CN113444737A

CN113444737A - 细胞色素p450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用

Info

Publication number: CN113444737A
Application number: CN202010214722.2A
Authority: CN
Inventors: 王猛; 肖晗; 袁伟
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS; Shanghai Jiao Tong University
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS; Shanghai Jiao Tong University
Priority date: 2020-03-24
Filing date: 2020-03-24
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2040-03-24
Also published as: CN113444737B

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用。本发明获得的CYP基因GL20421可催化灵芝酸HLDOA形成一种新的天然灵芝三萜产物‑式(I)所示的灵芝三萜类化合物；本发明获得的CYP基因GL21117可催化灵芝酸HLDOA形成的灵芝酸Jb，其与天然的化合物结构完全一致，具有同等的产品性能和质量。本发明通过将GL20421和GL21117基因在酿酒酵母中异源表达，实现了灵芝三萜类化合物异源生物合成，产率高，具有广泛的应用前景。

Description

细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用。

背景技术

三萜类化合物由六个异戊二烯单元聚合而成，在自然界中分布广泛、种类众多，主要以游离、苷或酯的形式广泛存在于蕨类、真菌类、单子叶和双子叶植物中，少数存在于动物体内(Vincken,J.P.,et al.,Phytochemistry,2007.68(3):p.275-97)。研究表明，三萜类化合物具有降血糖、抗炎、降血脂等多种生物活性(郑光海等,华西药学杂志,2011.26(03):294-297)，是抗糖尿病药物研究的重要先导化合物(诸夔妞等，中国药科大学学报，2015，46(6)：764-770)，在抗肿瘤方面具有“靶向杀伤”的特性，对乳腺癌、肺癌、直肠癌和中枢神经癌等多种肿瘤均具有显著的抑制效果(Kim,E.H.,et al.,Cancer Prev Res(Phila),2011.4(3):425-34；Zhang,Y.,et al.,Food Chem,2013.138(1):208-13；Yu,L.,et al.,Bioorg Med Chem Lett,2012.22(16):5232-8；Lanzotti,V.,et al.,Bioorg MedChem,2012.20(10):3280-6；Shanmugam,M.K.,et al.,BiochemPharmacol,2013.85(11):1579-87)，成为近年来国内外抗肿瘤药物研究的焦点之一(Shanmugam,M.K.,et al.,Biochem Pharmacol,2013.85(11):1579-87；Szakiel,A.,et al.,J Agric Food Chem,2012.60(19):4994-5002；Pena-Rodriguez,L.M.,et al.,J Org Chem,2014.79(7):2864-73)。

研究表明，三萜类化合物具有几大类不同的骨架结构，各化合物间的差异取决于骨架形成后的后修饰过程，其中细胞色素P450酶(Cytochrome P450，CYP)发挥主要作用，是三萜类化合物生物合成途径研究的重点。目前对三萜类化合物生物合成的研究主要集中在植物方面。

灵芝中含有丰富的三萜类化合物。从1982年(Kubota,T.,et al.,HelveticaChimica Acta,1982.65:611-619)起，目前人们已成功分离鉴定出200多种灵芝三萜类化合物(Baby,S.,et al.,Phytochemistry,2015.114:66-101)。灵芝在辅助肿瘤治疗、抗HIV、提高人体免疫力、延缓衰老等方面具有显著效果(Sliva,D.,Mini Rev Med Chem,2004.4(8):873-9)。灵芝这些独特的功效得源于其胞内一系列具有生理活性的次级代谢产物。其中，灵芝三萜类化合物尤为重要(Qin,H.,et al.,Bioreactor Engineering Research andIndustrial Applications I:Cell Factories,2016.199-235)，引起人们的广泛关注(Tang,W.,et al.,Life Sci,2006.80(3):205-211；Zhao,Y.,et al.,Bioresour Technol,2018.257:339-343；Lan,X.,et al.,Biotechnol Bioeng,2019.116(12):3301-3311)。

然而，灵芝的生长周期过长且易受环境因素影响，灵芝三萜类化合物产量过低，产物提取、分离纯化程序繁琐，成本较高，都严重限制了灵芝三萜的开发和利用。

由于缺少成熟的灵芝真菌细胞基因操作手段以及对灵芝三萜生物合成途径相关基因的认知匮乏(Xiao,H.,et al.,Trends Biotechnol,2016.34(3):242-255；Xiao,H.,etal.,Trends in Biotechnology,2019.37(6):618-631)，通过代谢工程改造灵芝真菌实现灵芝三萜类化合物产量的大幅提高也具有极大的挑战和困难。目前，灵芝三萜的相关研究都停留在实验室阶段，鲜有成药报道。挖掘新型灵芝三萜类化合物，降低成本以提高灵芝三萜类化合物的生产效率，成为科研工作者面临的两大课题。

合成生物学的发展和酿酒酵母模式生物的深入研究为灵芝三萜类化合物的挖掘和开发提供了一种非常有潜力的途径。酿酒酵母具有基因组序列明确、有丰富的基因操作手段、含有多种三萜化合物生物合成的前体、内质网和翻译后修饰系统利于真核基因表达等特点，在异源表达真菌类、植物类来源天然产物生物合成基因尤其是细胞色素P450酶方面具有其他微生物无可比拟的显著优势(Xiao,H.,et al.,Trends in Biotechnology,2019.37(6):618-631)，得到了国内外科学家的广泛认同和采用(Lan,X.,et al.,Biotechnol Bioeng,2019.116(12):3301-3311；Ajikumar,P.K.,et al.,Mol Pharm,2008.5(2):167-90；Dai,Z.,et al.,Sci Rep,2014.4:3698；Yan,X.,et al.,Cell Res,2014.24(6):770-3)。利用合成生物学的技术手段，对酿酒酵母进行改造，将灵芝中可能与灵芝三萜类化合物合成相关的基因导入酿酒酵母中进行表达，实现对灵芝中新型灵芝三萜类化合物的深入挖掘及灵芝三萜类化合物的异源生物合成成为可能。

