照(b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR+b12-FEALxPD-L1-547-FEAR)或两种亲本抗体(CD137-009-HC7LC2-FEAR+PD-L1-547-FEAR)的组合的比较。将CFSE标记的PBMC与次优浓度的抗CD3抗体(0.03μg/mL和0.1μg/mL)，或不与(w/o)抗CD3抗体(作为T细胞活化的阴性对照)温育，并在存在0.2μg/mL i)PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR、ii)b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR+b12-FEALxPD-L1-547-FEAR各自、iii)b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR、iv)b12-FEALxPD-L1-547-FEAR、v)CD137-009-HC7LC2-FEAR+PD-L1-547-FEAR各自、vi)CD137-009-HC7LC2-FEAR、vii)PD-L1-547-FEAR或viii)b12-IgG-FEAL对照抗体的情况下培养四天。通过流式细胞术测量CD4+(A)和CD8+(B)T细胞增殖。来自三个供体的数据显示为如使用FlowJo v10.4软件计算的三个重复的平均扩增指数。误差条(SD)表示实验中的变化(三次重复，使用来自一个供体的细胞)。
图15：在非抗原特异性T细胞增殖测定法中，通过PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEARx确定诱导T细胞增殖的EC50值。将CFSE标记的PBMC与次优浓度的抗CD3抗体和PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR(1–0.00015μg/mL)的连续稀释液或1μg/mL b12IgG(作为对照抗体)一起温育4天。显示了来自两个代表性供体的数据；用0.03μg/mL的抗CD3刺激来自供体1的PBMC(A，B)，并且用0.09μg/mL的抗CD3刺激来自供体2的PBMC(C，D)。通过流式细胞术测量CD4+(A和C)和CD8+(B和D)T细胞增殖。显示的数据是如使用FlowJo v10.4软件计算并用四参数对数拟合进行拟合的三个重复的平均扩增指数值。误差条(SD)表示实验中的变化(三次重复，使用来自一个供体的细胞)。
图16：在具有或不具有对T细胞的PD-1电穿孔的抗原特异性T细胞测定法中，PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR对10种促炎细胞因子分泌的作用。在存在不同浓度的CD137-009-HC7LC2-FEALxPD-L1-547-FEAR(三倍连续稀释；范围从1μg/mL至0.00015μg/mL)或b12对照抗体b12-IgG-FEAL的情况下，将用CLDN6-特异性TCR-且用或不用2μgPD1-IVT-RNA电穿孔的T细胞与经CLDN6-IVT-RNA电穿孔的iDC一起温育。抗体添加后48小时，使用MSD V-Plex人促炎组1(10-Plex)试剂盒通过多重夹心免疫测定法测定上清液的细胞因子水平。每个数据点代表三个单独孔的平均值±SD。
图17：在抗原非特异性T细胞测定法中，PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR对10种促炎细胞因子分泌的作用。在存在不同浓度的PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR(三倍连续稀释；范围从1μg/mL至0.00015μg/mL)或b12对照抗体b12-IgG-FEAL的情况下，用抗CD3抗体次优地刺激人PBMC。抗体添加后48小时，使用MSD V-Plex人促炎组1(10-Plex)试剂盒通过多重夹心免疫测定法测定上清液中的细胞因子水平。每个数据点代表三个单独孔的平均值±SD。
发明详述
定义
在本发明的上下文中，术语“结合剂”是指能够结合所期望的抗原的任何试剂。在本发明的某些实施方案中，结合剂是抗体、抗体片段或其构建体。结合剂也可以包含合成的、修饰的或非天然存在的部分，特别是非肽部分。此类部分可以例如连接期望的抗原结合功能或区域，如抗体或抗体片段。在一个实施方案中，结合剂是包含抗原结合CDR或可变区的合成构建体。
术语“免疫球蛋白”是指由两对多肽链，一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链组成的一类结构相关的糖蛋白，所有四个通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已得到充分表征。例如参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文缩写为VH或VH)和重链恒定区(本文缩写为CH或CH)组成。重链恒定区通常由三个域CH1，CH2和CH3组成。铰链区是重链的CH1和CH2域之间的区域，并且是高柔性的。铰链区中的二硫键是IgG分子中两条重链之间相互作用的一部分。每条轻链通常由轻链可变区(在本文中简称为VL或VL)和轻链恒定区(在本文中简称为CL或CL)组成。轻链恒定区通常由一个域CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变性区(或结构上定义的环的序列和/或形式上可高变的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，其散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4(另参见Chothia andLesk J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另有说明或与上下文矛盾，否则本文的CDR序列是根据DomainGapAlign(Lefranc MP.,Nucleic Acids Research 1999；27:209-212和Ehrenmann F.,Kaas Q.and Lefranc M.-P.Nucleic Acids Res.,38,D301-307(2010)；还见因特网http地址www.imgt.org/)的IMGT规则鉴定。除非另有说明或与上下文矛盾，在本发明中提及恒定区中的氨基酸位置根据EU编号(Edelman et al.,Proc Natl Acad Sci US A.1969May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版1991NIH Publication No.91-3242)。
如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE或IgM)或其任何同种异型，例如IgG1m(za)和IgG1m(f))。此外，每个重链同种型均可与kappa(κ)或lambda(λ)轻链组合。
在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指具有在典型的生理条件下以相当长的时间段的半衰期，例如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更多，约48小时或更多，约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关的功能定义的时段(例如足以诱发，促进，增强和/或调节与抗体与抗原的结合相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应器活性的时间)与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。本文所用的术语“抗原结合区”是指与抗原相互作用并包含VH区和VL区两者的区域。术语抗体在本文中使用时不仅包含单特异性抗体，而且还包括包含多个，例如两个或多个，例如三个或更多个不同的抗原结合区的多特异性抗体。抗体(Ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的成分(例如C1q)，即补体激活的经典途径中的第一成分。如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中的术语抗体包括作为抗原结合片段，即，保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。术语“抗体”中涵盖的抗原结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，由VL，VH，CL和CH1域组成的单价片段或如WO2007059782(Genmab)中所述的单价抗体；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)基本上由VH域组成，也称为域抗体(Holt et al；Trends Biotechnol.2003Nov；21(11):484-90)的dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))；(vi)骆驼科抗体或纳米抗体分子(Revets et al；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，所述合成接头使它们能够制备成单一蛋白链，其中VL区和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird etal.,Science242,423-426(1988)和Huston et al.,PNAS USA 85,5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，否则此类单链抗体涵盖在术语抗体内。尽管此类片段通常包括在抗体的含义内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明的上下文中，这些和其他有用的抗体片段以及此类片段的双特异性形式在本文中进一步讨论。还应理解，除非另有说明，术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及可通过任何已知技术，例如酶促裂解，肽合成和重组技术提供的保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。产生的抗体可以具有任何同种型。如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE或IgM)。当在本文中提到特定同种型，例如IgG1时，该术语不限于特定的同种型序列，例如特定的IgG1序列，但用于表示抗体在序列上比其他同种型更接近该同种型，例如IgG1。因此，例如本发明的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，包括恒定区中的变异。
如本文所用，术语“臂”、“Fab臂”和“半分子”指一个重链-轻链对。当双特异性抗体描述为包含“源自”第一抗体的半分子抗体和“源自”第二抗体的半分子抗体时，术语“源自”表示双特异性抗体是通过任何已知的方法将来自所述第一抗体和第二抗体中每种的所述半分子重组为所得的双特异性抗体产生的。在此上下文下，“重组”并不旨在受到任何特定的重组方法的限制，因此包括下文所述的所有产生双特异性抗体的方法，包括例如通过半分子交换的重组以及在核酸水平处进行重组和/或通过在同一细胞中两个半分子的共表达。
如本文所用，术语“抗原结合区”或“结合区”是指能够与抗原结合的抗体区域。抗原可以是任何分子，例如多肽，例如存在于细胞、细菌或病毒体上。除非上下文矛盾，术语“抗原结合区”和“抗原结合位点”可以在本发明的上下文中可互换地使用。
除非上下文矛盾，术语“抗原”和“靶标”可以在本发明的上下文中可互换地使用。
如本文所用，术语“结合”是指当使用抗体作为配体和抗原作为分析物通过生物层干扰量度法测定时抗体通常以对应于1E-6M或更小，例如，5E-7M或更小，1E-7M或更小，诸如5E-8M或更小，诸如1E-8M或更小，诸如5E-9M或更小，或诸如1E-9M或更小的KD的结合亲和力结合预定抗原或靶标，并且以对应于如下的KD的亲和力结合预定抗原，所述KD比其结合预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA，酪蛋白)的亲和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。
如本文所用，术语“KD”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，并通过将kd除以ka而获得。
如本文所用，术语“kd”(sec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值或解离速率。
如本文所用，术语“ka”(M-1x sec-1)是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率常数。所述值也称为kon值或结合速率。
如本文所用，术语“PD-L1”是指程序性死亡配体1蛋白。PD-L1存在于人和其他物种中，因此，除非上下文矛盾，否则术语“PD-L1”不限于人PD-L1。人、猕猴(食蟹猴)、非洲象、野猪和小鼠PD-L1序列可分别通过Genbank登录号NP_054862.1、XP_005581836、XP_003413533、XP_005665023和NP_068693找到。人PD-L1的序列也显示在SEQ ID NO:28中，其中预测氨基酸1-18为信号肽。猕猴(食蟹猴)PD-L1的序列也显示在SEQ ID NO:29中，其中预测氨基酸1-18为信号肽。
如本文所用，术语“CD137”是指人137蛋白分化簇。CD137(4-1BB)，也称为TNFRSF9，是配体TNFSF9/4-1BBL的受体。据信CD137参与T细胞活化。在一个实施方案中，CD137是人CD137，具有UniProt登录号Q07011。人CD137的序列也显示在SEQ ID NO:30中，其中预测氨基酸1-23为信号肽。在一个实施方案中，CD137是食蟹猴(Macaca fascicularis)CD137，具有UniProt登录号A9YYE7-1。食蟹猴CD137的序列显示在SEQ ID NO:31中，其中预测氨基酸1-23为信号肽。野猪(Sus scrofa)CD137显示在SEQ ID NO:38中，其中预测氨基酸1-23为信号肽。非洲象(Loxodonta africana)CD137显示在SEQ ID NO:39中，其中预测氨基酸1-23为信号肽。
“PD-L1抗体”或“抗PD-L1抗体”是特异性结合抗原PD-L1，特别是人PD-L1的如上所述的抗体。
“CD137抗体”或“抗CD137抗体”是特异性结合抗原CD137的如上所述的抗体。
“CD137xPD-L1抗体”、“抗CD137xPD-L1抗体”、“PD-L1xCD137抗体”或“抗PD-L1xCD137抗体”是包含两个不同的抗原结合区的双特异性抗体，所述抗原结合区之一特异性结合抗原PD-L1并且所述抗原结合区之一特异性结合抗原CD137。
术语“双特异性抗体”是指对至少两个不同的，通常是非重叠的表位具有特异性的抗体。此类表位可以在相同或不同的靶物上。对于本发明，表位在先攻靶物，即PD-L1和4-1BB上。包含Fc区的不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于：不对称双特异性分子，例如具有互补CH3域的IgG样分子；和对称的双特异性分子，例如重组IgG样双重靶向分子，其中分子的每个抗原结合区结合至少两个不同的表位。
双特异性分子的实例包括但不限于
Figure BDA0003092988020000121
(Trion Pharma/FreseniusBiotech,WO/2002/020039)、突出-进入-空穴(Genentech,WO 1998/50431)、CrossMAbs(Roche,WO 2009/080251,WO 2009/080252,WO 2009/080253)、静电匹配Fc-异二聚体分子(Amgen,EP1870459和WO2009089004；Chugai,US201000155133；Oncomed,WO 2010/129304)、LUZ-Y(Genentech)、DIG-body、PIG-body和TIG-body(Pharmabcine)、链交换工程化域抗体(Strand Exchange Engineered Domain body)(SEEDbody)(EMD Serono,WO2007110205)、双特异性IgG1和IgG2(Pfizer/Rinat,WO 2011/143545)、Azymetric支架(Zymeworks/Merck,WO2012058768)、mAb-Fv(Xencor,WO2011/028952)、XmAb(Xencor)、二价双特异性抗体(Roche,WO 2009/080254)、双特异性IgG(Eli Lilly)、
Figure BDA0003092988020000122
分子(Genmab A/S,WO2011/131746)、DuetMab(Medimmune,US2014/0348839)、Biclonics(Merus,WO2013/157953)、NovImmune(κλBodies,WO 2012/023053)、FcΔAdp(Regeneron,WO 2010/151792)、(DT)-Ig(GSK/Domantis)、二合一抗体或双重作用Fab(Genentech,Adimab)、mAb2(F-Star,WO 2008/003116)、ZybodyTM分子(Zyngenia)、CovX-body(CovX/Pfizer)、FynomAbs(Covagen/Janssen Cilag)、DutaMab(Dutalys/Roche)、iMab(MedImmune)、双重可变域(DVD)-IgTM(Abbott)、双重域双头部抗体(Unilever；Sanofi Aventis,WO 2010/0226923)、Ts2Ab(MedImmune/AZ)、BsAb(Zymogenetics)、HERCULES(Biogen Idec,US7,951,918)、scFv-融合物(Genentech/Roche,Novartis,Immunomedics,Changzhou Adam Biotech Inc,CN 102250246)、TvAb(Roche,WO2012/025525,WO2012/025530)、ScFv/Fc融合物、SCORPION(Emergent BioSolutions/Trubion,Zymogenetics/BMS)。Interceptor(Emergent)。双重亲和力重新靶向技术(Dual Affinity Retargeting Technology)(Fc-DARTTM)(MacroGenics,WO2008/157379,WO2010/080538)、BEAT(Glenmark)、二-双抗体(Di-Diabody)(Imclone/Eli Lilly)和化学交联的单抗(Karmanos Cancer Center)和共价融合的单抗(AIMM therapeutics)。
在本发明的上下文中，术语“单价抗体”是指可以与仅具有一个抗原结合结构域(例如一个Fab臂)的抗原上的特定表位相互作用的抗体分子。在双特异性抗体的上下文中，“单价抗体结合”是指双特异性抗体与仅具有一个抗原结合结构域(例如一个Fab臂)的抗原上的一个特异性表位的结合。
在本发明的上下文中，术语“单特异性抗体”是指仅对一个表位具有结合特异性的抗体。该抗体可以是单特异性单价抗体(即仅携带一个抗原结合区)或单特异性二价抗体(即具有两个相同抗原结合区的抗体)。
术语“双特异性抗体”是指具有两个不同的抗原结合结构域的抗体，例如。两个不同的Fab臂或两个具有不同CDR区的Fab臂。在本发明的上下文中，双特异性抗体对至少两个不同的表位具有特异性。这样的表位可以在相同或不同的抗原或靶标上。如果表位在不同的抗原上，则这些抗原可以在相同的细胞或不同的细胞，细胞类型或结构上，例如细胞外基质或囊泡和可溶性蛋白。因此，双特异性抗体可能能够交联多种抗原，例如，Aβ。两个不同的单元格。
术语“二价抗体”是指具有两个抗原结合区的抗体，所述两个抗原结合区与一个或两个靶标或抗原上的表位结合或与相同抗原上的一个或两个表位结合。因此，二价抗体可以是单特异性二价抗体或双特异性二价抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”，“单克隆Ab”，“单克隆抗体组合物”，“mAb”等是指单分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因或转染色体非人类动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，所述B细胞具有与人源化融合的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。细胞。单克隆抗体也可以从重组修饰的宿主细胞或使用支持体外转录和/或翻译编码抗体的核酸序列的细胞提取物的系统中产生。
如本文所用，术语“全长抗体”是指包含一对或两对重链和轻链的抗体(例如，亲本或变体抗体)，每对重链和轻链均包含通常为正常的所有重链和轻链恒定和可变结构域。在同种野生型抗体的重链-轻链对中发现。在全长变体抗体中，当与全长亲本或野生型抗体相比时，重链和轻链恒定和可变结构域可特别包含改善抗体功能特性的氨基酸取代。根据本发明的全长抗体可以通过以下方法产生，所述方法包括以下步骤：(i)将CDR序列克隆到包含完整重链序列和完整轻链序列的合适载体中，和(ii)表达完整重链和在合适的表达系统中的轻链序列。当从CDR序列或完整可变区序列开始时，产生全长抗体在本领域技术人员的知识范围内。因此，技术人员将知道如何产生根据本发明的全长抗体。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指下述抗体，其中可变区源自非人物种(例如，源自啮齿动物)并且恒定区源自不同物种，例如人。开发出用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体的免疫原性。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列和人免疫球蛋白恒定域的可变区和框架区的抗体。本发明的人抗体可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变，插入或缺失)。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不意图包括其中源自另一非人物种例如小鼠的种系的CDR序列已被嫁接到人框架序列上的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指遗传工程化的非人抗体，其含有人抗体恒定域和经修饰以与人可变域含有高水平序列同源性的非人可变域。这可以通过将6个一起形成抗原结合位点的非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现(参见WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人框架区(反向突变)。结构同源性建模可以帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列，主要是人框架区(其任选地包含一个或多个向非人氨基酸序列的氨基酸反向突变)，以及完全人恒定区。任选地，可以应用不一定是反向突变的其他氨基酸修饰，以获得具有优选特性，例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。
如本文所用，术语“Fc区”是指在从抗体的N端至C端的方向上至少包含铰链区，CH2区和CH3区的区域。抗体的Fc区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和补体系统的组分。
如本文所用，术语“铰链区”指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，人IgG1抗体的铰链区对应于根据Kabat Kabat,E.A.et al.,Sequences of proteins ofimmunological interest.5th Edition-US Department of Health and HumanServices,NIH publication No.91-3242,pp 662,680,689(1991)中列出的EU编号的氨基酸216-230。然而，铰链区也可以是如本文中描述的其它亚型中的任一种。
如本文所用，术语“CH1区”或“CH1域”指免疫球蛋白重链的CH1区。因此，例如人IgG1抗体的CH1区对应于根据如Kabat(同上)中列出的Eu编号的氨基酸118-215。然而，CH1区也可以是如本文中描述的其它亚型中的任一种。
如本文所用，术语“CH2区”或“CH2域”指免疫球蛋白重链的CH2区域。因此，例如，人IgG1抗体的CH2区对应于根据如Kabat(同上)中列出的Eu编号的氨基酸231-340。然而，CH2区也可以是如本文中描述的其它亚型中的任一种。
如本文所用，术语“CH3区”或“CH3域”意图指免疫球蛋白重链的CH3区。因此，例如，人IgG1抗体的CH3区对应于根据如Kabat(同上)中列出的Eu编号的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是如本文中描述的其它亚型中的任一种。
术语“表位”是指能够结合抗体的抗原结合区(“互补位”)的蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链等的分子的表面分组组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者的结合而非后者的结合丧失。表位定位技术可以确定“结构表位”或“功能性表位”。结构表位定义为与抗体直接接触的结构内的那些残基，并且可以例如通过基于结构的方法如X射线晶体学进行评估。结构表位可以包含直接参与抗体结合的氨基酸残基以及不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如被抗体有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基在抗体的足迹内)。功能性表位定义为对抗原-抗体结合相互作用作出有力贡献的那些残基，并且可以例如通过定点诱变例如丙氨酸扫描(Cunningham,B.C.,&Wells,J.A.(1993)Journalof Molecular Biology；Clackson,T.,&Wells,J.(1995)Science,267(5196),383–386)来评估。功能性表位可包含直接参与抗体结合的氨基酸残基，以及不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如引起参与直接相互作用的残基的位置发生构象变化的氨基酸残基(Greenspan,N.S.,&Di Cera,E.(1999)Nature Biotechnology,17(10),936–937)。在抗体-抗原相互作用的情况下，功能性表位可用于彼此区分抗体分子。