研究表明，灵芝细胞内通过甲羟戊酸途径(Mevalonate pathway)合成羊毛甾醇(Lanosterol)，通过同位素示踪技术研究表明，羊毛甾醇是灵芝三萜的直接生物合成前体(Yeh,S.-f.Proc Natl Sci Council ROC(B).1989)。细胞色素P450酶CYP5150L8能够催化羊毛甾醇，经过三步氧化反应形成一种灵芝三萜HLDOA(Ganoderic acid HLDOA)(Wang,W.F.,et al.,Biotechnol Bioeng,2018.115(7):1842-1854)。而灵芝三萜类化合物的其他生物合成基因仍未可知。

发明内容

针对现有人工栽培灵芝或灵芝深层发酵的宿主生长缓慢等不足，本发明提出一种基于合成生物学策略发现新颖灵芝三萜类化合物并实现其异源生物合成的方法，具体来讲是通过挖掘鉴定和灵芝三萜生物合成相关的细胞色素P450酶基因，并在酿酒酵母细胞中异源表达，从而实现灵芝三萜类化合物的异源生物合成。

本发明提供如下技术方案：

本发明首先提供编码细胞色素P450酶或其催化活性片段的核酸分子，包括如SEQID No.1(GL20421基因)或SEQ ID No.3(GL21117基因)所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种细胞色素P450酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4所示；或者，与SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4具有65％以上的同源性，例如70％以上、80％以上、90％以上、95％以上或者99％以上的同源性，且仍保持催化活性。

本发明所提供的核酸分子或所述核酸分子编码的细胞色素P450酶具有催化灵芝酸生成灵芝三萜类化合物的活性，可以实现灵芝三萜类化合物的异源生物合成。

本发明还提供一种重组的宿主细胞，其编码本发明提供的任意一种细胞色素P450酶的异源核酸分子。在一个实施方案中，所述重组的宿主细胞编码SEQ ID No.1或SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列，例如所述重组的宿主细胞通过编码上述核苷酸序列表达如SEQ IDNo.2或SEQ ID NO.4所示的细胞色素P450酶。

根据本发明的实施方案，所述重组的宿主细胞是通过本领域已知的技术手段将宿主细胞进行改造，使其能够产生灵芝三萜类化合物。例如，可以通过同源重组、基因编辑或本领域已知的其他基因重组技术将本发明提供的核酸分子导入到宿主细胞中，实现宿主细胞的改造或修饰。

根据本发明的实施方案，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，例如，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。例如，所述宿主细胞是酵母属(Saccharomycesgenus)细胞、毕赤酵母属(Pichiagenus)细胞或大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞。

本发明进一步提供上述核酸分子或者细胞色素P450酶或者重组的宿主细胞在合成灵芝三萜类化合物中的应用。

根据本发明的实施方案，所述灵芝三萜类化合物为式(I)或式(II)所示的化合物：

根据本发明的实施方案，GL20421基因或其编码的细胞色素450酶或含有该基因的宿主细胞用于合成式(I)所示的灵芝三萜类化合物。

根据本发明的实施方案，GL21117基因或其编码的细胞色素450酶或含有该基因的宿主细胞用于合成式(II)所示的灵芝三萜类化合物。

本发明还提供一种灵芝三萜类化合物的合成方法，包括：将本发明所述的细胞色素P450酶与灵芝酸HLDOA接触，生成灵芝三萜类化合物。

在一个实施方案中，所述灵芝三萜类化合物为式(I)或式(II)所示的化合物。

本发明还提供式(I)所示的化合物的合成方法，包括：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的细胞色素P450酶与灵芝酸HLDOA接触，生成式(I)所示的化合物。

本发明还提供式(II)所示的化合物的合成方法，包括：氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的细胞色素P450酶与灵芝酸HLDOA接触，生成式(II)所示的化合物。

根据本发明的实施方案，所述合成方法为异源生物合成方法。具体来说，所述异源生物合成方法包括培养本发明所述的重组的宿主细胞，表达所述细胞色素P450酶，并催化灵芝酸HLDOA生成所述灵芝三萜类化合物。

根据本发明的实施方案，所述合成方法还包括从重组的宿主细胞的培养物中分离所述灵芝三萜类化合物。

根据本发明的实施方案，所述重组的宿主细胞为重组的酿酒酵母，通过发酵方式培养所述酿酒酵母，从发酵液中分离所述灵芝三萜类化合物。

在一个实施方案中，所述重组的酿酒酵母包括含有SEQ ID No.1(GL20421基因)或SEQ ID No.3(GL21117基因)所示核苷酸序列的重组质粒；所述重组质粒含有表达载体、SEQID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列、启动子、终止子等表达元件。例如，所述重组质粒由表达载体pRS426、SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列、酵母HXT7p启动子、酵母FBA1t终止子和含有截短启动子Ura3(tP-Ura3)的KanMX基因表达框重组连接。

根据本发明的实施方案，所述酿酒酵母还包括羊毛甾醇生物合成途径上游的基因例如tHMG1、ERG20、ERG9和/或ERG1中的至少一种。

根据本发明的实施方案，所述重组的酿酒酵母发酵用的发酵培养基为YPD24发酵培养基，所述培养基含有遗传霉素G418和潮霉素(Hygromycin)。

根据本发明的实施方案，所述发酵培养基中，遗传霉素G418的浓度为200～800mg/L，例如300～700mg/L，例如400～600mg/L；所述潮霉素(Hygromycin)的浓度为100～500mg/L，例如200～400mg/L。

根据本发明的实施方案，所述发酵的温度为20-40℃，优选25-30℃。

本发明还提供一种如上所述式(I)所示的灵芝三萜类化合物。

进一步地，本发明还提供式(I)所示的灵芝三萜类化合物的合成方法，包括如下步骤：

a1)取过表达GL20421基因的酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL20421，在SC-HLU固体平板上划线，然后放置于培养箱中培养，以活化菌体；

a2)当单克隆长好后，挑取单克隆，转接至SC-HLU液体培养基中至菌液长到对数期，此时菌液OD600达到1～2.5；

a3)菌液长好后，然后转接400mL SC-HLU液体培养基中，培养菌液OD600达到2～2.5，得到发酵种子；

a4)将发酵种子接种至添加有遗传霉素G418和潮霉素(Hygromycin)的YPD24培养基中进行发酵。

根据本发明的实施方案，步骤a1)中，培养的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤a1)中，培养的时间为0.5～5天，例如1～3.5天，如1.5～3天。