如本文所用，术语“Fc效应器功能”或“Fc介导的效应器功能”意图指由于多肽或抗体与其在细胞膜上的靶物(例如抗原)结合以及IgG Fc域与先天免疫系统分子(例如可溶性分子或膜结合分子)的后续相互作用而产生的功能。Fc效应器功能的例子包括(i)C1q结合，(ii)补体激活，(iii)补体依赖性细胞毒性(CDC)，(iv)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(v)Fc-gamma受体结合，(vi)抗体依赖性细胞性吞噬作用(ADCP)，(vii)补体依赖性细胞性细胞毒性(CDCC)，(viii)补体增强的细胞毒性，(ix)由抗体介导的经调理的细胞对补体受体的结合，(x)调理(opsonisation)和(xi)(i)至(x)中任一项的组合。
术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可以互换使用，并且不应理解为限制性的。氨基酸是含有胺(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每个氨基酸特有的侧链(R基团)的有机化合物。在本发明的上下文中，可以基于结构和化学特性对氨基酸进行分类。因此，氨基酸类别可反映在下表中的一个或两个中：
基于R基团的结构和一般化学特征的主要分类
Figure BDA0003092988020000161
Figure BDA0003092988020000171
氨基酸残基的备选物理和功能分类
Figure BDA0003092988020000172
用一种氨基酸取代另一种氨基酸可以分类为保守或非保守取代。在本发明的上下文中，“保守取代”是一个氨基酸被具有相似结构和/或化学特征的另一种氨基酸取代，用一个氨基酸残基对如上述两表的任一张中定义的相同类别的另一种氨基酸残基的此类取代：例如，亮氨酸可以用异亮氨酸取代，因为它们都是脂肪族的、支链的疏水物。类似地，天冬氨酸可以用谷氨酸取代，因为它们都是小的带负电荷的残基。
在本发明的上下文中，抗体中的取代表示为：
原始氨基酸–位置–取代的氨基酸；
参照公认的氨基酸命名法，使用三字母代码或一字母代码，包括代码“Xaa”或“X”表示任何氨基酸残基。因此，Xaa或X通常可以代表20种天然存在的氨基酸中的任一种。如本文所用，术语“天然存在的”是指以下氨基酸残基中的任何一个；甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，赖氨酸，精氨酸，组氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，脯氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，甲硫氨酸和半胱氨酸。因此，符号“K409R”或“Lys409Arg”是指抗体在氨基酸位置409中包含赖氨酸用精氨酸的取代。
将给定位置的氨基酸取代为任何其他氨基酸称为：
原始氨基酸–位置；或例如“K409”
对于其中一个或多个原始氨基酸和/或一个或多个取代氨基酸可以包含超过一个但并非所有氨基酸的修饰，可以用“，”或“/”分开超过一个氨基酸。例如。在位置409中用赖氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸取代赖氨酸为：
“Lys409Arg,Ala,Phe”或“Lys409Arg/Ala/Phe”或“K409R,A,F”或“K409R/A/F”或“K409至R,A或F”。
此类名称在本发明的上下文中可以互换使用，但是具有相同的含义和目的。
此外，术语“取代”包括取代成任何一个或其他19种天然氨基酸，或取代成其他氨基酸，例如非天然氨基酸。例如，位置409中氨基酸K的取代包括以下每个取代：409A,409C,409D,409E,409F,409G,409H,409I,409L,409M,409N,409Q,409R,409S,409T,409V,409W,409P和409Y。也就是说，这等同于名称409X，其中X表示除原始氨基酸以外的任何氨基酸。这些取代也可以称为K409A，K409C等，或K409A，C等或K409A/C/等。类似地，这适用于本文提及的每个位置，以在本文中具体包括此类取代中的任何一种。
根据本发明的抗体还可包含氨基酸残基的缺失。此类缺失可以表示为“del”，并且包括例如写为K409del。因此，在此类实施方案中，位置409中的赖氨酸已经从氨基酸序列中缺失。
为了本发明的目的，使用在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular BiologyOpen Software Suite,Rice et al.,2000,Trends Genet.16:276-277)，优选版本5.0.0或更高版本的Needle程序中实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并且如下计算：
(相同残基x 100)/(比对长度-比对中缺口总数)
相似残基的保留也或备选可以通过相似性得分测量，如通过使用BLAST程序确定(例如，使用标准设置BLOSUM62，开放缺口＝11和延伸缺口＝1，可通过NCBI获得的BLAST2.2.8)。合适的变体通常表现出至少约45％，例如至少约55％，至少约65％，至少约75％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或更多(例如，约99％)与亲本序列的相似性。
在本发明的上下文中，“抑制PD-L1与PD-1的结合”是指在能够结合PD-L1的抗体存在下，PD-L1与PD-1的结合的任何可检测到的显著降低。通常，抑制是指由抗PD-L1抗体的存在引起的PD-L1与PD-1之间结合的至少约10％降低，例如至少约15％，例如至少约20％，例如至少40％降低。PD-L1与PD-1结合的抑制可以通过任何合适的技术来确定。在一个实施方案中，如本文实施例6中所述确定抑制。
术语“治疗/处理”是指以缓解，改善，阻止或消除(治愈)症状或疾病状态为目的施用有效量的本发明的药物组合物。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指在必需的剂量且持续必需的时间段对于实现期望的治疗结果有效的量。结合剂，诸如抗体，特别是双特异性抗体的治疗有效量可以随着因素，诸如个体的疾病状态，年龄，性别和体重以及结合剂在个体中引起期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用超过的量。
在第一方面，本发明涉及药物配制剂，其包含
a.结合剂，所述结合剂包含结合人CD137(4-1BB)的第一抗原结合区和结合人PD-L1(CD274)的第二抗原结合区，
-所述第一抗原结合区，其包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，所述第一重链可变区包含存在于以SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述第一轻链可变区包含存在于以SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，和
-所述第二抗原结合区，其包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述第二重链可变区包含存在于以SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述第二轻链可变区包含存在于以SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；
b.组氨酸缓冲剂
c.约100至约400mM的糖，和
d.约0.001至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂；
并且具有约4.5至约6.5之间的pH。
根据本发明的药物配制剂中包含的结合剂可以通过结合CD137，而同时结合另一细胞上的PD-L1激活一个细胞和/或诱导一个细胞的增殖。在人类中，CD137在活化的T细胞(如CD8+T细胞和CD4+T细胞)上表达，而PD-L1主要在抗原呈递细胞(APC)(如树突细胞或肿瘤细胞)上表达。因此，根据本发明能够结合CD137和PD-L1两者的结合剂，如双特异性抗体，能够同时结合T细胞和APC或T细胞和肿瘤细胞。因此，根据本发明的配制剂中的结合剂可以通过同时结合细胞上的PD-L1和CD137来介导APC和T细胞之间的细胞间相互作用。因此，这可以导致抗原特异性T细胞的增殖。此外，根据本发明的配制剂中的结合剂可以通过同时结合肿瘤细胞上的PD-L1和T细胞上的CD137来介导肿瘤细胞和T细胞之间的细胞间相互作用。因此，这可以通过与T细胞上的CD137结合而导致在存在肿瘤细胞的情况下T细胞的进一步活化，而肿瘤细胞上PD-L1的结合使T细胞和肿瘤细胞紧密接近。因此，在存在肿瘤细胞的情况下活化T细胞可以导致T细胞对肿瘤细胞的杀伤增强。此外，根据本发明的配制剂中的结合剂的PD-L1抗原结合区抑制肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合的能力阻止了肿瘤细胞能够诱导T细胞抑制，从而逃避活化T细胞的抗肿瘤作用。
因此，本发明的结合剂，双特异性抗体，可以用于治疗可以得益于T细胞的再活化的疾病，如癌症。
药物配制剂可包含1至100mM组氨酸，例如5至100mM、10至100mM、15至100mM、5至90mM、5至80mM、5至70mM、5至60mM、5至50mM、5至40mM、5至30mM、10至90mM、10至80mM、10至70mM、10至60mM、10至50mM、10至40mM、10至30mM、15至90mM、15至80mM、15至70mM、15至60mM、15至50mM、15至40mM、15至30mM或15至20mM组氨酸。
药物配制剂可以特别地包含约20mM组氨酸，例如20mM组氨酸。
药物配制剂可包含100至400mM的糖，例如125至400mM、150至400mM、150至400mM、175至400mM、200至400mM、225至400mM、100至375mM、100至350mM、100至325mM、100至300mM、125至375mM、125至350mM、125至325mM、125至300mM、125至275mM、150至375mM、150至350mM、150至325mM、150至300mM、150至275mM、175至375mM、175至350mM、175至325mM、175至300mM、175至275mM、200至375mM 1、200至350mM 1、200至325mM、200至300mM、200至275mM、225至375mM、225至350mM、225至325mM、225至300mM、或诸如225至275mM糖。
特别地，药物配制剂可以包含约250mM的糖，例如250mM的糖。示例性的糖包括葡萄糖，半乳糖，蔗糖和海藻糖脱水。该糖可以特别是蔗糖。
本文公开的药物配制剂可包含0.005至0.1％(w/v)的非离子表面活性剂，例如0.01至0.1％(w/v)、0.015至0.1％(w/v)、0.001至0.09％(w/v)、0.001至0.08％(w/v)、0.001至0.07％(w/v)、0.001至0.06％(w/v)、0.001至0.05％(w/v)、0.001至0.04％(w/v)、0.001至0.02％(w/v)、0.005至0.1％(w/v)、0.005至0.09％(w/v)、0.005至0.08％(w/v)、0.005至0.07％(w/v)、0.005至0.06％(w/v)、0.005至0.05％(w/v)、0.005至0.04％(w/v)、0.005至0.03％(w/v)、0.005至0.02％(w/v)、0.01至0.09％(w/v)、0.01至0.08％(w/v)、0.01至0.07％(w/v)、0.01至0.06％(w/v)、0.01至0.05％(w/v)、0.01至0.04％(w/v)、0.01至0.03％(w/v)、0.01至0.02％(w/v)、0.015至0.09％(w/v)、0.015至0.08％(w/v)、0.015至0.07％(w/v)、0.015至0.06％(w/v)、0.015至0.05％(w/v)、0.015至0.04％(w/v)、0.015至0.03％(w/v)、or such as 0.015至0.02％(w/v)非离子表面活性剂。
特别地，药物配制剂可包含约0.02％(w/v)的非离子表面活性剂，例如0.02％(w/v)的非离子表面活性剂。
非离子表面活性剂可以选自2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基(E)-十八碳-9-烯酸酯(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯；Polysorbate 80)或2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]十二酸乙酯(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯；Polysorbate 20)。
药物配制剂可以具有4.5至6.5之间，例如在4.7至6.5之间，例如在4.9和6.5之间，在5.1和6.5之间，在5.3和6.5之间，在4.5和6.3之间，在4.7和6.1之间，在4.7和5.9之间，在4.7和5.7之间，在5.1和6.3之间，在4.7和6.1之间，在4.7和5.9之间，在4.7和5.7之间，在4.9和6.3之间，在4.9和6.1之间，在4.9和5.9之间，在4.9和5.7之间，在5.1和6.3之间，在5.1和6.1之间，在5.1和5.9之间，在5.1和5.7之间，在5.3和6.3之间，在5.3和6.1之间，在5.3和5.9之间，例如5.3和5.7之间的pH。
在当前优选的实施方案中，根据本发明的药物配制剂具有约5.5的pH，例如5.5的pH。
药物配制剂可包含5-200mg/mL的结合剂，例如10至200mg/mL、20至200mg/mL、40至200mg/mL、60至200mg/mL、80至200mg/mL、100至200mg/mL、120至200mg/mL、150至200mg/mL、5至150mg/mL、10至150mg/mL、20至150mg/mL、40至150mg/mL、60至150mg/mL、80至150mg/mL、100至150mg/mL、5至130mg/mL、10至130mg/mL、20至130mg/mL、40至130mg/mL、60至130mg/mL、80至130mg/mL、100至130mg/mL、5至100mg/mL、10至100mg/mL、15至100mg/mL、20至100mg/mL、30至100mg/mL、40至100mg/mL、50至100mg/mL、60至100mg/mL、5至80mg/mL、5至60mg/mL、5至50mg/mL、5至40mg/mL、5至30mg/mL、5至20mg/mL、10至80mg/mL、10至60mg/mL、10至50mg/mL、10至40mg/mL、10至30mg/mL、15至80mg/mL、15至60mg/mL、15至40mg/mL、或诸如15至25mg/mL的结合剂。
根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述配制剂包含
i)约20mg/mL的所述结合剂，例如约40mg/mL，约60mg/mL，约80mg/mL，约100mg/mL，约120mg/mL或约140mg/mL，和
ii)约20mM组氨酸，约250mM糖和约0.02％(w/v)的非离子表面活性剂，并且具有约5.5的pH。
特别地，本文提供的药物配制剂可以包含约20mg/mL的结合剂，例如20mg/mL的结合剂。
配制剂可以特别地包含约20mg/mL的结合剂，约20mM的组氨酸，约250mM的糖和约0.02％(w/v)的非离子表面活性剂，并且具有约5.5的pH。
药物配制剂可以包括：
i)20mg/mL的所述结合剂，例如40mg/mL，60mg/mL，80mg/mL，100mg/mL，120mg/mL或140mg/mL，和
ii)20mM组氨酸，250mM糖和0.02％(w/v)的非离子表面活性剂并且具有5.5的pH。
在目前优选的一个实施方案中，根据本发明的药物配制剂包含20mg/mL的结合剂，20mM组氨酸，250mM糖和0.02％(w/v)的非离子表面活性剂，并具有pH 5.5。
优选地，根据针对黑色背景和针对白色背景在2000和3750勒克斯之间的强度照明下进行的可见颗粒计数确定，根据本发明的配制剂在已经进行了5次由-65℃冷冻12h，然后于25℃融化12h组成的冷冻-融化循环后基本上不含可见颗粒。
药物配制剂所包含的结合剂可以特别是抗体，例如双特异性抗体。
上文定义的每个可变区可包含三个互补决定区CDR1，CDR2和CDR3，以及四个框架区FR1，FR2，FR3和FR4。
在药物配制剂中，所述互补性决定区和所述框架区从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
在本发明的一个实施方案中，结合剂，特别是抗体形式，例如双特异性抗体，包括重链可变区，其中互补决定区和框架区从氨基末端排列至羧基末端按以下顺序排列：HFR1，HCDR1，HFR2，HCDR2，HFR3，HCDR3，HFR4。
在本发明的一个实施方案中，结合剂，特别是抗体的形式，例如双特异性抗体，包括轻链可变区，其中互补决定区和框架区从氨基末端排列至羧基末端按以下顺序排列：LFR1，LCDR1，LFR2，LCDR2，LFR3，LCDR3，LFR4。
在药物配制剂中
-所述第一抗原结合区包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，所述第一重链可变区包含分别以SEQ ID NO:9、10、11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第一轻链可变区包含分别以SEQ ID NO:13、GAS和SEQ ID NO:14所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及
-所述第二抗原结合区包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述第二重链可变区包含分别以SEQ ID NO:18、19和20所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第二轻链可变区包含分别以SEQ ID NO:22、DDN和SEQ ID NO:23所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
本发明还提供了配制剂，其中抗体包含如本申请的实施例中所公开的重链和轻链可变区。还提供了抗体配制剂，所述抗体包含实施例中公开的VL区，VH区的功能变体。在抗体的上下文中使用的VL或VH的功能变体仍使抗体保留至少相当大的比例(至少约50％，60％，70％，80％，90％，95％或更高)“参考”或“亲本”抗体的亲和力和/或特异性/选择性，在某些情况下，与亲本抗体相比，此类抗体可以与更大的亲和力，选择性和/或特异性有关。此类功能性变体通常与亲本抗体保持显着的序列同一性。
因此，根据本发明的药物配制剂可以是如下的，其中
-所述第一抗原结合区包含与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第一重链可变区(VH)；和与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第一轻链可变区(VL)；和
-所述第二抗原结合区包含与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第二重链可变区(VH)；和与SEQ ID NO:21所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第二轻链可变区(VL)。
此外，根据本发明的药物配制剂可以是如下的，其中
-所述第一抗原结合区包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，所述第一重链可变区包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第一重链可变区与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性；所述第一轻链可变区包含分别以SEQ ID NO:13、GAS和SEQ ID NO:14所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第一轻链可变区与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性，以及
-所述第二抗原结合区包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述第二重链可变区包含分别以SEQ ID NO:18、19和20所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第二重链可变区与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性；所述第二轻链可变区包含分别以SEQ ID NO:22、DDN和SEQ ID NO:23所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第二轻链可变区与SEQ ID NO:21所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性。
根据本发明的药物配制剂可以是如下的，其中：
a.所述结合人CD137的第一抗原结合区包含
-所述第一重链可变区，其包含SEQ ID NO:15所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:15所示的序列相比多达20个氨基酸残基，例如多达19个，多达18个，多达17个，多达16个，多达15个，多达14个，多达13个，多达12个，多达11个，多达10个，多达9个，多达8个，多达7个，多达6个，多达5个，多达4个，多达3个，多达2个，多达1个氨基酸残基是修饰的，所述第一重链可变区(VH)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和
-所述第一轻链可变区，其包含SEQ ID NO:16所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:16所示的序列相比多达20个氨基酸残基，例如多达19个，多达18个，多达17个，多达16个，多达15个，多达14个，多达13个，多达12个，多达11个，多达10个，多达9个，多达8个，多达7个，多达6个，多达5个，多达4个，多达3个，多达2个，多达1个氨基酸残基是修饰的，所述第一轻链可变区(VL)包含分别以SEQ ID NO:13、GAS和SEQ ID NO:14所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区包含
-所述第二重链可变区，其包含SEQ ID NO:17所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:17所示的序列相比多达20个氨基酸残基，例如多达19个，多达18个，多达17个，多达16个，多达15个，多达14个，多达13个，多达12个，多达11个，多达10个，多达9个，多达8个，多达7个，多达6个，多达5个，多达4个，多达3个，多达2个，多达1个氨基酸残基是修饰的，所述第二重链可变区(VH)包含分别以SEQ ID NO:18、19和20所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和
-所述第二轻链可变区，其包含SEQ ID NO:21所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:21所示的序列相比多达20个氨基酸残基，例如多达19个，多达18个，多达17个，多达16个，多达15个，多达14个，多达13个，多达12个，多达11个，多达10个，多达9个，多达8个，多达7个，多达6个，多达5个，多达4个，多达3个，多达2个，多达1个氨基酸残基是修饰的，所述第二轻链可变区(VH)包含分别以SEQ ID NO:22、DDN和SEQ ID NO:23所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
在特定的实施方案中，上文提及的氨基酸残基的修饰可以是氨基酸取代，例如保守氨基酸取代。本公开内容包括的氨基酸残基的其他修饰包括一个或多个氨基酸的缺失以及一个或多个氨基酸残基的添加和/或插入。
本公开内容进一步提供了药物配制剂，其中所述结合剂包含(i)包含所述第一重链可变区(VH)并还包含第一重链恒定区(CH)的多肽和(ii)包含所述第二重链可变区(VH)并还包含第二重链恒定区(CH)的多肽。
如本文公开的药物组合物可包含(i)包含所述第一轻链可变区(VL)并还包含第一轻链恒定区(CL)的多肽和(ii)包含所述第二轻链可变区(VL)并还包括第二轻链恒定区(CL)的多肽。
药物配制剂可以包含结合剂，例如抗体，其包含第一结合臂和第二结合臂，其中
a.所述第一结合臂包含i)包含所述第一重链可变区(VH)和所述第一重链恒定区(CH)的多肽和ii)包含所述第一轻链可变区(VL)和所述第一轻链恒定区(CL)的多肽和；
b.所述第二结合臂包含i)包含所述第二重链可变区(VH)和所述第二重链恒定区(CH)的多肽和ii)包含所述第二轻链可变区(VL)和所述第二轻链恒定区(CL)的多肽。
在本发明的特定实施方案中，第一抗原结合区结合如SEQ ID NO:30所示的人CD137或其成熟多肽。
第一抗原结合区也可以能够结合食蟹猴(cynomolgus monkey)(食蟹猕猴(Macacafascicularis))CD137，如SEQ ID NO:31所示，或其成熟多肽。对人和食蟹猴CD137具有交叉特异性的抗原结合区使药物配制剂中的结合剂适合于食蟹猴的临床前测试。
在根据本公开内容的药物配制剂中，第二抗原结合区优选结合如以SEQ ID NO:28所示的人PD-L1或其成熟多肽。
第二抗原结合区也可以能够结合如以SEQ ID NO:29所示的食蟹猴(食蟹猕猴)PD-L1或其成熟多肽。
此外，第二抗原结合区可以能够抑制人PD-L1与人PD-1的结合。这是令人感兴趣的，因为结合剂可以由此防止PD-L1阻碍通过PD-1的抗肿瘤免疫性。因此，结合剂可以防止T细胞通过PD-1/PD-L1相互作用而接收抑制信号，而通过与CD137分子结合而接收激活信号，从而导致增强T细胞的增殖，激活，效应器和记忆功能的信号传导。
结合剂可以是全长抗体或抗体片段的形式。
特别地，诸如抗体的结合剂可以是选自由IgG1，IgG2，IgG3和IgG4组成的组的同种型。
根据本公开内容，结合剂是全长IgG1抗体。
在各种实施方案中，该抗体是IgG1抗体，更特别地是IgG1，kappa或IgG1，λ同种型(即IgG1，κ，λ)，IgG2a抗体(例如IgG2a，κ，λ)，IgG2b抗体(例如IgG2b，κ，λ)，IgG3抗体(例如IgG3，κ，λ)或IgG4抗体(例如IgG4，κ，λ)。
在根据本公开内容的药物配制剂中
a.所述结合CD137的第一抗原结合区可以源自嵌合抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区可以源自嵌合抗体。
或者，在根据前述公开内容的药物配制剂中，