根据本发明的实施方案，步骤a2)中，培养的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤a2)中，培养的时间为6～48小时，例如10～24小时。

根据本发明的实施方案，步骤a2)中，培养的转速为100～400rpm，例如150～250rpm。

根据本发明的实施方案，步骤a3)中，培养的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤a3)中，培养的时间为6～48小时，例如10～24小时。

根据本发明的实施方案，步骤a3)中，培养的转速为100～400rpm，例如150～250rpm。

根据本发明的实施方案，步骤a4)中，G418的浓度为200～800mg/L，例如300～700mg/L，例如400～600mg/L。

根据本发明的实施方案，步骤a4)中，潮霉素(Hygromycin)的浓度为100～500mg/L，例如200～400mg/L。

根据本发明的实施方案，步骤a4)中，接种种子液后培养基中的初始菌体浓度OD600为0.05～0.1。

根据本发明的实施方案，步骤a4)中，发酵的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤a4)中，发酵的时间为1～10天，例如3～7天。

根据本发明的实施方案，步骤a4)中，发酵在摇瓶中进行，摇瓶的转速为100～400rpm，例如150～250rpm。

本发明还提供如上所述CYP基因GL21117合成式(II)所示灵芝酸Jb的方法，包括如下步骤：

b1)取过表达GL21117基因的酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117，在SC-HLU固体平板上划线，然后放置于培养箱培养，以活化菌体；

b2)当单克隆长好后，挑取单克隆，转接至SC-HLU液体培养基中至菌液长到对数期，此时菌液OD600达到1～2.5；

b3)菌液长好后，然后转接400mL SC-HLU液体培养基中，培养菌液OD600达到2～2.5，得到发酵种子；

b4)将发酵种子接种至添加有G418和潮霉素(Hygromycin)的YPD24培养基中，进行发酵。

根据本发明的实施方案，步骤b1)中，培养的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤b1)中，培养的时间为0.5～5天，例如1～3.5天，如1.5～3天。

根据本发明的实施方案，步骤b2)中，培养的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤b2)中，培养的时间为6～48小时，例如10～24小时。

根据本发明的实施方案，步骤b2)中，培养的转速为100～400rpm，例如150～250rpm。

根据本发明的实施方案，步骤b3)中，培养的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤b3)中，培养的时间为6～48小时，例如10～24小时。

根据本发明的实施方案，步骤b3)中，培养的转速为100～400rpm，例如150～250rpm。

根据本发明的实施方案，步骤b4)中，G418的浓度为200～800mg/L，例如300～700mg/L，例如400～600mg/L。

根据本发明的实施方案，步骤b4)中，潮霉素(Hygromycin)的浓度为100～500mg/L，例如200～400mg/L。

根据本发明的实施方案，步骤b4)中，接种种子液后培养基中的初始菌体浓度OD600为0.05～0.1。

根据本发明的实施方案，步骤b4)中，发酵的温度为20～40℃。

根据本发明的实施方案，步骤b4)中，发酵的时间为1～10天，例如3～7天。

根据本发明的实施方案，步骤b4)中，发酵在摇瓶中进行，摇瓶的转速为100～400rpm，例如150～250rpm。

有益效果

本发明通过从灵芝基因组中挖掘到两个参与灵芝三萜合成的GL20421和GL21117基因，并利用合成生物学技术手段构建了酿酒酵母工程菌株，实现了灵芝三萜类物质的异源生物合成，为取代传统的人工栽培或深层液体发酵获取灵芝三萜类物质提供了一种潜在的方法，为进一步通过代谢工程改造实现灵芝三萜类物质的高效生物合成奠定了基础。

具体地，本发明获得的CYP基因GL20421可催化灵芝酸HLDOA形成一种新的尚未被报导的天然灵芝三萜产物-式(I)所示的灵芝三萜类化合物。而本发明获得的CYP基因GL21117可催化灵芝酸HLDOA形成灵芝酸Jb，其与天然的化合物结构完全一致，故可认为具有同等的产品性能和质量。研究表明，灵芝酸Jb能够激活人血小板磷脂酶C和A2从而促进血小板凝集(Wang,C.N.,et al.,Eur J Pharmacol,1994.267(1):33-42)。并且，由于酿酒酵母的生长速度显著超过灵芝，因此本发明提供的CYP基因GL21117催化制备灵芝酸Jb方法的效率远远高于利用灵芝生长，并从其中分离获得灵芝酸Jb。

附图说明

图1为本发明表达质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr的示意图；

图2为本发明表达质粒pRS426HF-GL20421-G418r的示意图；

图3为本发明表达质粒pRS426HF-GL21117-G418r的示意图；

图4为酿酒酵母YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL20421菌株和对照菌株发酵产物的HPLC谱图；

图5为酿酒酵母YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117菌株和对照菌株发酵产物的HPLC谱图；

图6为GL20421编码的细胞色素P450酶催化产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物的¹H-NMR谱图；

图7为GL20421编码的细胞色素P450酶催化产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物的¹³C-NMR谱图；

图8为GL20421编码的细胞色素P450酶催化产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物的DEPT谱图；

图9为GL20421编码的细胞色素P450酶催化产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物的COSY谱图；

图10为GL20421编码的细胞色素P450酶催化产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物的HSQC谱图；

图11为GL20421编码的细胞色素P450酶催化产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物的HMBC谱图；

图12为GL20421编码的细胞色素P450酶催化产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物形成的示意图；

图13为GL21117编码的细胞色素P450酶催化产物灵芝酸Jb的¹H-NMR谱图；

图14为GL21117编码的细胞色素P450酶催化产物灵芝酸Jb的¹³C-NMR谱图；

图15为GL21117编码的细胞色素P450酶催化产物灵芝酸Jb的DEPT谱图；

图16为GL21117编码的细胞色素P450酶催化产物灵芝酸Jb的COSY谱图；

图17为GL21117编码的细胞色素P450酶催化产物灵芝酸Jb的HSQC谱图；

图18为GL21117编码的细胞色素P450酶催化产物灵芝酸Jb的HMBC谱图；

图19为GL21117编码的细胞色素P450酶催化产物灵芝酸Jb形成的示意图；

图20为GL20421编码的细胞色素P450酶催化生成产物式(I)所示的灵芝三萜类化合物和GL21117催化生成产物灵芝酸Jb的合成路线图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

本发明首先选择可能参与灵芝酸生物合成的灵芝基因组中CYP基因，然后分别将其克隆到酿酒酵母表达质粒中，并将酿酒酵母表达质粒分别转化至重组改造后的微生物酿酒酵母中进行异源表达，通过对转化后的菌株进行发酵筛选，最终筛选得到用于催化灵芝酸HLDOA生成灵芝三萜的CYP基因GL20421(SEQ ID No.1)和GL21117(SEQ ID No.3)，从而实现灵芝三萜的异源生物合成。

可能参与灵芝酸生物合成的灵芝基因组中CYP基因是指：灵芝细胞中的所有CYP基因。

所述的异源表达具体是指：以灵芝cDNA为模板，通过PCR扩增得到各个CYP编码区序列片段，通过同源重组等方法将表达载体pRS426、CYP编码区序列片段、酵母HXT7p启动子、酵母FBA1t终止子和含有截短启动子Ura3(tP-Ura3)的KanMX基因表达框重组连接，得到一系列重组表达质粒pRS426HF-CYPs-G418r(s代指不同的CYP基因)。

所述的过表达灵芝酸HLDOA的酿酒酵母菌株是指：在基因工程改造后的BY4742菌株YL-T3(BY4742,Δtrp1,δDNA::PPGK1-tHMG1-TADH1-PTEF1-LYS2-TCYC1,TRP::HIS-PPGK1-ERG20-TADH1-PTEF1-ERG9-TCYC1-PTDH3-ERG1-TTPL1)(具体构建方法可参考(Dai,Z.,et al.,Sci Rep,2014.4:3698)文献获得)的基础上进一步改造。引入酵母表达质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr。其中BY4742菌株为本领域技术人员常用的一种商品化酵母宿主。在此基础上过表达了Lanosterol生物合成途径上游几个基因tHMG1、ERG20、ERG9和ERG1，从而提高Lanosterol合成量。pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr表达质粒的引入可以使YL-T3细胞中产生的Lanosterol进一步经过三步催化形成灵芝酸HLDOA。

引入的酵母表达质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr是指在酵母表达商业载体pRS425的基础上，通过同源重组的方法将pRS425、TEF1p启动子、GL19526基因(iGLCPR)、PGK1t终止子、含有截短启动子Ura3(tP-Ura3)的Hygromycin B基因表达框和CYP5150L8表达框重组连接，得到重组表达质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr。其中GL19526基因的表达产物是一个细胞色素P450还原酶(CPR)iGLCPR，CYP行使一系列的催化氧化功能往往需要CPR从NAD(P)H传递供给电子。CPR一定程度的过表达能够更好地支撑CYP发挥催化功能。CYP5150L8能够催化Lanosterol，经过三步氧化反应形成一种灵芝酸HLDOA(Wang,W.F.,etal.,Biotechnol Bioeng,2018.115(7):1842-1854).

所述的发酵筛选具体是指：通过标准的醋酸锂转化法(Gietz,R.D.,et al.,NatProtoc,2007.2(1):31-4)或者使用酵母转化试剂盒(Frozen-EZ Yeast TransformationII,ZYMO RESEARCH)的方法，将各个表达质粒导入重组改造后的酿酒酵母后，通过YPD24培养基发酵，随后对发酵产物的菌体沉淀经过甲醇萃取，最后将萃取液通过HPLC(高效液相色谱)方法分析观察和对照菌株相比是否有新峰产生，从而初步判断所转化的CYP基因是否为所需的目的基因。

所述的对照菌株是指：将不含CYP基因的pRS426HF-G418r酵母表达质粒转入重组改造后的微生物酿酒酵母后得到的菌株。

所述的YPD24培养基成分为酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，甘油40g/L。对于含有pRS426HF-CYPs-G418r或pRS426HF-G418r的酵母表达质粒的酿酒酵母，培养基中同时添加500mg/L的G418。对于含有pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr酿酒酵母表达质粒的酿酒酵母，培养基中同时添加300mg/L的潮霉素(Hygromycin)。

实施例1

过表达灵芝酸HLDOA的酿酒酵母菌株的构建

将酵母表达质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr转入酿酒酵母YL-T3中，形成经过重组改造后的酿酒酵母YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR。具体操作步骤如下：

酵母表达质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr的构建

1.1)在pRS425-iGLCPR-Hygr的基础上进行改造。其中pRS425-iGLCPR-Hygr质粒可参考(Lan,Yuan,Wang,&Xiao,2019)文献构建获得。首先使用Pmel酶消化质粒pRS425-iGLCPR-Hygr得到线性化质粒载体片段。

1.2)然后使用引物对HF-CYP5150L8-F和HF-CYP5150L8-R，以pRS426-HXT7p-CYP5150L8-FBA1t(Lan,X.,et al.,Biotechnol Bioeng,2019.116(12):3301-3311)为模板扩增出含同源臂的CYP5150L8de表达框。引物具体序列如序列表1所示：

表1：扩增含同源臂的CYP5150L8的表达框的引物序列表

引物名称	序列号	Sequence(5'to 3')
			HF-CYP5150L8-F	SEQ ID No.5	ggcaaaggaataatctcgagtcatgtaattagttatgtca
HF-CYP5150L8-R	SEQ ID No.6	cgagcggtctaaggcggtttacttctcgtaggaacaattt

F和R分别表示正向和反向引物。

1.3)然后将线性化的pRS425-iGLCPR-Hygr载体片段和含同源臂的CYP5150L8de表达框片段进行同源重组连接。具体步骤如下：

1.3.1)连接体系：线性化的pRS425-iGLCPR-Hygr质粒0.03pmol、扩增得到的含同源臂的CYP5150L8de表达框片段0.06pmol、CE II Buffer 4μL、Exnase II 2μL、无菌水补至20μL。轻轻混匀，避免产生气泡，然后37℃反应连接30min，冰浴5min。