a.所述结合CD137的第一抗原结合区可以源自人源化抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区可以源自人源化抗体。
作为另一种选择，
a.所述结合人CD137的第一抗原结合区可以源自人抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区可以源自人抗体。
在另一个替代方案中
a.所述结合人CD137的第一抗原结合区可以源自人源化抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区可以源自人抗体。
第一抗原结合区可以特别地源自兔抗体。第一抗原结合区可以进一步源自人源化抗体。第一结合臂也可以源自全长抗体。在本发明的一个实施方案中，第一结合臂源自单克隆抗体。第一结合臂可以源自全长IgG1，λ(lambda)或IgG1，κ(kappa)抗体。
第二抗原结合区可以源自大鼠抗体。在本发明的一个实施方案中，第二抗原结合区是人的。或者，第二抗原结合区可以源自人源化抗体。第二结合臂也可以源自全长抗体。在本发明的一个实施方案中，第二结合臂源自单克隆抗体。在本发明的一个实施方案中，第二结合臂源自全长IgG1，λ(lambda)或IgG1，κ(kappa)抗体。第一和第二抗原结合区可以源自人源化抗体。第一和第二抗原结合区可以是人抗体。第一和第二结合臂可以源自全长抗体，例如源自全长IgG1，λ(lambda)或IgG1，κ(kappa)抗体。第一和第二结合臂可以源自单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，第一抗原结合区源自IgG1 lambda，第二抗原结合区源自IgG1 kappa。
双特异性抗体的许多不同形式和用途是本领域已知的，并且已由Kontermann；Drug Discov Today,2015Jul；20(7):838-47和MAbs,2012Mar-Apr；4(2):182-97进行了综述。
在本发明的实施方案中，其中结合剂是双特异性抗体，本公开内容不限于任何特定的双特异性形式或生产它的方法。
可用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括：(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单一抗体；和(ii)对两个不同表位具有特异性的单链抗体，例如，通过两个额外的肽接头串联连接的scFv；(iii)双重可变域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有通过短肽连接串联的两个可变域(Wu et al.,Generation and Characterization of a DualVariable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,于:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)Tandab，其是两个单链双抗体(diabodies)的融合体，产生四价双特异性抗体，该四价双特异性抗体对每个靶抗原具有两个结合位点；(vi)柔性体(flexibody)，其是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(vii)基于蛋白质激酶A中“二聚化和对接域”的所谓“对接和锁定”分子，其当应用于Fab时可以产生由与不同Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的Scorpion分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(ix)双抗体。
本发明的结合剂可以是双抗体或交叉抗体(cross-body)。
在一个实施方案中，本发明的结合剂是经由受控Fab臂交换获得的双特异性抗体(例如WO2011131746(Genmab)中所述)。
可以应用于本发明内容中的不同类别的结合剂的实例包括但不限于(i)IgG样分子，其具有互补CH3域以迫使异二聚化；(ii)重组分子，包括但不限于Triomab/Quadroma分子(Trion Pharma/Fresenius Biotech；Roche,WO2011069104)、所谓的突出-入-空穴分子(Genentech,WO9850431)、CrossMAbs(Roche,WO2011117329)和静电匹配分子(Amgen,EP1870459和WO2009089004；Chugai,US201000155133；Oncomed,WO2010129304)、LUZ-Y分子(Genentech,Wranik et al.J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012Nov 1)、DIG-body和PIG-body分子(Pharmabcine,WO2010134666,WO2014081202)、链交换工程化域体(SEEDbody)分子(EMD Serono,WO2007110205)、Biclonics分子(Merus,WO2013157953)、FcΔAdp分子(Regeneron,WO201015792)、双特异性IgG1和IgG2分子(Pfizer/Rinat,WO11143545)、Azymetric支架分子(Zymeworks/Merck,WO2012058768)、mAb-Fv分子(Xencor,WO2011028952)、二价双特异性抗体(WO2009080254)和
Figure BDA0003092988020000291
分子(Genmab,WO2011131746)。
重组IgG样双重靶向分子的实例包括但不限于双重靶向(DT)-Ig分子(WO2009058383)、二合一抗体(Genentech；Bostrom,et al 2009.Science 323,1610–1614.)、交联的Mab(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star,WO2008003116)、Zybody分子(Zyngenia；LaFleur et al.MAbs.2013Mar-Apr；5(2):208-18)、采用共同轻链的方法(Crucell/Merus,US7,262,028),κλBodies(NovImmune,WO2012023053)和CovX-body(CovX/Pfizer；Doppalapudi,V.R.,et al 2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17,501–506.)。
IgG融合分子的实例包括但不限于双重可变域(DVD)-Ig分子(Abbott,US7,612,181)、双重域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis,WO20100226923)、IgG类双特异性分子(ImClone/Eli Lilly,Lewis etal.Nat Biotechnol.2014Feb；32(2):191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ；Dimasi et al.J Mol Biol.2009Oct30；393(3):672-92)和BsAb分子(Zymogenetics,WO2010111625)、HERCULES分子(Biogen Idec,US007951918)、scFv融合分子(Novartis)、scFv融合分子(Changzhou Adam Biotech Inc,CN 102250246)和TvAb分子(Roche,WO2012025525,WO2012025530)。
Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc融合体(Pearce et al.,Biochem MolBiol Int.1997Sep；42(6):1179-88)、SCORPION分子(Emergent BioSolutions/Trubion,Blankenship JW,et al.AACR 100th Annual meeting 2009(Abstract#5465)；Zymogenetics/BMS,WO2010111625)、双重亲和力再靶向技术(Fc-DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)和Dual(ScFv)2-Fab分子(National Research Center forAntibody Medicine–China)。
Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2分子(Medarex/AMGEN；Deo etal J Immunol.1998Feb 15；160(4):1677-86.)、双重作用或Bis-Fab分子(Genentech,Bostrom,et al 2009.Science 323,1610–1614.)、锁定对接(DNL)分子(ImmunoMedics,WO2003074569,WO2005004809)、二价双特异性分子(Biotecnol,Schoonjans,JImmunol.2000Dec 15；165(12):7050-7.)和Fab-Fv分子(UCB-Celltech,WO 2009040562A1)。
基于ScFv，基于双抗体的抗体和域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞结合剂(BiTE)分子(Micromet,WO2005061547)、串联双抗体分子(TandAb)(Affimed)Le Gall etal.,Protein Eng Des Sel.2004Apr；17(4):357-66.)、双重亲和力再靶向技术(DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)、单链双抗体分子(Lawrence,FEBSLett.1998Apr 3；425(3):479-84)、TCR样分子(AIT,ReceptorLogics)、人血清清蛋白ScFv融合体(Merrimack,WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech,Zhu et al.ImmunolCell Biol.2010Aug；88(6):667-75.)、双重靶向纳米抗体(Ablynx,Hmila et al.,FASEBJ.2010)和双重靶向仅重链域抗体。
第一和第二重链恒定区(CH)各自可以包含恒定区域1区(CH1区)，铰链区，CH2区和CH3区，优选铰链区，CH2区和CH3区中的一个或多个。
本公开内容的结合剂，诸如双特异性抗体包括包含第一CH3区域的第一Fc序列和包含第二CH3区域的第二Fc序列，其中第一和第二CH3区域的序列不同并且使得所述第一和第二CH3区域之间的异二聚体相互作用比所述第一和第二CH3区域的每个同二聚体相互作用更强。在WO2011131746和WO2013060867(Genmab)(其通过引用并入本文)中提供了关于这些相互作用以及可以如何实现它们的更多细节。
如本文进一步所述，基于一种同二聚体起始PD-L1抗体和一种在CH3区中仅含有几个保守的不对称突变的同二聚体起始CD137抗体，可以使用特定方法以高收率获得稳定的双特异性PD-L1xCD137抗体。不对称突变是指所述第一和第二CH3区的序列在不同位置处含有氨基酸取代。
因此，在本发明的一个实施方案中，第一重链恒定区和第二重链恒定区(CH)各自包含CH3区，两个CH3区包含不对称突变。
在根据本发明的药物配制剂中，其可以包含结合剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)中，在与选自下组的位置对应的位置中的氨基酸中的至少一个已经被取代：根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，在与选自下组的位置对应的位置中的氨基酸中的至少一个已经被取代：根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409，并且其中所述第一和所述第二重链在相同位置处未被取代。
本文公开的药物配制剂可以包含结合剂，其中(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置中的氨基酸是R，或(ii)在所述第一重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置中的氨基酸是L。
本文公开的双特异性抗体可以包含在人IgG1重链中的位置366处具有氨基酸取代的第一CH3区和在选自下组的位置处具有氨基酸取代的第二CH3区：人IgG1重链中的368、370、399、405、407和409。人IgG1重链中的位置366处的氨基酸可以选自Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val或Gln。
本文公开的双特异性抗体可包含人IgG1重链中的位置368处具有氨基酸取代的第一CH3区和在选自下组的位置处具有氨基酸取代的第二CH3区：人IgG1重链中的366、370、399、405、407和409。
本文公开的双特异性抗体可以包含在人IgG1重链的位置370处具有氨基酸取代的第一CH3区和在选自下组的位置处具有氨基酸取代的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、399、405、407和409。
本文公开的双特异性抗体可以包含在人IgG1重链的位置399处具有氨基酸取代的第一CH3区和在选自下组的位置处具有氨基酸取代的第二CH3区：人IgG1重链中的366、368、370、405、407和409。
本文公开的双特异性抗体可以包含在人IgG1重链的位置405处具有氨基酸取代的第一CH3区和在选自下组的位置处具有氨基酸取代的第二CH3区：人IgG1重链中的366,368,370,399,407和409。
本文公开的双特异性抗体可以包含在人IgG1重链的位置407处具有氨基酸取代的第一CH3区和在选自下组的位置处具有氨基酸取代的第二CH3区：人IgG1重链中的366,368,370,399,405和409。
本文公开的双特异性抗体可以包含在人IgG1重链的位置409处具有氨基酸取代的第一CH3区和在选自下组的位置处具有氨基酸取代的第二CH3区：人IgG1重链中的366,368,370,399,405和407。
因此，本文公开的双特异性抗体可以包含所述第一和第二CH3区域的序列，所述第一和第二CH3区域的序列包含不对称突变，即两个CH3区中不同位置处的突变，例如在CH3区之一中的位置405处的突变和另一个CH3区中的位置409处的突变。
本文公开的双特异性抗体可以是如下的抗体，其中第一CH3区具有位置409处的除Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,399,405和407。第一CH3区可以具有位置409处的除Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区可以具有位置405处的除Phe以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr,Cys,Lys或Leu。在进一步的实施方案中，第一CH3区可以具有位置409处的除Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区可以具有位置405处的除Phe，Arg或Gly以外的氨基酸，例如Leu,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Met,Lys,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Leu。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置405处的Phe和位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区包含位置405处的除Phe以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr,Leu,Met或Cys和位置409处的Lys。第一CH3区可包含位置405处Phe和位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且第二CH3区可包含位置405处的除Phe，Arg或Gly外的氨基酸，例如Leu,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Met,Lys,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置405处的Phe和位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。第一CH3区可包含位置405处Phe和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区可包含位置405处的除Phe，Arg或Gly外的氨基酸，例如Leu,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Met,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys和位置409处的Lys。第一CH3区可以包含位置405处的Phe和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置409处的除Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys，位置370处的Thr和位置405处的Leu。第一CH3区可以包含位置409处的Arg，并且所述第二CH3区可以包含位置409处的Lys，位置370处的Thr和位置405处的Leu。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置370处的Lys，位置405处的Phe，位置409处的Arg，并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys，位置370处的Thr和位置405处的Leu。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置409处的除Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置409处的Arg，并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys，和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置350处的Thr，位置370处的Lys，位置405处的Phe和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区包含位置350处的Thr，位置370处的Lys，位置405处的Phe和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区域包含位置350处的Ile，位置370处的Thr，位置405处的Leu和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区域包含位置409处除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，并且所述第二CH3区包含位置405处的除Phe以外的氨基酸，例如位置405处的除Phe，Arg或Gly以外的氨基酸；或所述第一CH3区包含位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，并且所述第二CH3区包含位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸。
本文公开的双特异性抗体可以包含在位置409处具有除Lys，Leu或Met以外的氨基酸的第一CH3区和位置407处具有除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸的第二CH3区。
本文公开的双特异性抗体可以包含具有位置407处的Tyr和位置409处除Lys，Leu或Met以外的氨基酸的第一CH3区和具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr和位置409处的Lys的第二CH3区。
本文公开的双特异性抗体可以包含具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg的第一CH3区和具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸和位置409处的Lys的第二CH3区。
所述第一CH3区可以具有位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区可以具有407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸，例如Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,His,Asn,Pro,Trp或Cys。所述第一CH3区可以具有位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区域可以具有位置407处的Ala,Gly,His,Ile,Leu,Met,Asn,Val或Trp。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区具有位置409处的除Lys，Leu或Met之外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区域具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸，例如Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,His,Asn,Pro,Trp或Cys和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二个CH3区具有位置407处的Ala,Gly,His,Ile,Leu,Met,Asn,Val或Trp和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr之外的氨基酸，例如Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,His,Asn,Pro,Trp或Cys和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区具有位置407处的Ala,Gly,His,Ile,Leu,Met,Asn,Val或Trp和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区具有位置407处的Gly，Leu，Met，Asn或Trp和位置409处的Lys。
本文公开的双特异性抗体可以是抗体，其中第一CH3区具有位置409处的除Lys，Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且第二CH3区可以具有
(i)位置368处的除Phe，Leu和Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，或
(ii)位置370处的Trp，或
(iii)位置399处的除Asp，Cys，Pro，Glu或Gln以外的氨基酸，例如Phe,Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asn,Trp,Tyr或Cys，或
(iv)位置366处的除Lys，Arg，Ser，Thr或Trp以外的氨基酸，例如Phe,Leu,Met,Ala,Val,Gly,Ile,Asn,His,Asp,Glu,Gln,Pro,Tyr或Cys。
第一CH3区域可以具有位置409处的Arg，Ala，His或Gly，并且第二CH3区域可以具有
(i)位置368处的Lys,Gln,Ala,Asp,Glu,Gly,His,Ile,Asn,Arg,Ser,Thr,Val或Trp，或
(ii)位置370处的Trp，或
(iii)位置399处的Ala,Gly,Ile,Leu,Met,Asn,Ser,Thr,Trp,Phe,His,Lys,Arg或Tyr，或
(iv)位置366处的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gln,Phe,Gly,Ile,Leu,Met或Tyr。
第一CH3区可以具有位置409处的Arg，并且第二CH3区可以具有：
(i)位置368处的Asp,Glu,Gly,Asn,Arg,Ser,Thr,Val或Trp，或
(ii)位置370处的Trp，或
(iii)位置399处的Phe,His,Lys,Arg或Tyr，或
(iv)位置366处的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gln。
双特异性抗体可以包括第一和第二重链，其中所述第一和第二重链各自至少包含铰链区，CH2和CH3区，其中(i)在所述第一重链中，对应于人IgG1重链中的F405的位置的氨基酸为L，并且在所述第二重链中，对应于人IgG1重链中的K409的位置的氨基酸为R，或(ii)在所述第一重链中，对应于人IgG1重链中的F405的位置的氨基酸为R，并且在所述第二重链中，对应于人IgG1重链中的K409的位置的氨基酸为L。
在上述指定的氨基酸取代外，相对于野生型重链序列，所述第一和第二重链可进一步包含氨基酸取代，缺失或插入。
在本公开内容的一个实施方案中，所述第一Fc序列和所述第二Fc序列都不在(核心)铰链区中包含Cys-Pro-Ser-Cys序列。在一个替代实施方案中，所述第一Fc序列和所述第二Fc序列均在(核心)铰链区中包含Cys-Pro-Pro-Cys序列。
优选地，与包含相同的第一和第二抗原结合区以及两个包含人IgG1，铰链，CH2和CH3区的重链恒定区(CH)的另一种抗体相比，本发明的药物配制剂中包含的抗体以更小的程度诱导Fc介导的效应器功能。
所述第一和第二重链恒定区(CH)进行了修饰，使得与除了包含非修饰的第一和第二重链恒定区(CH)以外相同的抗体相比，所述抗体以更小的程度诱导Fc介导的效应器功能。
优选地，通过与Fcγ受体结合，与C1q结合或诱导Fc介导的Fcγ受体交联来测量所述Fc介导的效应器功能。
特别地，通过与C1q结合来测量Fc介导的效应器功能。
所述第一和第二重链恒定区可以已经进行了修饰，使得与野生型抗体相比，C1q与所述抗体的结合减少，优选减少至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％或100％，其中优选通过ELISA确定C1q结合。