1.3.2)取出-80℃冻存的50μL DH5α感受态细胞，冰上放置，至完全解冻，约需5min。

1.3.3)将连接产物转移到50μL DH5α感受态细胞中，混匀，避免产生气泡，冰上放置20min，42℃热激60s，然后冰上放置2min，加入900μL LB培养基，37℃孵育60min。随后涂含100ug/mL的Amp抗性的LB平板，37℃培养箱倒置过夜培养。

1.3.4)等平板长出单菌落后，挑选单克隆转接含100ug/mL Amp抗性的3mL液体LB培养基，37℃220rpm过夜培养。

1.3.5)等菌液长至稳定期后，提取质粒，使用测序引物进行PCR验证，然后挑选可能对的质粒进行测序，比对测序结果，从而可以得到正确的重组质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr。

所使用的测序引物如表2所示：

表2：验证重组质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr正确性的测序引物序列表

引物名称	序列号	Sequence(5'to 3')
			HF-CYP5150L8-CX-F	SEQ ID No.7	atttcgatgatgcagcttgg
HF-CYP5150L8-CX-R	SEQ ID No.8	acatcaaaatccacattctc

1.4)将上述得到的测序正确的重组质粒pRS425-CYP5150L8-iGLCPR-Hygr通过醋酸锂法(Gietz,R.D.,et al.,Nat Protoc,2007.2(1):31-4)或者使用酵母转化试剂盒(Frozen-EZ Yeast Transformation II,ZYMO RESEARCH)的方法转化到酿酒酵母细胞YL-T3中，将转化后的酵母涂布在SC-His-Leu(SC-HL)固体培养基(酵母脱氨基酸氮源(yeastnitrogen base without amino acids，YNB)，6.7g/L；葡萄糖，20g/L；酵母氨基酸缺陷型合成培养基(yeast synthetic drop-out media，SD)Y2001，1.39g/L；色氨酸，76mg/L；尿嘧啶，76mg/L；琼脂粉，2％)上。30℃培养1.5～3天。至转化子出现，挑选单克隆，从而得到经过改造后的酿酒酵母YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR菌株。

上述的酿酒酵母YL-T3是指：基因工程改造后的BY4742菌株YL-T3(BY4742,Δtrp1,δDNA::PPGK1-tHMG1-TADH1-PTEF1-LYS2-TCYC1,TRP::HIS-PPGK1-ERG20-TADH1-PTEF1-ERG9-TCYC1-PTDH3-ERG1-TTPL1)，其中BY4742菌株为本领域技术人员常用的一种商品化酵母宿主，在此基础上过表达了羊毛甾醇生物合成途径上游基因tHMG1、ERG20、ERG9和ERG1，从而提高羊毛甾醇合成量。具体构建方法可参考(Dai,Z.,et al.,Sci Rep,2014.4:3698)文献获得。

实施例2

构建表达CYP基因的酿酒酵母转化菌株

2.1)以灵芝cDNA为模板，通过PCR扩增得到CYP基因编码区序列片段，GL20421和GL21117的编码区序列片段分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.3。其中用于从灵芝cDNA中扩增获得灵芝CYP基因GL20421和GL21117编码区序列片段的引物序列如表3所示。

表3.扩增灵芝CYP基因编码区序列片段所用引物序列表

引物名称	序列号	Sequence(5'to 3')
			GL20421-F	SEQ ID No.9	taattttaatcaaaaagtttatgatcatcccagtagacat
GL20421-R	SEQ ID No.10	attaatttgaattaacgttttcagtctgcacgacgcaccc
			GL21117-F	SEQ ID No.11	taattttaatcaaaaagtttatggcgacgttggaggaccc
GL21117-R	SEQ ID No.12	attaatttgaattaacgttttcaagaagcctgcgcatgcc

2.2)通过同源重组等方法将表达载体pRS426、CYP基因编码区序列片段、酵母HXT7p启动子、酵母FBA1t终止子和含有截短启动子Ura3(tP-Ura3)的KanMX基因表达框重组连接，得到重组表达质粒pRS426HF-CYPs-G418r(s表示不同的CYP基因，例如GL20421和GL21117)；具体通过以下方式得到：

i)通过Smal线性化pRS426-HXT7p-FBA1t-G418r质粒，pRS426-HXT7p-FBA1t-G418r质粒的具体构建方法可参考(Lan,X.,et al.,Biotechnol Bioeng,2019.116(12):3301-3311)文献获得。

ii)将线性化的pRS426-HXT7p-FBA1t-G418r质粒与扩增得到的CYP基因编码区序列片段通过重组酶连接，具体步骤如下：

a)连接体系：线性化的pRS426-HXT7p-FBA1t-G418r质粒0.03pmol、扩增得到的CYP基因编码区序列片段0.06pmol、CE II Buffer 4μL、Exnase II 2μL、无菌水补至20μL。轻轻混匀，避免产生气泡，然后37℃反应连接30min，冰浴5min。

b)操作方式同实施例1中的步骤1.3.2。

c)操作方式同实施例1中的步骤1.3.3。

d)操作方式同实施例1中的步骤1.3.4。

e)等菌液长至稳定期后，提取质粒，使用测序引物进行PCR验证，然后挑选可能对的质粒进行测序，比对测序结果，从而可以得到正确的重组质粒pRS426HF-CYPs-G418r。

所使用的测序引物如表4所示：

表4：验证重组质粒pRS426HF-CYPs-G418r正确性的测序引物序列表

引物名称	序列号	Sequence(5'to 3')
			P450-CX-F	SEQ ID No.13	gccaatacttcacaatgttc
P450-CX-R	SEQ ID No.14	tcattttgtcattgaccttc

2.3)将上述得到的测序正确的重组质粒pRS426HF-CYPs-G418r通过醋酸锂法(Gietz,R.D.,et al.,Nat Protoc,2007.2(1):31-4)(使用酵母转化试剂盒(Frozen-EZYeast Transformation II,ZYMO RESEARCH)的方法可以达到相同的效果)转化到经过重组改造后的酿酒酵母细胞YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR中，将转化后的酵母涂布在SC-His-Leu-Ura(SC-HLU)固体培养基(酵母脱氨基酸氮源(yeast nitrogen base without aminoacids(YNB))，6.7g/L；葡萄糖，20g/L；酵母氨基酸缺陷型合成培养基(yeast syntheticdrop-out media(SD))Y2001，1.39g/L；色氨酸，76mg/L；琼脂粉，2％)进行培养。30℃培养箱1.5～3天。至转化子出现，挑选单克隆，从而得到过表达CYP基因GL20421和GL21117的酿酒酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL20421和YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117。