药物配制剂所包含的结合剂可以是如下的，其中在所述第一和第二重链恒定区(CH)的至少一个中，在与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331对应的位置中一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
在药物配制剂的结合剂中，在所述第一重链和第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235对应的位置分别是F和E。
在药物配制剂的结合剂中，在所述第一和第二重链恒定区(HC)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265对应的位置分别是F、E和A。
药物配制剂可以包含结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区两者的与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265对应的位置分别是F、E和A，并且其中(i)所述第一重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L，并且所述第二重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，或(ii)所述第一重链的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，并且所述第二重链的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L。
药物配制剂可以包含结合剂，其中所述第一和第二重链恒定区两者的与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235对应的位置分别是F和E，并且其中(i)所述第一重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L，并且所述第二重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，或(ii)所述第一重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，并且所述第二重链的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L。
在特定实施方案中，所述第一结合臂包含kappa(κ)轻链，例如包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的kappa轻链，并且所述第二结合臂包含lambda(λ)轻链，例如包含SEQID NO:27所示的氨基酸序列的lambda轻链。
在其他实施方案中，所述第一结合臂包含lambda(λ)轻链，例如包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的lambda轻链，并且所述第二结合臂包含kappa(κ)轻链，例如包含SEQID NO:26所示的氨基酸序列的kappa轻链。
在其他实施方案中，所述第一结合臂和所述第二结合臂均包含lambda(λ)轻链，例如包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的lambda轻链。
在其他实施方案中，所述第一结合臂和所述第二结合臂均包含kappa(κ)轻链，例如包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的kappa轻链。
结合剂可以是如下的，其中所述第一结合臂包含与SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，并且所述第二结合臂包含以SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
或者，结合剂是如下的，其中所述第一结合臂包含以SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，并且所述第二结合臂包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
结合剂可以是诱导和/或增强T细胞增殖的结合剂。
特别地，所述T细胞可以是CD4+和/或CD8+T细胞。
在根据本发明的药物配制剂中，所述结合剂是仅当所述第二抗原结合区结合PD-L1时才可以激活CD137信号传导的结合剂。
可以通过将表达特定T细胞受体(TCR)的T细胞与在由TCR识别的主要组织相容性复合物上呈递相应抗原的树突细胞(DC)共培养来测量T细胞的增殖。
在一个实施方案中，通过抗原特异性测定法来确定所述T细胞增殖的诱导或增强，其中用claudin-6抗原转染DC，并且用识别DC细胞上HLA-A2中呈递的claudin-6衍生的表位的TCR转染T细胞。实施例7中描述了此测定法。
本发明的结合剂可以能够在人肿瘤组织的离体培养物中介导肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的扩增。TIL的扩增可以为1.5倍或更多，2倍或更多，3倍或更多，4倍或更多，5倍或更多，6倍或更多，7倍或更多，8倍或更多，或9倍或或更多或10倍或更多。CD3-CD56+自然杀伤(NK)细胞的扩增可以是至少10倍，例如至少20倍，至少30倍，至少40倍或例如至少50倍。CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的扩增可以是至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍，至少6倍或例如至少7倍。优选地，以响应与对应于0.01、0.1和1μg/mL的双特异性结合剂浓度的温育，诸如响应与对应于0.1μg/mL的双特异性结合剂的浓度的温育，从人非小细胞肺癌组织样本的TIL扩增测定TIL扩增。
可以在包含以下步骤的测定法中确定TIL的扩增：
i)提供肿瘤组织的切除样本，例如新鲜的切除样本，并在造血细胞培养基中洗涤样本，
ii)将肿瘤组织切成具有直径1-2mm的碎片，并提供包含两块肿瘤组织片的样品，
iii)在具有10％人血清白蛋白，抗生素和
Figure BDA0003092988020000391
S(重组人IL-2类似物；SEQID NO:56)的造血细胞培养基(如LonzaTMX-VIVOTM15)中在组织培养板的孔中于37℃,5％CO2将样品与浓度0.1μg/ml的本发明的双特异性结合剂温育72小时；其中当在样品中观察到超过25个TIL微簇时，则将所述样品中的细胞分开并转移到6个样品中，或组织培养板中的6个孔中，
iv)在10-14天的总温育期后收获TIL，并用针对人CD3，人CD4，人CD56和人CD8的标记抗体以及对非存活细胞染色的染料(例如氨基放线菌素D)对它们进行染色；和
v)通过流式细胞术分析每个样品。
本发明的结合剂可以特别地能够诱导外周血单个核细胞(PBMC)群体中的CD40+和CD8+T细胞的扩增，其中通过与抗CD3抗体，例如克隆UCHT1，优选浓度在0.03至0.1μg/mL之间一起温育来活化T细胞，例如亚最佳活化，并且优选与对应于0.2μg/mL的浓度的根据本发明的双特异性结合剂温育。特别地，确定T细胞扩增的过程可以包括以下步骤：
i)从健康供体的血沉棕黄层中获得PBMC，例如通过分离Ficoll梯度，
ii)用PBS中的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记PBMC，
iii)提供包含75000个CFSE标记的PBMC的样品，并于37℃,5％CO2在具有谷氨酰胺并且补充有人AB血清的Iscove改良Dulbecco培养基中将该样品与抗CD3抗体，优选浓度为0.03至0.1μg/mL之间(如对于每个供体预先确定为诱导亚最佳T细胞增殖的浓度)以及与浓度0.2μg/mL的本发明的双特异性结合剂一起温育四天，
iv)用针对人CD4，人CD8，人CD56的标记抗体和可染色非存活细胞的染料(例如7-氨基放线菌素D)对PBMC进行染色；和
v)通过流式细胞术分析样品中不同亚群(CD4+和CD8+T细胞)中的CSFE。
传统方法诸如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin and Zhu(2005)ActaPharmacol Sin 26:649)可以用于制备本发明背景中的结合剂。除了期望的双特异性结合剂外，在宿主细胞中共表达两种抗体(它们由不同的重链和轻链组成)导致可能的抗体产物的混合物，其然后可以通过例如亲和层析或类似方法分离。
当共表达不同抗体构建体时，也可以使用有利于形成功能性双特异性产物的策略，例如，Lindhofer et al.(1995J Immunol 155:219)所述的方法。产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致有限数量的异二聚体蛋白，这是由于优先的物种限制的重/轻链配对。相对于同二聚体促进异二聚体形成的另一种策略是“突出-入-空穴”策略，其中在第一重链多肽中引入突出，并且在第二重链多肽中引入相应的腔，使得该突出可以位于这两个重链的界面处的腔中，从而促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。通过用较大的侧链替换来自第一多肽的界面的小的氨基酸侧链来构建“突出”。通过用较小的氨基酸侧链替换大的氨基酸侧链在第二多肽的界面中创建与突出相同或相似大小的补偿“腔”(美国专利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO2009089004(Amgen)描述了有利于在宿主细胞中不同抗体域共表达后异二聚体形成的其他策略。在这些方法中，构成这两个CH3域中CH3-CH3界面的一个或多个残基替换为带电荷的氨基酸，使得同二聚体的形成在静电上是不利的，而异二聚化在静电上是有利的。WO2007110205(Merck)描述了另一种策略，其中利用IgA和IgG CH3域之间的差异来促进异二聚化。
WO2008119353(Genmab)中已经描述了另一种产生双特异性抗体的体外方法，其中双特异性抗体通过还原条件下温育后两个单特异性抗体IgG4-或IgG4-样抗体之间的“Fab臂”或“半分子”交换(交换重链和连接的轻链)形成。所得的产物是具有两个可以包含不同序列的Fab臂的双特异性抗体。
制备如本文中公开的双特异性PD-L1xCD137结合剂的优选方法包括WO2011131746和WO2013060867(Genmab)中描述的方法，包括以下步骤：
a)提供包含Fc区的第一抗体，所述Fc区包含第一CH3区；
b)提供包含第二Fc区的第二抗体，所述Fc区包含第二CH3区，其中第一抗体是CD137抗体且第二抗体是PD-L1抗体，或反之亦然；
其中所述第一和第二CH3区域的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区域之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区域的每个同二聚体相互作用；
c)在还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育；和
d)获得所述双特异性PD-L1xCD137抗体。
类似地，提供了用于产生如本发明背景中公开的结合剂的方法，该方法包括以下步骤：
a)培养产生包含如本文定义的能够结合人CD137的抗原结合区的第一抗体的宿主细胞，并从培养物中纯化所述第一抗体；
b)培养产生包含如本文定义的能够结合人PD-L1的抗原结合区的第二抗体的宿主细胞，从培养物中纯化所述第二抗体；
c)在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育，并且
d)获得所述双特异性抗体。
在本发明的一个实施方案中，在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育，其中在所得异二聚体抗体中所述第一抗体和第二抗体之间的异二聚体相互作用使得在37℃的24小时后在0.5mM GSH未发生Fab臂交换。
不受理论的限制，在步骤c)中，亲本抗体的铰链区中的重链二硫键被还原，然后所得的半胱氨酸能够与另一个亲本抗体分子(最初具有不同的特异性)的半胱氨酸残基形成重链间的二硫键。在此方法的一个实施方案中，步骤c)中的还原条件包括添加还原剂，例如选自下组的还原剂：2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫丁四醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基-乙醇，优选选自下组的还原剂：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦。在另一个实施方案中，步骤c)包括恢复条件以变为非还原性的或还原性较小的，例如通过除去还原剂，例如通过脱盐。
对于此方法，可以使用上述的任何CD137和PD-L1抗体，包括分别包含第一和/或第二Fc区的第一和第二CD137和PD-L1抗体。此类第一和第二Fc区域(包括此类第一和第二Fc区域的组合)的例子可以包括上述的任何一个。在一个特定的实施方案中，可以分别选择第一抗体和第二CD137和PD-L1抗体，以获得如本文所述的双特异性抗体。
在此方法的一个实施方案中，所述第一和/或第二抗体是全长抗体。
第一和第二抗体的Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。优选地，所述第一和第二抗体的Fc区均为IgG1同种型。或者，所述抗体的Fc区之一是IgG1同种型，并且另一个是IgG4同种型。在后一个情况中，所得的双特异性抗体包含IgG1的Fc序列和IgG4的Fc序列，因此就效应器功能的激活而言可具有令人感兴趣的中间性质。
可以已经将抗体起始蛋白之一工程化改造为不结合蛋白A，从而允许通过使产物通过蛋白A柱而将异二聚体蛋白与所述同二聚体起始蛋白分离。
如上所述，同二聚体起始抗体的第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区的每个同二聚体相互作用。在WO2011131746和WO2013060867(Genmab)(其在此通过引用完整并入)中已经提供了关于这些相互作用以及如何可以实现它们的更多细节。
特别地，在分别结合CD137和PD-L1的两种同二聚体起始抗体的基础上，可以使用本发明的上述方法以高产率获得稳定的双特异性PD-L1xCD137抗体，并且在CH3区中仅含有几个保守的不对称突变。不对称突变是指所述第一和第二CH3区的序列在不同位置处含有氨基酸取代。
本文中公开的双特异性抗体也可以通过在单一细胞中共表达编码第一和第二多肽的构建体来获得。因此，在另一方面，本发明涉及生产双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供编码第一多肽的第一核酸构建体，所述第一多肽包含第一抗体重链的第一Fc序列和第一抗原结合区，所述第一Fc序列包含第一CH3区，
b)提供编码第二多肽的第二核酸构建体，所述第二多肽包含第二抗体重链的第二Fc序列和第二抗原结合区，所述第二Fc序列包含第二CH3区，
其中所述第一和第二CH3区域的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区域之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区域的每个同二聚体相互作用，并且其中所述第一同二聚体蛋白质具有位置409处的Lys，Leu或Met以外的氨基酸，并且所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405和407，任选地，其中所述第一和第二核酸构建体编码所述第一和第二抗体的轻链序列
c)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体，和
d)从细胞培养物中获得所述异二聚体蛋白。
根据本发明提供的药物配制剂优选是水性配制剂。
本发明还提供了制备如上所定义的药物配制剂的方法，该方法包括提供如上所定义的结合剂并将其与以下物质组合：
a.组氨酸缓冲剂
b.约100至约400mM的糖，以及
c.约0.001至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂；
在约4.5至约6.5之间的pH。
应当理解，以上提供的关于组氨酸缓冲剂，糖，非离子表面活性剂和pH的细节也适用于生成制剂的方法。
在另一方面，本发明提供了如上所定义的药物配制剂，用作药物。
药物配制剂可以特别地用于治疗癌症。
本发明进一步提供了用于治疗疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如本文所定义的药物配制剂。
特别地，疾病可以是癌症。
本发明还提供了诱导表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞死亡或抑制其生长和/或增殖的方法，该方法包括向有此需要和/或携带所述肿瘤细胞的受试者施用有效量的如上定义的药物配制剂。
关于如上所述使用的药物配制剂或上述定义的方法，所述癌症特别可以以实体瘤的存在为特征，或者可以选自：黑素瘤，卵巢癌，肺癌，结直肠癌癌症，头颈癌，胃癌，乳腺癌，肾癌，膀胱癌，食道癌，胰腺癌，肝癌，胸腺瘤和胸腺癌，脑癌，神经胶质瘤，肾上腺皮质癌，甲状腺癌，其他皮肤癌，肉瘤，多发性骨髓瘤，白血病，淋巴瘤，骨髓增生异常综合症，卵巢癌，子宫内膜异位癌，前列腺癌，阴茎癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，Merkel细胞癌和间皮瘤。
特别地，癌症可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。
本发明进一步提供了如上定义的药物配制剂在制备药物中的用途，所述药物例如是用于治疗癌症的药物，例如以实体瘤的存在为特征的癌症或选自黑素瘤，卵巢癌，肺癌，结肠癌和头颈癌的癌症。
特别地，肺癌可以是非小细胞肺癌(NSCLC)。
调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度指示按比例减少或增加剂量。胃肠外组合物可以配制成剂量单位形式，以易于施用和剂量均匀。
药物配制剂的有效剂量和剂量方案取决于要治疗的疾病或状况，并且可以由本领域技术人员确定。本发明化合物的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.001-10mg/kg，诸如约0.001-5mg/kg，例如约0.001-2mg/kg，诸如约0.001-1mg/kg，例如约0.001、约0.01、约0.1、约1或约10mg/kg。本发明的结合剂(例如双特异性抗体)的治疗有效量的另一个示例性的非限制性范围是约0.1-100mg/kg，诸如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，例如约0.1-10mg/kg，例如约0.5，例如约0.3、约1、约3、约5、或约8mg/kg。
具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出所需要的药物配制剂的有效量。例如，医师或兽医可以以比实现期望治疗效果所需要的水平更低的水平开始在药物组合物中使用的结合剂(例如双特异性抗体)剂量，并逐渐增加剂量直至实现期望的效果。通常，本发明的结合剂(例如双特异性抗体)的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用可以例如是胃肠外的，例如静脉内，肌肉内或皮下的。在一个实施方案中，可以通过以mg/m2计算的每周剂量通过输注来施用结合剂(例如双特异性抗体)。此类剂量可以例如基于上文根据以下提供的mg/kg剂量：剂量(mg/kg)x 70:1.8。此类施用可以重复例如1至8次，例如3至5次。可以通过2至24小时，例如2至12小时的时段内持续输注进行施用。在一个实施方案中，可以通过长时间(例如超过24小时)内缓慢连续输注来施用结合剂(例如双特异性抗体)，以减少毒性副作用。
当一周一次给予时，药物配制剂可以以以固定剂量计算的每周剂量施用直至8次，例如4至6次。此类方案可以根据需要重复一次或多次，例如在6个月或12个月后。此类固定剂量可以例如基于以上提供的mg/kg剂量，体重估计为70kg。可以通过例如取出生物样品并使用靶向本发明抗体的PD-L1抗原抗原结合区的抗独特型抗体，测量施用后血液中本发明的结合剂(例如双特异性抗体)的量确定或调节剂量。
可以将药物配制剂作为维持疗法施用，诸如例如每周一次，持续6个月或更长时间。
还可以预防性地施用药物配制剂，以降低发生癌症的风险，延迟癌症进展中事件的发生和/或降低癌症缓解时复发的风险。
当如上定义使用时，本发明的药物配制剂优选静脉内施用。
以上定义的用途或方法可包括将药物配制剂与一种或多种其他治疗剂例如化学治疗剂组合使用。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。
序列
表1
Figure BDA0003092988020000451
Figure BDA0003092988020000461
Figure BDA0003092988020000471
Figure BDA0003092988020000481
Figure BDA0003092988020000491
实施例
实施例1：CD137抗体的生成
如WO2016/110584的实施例1中所述生成抗体CD137-009。简而言之，用含有人CD137-Fc融合蛋白的蛋白质混合物对兔进行免疫。从血液中分选出单一B细胞，并通过ELISA和流式细胞术筛选CD137特异性抗体的产生。从筛选阳性的B细胞中提取RNA并进行测序。基因合成重链和轻链的可变区，并将其克隆到人IgG1 kappa表达载体或人IgG1 lambda表达载体中，其包括含有以下氨基酸突变的人IgG1重链：L234F、L235E、D265A和F405L(FEAL)或K409R(FEAR)，其中氨基酸位置编号是根据EU编号(对应于SEQ ID NO:25)。嵌合CD137抗体(CD137-009)的可变区序列显示于本文的序列表SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12中。
实施例2：兔(嵌合)CD137抗体的人源化
来自兔抗CD137-009的人源化抗体序列在Antitope(Cambridge，UK)生成。使用种系人源化(CDR-移植)技术生成人源化抗体序列。基于人种系序列设计人源化V区基因，所述人种系序列与兔抗体的VH和Vκ氨基酸序列具有最接近的同源性。设计了一系列7个VH和3个Vκ(VL)种系人源化V区基因。使用Swiss PDB产生非人亲本抗体V区的结构模型并进行分析以鉴定V区框架中可以对抗体的结合特性重要的氨基酸。注意到这些氨基酸掺入一种或多种变体CDR-移植的抗体中。用作人源化设计基础的种系序列示于表2中。
表2：最接近匹配的人种系V区段和J区段序列。
Figure BDA0003092988020000501
然后使用Antitope专有的计算机技术，iTopeTM和TCEDTM(T细胞表位数据库)选择具有最低潜在T细胞表位发生率的变体序列(Perry,L.C.A,Jones,T.D.and Baker,M.P.NewApproaches to Prediction of Immune Responses to Therapeutic Proteins duringPreclinical Development(2008).Drugs in R&D 9(6):385-396；20；Bryson,C.J.,Jones,T.D.and Baker,M.P.Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins(2010).Biodrugs 24(1):1-8)。最后，对设计的变体的核苷酸序列进行了密码子优化。
人源化CD137抗体(CD137-009-HC7LC2)的可变区序列显示在本文的序列表SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:16中。
实施例3：在野猪CD137或象CD137和人CD137之间进行DNA改组以确定CD137抗体的对结合重要的域
为了确定对CD137抗体与人CD137结合重要的域，在人和野猪CD137(sus scrofa；XP_005665023)之间或人和非洲象CD137(loxodonta africana；XP_003413533)之间进行DNA改组。通过用野猪(改组构建体1-4、6)或象(改组构建体5)域替换人域，从编码人CD137的DNA制备改组构建体。改组构建体的氨基酸序列显示于表1中。
如果人CD137中的域对于抗CD137抗体的结合是重要的，则在用野猪或非洲象域替换该域时将丧失结合。
人和野猪之间以及人和非洲象CD137之间的同源性分别为70.2％和74.5％。选择这两个物种的要求是，与人相比，非洲象和野猪中感兴趣的域有足够的差异，从而导致结合的丧失，而保留关键的结构相互作用，这对于最小化错误折叠或表达丧失的风险是必要的。图1显示了人、野猪和非洲象CD137的序列比对。图2显示了含有野猪CD137或非洲象CD137域的人CD137的构建体，如所示。
将3×106个HEK293T-17细胞接种在T75培养瓶(Greiner Bio-One，目录号658175)中的含有10％FCS(Biochrom，目录号S 0115)的20mL RPMI 1640GlutaMAX培养基中。在O/N温育后，根据制造商的说明书，使用
Figure BDA0003092988020000511
转染试剂，Mirus Bio(VWRInternational，目录号731-0029)，用组成型活性人延伸因子-1alpha(EF-1alpha)启动子下游的编码改组构建体或野猪、非洲象或人CD137的表达载体瞬时转导细胞。次日，使用1.5mL Accutase(Sigma Aldrich，目录号A6964)(在37℃温育5分钟)收获细胞，并且基本上同上所述进行流式细胞术，以测量改组构建体和人、非洲象和野猪CD137的表面表达，并测量抗体克隆与不同改组构建体的结合。为了测量构建体的细胞表面表达，将转导的细胞与1μg/mL山羊多克隆抗人CD137(R&D Systems，目录号AF838)在FACS缓冲剂中温育(4℃，20分钟)，然后与APC标记的抗山羊IgG(H+L)(R&D Systems，目录号F0108)(4℃，20分钟)温育。通过将转导的细胞与1μg/mL的抗体克隆一起温育，然后与APC标记的AffiniPure F(ab’)2片段(1:50最终稀释；Jackson，目录号109-136-127)一起温育来测量不同CD137抗体克隆与表达改组构建体的细胞的结合。
所有CD137改组构建体以及人、非洲象和野猪CD137以相似的表达水平在细胞表面上表达(图3)。
图4显示CD137-009显示出与非洲象和野猪CD137的结合丧失。与结合人CD137相比，CD137-009也显示出与改组构建体5的结合丧失。
实施例4：PD-L1抗体的生成