实施例3CYP基因的确定以及利用酵母转化株的发酵来进行功能鉴定

酵母转化菌株的发酵：

3.1)将构建好的各个包含CYP基因(GL20421基因或GL21117基因)的酵母转化菌株转化子进行发酵，同时以不含CYP基因的空质粒菌株作为对照。通过比较发酵后代谢产物的差异，从而初步筛选可能和灵芝三萜生物合成相关的CYP基因。具体操作如下：

3.1.1)将实施例2中构建好的各个包含CYP基因的酵母转化菌株转化子分别液体转接到3mL SC-His-Leu-Ura(SC-HLU)液体培养基中(yeast nitrogen base withoutamino acids(YNB)，6.7g/L；葡萄糖，20g/L；yeast synthetic drop-out media(SD)Y2001，1.39g/L；tryptophan，76mg/L)，30℃850rpm 90％湿度条件下放置于高通量摇床中培养24h；

3.1.2)然后将培养好的菌液以3％的比例(体积比)再次液体转接3mL SC-HLU液体培养基，30℃850rpm 90％湿度条件下培养12h，至菌体达到对数期，种子菌液制备完成；

3.1.3)然后开始将种子以3％的比例(体积比)接种到添加有500mg/L的G418和300mg/L的潮霉素(Hygromycin)的YPD24培养基(酵母粉10g/L，牛肉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，甘油40g/L)中，然后30℃850rpm 90％湿度条件下发酵培养5天。

3.1.4)发酵培养5天后，取出发酵后的菌液，15,600g离心10min，去除上清，细胞沉淀与2mL甲醇混匀，然后30℃220rpm放置30min进行萃取，然后15,600g离心10min，上清过0.22μm针头过滤器后即可得到重组菌株发酵后粗提物，之后HPLC检测分析发酵产物。

3.2)通过观察发酵产物的HPLC图谱中是否有新峰出现，来初步判定CYP基因GL20421和GL21117是否和灵芝三萜生物合成相关。

实施例4

酿酒酵母转化株的发酵产物HPLC检测

4.1)发酵产物的HPLC分析方法：

仪器：安捷伦1260Infinity II HPLC分析系统，DAD(Diode array detector)检测器。

色谱柱：Kinetex Biphenyl分析柱(2.6μm,150mm×4.6mm,Phenomenex,Torrance,CA)。

柱温：30℃；流速：0.5mL/min；进样量：20μL，检测波长214nm。

A相：超纯水，B相：甲醇(含0.1％乙酸)。

梯度洗脱程序为：0-30min，80％-100％B相；30-35min，100％B相；35-36min，100％-80％B相；36-45min，80％B相。

4.2)通过和空质粒对照菌株发酵产物HPLC峰图对比，观察发现当在YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR酿酒酵母菌株中导入了包含GL20421或GL21117基因的重组质粒即pRS426HF-GL20421-G418r(图2)或pRS426HF-GL21117-G418r(图3)时，该重组酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL20421与YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117和对照菌株都有显著不同的峰(图4和图5)

实施例5

过表达GL20421和GL21117基因的酵母菌株的发酵产物分离纯化及鉴定

5.1)过表达GL20421基因的酵母菌株的发酵产物分离纯化及鉴定

5.1.1)取-80℃冻存的过表达GL20421基因的酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL20421，在SC-HLU固体平板上划线，然后30℃放置于培养箱中倒置培养1.5～3天，以活化菌体。

5.1.2)当单克隆长好后，挑取单克隆，转接至20mL SC-HLU液体培养基中，30℃220rpm培养约24h，至菌液长到对数期，此时菌液OD600达到1～2.5。

5.1.3)菌液长好后，测定菌液OD600值，然后转接400mL SC-HLU液体培养基的2L摇瓶中，至初始OD600为0.05，然后30℃220rpm培养约12h，至菌液OD600达到2～2.5。此时发酵种子制备完成。

5.1.4)接种发酵：将培养好种子液接种10L添加有500mg/L的G418和300mg/L的潮霉素(Hygromycin)的YPD24培养基中，至初始OD600为0.05。采用2L大摇瓶，每瓶装量为400mL，共计25瓶。将所有摇瓶放置于30℃220rpm发酵5天。

5.1.5)发酵结束后，以1:1的比例向发酵液中加入乙酸乙酯，封膜后放置于30℃250rpm摇床上震荡萃取1h。然后取出，使用离心机，3300rpm,25℃离心5min促进分层。收集上清乙酸乙酯层。下层再用乙酸乙酯重复萃取一次。然后合并两次萃取后的乙酸乙酯，使用旋转蒸发仪，27℃加热，9℃冷凝进行旋蒸至基本蒸干。然后吸出，残余物使用甲醇溶出，合并溶出物后，体积约为20mL。

5.1.6)过正相硅胶柱纯化。方法如下：

使用34mm(柱内径)*500mm(有效柱长)层析柱；

洗脱程序为：石油醚，200mL；石油醚：乙酸乙酯＝8:1，200mL；石油醚：乙酸乙酯＝2:1，200mL；石油醚：乙酸乙酯＝1:1，600mL；石油醚：乙酸乙酯＝1:2，600mL；石油醚：乙酸乙酯＝1:4，400mL；甲醇，600mL。

洗脱过程中，使用100mL玻璃管收集100mL。之后每管取出0.5mL，用0.22μm有机针头过滤器过滤后，用HPLC检测分析。HPLC检测方法同实施例4中的4.1。

检测后，将含有式I所示的灵芝三萜类化合物的收集液全部合并，然后使用旋转蒸发仪，27℃加热，9℃冷凝进行旋蒸至蒸干，然后用少量甲醇(<5mL)溶出，12000rpm离心10min，取上清进行后续处理。

5.1.7)使用制备液相进行制备纯化。

浓缩后的粗品通过制备液相进一步进行制备纯化，方法如下：

仪器：安捷伦1200系列半制备高效液相色谱仪；

色谱柱：100-10-C18 column(20x250 mm)(Kromasi,Sweden)；

流速：10mL/min；进样量：600μL；

A相为超纯水，B相为乙腈；

梯度洗脱程序为：0-30min，85％-90％B相；30-60min，90％-100％B相；

式I所示的灵芝三萜类化合物大约在14.5-15min出峰，在出峰阶段用2mL离心管接样品，每个管子装大约1.5mL。

然后将每管都用HPLC检测分析，方法同实施例4中的4.1。验证式I所示的灵芝三萜类化合物的纯度，将纯度高于95％的离心管合并，后旋蒸蒸干，用1mL甲醇重溶于1.5mL离心管中(加入前需称空离心管重量)，45℃真空挥干成粉末，再称重，确定纯品重量。

5.1.8)取纯化物质进行UPLC-APCI-MS分析，其在阳离子模式下m/z以437.3480为主，同时455.3583信号也较强。灵芝酸HLDOA在阳离子模式下m/z以439.3577为主。

5.1.9)将纯化物质进一步进行NMR(核磁共振波谱法)检测以确定新产物的结构。经过对一维碳谱、一维氢谱、COSY、HSQC、HMBC的谱图进行细致解析，最终确定了新化合物的结构与已经报导过的化合物都不相同，为式I所示的灵芝三萜类化合物，是一种新的天然灵芝三萜类产物。式I所示化合物的一维碳谱和氢谱数据如表5所示。产物的¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、COSY、HSQC、HMBC谱图详见图6至图11所示。图12为GL20421催化产物式I所示的灵芝三萜类化合物形成的示意图。

表5式I所示的灵芝三萜类化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR数据

5.2)过表达GL21117基因的酵母菌株的发酵产物分离纯化及鉴定

5.2.1)取-80℃冻存的过表达GL21117基因的酵母菌株YL-T3-CYP5150L8-iGLCPR-GL21117，在SC-HLU固体平板上划线，然后30℃放置于培养箱中倒置培养1.5～3天，以活化菌体。

5.2.2)操作步骤同5.1.2。

5.2.3)操作步骤同5.1.3。

5.2.4)操作步骤同5.1.4。

5.2.5)操作步骤同5.1.5。

5.2.6)过正相硅胶柱纯化。方法如下：

使用34mm(柱内径)*500mm(有效柱长)层析柱；

检测后，将含有灵芝酸Jb的收集液全部合并，然后使用旋转蒸发仪，27℃加热，9℃冷凝进行旋蒸至蒸干，然后用少量甲醇(<5mL)溶出，12000rpm离心10min，取上清进行后续处理。

5.2.7)使用制备液相进行制备纯化。

仪器：安捷伦1260系列制备液相色谱仪。DAD检测器，检测波长214nm；

色谱柱：YMC-Pack ODS-A,20x250 mm,5um,12nm；

流速：10mL/min；进样量：800μL；

A相：超纯水，B相：甲醇；

梯度洗脱程序为：0-50min，80％-100％B相；50-60min，100％B相；60-60.5min，100％-80％B相；60.5-70min，80％B相。

收集20.5～27.5min时间段的馏分。每0.5min收集一管。第二次纯化时可以适当缩短每管收集时间，可以0.25min收集一管。然后每管的馏分都用HPLC检测分析，方法同实施例4中的4.1。验证灵芝酸Jb(式II所示的化合物)的纯度，将纯度高于95％的收集管中的收集液合并，后旋蒸蒸干，用低于10mL的甲醇溶出于离心管中(加入前需称量其中两个离心管的重量)。真空挥干成粉末后再称重，确认纯品重量。

5.2.8)取纯物质进行UPLC-APCI-MS分析，其在阳离子模式下m/z以453.3353为主，同时435.3260信号也较强。435.3260很可能是453.3353对应物质脱水产生的信号。灵芝酸HLDOA在阳离子模式下m/z以439.3577为主。

5.2.9)将纯化后的物质进一步进行NMR检测以确定新产物的结构。经过对一维碳谱、一维氢谱、COSY、HSQC、HMBC的谱图进行细致解析，最终确定了新化合物的结构与已经报导过灵芝酸Jb完全一致，是一种灵芝中天然存在的灵芝三萜类化合物。其一维碳谱和氢谱数据如表6所示。¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、COSY、HSQC、HMBC谱图详见图13至图18所示。图19为GL21117催化产物灵芝酸Jb形成的示意图。

表6灵芝酸Jb的¹H-NMR、¹³C-NMR数据：

实验表明，本发明得到了两个可以催化灵芝酸HLDOA(Ganoderic acid HLDOA)的细胞色素氧化酶基因，如图20所示，GL20421可以催化灵芝酸HLDOA形成一种如式I所示的新的灵芝三萜类化合物。GL21117可以催化灵芝酸HLDOA形成灵芝酸Jb。分别通过将基因GL20421和GL21117在酵母中进行表达，实现了式I所示的灵芝三萜类化合物和灵芝酸Jb的异源生物合成。酿酒酵母是一种成熟的工业生产用菌种，且目前针对酿酒酵母具有成熟的遗传操作技术手段，通过代谢工程改造和发酵工艺的优化，能大幅提高灵芝三萜类化合物的发酵产量，故本发明提供了一种有广阔工业化应用前景的灵芝酸异源生物合成技术。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所;上海交通大学