在Aldevron GmbH(Freiburg,Germany)进行免疫和杂交瘤的产生。将编码人PD-L1氨基酸19-238的cDNA克隆到Aldevron专有表达质粒中。通过使用用于颗粒轰击的手持式装置(“基因枪”)，使用皮内应用涂有人PD-L1cDNA的金颗粒，对OmniRat动物(表达具有完全人独特型的抗体的多样化全集的转基因大鼠；Ligand Pharmaceuticals Inc.,San Diego,USA)进行免疫来生成抗体PD-L1-547。一系列免疫后收集血清样品，并在流式细胞仪中对用上述表达质粒瞬时转染以表达人PD-L1的HEK细胞进行测试。分离产生抗体的细胞，并根据标准程序与小鼠骨髓瘤细胞(Ag8)融合。提取来自产生PD-L1特异性抗体的杂交瘤的RNA，并进行测序。重链和轻链的可变区(SEQ ID NO:17和21)经基因合成并克隆到人IgG1 lambda表达载体中，其包括含有以下氨基酸突变的人IgG1重链：L234F、L235E、D265A和K409R(FEAR)，其中氨基酸位置编号是根据EU编号(对应于SEQ ID NO:24)。
实施例5：通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体
通过在受控的还原条件下进行Fab臂交换产生双特异性IgG1抗体。该方法的基础是使用互补的CH3域，该CH3域在特定的测定条件下促进异二聚体的形成，如WO2011/131746中所述。将F405L和K409R(EU编号)突变引入相关抗体中，以创建具有互补CH3域的抗体对。
为了生成双特异性抗体，将两种亲本互补抗体(每种抗体的终浓度为0.5mg/mL)与75mM 2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)在31℃下以100μL PBS的总体积温育5小时。通过使用旋转柱(Microcon离心过滤器，30k，Millipore)根据制造商的方案除去还原剂2-MEA来终止还原反应。
通过组合以下来自实施例1和4的抗体生成双特异性抗体：
-CD137-009-FEAL抗体与PD-L1-547-FEAR抗体组合
-PD-L1-547-FEAL抗体与CD137-009-FEAR组合
-PD-L1-547-FEAL抗体与CD137-009-HC7LC2-FEAR抗体组合
-b12-FEAL抗体与PD-L1-547-FEAR抗体、与CD137-009-FEAR或与CD137-009-HC7LC2-FEAR抗体组合，使用抗体b12作为第一臂，所述抗体b12是gp120特异性抗体(Barbas,CF.J Mol Biol.1993Apr 5；230(3):812-23)
-PD-L1-547-FEAL或CD137-009-FEAL与b12-FEAR抗体
实施例6：PD-L1抗体对PD-1/PD-L1相互作用的影响
如在Promega(Madison,USA)开发的PD-1/PD-L1抑制生物测定法中测定单价PD-L1抗体b12-FEALxPD-L1-547-FEAR对PD-1和PD-L1相互作用的影响。这是一种基于生物发光细胞的测定法，其由两种遗传工程化细胞系组成：PD-1效应细胞，其是表达由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的人PD-1和萤光素酶报告物的Jurkat T细胞，以及PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞，其是表达人PD-L1和工程化细胞表面蛋白的CHO-K1细胞，所述工程化细胞表面蛋白设计为以不依赖于抗原的方式激活关联TCR。当将两种细胞类型共培养时，PD-1/PD-L1相互作用抑制TCR信号传导和NFAT-RE介导的发光。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体释放抑制信号，并导致TCR活化和NFAT-RE介导的发光。
根据制造商的方案融化PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞(Promega，目录号J109A)，重悬于含有10％胎牛血清(FBS；Promega，目录号：J121A)的Ham’s F12培养基(Promega,目录号J123A)中，并接种在96孔平底培养板(CulturPlate-96，Perkin Elmer，目录号6005680)中。将板在37℃,5％CO2温育16小时。除去上清液，并且添加抗体的连续稀释(最终浓度范围为5至0.001μg/mL；在含1％胎牛血清[FBS；Promega,目录号J121A]的RPMI1640[Lonza,目录号BE12-115F]中的4倍稀释)。添加PD-1效应细胞(Promega，目录号J115A；根据制造商的方案融化并重悬于RPMI/1％FBS)。将板在37℃,5％CO2温育6小时。平衡至室温后，将40μl Bio-Glo试剂(Bio-Glo萤光素酶测定缓冲剂[Promega,目录号G7198]中根据制造商的方案重建的Bio-Glo萤光素酶测定底物[Promega目录号G720B])添加到每孔。将板在室温温育5-10分钟，并使用EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer)测量发光。相对于对照(未添加抗体)，对PD1-PD-L1相互作用的影响如下计算：
诱导倍数＝RLU(诱导-背景)/RLU(无抗体对照-背景)，RLU是相对光单位
图5显示单价抗体b12-FEALxPD-L1-547-FEAR有效地抑制了PD1-PD-L1相互作用。
实施例7：抗原特异性CD8+T细胞增殖测定法以测量与PD-L1和CD137结合的双特异性抗体的作用
CD137xPD-L1双特异性抗体的预期作用模式的示意图显示于图6中。
为了在抗原特异性测定法中测量通过靶向PD-L1和CD137的双特异性抗体对T细胞增殖的诱导，用密蛋白-6体外转录RNA(IVT-RNA)转染树突细胞(DC)以表达密蛋白-6抗原。用PD-1IVT-RNA和用密蛋白-6特异性HLA-A2限制性T细胞受体(TCR)转染T细胞。该TCR可以识别DC上HLA-A2中呈递的密蛋白-6衍生表位。CD137xPD-L1双特异性抗体可以交联在单核细胞衍生的树突细胞上或肿瘤细胞上内源表达的PD-L1以及T细胞上的CD137，从而导致抑制了抑制性PD-1/PD-L1相互作用以及同时CD137的聚集，导致T细胞增殖。在T细胞上表达的CD137受体的聚集导致CD137受体的激活，从而将共刺激信号传递到T细胞。
HLA-A2+外周血单个核细胞(PBMC)获自健康供体(Transfusionszentrale,University Hospital,Mainz,Germany)。根据制造商的说明，使用抗CD14MicroBead(Miltenyi；目录号130-050-201)，通过磁激活细胞分选(MACS)技术从PBMC中分离出单核细胞。将外周血淋巴细胞(PBL，CD14阴性级分)冷冻，用于将来T细胞分离。为了分化成未成熟的DC(iDC)，将1x106个单核细胞/ml在含有5％人AB血清(Sigma-Aldrich Chemie GmbH,目录号H4522-100ML)，丙酮酸钠(Life Technologies GmbH，目录号11360-039)，非必需氨基酸(Life Technologies GmbH，目录号11140-035)，100IU/mL青霉素-链霉素(LifeTechnologies GmbH，目录号15140-122)，1000IU/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF；Miltenyi，目录号130-093-868)和1,000IU/mL白介素-4(IL-4；Miltenyi，目录号130-093-924)的RPMI GlutaMAX(Life technologies GmbH，目录号61870-044)中培养5天。在这五天期间，一次将一半的培养基替换为新鲜的培养基。通过收集非贴壁细胞来收获iDC，并且通过与含有2mM EDTA的PBS在37℃温育10分钟来分离贴壁细胞。洗涤后，将iDC冷冻在含有10％v/v DMSO(AppliChem GmbH，目录号A3672,0050)+50％v/v人AB血清的RPMIGlutaMAX中，以用于将来的抗原特异性T细胞测定法。
在开始抗原特异性CD8+T细胞增殖测定法的前一天，将来自同一供体的冷冻PBL和iDC融化。根据制造商的说明，使用抗CD8 MicroBead(Miltenyi，目录号130-045-201)通过MACS技术从PBL中分离出CD8+T细胞。使用BTX
Figure BDA0003092988020000551
830电穿孔系统设备(BTX；500V，1x3ms脉冲)在4-mm电穿孔比色皿(VWR International GmbH，目录号732-0023)中用250μL X-Vivo15(Biozym Scientific GmbH，目录号881026)中的10μg编码α链的体外翻译(IVT)-RNA加10μg编码密蛋白-6特异性鼠TCR的β链的IVT-RNA(HLA-A2受限；描述于WO 2015150327A1中)加10μg编码PD-1的IVT-RNA对约10-15x 106个CD8+T细胞进行电穿孔。电穿孔后，立即将细胞转移到新鲜的补充有5％人AB血清的IMDM培养基(Life Technologies GmbH，目录号12440-061)中，并在37℃，5％CO2下静置至少1小时。根据制造商的说明，使用PBS中的1.6μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；Invitrogen，目录号C34564)标记T细胞，并在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中温育，O/N。
使用如上所述的电穿孔系统(300V，1x12 ms脉冲)，在250μL X-Vivo15培养基中，用5μg编码全长密蛋白-6的IVT-RNA电穿孔多达5x 106个融化的iDC，并在补充有5％人AB血清的IMDM培养基中温育，O/N。
次日，收获细胞。通过流式细胞术检查DC上的密蛋白-6和PD-L1以及T细胞上的TCR和PD-1的细胞表面表达。用Alexa647缀合的CLDN6特异性抗体(非市售；内部生产)和抗人CD274抗体(PD-L1，eBioscienes，目录号12-5983)对DC进行染色，并用抗小鼠TCRβ链抗体(Becton Dickinson GmbH，目录号553174)和抗人CD279抗体(PD-1，eBioscienes，目录号17-2799)对T细胞染色。在存在双特异性或对照抗体的情况下，在96孔圆底板中补充有5％人AB血清的IMDM GlutaMAX中将5,000个经电穿孔的DC与50,000个经电穿孔的CFSE标记的T细胞一起温育。5天后通过流式细胞术测量T细胞增殖。通过FlowJo软件基于表明细胞分裂的CFSE峰进行了T细胞增殖的详细分析。结果中，“％分裂的细胞”表示进入分裂的细胞的百分比，而“增殖指数”表示进入分裂的细胞的分裂的平均数。
与和b12(作为常规IgG1)温育相比，具有一个无关的结合臂的单价PD-L1对照抗体b12-FEALxPD-L1-547-FEAR在一定程度上增强了T细胞增殖，并且双特异性抗体CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR诱导CD8+T细胞的强烈增殖(图7)。这通过分裂细胞百分比的增加(图7B和D的左图)以及增殖指数的增加(图7B和D的右图)两者来反映。
另外，该测定法中的EC50值是针对CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR确定的。为此，以1至0.00015μg/mL的3倍连续稀释液对双特异性抗体进行分析(图8)。通过FlowJo软件确定分裂细胞的百分比和增殖指数。使用GraphPad Prism 5软件(GraphPad Software,SanDiego,CA,USA)，通过非线性回归(具有可变斜率的S形剂量响应)来分析曲线。CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR诱导抗原特异性T细胞增殖的EC50值对于“％分裂的细胞”为0.003492μg/mL，而对于“增殖指数”为0.005388μg/mL。
实施例8：在具有活性PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞测定法中将靶向PD-L1和CD137的双特异性抗体与两种单价结合的CD137和PD-L1抗体或两种亲本抗体(PD-L1-547+CD137-009)的组合进行比较
为了测量靶向PD-L1和CD137的双特异性抗体对T细胞增殖的诱导，进行了具有活性PD1/PD-L1轴的抗原特异性T细胞增殖测定法(类似于实施例7的一般测定设置)。简而言之，在存在双特异性或对照抗体的情况下，在96孔圆底板中补充有5％人AB血清的IMDMGlutaMAX中将5,000个经密蛋白-6-IVT-RNA电穿孔的DC与50,000个经密蛋白-6特异性TCR和PD1-IVT-RNA电穿孔的CFSE标记的T细胞一起温育。5天后通过流式细胞术测量T细胞增殖。使用FlowJo软件基于表明细胞分裂的CFSE峰进行了T细胞增殖的详细分析。结果中，“％分裂的细胞”表示进入分裂的细胞的百分比，而“增殖指数”表示进入分裂的细胞的分裂的平均数。
当与IgG1-b12进行比较时，具有一个无关的结合臂的单价CD137对照抗体CD137-009-FEALxb12-FEAR和相应的二价亲本抗体CD137-009都不对T细胞增殖具有影响。相比之下，与和IgG1-b12对照抗体温育相比，与单价PD-L1对照抗体以及二价亲本抗体(分别为b12-FEALxPD-L1-547-FEAR和PD-L1-547)温育导致T细胞增殖适度增强。与组合的单价对照抗体(CD137-009-FEALxb12-FEAR+b12-FEALxPD-L1-547-FEAR)和组合的相应亲本抗体(CD137-009+PD-L1-547)一起温育后，可检测到相当水平的T细胞增殖。相反，双特异性抗体CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR诱导了CD8+T细胞强烈的增殖，这优于两种组合的对照(单价和二价)(图9)。这通过分裂细胞百分比的增加(图9B)以及增殖指数的增加(图9C)两者反映出来。
实施例9：离体TIL扩增测定法以评估CD137xPD-L1双特异性抗体对肿瘤浸润淋巴细胞的作用。
为了评估CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的作用，如下进行人肿瘤组织的离体培养。通过使用抹刀(spatula)或血清移液管将分离的肿瘤块从含有洗涤培养基的6孔板(Fisher Scientific目录号10110151)的一个孔中转移到下一个孔，将新鲜的人肿瘤组织切除样品洗涤3次。洗涤培养基由补充有1％Pen/Strep(ThermoFisher，目录号15140-122)和1％两性霉素B(Fungizone)(Thermo Fisher，目录号15290-026)的X-VIVO 15(Biozym，目录号881024)组成。接下来，用手术刀(Braun/Roth，目录号5518091BA223)切割肿瘤，并切成直径约1-2mm的片。将两片各自放入含有1mL TIL培养基(X-VIVO 15，10％人血清白蛋白(HSA，CSL Behring，目录号PZN-6446518)1％Pen/Strep，1％两性霉素B并补充有10U/mL IL-2(
Figure BDA0003092988020000571
S，Novartis Pharma，目录号02238131))的24孔板(VWR international，目录号701605)的一个孔中。以指定的最终浓度添加CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR。将培养板在37℃和5％CO2下温育。72小时后，将1mL含有指定浓度的双特异性抗体的新鲜TIL培养基添加到每个孔中。每隔一天经由显微镜监测孔中是否存在TIL簇。当在各个孔中检测到超过25个TIL微簇时，分别转移孔。为了分开TIL培养物，将24孔板的孔中的细胞重悬于2mL培养基中，并将其转移至6孔板的孔中。另外，每个孔补充了另外2mL的TIL培养基。
经过10-14天的总培养时段后，收获TIL，并通过流式细胞仪进行分析。用以下试剂对细胞进行染色，所有试剂均在染色缓冲剂(含有5％FCS和5mM EDTA的D-PBS)中1:50稀释：抗人CD4-FITC(Miltenyi Biotec，目录号130-080-501)，抗人CD3-PE-Cy7(BD Pharmingen，目录号563423)，7-氨基放线菌素D(7-AAD，Beckman Coulter，目录号A07704)，抗人CD56-APC(eBioscience，目录号17-0567-42)和抗人CD8-PE(TONBO，目录号50-0088)。为了允许定量比较不同处理组之间获得的细胞，在最后的洗涤步骤之后，将细胞沉淀重悬在补充有BDTMCompBead(BD biosciences，目录号51-90-9001291)的FACS缓冲剂中。在BDFACSCantoTMII流式细胞仪(Becton Dickinson)上进行流式细胞术分析，并使用FlowJo7.6.5软件分析采集的数据。通过将获得的7AAD阴性级分相对于获得的珠计数进行标准化来计算与6孔板中相应孔相关的每1,000个珠的相对活TIL计数，CD3+CD8+T细胞计数，CD3+CD4+T细胞计数和CD3-CD56+NK细胞计数。
图10显示了来自人非小细胞肺癌组织样品的TIL扩增的分析。在此，添加了以下浓度的CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR：0.01、0.1和1μg/mL；来自相同患者的未添加抗体的组织样品用作阴性对照。培养10天后，收获TIL并通过流式细胞术分析。对于源自24孔板的不同孔的每种抗体浓度，测量了五个样品(来自5个原始孔)。与没有抗体对照样品的情况下相比，在所有用双特异性抗体培养的样品中，TIL的活计数显著增加。总体而言，当向培养物中添加0.1μg/mL CD137-009-FEALxPD-L1-547-FEAR时，观察到多达10倍的活TIL扩增(图10A)。CD3+CD4+T辅助细胞仅略微扩增(图10C；2.8倍扩增)，而相比之下，对于CD3-CD56+NK细胞可见最明显的TIL扩增(图10D；相对于对照的多达64倍扩增)。还观察到了对CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的强烈作用(图10B；相对于对照的7.4倍扩增)。
实施例10：在OT-1CD8+过继性T细胞转移后，与mPD-L1和mCD137结合的替代双特异性小鼠抗体对C57BL/6小鼠中卵清蛋白特异性T细胞增殖的作用
使用基于受控Fab臂交换的生成鼠双特异性抗体的方法生成替代小鼠双特异性抗体mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A、mCD137-3H3xb12和mPD-L1-MPDL3280Axb12(Labrijn etal,2017Sci Rep.7(1):2476和WO2016097300)。
从BioXcell(目录号BE0239)获得与小鼠4-1BB结合的单克隆抗体3H3，并在ProtTech进行了蛋白质测序。使用专有方法推导推断的cDNA序列。重链和轻链的可变区经基因合成并克隆到小鼠IgG2a表达载体中，其包括含有以下氨基酸突变的鼠IgG2a恒定区：L234A、L235A、F405L和R411T。类似地，将b12的可变区克隆到该表达载体中。
已经描述了抗体MPDL3280A(重链和轻链可变序列分别如SEQ ID NO:50和51中所示)结合人和小鼠PD-L1两者。将该抗体的重链和轻链的可变区克隆到小鼠IgG2a表达载体中，其包括含有以下氨基酸突变的鼠IgG2a恒定区：L234A、L235A、T370K和K409R。
如上文所述，通过Fab臂交换在受控的还原条件下生成双特异性小鼠(本质上是大鼠-人-小鼠嵌合)抗体。
在研究入组前至少六天，将体重在17至24g之间的6-8周龄的雌性C57BL/6JOlaHsd小鼠(Envigo RMS GmbH，Rossdorf，Germany)驯化。这些小鼠用作受体。对OT-1和Thy1.1等位基因两者纯合的雌性或雄性C57BL/6Thy1.1 x C57BL/6J OT-1小鼠进行内部繁殖(从C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/Crl和B6.PL-Thy1a/CyJ小鼠杂交)并用作供体。小鼠可以自由进食食物(ssniff M-Z autoclavable Soest,Germany)和无菌水，并在22℃±2℃及相对湿度55％±15％的12小时光照/黑暗周期下饲养。
在研究开始的当天，处死C57BL/6Thy1.1 x C57BL/6J OT-1供体小鼠并分离脾脏。机械分离脾脏，并通过用红细胞裂解缓冲剂(8.25g/L NH4Cl，1g/LKHCO3、0.1mM EDTA，pH7)重悬脾细胞沉淀物来裂解红细胞。随后，用Dulbecco的PBS(DPBS)洗涤脾细胞，并使用CD8a(Ly-2)MicroBead，小鼠与autoMACS Pro Separator(两者均为Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，Germany)组合来分离CD8+T细胞。每C57BL/6JOlaHsd受体小鼠经眶后注射总体积为200μL的CD8+/OT-1+/Thy1.1+T细胞(2.5-5x105个细胞)。在过继性细胞转移后次日，用100μg卵清蛋白/200μL PBS作为抗原刺激物对受体小鼠进行眶后“接种疫苗”。6小时后，用相应的双特异性抗体对小鼠进行眶后处理。详细地，每小鼠注射100μg或20μg的mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A、mCD137-3H3xb12或mPD-L1-MPDL3280Axb12抗体。普通PBS的注射用作基线参考，并且未处理的动物(仅接受供体细胞的小鼠)用作阴性对照。6天后，经由眶后途径抽取100μL血液，并在BD FACSCanto II细胞仪(Becton Dickinson GmbH)上使用V500大鼠抗小鼠CD45(Becton Dickinson GmbH，目录号561487)，FITC大鼠抗小鼠CD8a(Life Technologies，目录号MCD0801)和Alexa Fluor 647抗大鼠CD90/小鼠CD90.1(BioLegend Europe，目录号202508)抗体对Thy1.1+CD8+T细胞进行分析。Thy1.1(CD90.1)阳性用作OT-1特异性T细胞的替代物。
图11A是OT-1过继性T细胞转移测定法概述的示意图。图11B显示了如通过流式细胞术确所定的Thy1.1+CD8+T细胞频率的分析。对于每种双特异性抗体处理方式，使用n＝5只小鼠。与未处理的动物相比，单独的卵清蛋白抗原刺激导致Thy1.1+CD8+T细胞频率的可检测到的增加。有趣的是，与仅用卵清蛋白处理的动物相比，具有一个不相关的b12结合臂的两种单价对照抗体mCD137-3H3-xb12和mPD-L1-MPDL3280Axb12均不能够增强卵清蛋白特异性OT-1T细胞扩增。相反，双特异性抗体mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A能够诱导OT-1T细胞的强烈增殖，导致在两种测试的剂量水平(20和100μg抗体)下，T细胞频率为10-20％CD8+/OT-1+/Thy1.1+T(总T细胞群的百分比)。
实施例11：与mPD-L1和mCD137的结合的替代双特异性小鼠抗体对皮下同基因CT26小鼠肿瘤模型中肿瘤生长的作用
在研究入组前至少六天，将体重在17至24g之间的6-8周龄的雌性BALB/c Rj小鼠(Janvier,Genest-St.
Figure BDA0003092988020000603
France)驯化。小鼠可以自由进食食物(ssniff M-Zautoclavable Soest,Germany)和无菌水，并在22℃±2℃及相对湿度55％±10％的12小时光照/黑暗周期下饲养。从
Figure BDA0003092988020000602
(目录号CRL-2638TM)获得CT26细胞，并在补充有10％胎牛血清(FBS)(Biochrom，目录号S 0115)的Roswell Park Memorial Institute培养基(RPMI)1640培养基，GlutaMAXTM(Life technologies，目录号61870-044)中在5％CO2中，37℃下培养。使用
Figure BDA0003092988020000601
细胞解离试剂(Life technologies，目录号A1110501)收获细胞，将其重悬于DPBS(Life technologies，目录号14190-169)，并且每小鼠0.5x 106个细胞/100μl皮下(SC)植入到雌性BALB/c Rj小鼠剃光的右侧腹。每2-3天通过卡尺测量来评价肿瘤体积，并使用以下公式将其表示为垂直直径的乘积：a2×b/2，其中b是两个直径的较长者(a＜b)。当平均肿瘤体积达到30mm3时，将动物分为四组。次日开始处理，腹腔内注射20μg与mPD-L1和mCD137结合的双特异性抗体(mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A)，其中具有一个无关的结合臂的单价mCD137对照抗体或mPD-L1对照抗体(mCD137-3H3xb12和mPD-L1-MPDL3280Axb12)或PBS作为阴性对照。给药时间表为前八次注射每2-3天一次，随后每7天注射一次，直到实验结束。肿瘤细胞接种后第29天，经由眶后途径抽取100μL血液，并在BD FACSCanto II细胞仪(Becton Dickinson GmbH)上使用V500大鼠抗小鼠CD45(Becton Dickinson GmbH，目录号561487)、FITC大鼠抗小鼠CD8α(Lifetechnologies，目录号MCD0801)抗体和T-Select H-2Ld MuLV gp70四聚体-SPSYVYHQF-APC(MBL Ltd.Corp.，目录号TS-M521-2)对gp70特异性CD8+T细胞进行分析(gp70是CT26肿瘤细胞上表达的包膜蛋白)。
图12A显示所有四个处理组的肿瘤生长曲线，其中各个线代表单个肿瘤/小鼠。每个绘图的底部给出了各个处理组的无进展生存(PFS)频率。图12B展示了相应的Kaplan-Meier生存曲线，直到肿瘤细胞接种后第71天实验结束。图12C显示了如通过流式细胞术确定的gp70四聚体+CD8+T细胞频率的分析。对于每种处理方式，分析了肿瘤细胞植入后第29天仍然存活的所有小鼠。总而言之，与mPD-L1和mCD137结合的双特异性抗体(mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A)提供了最有效的肿瘤控制，其中10只动物中有5只(即50％)进入完全肿瘤消退。相比之下，对于mCD137-3H3xb12对照，观察到抗肿瘤作用稍弱，但仍很突出；处理导致11只动物中有3只(即27％)能够排斥肿瘤。在这两种情况下，所有进入完全缓解的小鼠直至实验结束均保持无肿瘤。与之形成鲜明对比的是，经mPD-L1-MPDL3280Axb12处理的分组以及PBS对照两者均不能够控制肿瘤负荷，其中mPD-L1-MPDL3280Axb12处理至少导致在肿瘤细胞接种后第15和30天之间，11只动物中有2只(即18％)有一些间歇性肿瘤生长抑制。当查看能够结合gp70四聚体的CD8+T细胞的频率时，在mCD137-3H3xmPD-L1-MPDL3280A处理的动物中可检测到最高的gp70特异性CD8+T细胞频率(2.14％±1.52％)。相比之下，mCD137-3H3xb12(0.90％±0.46％)、mPD-L1-MPDL3280Axb12(0.94％±1.06％)和PBS处理的对照动物(0.66％±0.49％)中的gp70四聚体+CD8-T细胞频率要低得多，在这三种处理方式之间只有最小程度的差异。
实施例12：PD-L1抗体或b12xPD-L1双特异性抗体与肿瘤细胞的结合
PD-L1抗体和b12xPD-L1双特异性抗体与人肿瘤细胞系MDA-MB-231(乳腺癌；ATCC；目录号HTB-26)，PC-3(前列腺腺癌；ATCC；目录号CRL-1435)和SK-MES-1(肺鳞状细胞癌；ATCC；目录号HTB-58)的结合通过流式细胞术分析。
将细胞(3-5x104个细胞/孔)在聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner bio-one，目录号650101)中与50μL PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物(FACS缓冲剂)中抗体的连续稀释液(5倍稀释步骤，范围为0.0001至10μg/mL)于4℃温育30分钟。在FACS缓冲剂中洗涤两次后，将细胞与二抗中于4℃温育30分钟。作为二抗，对于所有实验使用50μL FACS缓冲剂中以1:500稀释的缀合有R-藻红蛋白(PE)的山羊抗人IgG F(ab’)2(目录号109-116-098,JacksonImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)。接下来，将细胞在FACS缓冲剂中洗涤两次，重悬于20μL FACS缓冲剂中，并在iQue筛选器(Intellicyt Corporation,USA)上进行分析。使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量响应)，使用GraphPad Prism V75.04软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)分析结合曲线。
使用MPDL3280A(重链和轻链可变序列分别如SEQ ID NO:50和51中所示)，如所描述的(Poncelet and Carayon,1985,J.Immunol.Meth.85:65-74)进行定量流式细胞术(
Figure BDA0003092988020000621
Dako；目录号K0078)，以定量MDA-MB-231,PC-3和SK-MES-1细胞的质膜上的抗原密度。确定细胞系具有以下PD-L1抗原密度(ABC，抗体结合能力)：
·MDA-MB-231：约21,000个ABC/细胞
·PC-3：约6,000个ABC/细胞
·SK-MES-1：约30,000个ABC/细胞
与MDA-MB-231细胞的结合
图13(A)显示b12-FEALxPD-L1-547-FEAR与MDA-MB-231细胞的剂量依赖性结合，具有比单特异性二价PD-L1-547-FEAR更高的最大结合。
与PC-3细胞的结合
图13(B)显示b12-FEALxPD-L1-547-FEAR与PC3细胞的剂量依赖性结合，具有比单特异性二价PD-L1-547-FEAR更高的最大结合。
与SK-MES-1细胞的结合
图13(C)显示b12-FEALxPD-L1-547-FEAR与SK-MES-1细胞的剂量依赖性结合，具有比单特异性二价PD-L1-547-FEAR更高的最大结合。
实施例13：非抗原特异性T细胞增殖测定法以测量与PD-L1和CD137结合的双特异性抗体的作用
PD-L1xCD137双特异性抗体的预期作用模式的示意图显示于图6中。
为了测量多克隆活化的T细胞中T细胞增殖的诱导，将PBMC与次优浓度的抗CD3抗体(克隆UCHT1)一起温育以活化T细胞，与PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR双特异性抗体或对照抗体组合。在PBMC群体中，表达PD-L1的细胞可以通过双特异性抗体的PD-L1特异性臂结合，而群体中的T细胞可以通过CD137特异性臂结合。在该测定法中，T细胞增殖是经由CD137特异性臂使T细胞反式激活的量度，其通过经由双特异性抗体与表达PD-L1的细胞交联并通过阻断PD-L1:PD-1相互作用来诱导，其测量为T细胞增殖。
使用Ficoll梯度(VWR，目录号17-5446-02)从健康供体(Transfusionszentrale，University Hospital，Mainz，Germany)的血沉棕黄层获得PBMC。根据制造商的说明，使用PBS中的1.6μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Thermo Fisher，目录号C34564)标记PBMC。在96孔圆底板(Sigma Aldrich，CLS3799-50EA)中每孔接种75,000个CFSE标记的PBMC，并在补充有5％人AB血清的150μL IMDM Gluta MAX中与对每个供体预先确定以诱导次优T细胞增殖的次优浓度的抗CD3抗体(R&D Systems，克隆UCHT1，目录号MAB100；0.03-0.1μg/mL终浓度)以及双特异性或对照抗体在37℃，5％CO2中温育四天。通过流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞的增殖，基本上如上所述。含有PE标记的CD4抗体(BD Biosciences，目录号555347；1:80最终稀释度)、PE-Cy7标记的CD8α抗体(克隆RPA-T8，eBioscience，目录号25-0088-41；1:80最终稀释度)、APC标记的CD56抗体(eBiosciences，目录号17-0567；1:80最终稀释度)和7-AAD(Beckman Coulter，目录号A07704；1:80最终稀释度)的30μL FACS缓冲剂用于染色细胞并从分析中排除CD56+自然杀伤(NK)细胞和7-AAD+死细胞。在BD FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences)上测量样品作为增殖读出。通过FlowJo 10.4软件基于表明细胞分裂的CFSE峰对T细胞增殖进行详细分析，并在GraphPad Prism版本6.04(GraphPadSoftware，Inc)中使用导出的扩增指数值绘制剂量反应曲线。扩增指数确定了整个培养的倍数扩增；扩增指数为2.0表示细胞计数加倍，而扩增指数为1.0表示整个细胞计数没有变化。
通过测试了用于刺激的两种不同的抗CD3浓度以及无抗CD3作为对照，分析了来自三个不同供体的PBMC。图14显示双特异性抗体PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR诱导了CD4+和CD8+T细胞两者的强烈扩增。当与和同种型对照抗体b12 IgG一起温育相比，具有一个无关臂的单价CD137对照抗体b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR和相应的二价亲本抗体CD137-009-HC7LC2-FEAR不影响CD4+(A)或CD8+(B)T细胞增殖。仅当抗CD3对PBMC的刺激已经导致强烈的T细胞活化(如仅培养基的对照组中通过较高的扩增指数所观察到的[参见供体1在0.1μg/ml的抗CD3刺激下])时，与b12 IgG相比，单价PD-L1对照抗体以及二价亲本抗体(分别为b12-FEALxPD-L1-547-FEAR和PD-L1-547-FEAR)略微增强了T细胞增殖。对于组合的单价对照抗体(b12-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR+b12-FEALxPD-L1-547-FEAR)和组合的相应的亲本抗体(CD137-009-HC7LC2-FEAR+PD-L1-547-FEAR)也可检测到与单价和二价PD-L1对照抗体相当的T细胞增殖水平。然而，由双特异性PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR抗体诱导的增殖的增强优于两种组合对照(单价和二价)(图14)。
在另一项独立研究中，使用从两个供体获得的PBMC确定了PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR的EC50值，所述供体分别用0.03和0.09μg/mL抗CD3次优地刺激。使用在1μg/mL开始且在0.15ng/mL结束的连续稀释液对PD-L1-547-FEAL xCD137-009-HC7LC2-FEAR进行测定，并包括处于1μg/mL的b12-IgG-FEAL作为同种型对照抗体。对于CD4+和CD8+T细胞的增殖，生成了剂量反应曲线(图15)，并且对于CD8+T细胞的增殖，还确定了EC20、EC50和EC90值，如表4中所示。
表4.基于如通过非抗原特异性T细胞增殖测定法测量的CD8+T细胞扩增数据，确定PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR的EC20、EC50和EC90值。显示的数据是基于四个参数对数拟合计算的值(图15)。
Figure BDA0003092988020000641
实施例14：抗原特异性CD8+T细胞增殖测定法以测量由与PD-L1和CD137结合的双特异性抗体诱导的细胞因子释放
基本上如实施例7所述进行，在抗原特异性测定法中测量了靶向PD-L1和CD137的双特异性抗体PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR诱导的细胞因子释放。
用10μg编码TCRα链和10μg编码β链的RNA(具有或不具有2μg编码PD-1的IVT RNA)对T细胞进行电穿孔。经电穿孔的T细胞未经CFSE标记(如上所述)，但是在电穿孔后立即转移到补充有5％人AB血清的新鲜IMDM培养基(Life Technologies GmbH，目录号12440-061)中。如上所述，用5μg密蛋白-6(CLDN6)编码RNA对iDC电穿孔。在O/N温育后，如上所述，用Alexa647缀合的CLDN6-特异性抗体对DC染色并且用抗小鼠TCRβ链抗体和抗人CD279抗体对T细胞进行染色。
在存在不同浓度的PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR双特异性抗体或对照抗体b12xIgG-FEAL的情况下，在96孔圆底板中的补充有5％人AB血清的IMDM GlutaMAX中将5,000个经电穿孔的DC与50,000个经电穿孔的T细胞一起温育。48小时温育时段后，将板以500x g离心5分钟，并将上清液小心地从每个孔转移到新鲜的96孔圆底板中，并存储在-80℃直至在
Figure BDA0003092988020000651
平台上进行细胞因子分析。根据制造商的说明在MESO QuickPlex SQ120仪器(Meso Scale Diagnostics，LLC.，目录号R31QQ-3)上通过MSD V-Plex人促炎组1(10-Plex)试剂盒(Meso Scale Diagnostics，LLC.，目录号K15049D-2)分析了从抗原特异性增殖测定法收集的上清液中10种不同细胞因子的细胞因子水平。
PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR的添加导致主要IFN-γ、TNF-α、IL-13和IL-8分泌的浓度依赖性增加(图16)。所有其他细胞因子(IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6)的细胞因子水平均未升高到高于用对照抗体b12-IgG-FEAL处理的共培养物中检测到的那些水平。当将其中未用PD-1RNA电穿孔的T细胞的T细胞:DC共培养物与其中用2μg PD-1RNA电穿孔的T细胞的T细胞:DC共培养物进行比较时，对于无PD-1RNA电穿孔共培养物，可检测到稍高的细胞因子水平。对于PD-L1-547-FEALxCD137-009-FEAR剂量反应曲线以及b12-IgG-FEAL对照抗体值均观察到这一点。
实施例15：抗原非特异性体外T细胞增殖测定法以测量由与PD-L1和CD137结合的双特异性抗体诱导的细胞因子释放
基本上如上文所述(实施例14)进行，在抗原非特异性体外T细胞增殖测定法中测量靶向PD-L1和CD137的双特异性抗体PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR诱导的细胞因子释放。反式结合，即双臂同时与其各自的靶标结合对十种促炎性细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-13、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6)的细胞因子释放的作用通过在添加抗体后48小时收集的上清液的多重夹心免疫测定法分析。
PBMC未经CSFE标记(如上所述)，但在分离后立即接种，并且仅使用一种浓度的抗CD3抗体(最终浓度为0.03μg/mL)。
48小时温育时段后，通过以500x g离心5分钟收集细胞，并将上清液小心地从每个孔转移到新鲜的96孔圆底板中，并存储在-80℃直至在
Figure BDA0003092988020000661
平台上进行细胞因子分析。根据制造商的说明在MESO QuickPlex SQ 120仪器(Meso Scale Diagnostics，LLC.，目录号R31QQ-3)上通过MSD V-Plex人促炎组1(10-Plex)试剂盒(Meso Scale Diagnostics，LLC.，目录号K15049D-2)分析了收集的上清液中10种不同细胞因子的细胞因子水平。
添加PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR诱导了主要IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-13的浓度依赖性的分泌增加(图17)。对于IL-10、IL-12p70以及IL-4，也可检测到仅具有轻微升高的水平的剂量反应曲线。IL-1β、IL-6和IL-8的细胞因子水平保持在基线水平，因此与用对照抗体b12-IgG-FEAL处理的共培养物中检测到的那些水平相当。
实施例16：抗体配制剂。
使用实施例5所述的2-MEA诱导的Fab-臂交换过程将抗体IgG1-7717-547-FEAL(7717b)和IgG1-CD137-009-HC7LC2-FEAR(7729a)组合成
Figure BDA0003092988020000662
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR。交换过程后，在添加0.02％PS80或PS20的情况下在20mM组氨酸，250mM蔗糖，pH 5.5中将DuoBody配制成20mg/mL。为了验证配制剂的合适特性，进行了一项研究，其评估pH，赋形剂浓度和表面活性剂类型的影响。下表5概述了所制备的配制剂，包括三种液体配制剂和一种冻干配制剂。
表5：配制剂
Figure BDA0003092988020000671
在配制剂稳定性研究的开始，将每种液体配制剂分成两个工作流。在一个工作流中，对液体配制剂进行5次由在-65℃冷冻12h，然后在25℃融化12h组成的冷冻-融化循环。使用用于第二个工作流的相同方法在5个冷冻/融化循环后测试样品，该方法评估液体配制剂在0、1和2个月时间点的稳定性。
可见颗粒
针对黑色背景和针对白色背景以2000至3750勒克斯的最小强度照明进行可见颗粒计数。
在时间0时，所有配制剂实际上都不含可见颗粒(0-3个颗粒/ml)，但在冷冻-融化循环后仅F1和F2不含可见颗粒。因此，就可见颗粒的形成而言，F1和F2配制剂中的样品是稳定的。结果示于表6。
浊度
通过使用浊度计相对于药典参考标准溶液进行测量来进行浊度测试。将样品溶液的结果(以浊度测定浊度单位(NTU)计)与最接近的参考溶液的结果进行比较。如果样品结果在相应参考溶液的NTU值[-10％至+10％]之内，则将结果报告为与参考溶液相等。
所有浊度值都较低。F1显示最低的浊度，在储存时和应激条件下具有很少的变化。结果示于表6。
亚可见颗粒
使用HIAC仪器通过光遮蔽原理检测5次冷冻-融化循环后的亚可见颗粒。计数大于2、5、10或25微米的颗粒。结果示于表6。
所有测试的配制剂仅包含很少的亚可见颗粒，特别是很少的超过10或25微米的颗粒。
尺寸排阻层析(SEC)
使用尺寸排阻UPLC(SE-UPLC)确定样品中存在的单体、高分子量物质(HMWS/聚集体)和低分子量物质(LMWS/碎片)的量。主峰、HMWS和LMWS以相对峰面积的百分比(％)表示。结果示于表8。
数据显示，所有配制剂的总HMWS和LMWS均较低，并且在冷冻-融化5个循环后未发现HMWS和LMWS的显著增加，但对应激条件观察到聚集增加。配制剂之间没有重大差异。结果示于表8。
成像毛细管等电聚焦(icIEF)
观察到加速和应激条件两者下主要同等型的下降。损失似乎导致酸性和碱性变体两者，并且也存在pH依赖性，与其他配制剂相比，在更高的pH产生更多的酸性变体(F3)。在建议的存储条件下，未观察到变化。结果示于表8。
反相层析(RP-HPLC)：
在非还原条件下，加速和应激条件下主峰含量增加。在还原条件下，观察到微小的变化。结果示于表9。
毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)
对于所有测试的样品，此参数的稳定性概况是非常稳健的。结果示于表10。
总体而言，F1配制剂表现出适合于制药用途的特性。
Figure BDA0003092988020000691
Figure BDA0003092988020000701
Figure BDA0003092988020000711
Figure BDA0003092988020000721
Figure BDA0003092988020000731
Figure BDA0003092988020000741
实施例17：抗体配制剂；稳定性研究。
对
Figure BDA0003092988020000751
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR，批次6371-16(生产日期：2018年5月18日)进行长期(12个月)稳定性研究。
表11中指示
Figure BDA0003092988020000752
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR，批次6371-16的稳定性样品的储存条件和测试间隔。
表11：储存条件和拉出间隔
Figure BDA0003092988020000753
rH指“相对湿度”
从散装容器中取出
Figure BDA0003092988020000754
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR,批次6371-16的适当的代表性样品。对于每个存储条件和时间间隔，模拟运输和存储容器，如表12中的描述存储20mL
Figure BDA0003092988020000755
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR的等分试样。
表12：包装材料
Figure BDA0003092988020000756
对于每个拉出点和储存条件，从适当的储存室中取出一个袋以完成测试。
外观和颜色(欧洲药典颜色视觉液体色标)：
对于≤-65℃和5℃的储存条件，未观察到外观和颜色的变化。对于40℃/75％rH的储存条件，储存6个月后颜色从≤BY7变为≤BY5。
乳白光：
通过使用浊度计相对于药典参考标准溶液进行测量来进行乳白光测试。将样品溶液的结果(以浊度测定浊度单位(NTU)计)与最接近的参考溶液的结果进行比较。如果样品结果在相应参考溶液的NTU值的[-10％至+10％]之内，则将结果报告为等于参考溶液。未观察到乳白光的显著变化。结果范围为<Ref.II至<Ref.III。
pH：
pH范围为5.4至5.6之间，并且完全在5.2至5.8的规定范围内。
通过UV280得到的蛋白质浓度：
对于储存条件≤-65℃和5℃，蛋白质浓度范围为20.1和20.6mg/ml之间，这完全在18.0至22.0mg/ml的规定范围内。对于储存条件40℃/75％rH，结果范围为19.5和22.9mg/ml之间。蛋白质浓度的增加可能是由溶剂的蒸发引起的。
通过尺寸排阻层析(SEC)-HPLC得到的纯度：
对于40℃/75％rH的储存条件，观察到从主峰向低分子量(LMW)和高分子量(HMW)形式的转变。储存6个月后，主峰从99.1面积％减少至71.1面积％。对于5℃的储存条件，在储存2个月后观察到主峰略有减少，但没有明显减少。对于储存条件≤-65℃，在12个月后未观察到明显变化，并且所有结果均符合定义的规格。
通过疏水相互作用层析(HIC)-HPLC得到的纯度：
在抗体纯度上未观察到显著变化。抗体纯度的变化反映分析的变化。未检测到同二聚物PD-L1。
通过成像毛细管等电聚焦(icIEF)得到的电荷异质性：
对于40℃/75％rH的储存条件，观察到从主峰到酸性物质的转变。储存6个月后，主峰从58.3面积％减少至5.7面积％。对于≤-65℃和5℃的储存条件，未观察到显著变化。
通过毛细管电泳(CE)-SDS得到的纯度：
除了在40℃/75％rH储存的样品外，所有样品与参考物相当。对于储存40℃/75％rH，在还原和非还原条件下观察到纯度的下降趋势。储存6个月后，未还原的完整IgG从94.9cor.％面积减少至77.0cor.％面积，并且还原的HC和LC的总和从99.0cor.％面积减少至87.4cor.％面积。对于≤-65℃和5℃的储存条件，未观察到显著变化。
结论：
稳定性数据显示了
Figure BDA0003092988020000773
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR在≤-65℃储存时稳定12个月，并且在未损坏的原始包装中在5℃存储时稳定2个月。对于40℃/75％rH的储存条件，来自SEC-HPLC，icIEF和CE-SDS的结果显示1个月后
Figure BDA0003092988020000772
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR的显著降解。
Figure BDA0003092988020000771
BisG1-7717-547-FEAL/CD137-009-HC7LC2-FEAR批次6371-16的稳定性数据确认了该材料在未损坏的原始包装中在不高于≤-65℃储存时限定的365天货架期。
Figure BDA0003092988020000781
Figure BDA0003092988020000791
Figure BDA0003092988020000801
序列表
<110> 健玛保
生物技术公司
Alintas, Isil
Satijn, David
Rademaker, Rik
Parren, Paul
Sahin, Ugur
Gieseke, Friederike
Muik, Alexander
<120> 抗体配制剂
<130> P/0142-WO-PCT[2]
<150> PCT/EP2018/080369
<151> 2018-11-06
<160> 51
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Phe Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Lys Glu Phe Ser Ala Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Gly Pro Tyr Ser Trp Asp Asp Ser Pro Gln Asp Asn Tyr
100 105 110
Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Tyr Arg Phe Ser Asn Phe Val
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asn Lys
1 5
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Ala Arg Val Gly Pro Tyr Ser Trp Asp Asp Ser Pro Gln Asp Asn Tyr
1 5 10 15
Tyr Met Asp Val
20
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Phe Ser Cys Arg Ser Ser His Ser Ile Arg Ser Arg
20 25 30
Arg Val Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Val
35 40 45
Ile His Gly Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Arg Val Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Gly Ala Ser Ser
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Arg Lys
100 105
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
His Ser Ile Arg Ser Arg Arg
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Gln Val Tyr Gly Ala Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asp Tyr Trp
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Tyr Ile Asp Val Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly
85 90 95
Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Gly Phe Ser Leu Asn Asp Tyr Trp
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ile Asp Val Gly Gly Ser Leu
1 5
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Ala Arg Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Arg Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ala Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Ser
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Tyr Tyr Ala Thr Ile Ser Gly
85 90 95
Leu Gly Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
His Tyr Tyr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Gly Val Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asp Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Asp Val Gly Gly Ser Leu Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Thr Tyr Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ala
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Tyr Tyr Ala Thr Ile Ser Gly
85 90 95
Leu Gly Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Glu Val Gln Leu Leu Glu Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Phe Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Pro Ala Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Ser Phe Gln His Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Phe Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr
1 5
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Ala Ile Pro Ala Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Ser Phe Gln His
1 5 10
<210> 21
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Leu Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val
1 5 10
<210> 24
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEAR取代的IgG1
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEAL取代的IgG1
<400> 25
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 27
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser
1 5 10 15
Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp
20 25 30
Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro
35 40 45
Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn
50 55 60
Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys
65 70 75 80
Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val
85 90 95
Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 28
<211> 290
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(18)
<400> 28
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 29
<211> 290
<212> PRT
<213> 成束猴
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(18)
<400> 29
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Thr Ile Tyr Trp His Leu Leu
1 5 10 15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20 25 30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35 40 45
Asp Leu Thr Ser Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50 55 60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Asn
65 70 75 80
Tyr Arg Gln Arg Ala Gln Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Ala Leu Arg Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100 105 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115 120 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130 135 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165 170 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Leu Asn
180 185 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Ala Asn Glu Ile Phe Tyr
195 200 205
Cys Ile Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210 215 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala Leu Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225 230 235 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Phe Leu Leu Leu Gly Val Ala Leu Thr
245 250 255
Phe Ile Phe Tyr Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Met Lys Lys Cys
260 265 270
Gly Ile Arg Val Thr Asn Ser Lys Lys Gln Arg Asp Thr Gln Leu Glu
275 280 285
Glu Thr
290
<210> 30
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 30
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 31
<211> 253
<212> PRT
<213> 成束猴
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 31
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg
195 200 205
Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
210 215 220
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
225 230 235 240
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
245 250
<210> 32
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人-野猪嵌合CD137
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 32
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Val Pro Asp Pro Cys Ser Asn Cys Ser
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Gly Lys Asn Ile Gln Glu Leu Cys Met Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Gly Gly Cys Glu Leu
195 200 205
<210> 33
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人-野猪嵌合CD137
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 33
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Leu Asn Ser Phe Ser Ser Thr Gly Gly Gln Met Asn Cys Asp Met
50 55 60
Cys Arg Lys Cys Glu Gly Val Phe Lys Thr Lys Arg Ala Cys Ser Pro
65 70 75 80
Thr Arg Asp Ala Glu Cys Glu Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 34
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人-野猪嵌合CD137
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 34
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Val Pro Gly Phe Arg Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ala Met Cys Glu Glu Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Gln Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 35
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人-野猪嵌合CD137
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 35
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Glu Gly Cys Lys Asp Cys Ser Phe Gly Thr Phe Asn Asp Glu
115 120 125
Glu His Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asp Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 36
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人-野猪嵌合CD137
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 36
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Ala Gly Lys
130 135 140
Pro Val Leu Met Asn Gly Thr Lys Ala Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 37
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人-野猪嵌合CD137
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 37
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Thr Asp Phe Ser Pro Gly Thr Pro Ser Thr Thr Met Pro Val
165 170 175
Pro Gly Gly Glu Pro Gly His Thr Ser His Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 38
<211> 255
<212> PRT
<213> 野猪
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 38
Met Gly Asn Gly Tyr Tyr Asn Ile Val Ala Thr Val Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Val Pro Asp Pro Cys Ser Asn Cys Ser
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Gly Lys Asn Ile Gln Glu Leu Cys Met Pro Cys
35 40 45
Pro Ser Asn Ser Phe Ser Ser Thr Ser Gly Gln Lys Ala Cys Asn Val
50 55 60
Cys Arg Lys Cys Glu Gly Val Phe Arg Thr Lys Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Val Cys Glu Cys Val Pro Gly Phe Arg Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ala Met Cys Glu Glu Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Gln Glu Gly Cys Lys Asp Cys Ser Phe Gly Thr Phe Asn Asp Glu
115 120 125
Glu His Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asp Cys Ser Leu Ala Gly Lys
130 135 140
Pro Val Leu Met Asn Gly Thr Lys Ala Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Arg Pro Thr Asp Phe Ser Pro Gly Thr Pro Ser Thr Thr Met Pro Val
165 170 175
Pro Gly Gly Glu Pro Gly His Thr Ser His Val Ile Ile Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Met Ser Thr Ala Val Phe Val Leu Val Ser Tyr Leu Ala Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Gln Gln Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Val
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Leu Lys Pro Ala Gln Thr Val Gln Glu Glu Asp Ala
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 39
<211> 255
<212> PRT
<213> 非洲象(Loxodonta Africana)
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(23)
<400> 39
Met Gly Asn Gly Tyr Tyr Asn Met Val Ala Thr Val Leu Leu Val Met
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Gly Ala Val Gln Asp Ser Cys Arg Asp Cys Leu
20 25 30
Ala Gly Thr Tyr Cys Val Lys Asn Glu Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Leu Asn Ser Phe Ser Ser Thr Gly Gly Gln Met Asn Cys Asp Met
50 55 60
Cys Arg Lys Cys Glu Gly Val Phe Lys Thr Lys Arg Ala Cys Ser Pro
65 70 75 80
Thr Arg Asp Ala Glu Cys Glu Cys Val Ser Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Thr Met Cys Gln Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Glu Gly Cys Lys Asp Cys Cys Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Asn Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Glu Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Ala Asn Gly Thr Lys Lys Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Ala Ala Asp Ser Phe Pro Asp Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ala
165 170 175
Pro Glu Arg Lys Pro Asp His His Pro Gln Ile Ile Thr Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Ile Ser Ala Ala Leu Leu Phe Leu Val Phe Phe Leu Val Val
195 200 205
Arg Phe Ser Val Ala Lys Trp Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Ile Lys Pro Val Gln Thr Ala Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Asp Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 40
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp
1 5 10 15
Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser
20 25 30
Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys
35 40
<210> 41
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu
165 170 175
Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg
180 185 190
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
195 200 205
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
210 215 220
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
225 230
<210> 42
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有FEAR取代的VH-CD137
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr Trp
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
<210> 46
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Asn Ile Gly Asp Gln Tyr
1 5
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val
1 5 10
<210> 49
<211> 153
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组人白介素类似物
<220>
<221> 信号
<222> (1)..(20)
<400> 49
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Ser Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 50
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Tyr
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (75)

1.药物配制剂，其包含
a.结合剂，所述结合剂包含结合人CD137(4-1BB)的第一抗原结合区和结合人PD-L1(CD274)的第二抗原结合区，
-所述第一抗原结合区，其包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，所述第一重链可变区包含存在于以SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述第一轻链可变区包含存在于以SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，和
-所述第二抗原结合区，其包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述第二重链可变区包含存在于以SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述第二轻链可变区包含存在于以SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列内的三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；
b.组氨酸缓冲剂，
c.约100至约400mM的糖，和
d.约0.001至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂；
并且具有约4.5至约6.5之间的pH。
2.根据权利要求1的药物配制剂，所述配制剂包含1至100mM组氨酸，例如5至100mM、10至100mM、15至100mM、5至90mM、5至80mM、5至70mM、5至60mM、5至50mM、5至40mM、5至30mM、10至90mM、10至80mM、10至70mM、10至60mM、10至50mM、10至40mM、10至30mM、15至90mM、15至80mM、15至70mM、15至60mM、15至50mM、15至40mM、15至30mM或15至20mM组氨酸。
3.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，所述配制剂包含约20mM组氨酸，例如20mM组氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，所述药物配制剂包含100至400mM糖，例如125至400mM、150至400mM、150至400mM、175至400mM、200至400mM、225至400mM、100至375mM、100至350mM、100至325mM、100至300mM、125至375mM、125至350mM、125至325mM、125至300mM、125至275mM、150至375mM、150至350mM、150至325mM、150至300mM、150至275mM、175至375mM、175至350mM、175至325mM、175至300mM、175至275mM、200至375mM 1、200至350mM 1、200至325mM、200至300mM、200至275mM、225至375mM、225至350mM、225至325mM、225至300mM、或例如225至275mM的糖。
5.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，所述配制剂包含约250mM的糖，例如250mM的糖。
6.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述糖是蔗糖。
7.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，所述药物配制剂包含0.005至0.1％(w/v)的非离子表面活性剂，例如0.01至0.1％(w/v)、0.015至0.1％(w/v)、0.001至0.09％(w/v)、0.001至0.08％(w/v)、0.001至0.07％(w/v)、0.001至0.06％(w/v)、0.001至0.05％(w/v)、0.001至0.04％(w/v)、0.001至0.02％(w/v)、0.005至0.1％(w/v)、0.005至0.09％(w/v)、0.005至0.08％(w/v)、0.005至0.07％(w/v)、0.005至0.06％(w/v)、0.005至0.05％(w/v)、0.005至0.04％(w/v)、0.005至0.03％(w/v)、0.005至0.02％(w/v)、0.01至0.09％(w/v)、0.01至0.08％(w/v)、0.01至0.07％(w/v)、0.01至0.06％(w/v)、0.01至0.05％(w/v)、0.01至0.04％(w/v)、0.01至0.03％(w/v)、0.01至0.02％(w/v)、0.015至0.09％(w/v)、0.015至0.08％(w/v)、0.015至0.07％(w/v)、0.015至0.06％(w/v)、0.015至0.05％(w/v)、0.015至0.04％(w/v)、0.015至0.03％(w/v)、或例如0.015至0.02％(w/v)的非离子表面活性剂。
8.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，所述配制剂包含约0.02％(w/v)的非离子表面活性剂，例如0.02％(w/v)的非离子表面活性剂。
9.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述非离子表面活性剂是2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙基(E)-十八碳-9-烯酸酯(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯；Polysorbate 80)或2-[2-[3,4-双(2-羟基乙氧基)氧杂环戊-2-基]-2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]十二酸乙酯(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯；Polysorbate 20)。
10.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其具有4.5至6.5之间，例如在4.7至6.5之间，例如在4.9和6.5之间，在5.1和6.5之间，在5.3和6.5之间，在4.5和6.3之间，在4.7和6.1之间，在4.7和5.9之间，在4.7和5.7之间，在5.1和6.3之间，在4.7和6.1之间，在4.7和5.9之间，在4.7和5.7之间，在4.9和6.3之间，在4.9和6.1之间，在4.9和5.9之间，在4.9和5.7之间，在5.1和6.3之间，在5.1和6.1之间，在5.1和5.9之间，在5.1和5.7之间，在5.3和6.3之间，在5.3和6.1之间，在5.3和5.9之间，例如5.3和5.7之间的pH。
11.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其具有约5.5的pH，例如5.5的pH。
12.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其包含5至200mg/mL的所述结合剂，例如10至200mg/mL、20至200mg/mL、40至200mg/mL、60至200mg/mL、80至200mg/mL、100至200mg/mL、120至200mg/mL、150至200mg/mL、5至150mg/mL、10至150mg/mL、20至150mg/mL、40至150mg/mL、60至150mg/mL、80至150mg/mL、100至150mg/mL、5至130mg/mL、10至130mg/mL、20至130mg/mL、40至130mg/mL、60至130mg/mL、80至130mg/mL、100至130mg/mL、5至100mg/mL、10至100mg/mL、15至100mg/mL、20至100mg/mL、30至100mg/mL、40至100mg/mL、50至100mg/mL、60至100mg/mL、5至80mg/mL、5至60mg/mL、5至50mg/mL、5至40mg/mL、5至30mg/mL、5至20mg/mL、10至80mg/mL、10至60mg/mL、10至50mg/mL、10至40mg/mL、10至30mg/mL、15至80mg/mL、15至60mg/mL、15至40mg/mL、或例如15至25mg/mL的所述结合剂。
13.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其包含约20mg/mL的所述结合剂，例如20mg/mL的所述结合剂。
14.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述配制剂包含
i)约20mg/mL的所述结合剂，例如约40mg/mL，约60mg/mL，约80mg/mL，约100mg/mL，约120mg/mL或约140mg/mL，和
ii)约20mM组氨酸，约250mM糖和约0.02％(w/v)的非离子表面活性剂，并且具有约5.5的pH。
15.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述配制剂包含
i)20mg/mL的所述结合剂，例如40mg/mL，60mg/mL，80mg/mL，100mg/mL，120mg/mL或140mg/mL，和
ii)20mM组氨酸，250mM糖和0.02％(w/v)的非离子表面活性剂并且具有5.5的pH。
16.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中根据针对黑色背景和针对白色背景在2000至3750勒克斯之间的强度照明下进行的可见颗粒计数所确定的，所述配制剂在已经进行了5次由-65℃冷冻12h，然后于25℃融化12h组成的冷冻-融化循环后基本上不含可见颗粒。
17.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述结合剂是抗体，例如双特异性抗体。
18.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中每个可变区包含三个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架区FR1、FR2、FR3和FR4。
19.根据权利要求18所述的药物配制剂，其中所述互补性决定区和所述框架区按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
20.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中
-所述第一抗原结合区包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，所述第一重链可变区包含分别以SEQ ID NO:9、10、11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第一轻链可变区包含分别以SEQ ID NO:13、GAS和SEQ ID NO:14所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，以及
-所述第二抗原结合区包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述第二重链可变区包含分别以SEQ ID NO:18、19和20所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第二轻链可变区包含分别以SEQ ID NO:22、DDN和SEQ ID NO:23所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
21.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中
-所述第一抗原结合区包含与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第一重链可变区(VH)；和与SEQ ID NO:16所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第一轻链可变区(VL)；和
-所述第二抗原结合区包含与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第二重链可变区(VH)；和与SEQ ID NO:21所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性的第二轻链可变区(VL)。
22.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中
-所述第一抗原结合区包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL)，所述第一重链可变区包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第一重链可变区与SEQ ID NO:15所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性；所述第一轻链可变区包含分别以SEQID NO:13、GAS和SEQ ID NO:14所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第一轻链可变区与SEQID NO:16所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性，以及
-所述第二抗原结合区包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)，所述第二重链可变区包含分别以SEQ ID NO:18、19和20所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第二重链可变区与SEQ ID NO:17所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性；所述第二轻链可变区包含分别以SEQID NO:22、DDN和SEQ ID NO:23所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述第二轻链可变区与SEQID NO:21所示的序列具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的序列同一性。
23.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中：
a.所述结合人CD137的第一抗原结合区包含
-第一重链可变区，其包含SEQ ID NO:15所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:15所示的序列相比至多20个氨基酸残基，例如至多19个，至多18个，至多17个，至多16个，至多15个，至多14个，至多13个，至多12个，至多11个，至多10个，至多9个，至多8个，至多7个，至多6个，至多5个，至多4个，至多3个，至多2个，至多1个氨基酸残基是修饰的，所述第一重链可变区(VH)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和
-第一轻链可变区，其包含SEQ ID NO:16所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:16所示的序列相比至多20个氨基酸残基，例如至多19个，至多18个，至多17个，至多16个，至多15个，至多14个，至多13个，至多12个，至多11个，至多10个，至多9个，至多8个，至多7个，至多6个，至多5个，至多4个，至多3个，至多2个，至多1个氨基酸残基是修饰的，所述第一轻链可变区(VL)包含分别以SEQ ID NO:13、GAS和SEQ ID NO:14所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区包含
-第二重链可变区，其包含SEQ ID NO:17所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:17所示的序列相比至多20个氨基酸残基，例如至多19个，至多18个，至多17个，至多16个，至多15个，至多14个，至多13个，至多12个，至多11个，至多10个，至多9个，至多8个，至多7个，至多6个，至多5个，至多4个，至多3个，至多2个，至多1个氨基酸残基是修饰的，所述第二重链可变区(VH)包含分别以SEQ ID NO:18、19和20所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；和
-第二轻链可变区，其包含SEQ ID NO:21所示的序列或如下的序列，其中与SEQ ID NO:21所示的序列相比至多20个氨基酸残基，例如至多19个，至多18个，至多17个，至多16个，至多15个，至多14个，至多13个，至多12个，至多11个，至多10个，至多9个，至多8个，至多7个，至多6个，至多5个，至多4个，至多3个，至多2个，至多1个氨基酸残基是修饰的，所述第二轻链可变区(VL)包含分别以SEQ ID NO:22、DDN和SEQ ID NO:23所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
24.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述结合剂包含(i)包含所述第一重链可变区(VH)并进一步包含第一重链恒定区(CH)的多肽，和(ii)包含所述第二重链可变区(VH)并进一步包含第二重链恒定区(CH)的多肽。
25.根据前述权利要求中任一项的药物组合物，其包含(i)包含所述第一轻链可变区(VL)并进一步包含第一轻链恒定区(CL)的多肽和(ii)包含所述第二轻链可变区(VL)并进一步包含第二轻链恒定区(CL)的多肽。
26.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其是包含第一结合臂和第二结合臂的抗体，其中
a.所述第一结合臂包含i)包含所述第一重链可变区(VH)和所述第一重链恒定区(CH)的多肽和ii)包含所述第一轻链可变区(VL)和所述第一轻链恒定区(CL)的多肽和；
b.所述第二结合臂包含i)包含所述第二重链可变区(VH)和所述第二重链恒定区(CH)的多肽和ii)包含所述第二轻链可变区(VL)和所述第二轻链恒定区(CL)的多肽。
27.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述第一抗原结合区结合以SEQID NO:30所示的人CD137或其成熟多肽。
28.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述第一抗原结合区结合以SEQID NO:31所示的食蟹猴(食蟹猕猴)CD137，或其成熟多肽。
29.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述第一抗原结合区结合以SEQID NO:28所示的人PD-L1，或其成熟多肽。
30.根据前述权利要求中任一项所述的药物配制剂，其中所述第二抗原结合区结合以SEQ ID NO:29所示的食蟹猴(食蟹猕猴)PD-L1，或其成熟多肽。
31.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述第二抗原结合区抑制人PD-L1与人PD-1的结合。
32.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述结合剂为全长抗体或抗体片段的形式。
33.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述结合剂是选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的同种型。
34.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述结合剂是全长IgG1抗体。
35.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中
a.所述结合CD137的第一抗原结合区源自嵌合抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区源自嵌合抗体。
36.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中
a.所述结合CD137的第一抗原结合区源自人源化抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区源自人源化抗体。
37.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中
a.所述结合人CD137的第一抗原结合区源自人抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区源自人抗体。
38.根据前述权利要求中任一项的结合剂，其中
a.所述结合人CD137的第一抗原结合区源自人源化抗体，和/或
b.所述结合人PD-L1的第二抗原结合区源自人抗体。
39.根据权利要求26至38中任一项的药物配制剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)各自包含恒定区结构域1区(CH1区)、铰链区、CH2区和CH3区的一个或多个，优选至少铰链区，CH2区和CH3区。
40.根据权利要求39的药物配制剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)各自包含CH3区，并且其中所述两个CH3区包含不对称突变。
41.根据权利要求25至40中任一项所述的药物配制剂，其中在所述第一重链恒定区(CH)中，在与选自下组的位置对应的位置中的氨基酸中的至少一个已经被取代：根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，在与选自下组的位置对应的位置中的氨基酸中的至少一个已经被取代：根据EU编号的人IgG1重链中的T366、L368、K370、D399、F405、Y407和K409，并且其中所述第一和所述第二重链不在相同位置处被取代。
42.根据权利要求41的药物配制剂，其中(i)在所述第一重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链恒定区(CH)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置中的氨基酸是R，或(ii)在所述第一重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置中的氨基酸是L。
43.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中与包含相同的第一和第二抗原结合区以及两个包含人IgG1铰链、CH2和CH3区的重链恒定区(CH)的另一种抗体相比，所述抗体以更小的程度诱导Fc介导的效应物功能。
44.根据权利要求43的药物配制剂，其中所述第一和第二重链恒定区(CH)进行了修饰，使得与除了包含未修饰的第一和第二重链恒定区(CH)以外其它相同的抗体相比，所述抗体以更小的程度诱导Fc介导的效应物功能。
45.根据权利要求43至44中任一项的药物配制剂，其中通过与Fcγ受体结合，与C1q结合或诱导Fc介导的Fcγ受体交联来测量所述Fc介导的效应物功能。
46.根据权利要求45所述的药物配制剂，其中通过与C1q结合来测量所述Fc介导的效应物功能。
47.根据权利要求43-46中任一项的药物配制剂，其中所述第一和第二重链恒定区已经进行了修饰，使得与野生型抗体相比，C1q与所述抗体的结合减少，优选减少至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％或100％，其中优选通过ELISA确定C1q结合。
48.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中在所述第一和第二重链恒定区(CH)的至少一个中，在与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235、D265、N297和P331对应的位置中一个或多个氨基酸分别不是L、L、D、N和P。
49.根据权利要求48的药物配制剂，其中在所述第一重链和第二重链中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235对应的位置分别是F和E。
50.根据权利要求48的药物配制剂，其中在所述第一和第二重链恒定区(HC)中，与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265对应的位置分别是F、E和A。
51.根据权利要求48的药物配制剂，其中所述第一和第二重链恒定区两者的与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234、L235和D265对应的位置分别是F、E和A，并且其中(i)所述第一重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L，并且所述第二重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，或(ii)所述第一重链的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，并且所述第二重链的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L。
52.根据权利要求48所述的药物配制剂，其中所述第一和第二重链恒定区两者的与根据EU编号的人IgG1重链中的位置L234和L235对应的位置分别是F和E，并且其中(i)所述第一重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L，并且所述第二重链的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，或(ii)所述第一重链恒定区的与根据EU编号的人IgG1重链中的K409对应的位置是R，并且所述第二重链的与根据EU编号的人IgG1重链中的F405对应的位置是L。
53.根据权利要求26至52中任一项的药物配制剂，其中所述第一结合臂包含kappa(κ)轻链，例如包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的kappa轻链，并且所述第二结合臂包含lambda(λ)轻链，例如包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的lambda轻链。
54.根据权利要求26至52中任一项所述的药物配制剂，其中所述第一结合臂包含lambda(λ)轻链，例如包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的lambda轻链，并且所述第二结合臂包含kappa(κ)轻链，例如包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的kappa轻链。
55.根据权利要求26至52中任一项的药物配制剂，其中所述第一结合臂和所述第二结合臂两者均包含lambda(λ)轻链，例如包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的lambda轻链。
56.根据权利要求26至52中任一项的药物配制剂，其中所述第一结合臂和所述第二结合臂两者均包含kappa(κ)轻链，例如包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的kappa轻链。
57.根据权利要求26至56中任一项的药物配制剂，其中所述第一结合臂包含以SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列，并且所述第二结合臂包含以SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
58.根据权利要求26至56中任一项的药物配制剂，其中所述第一结合臂包含以SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列，并且所述第二结合臂包含以SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
59.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中所述结合剂诱导和/或增强T细胞的增殖。
60.根据权利要求59的药物配制剂，其中所述T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。
61.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，其中仅当所述第二抗原结合区结合PD-L1时，所述结合剂才激活CD137信号传导。
62.根据权利要求59至61的药物配制剂，其中通过将表达特定T细胞受体(TCR)的T细胞与在由所述TCR识别的主要组织相容性复合物上呈递相应抗原的树突细胞(DC)共培养来测量T细胞的增殖。
63.根据前述权利要求中任一项的药物配制剂，所述配制剂是水性配制剂。
64.如前述权利要求中任一项限定的药物配制剂，其用作药物。
65.如权利要求1至64中任一项限定的药物配制剂，其用于治疗癌症。
66.治疗疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的如权利要求1至64中任一项限定的药物配制剂。
67.根据权利要求66的方法，其中所述疾病是癌症。
68.产生如权利要求1至64中任一项限定的药物配制剂的方法，所述方法包括提供如权利要求1至65中任一项中限定的结合剂，并将其与以下物质组合：
a.组氨酸缓冲剂，
b.约100至约400mM的糖，以及
c.约0.001至约0.1％(w/v)的非离子表面活性剂；
在约4.5至约6.5之间的pH。
69.诱导表达PD-L1的肿瘤细胞的细胞死亡或抑制其生长和/或增殖的方法，所述方法包括向有此需要和/或带有所述肿瘤细胞的受试者施用有效量的如权利要求1至64中任一项限定的药物配制剂。
70.根据权利要求65使用的药物配制剂，或根据权利要求67的方法，其中所述癌症的特征在于实体瘤的存在或者所述癌症选自：黑素瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌和头颈癌。
71.根据权利要求65使用的药物配制剂，或根据权利要求67或68的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)。
72.根据权利要求1至64中任一项的药物配制剂用于制备药物，如治疗癌症的药物的用途，所述癌症例如为以实体瘤的存在为特征的癌症或选自下组的癌症：黑素瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌和头颈癌。
73.根据权利要求72的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。
74.根据权利要求64或65使用的药物配制剂，根据权利要求72至73中任一项的用途或根据权利要求66、67、69中任一项的方法，其中静脉内施用所述药物配制剂。
75.根据权利要求64或65使用的药物配制剂，根据权利要求72至73中任一项的用途或根据权利要求66、67、69中任一项的方法，其中所述用途或方法包括与一种或多种进一步的治疗剂，例如化学治疗剂组合。
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