<120> 细胞色素P450酶及其在合成灵芝三萜类化合物中的应用

<130> CPCN20110138

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1626

<212> DNA

<213> GL20421

<400> 1

atgatcatcc cagtagacat tgtatcgccc ctatctgtct ggcaggtcgc cgccgtcctc 60

accgcggtct acttcgccca cagcttcgtc cgcgcccgcc gcaaggccgc ccgcgagacg 120

cctcttgcgt gtcctccaag gcagagctgg ctcttcggca tccgcaacct tatcgcaggc 180

aaccccgagg ccggctccat ctacgaggcc tggatcgagg aatacgggtc cgtctaccgc 240

gtccccgcac cactggggtc cacccgggtc atcctcaccg atcccaaggc gatcgcgcac 300

ttctactcgg tcgagacgtg gacgtatgtg cagacgaagc tcgcgagggt cgcgattgag 360

ggcctgttgg gccgtgggtt gctttgggcg gaaggggagt ctcataaacg gcaacgcaag 420

gcgatatccc ccgccttcag caacattgcc attcgaaggc ttacctccgt gttctacgac 480

tccgtctaca agctcaagac caattgggac aaccaattgg cttcagtgga tttcgccacg 540

atagatgtac agaaatggat gaaccacgtc tcccttgaca gtatcggcat cgcgggattc 600

tctcatgact ttggctccct cgaaggcaag cactccgctg tcgccgaagt attcgatgcc 660

atgggtcatg tcaagccggg catctttacc gctgcggccc tcttcttcgg caatgtcttc 720

cccgtcctct ggcgtctccc cacagaaacg cgccgtctcc aactgaagct gaataagtgt 780

atggaggaga tcgctgtacc cctgctggag aacacgcgca atgagatgag gggtctaggc 840

gagaagggta aggaggagaa gagtatcatt ggcctgttga ttaaggcgga ggatgccaat 900

tcaagcctgc aaatgtctca ggaagagatc atggcccaga tgaaggtgct aatcttggca 960

ggatacgaaa ctacgtcaat cagtctcacg tgggccctca tcgagttatc acgcaagcca 1020

gagacccagg aacgccttcg tgaggagctg aaagaggagt tcccgaacgc ggatccaacc 1080

tgggaacagc tcacgaacgg ctccggtcta cattacctcg acgccgtcgt gcacgagatc 1140

ctcagactcc acgcgccgct caacgtcacc actcgtgttg ccgcaaagga tgacgtcatt 1200

ccactctcca cacccttgcg cctcccaact ggcgagctca ccgaccacgt cgccatcacc 1260

gagggccaag aggtcaccgt gcccatcagc tgcatgaaca ccgccgtcgc attctggggc 1320

cccgacgcac gcgagttccg cccggaacgc tggctcaacg aagacgggct cccgaagaag 1380

gcgcaggaga ttcaggggca ccgccacctg ctcaccttcg tcgacgggca ccgcatctgt 1440

ctcgggcgcg gctttgcgct agcagagttc aaggccgtgc tcggggtgtt gatcaagaac 1500

taccagttcg agctgccgga cgggccagag accaagatcg agttctgtcg tggggtcctt 1560

ccgcgcccgc gcgtcgtcgg cgagaagggc gcgaacctcc cgatgcgggt gcgtcgtgca 1620

gactga 1626

<210> 2

<211> 541

<212> PRT

<213> GL20421

<400> 2

Met Ile Ile Pro Val Asp Ile Val Ser Pro Leu Ser Val Trp Gln Val

1 5 10 15

Ala Ala Val Leu Thr Ala Val Tyr Phe Ala His Ser Phe Val Arg Ala

20 25 30

Arg Arg Lys Ala Ala Arg Glu Thr Pro Leu Ala Cys Pro Pro Arg Gln

35 40 45

Ser Trp Leu Phe Gly Ile Arg Asn Leu Ile Ala Gly Asn Pro Glu Ala

50 55 60

Gly Ser Ile Tyr Glu Ala Trp Ile Glu Glu Tyr Gly Ser Val Tyr Arg

65 70 75 80

Val Pro Ala Pro Leu Gly Ser Thr Arg Val Ile Leu Thr Asp Pro Lys

85 90 95

Ala Ile Ala His Phe Tyr Ser Val Glu Thr Trp Thr Tyr Val Gln Thr

100 105 110

Lys Leu Ala Arg Val Ala Ile Glu Gly Leu Leu Gly Arg Gly Leu Leu

115 120 125

Trp Ala Glu Gly Glu Ser His Lys Arg Gln Arg Lys Ala Ile Ser Pro

130 135 140

Ala Phe Ser Asn Ile Ala Ile Arg Arg Leu Thr Ser Val Phe Tyr Asp

145 150 155 160

Ser Val Tyr Lys Leu Lys Thr Asn Trp Asp Asn Gln Leu Ala Ser Val

165 170 175

Asp Phe Ala Thr Ile Asp Val Gln Lys Trp Met Asn His Val Ser Leu

180 185 190

Asp Ser Ile Gly Ile Ala Gly Phe Ser His Asp Phe Gly Ser Leu Glu

195 200 205

Gly Lys His Ser Ala Val Ala Glu Val Phe Asp Ala Met Gly His Val

210 215 220

Lys Pro Gly Ile Phe Thr Ala Ala Ala Leu Phe Phe Gly Asn Val Phe

225 230 235 240

Pro Val Leu Trp Arg Leu Pro Thr Glu Thr Arg Arg Leu Gln Leu Lys

245 250 255

Leu Asn Lys Cys Met Glu Glu Ile Ala Val Pro Leu Leu Glu Asn Thr

260 265 270

Arg Asn Glu Met Arg Gly Leu Gly Glu Lys Gly Lys Glu Glu Lys Ser

275 280 285

Ile Ile Gly Leu Leu Ile Lys Ala Glu Asp Ala Asn Ser Ser Leu Gln

290 295 300

Met Ser Gln Glu Glu Ile Met Ala Gln Met Lys Val Leu Ile Leu Ala

305 310 315 320

Gly Tyr Glu Thr Thr Ser Ile Ser Leu Thr Trp Ala Leu Ile Glu Leu

325 330 335

Ser Arg Lys Pro Glu Thr Gln Glu Arg Leu Arg Glu Glu Leu Lys Glu

340 345 350

Glu Phe Pro Asn Ala Asp Pro Thr Trp Glu Gln Leu Thr Asn Gly Ser

355 360 365

Gly Leu His Tyr Leu Asp Ala Val Val His Glu Ile Leu Arg Leu His

370 375 380

Ala Pro Leu Asn Val Thr Thr Arg Val Ala Ala Lys Asp Asp Val Ile

385 390 395 400

Pro Leu Ser Thr Pro Leu Arg Leu Pro Thr Gly Glu Leu Thr Asp His

405 410 415

Val Ala Ile Thr Glu Gly Gln Glu Val Thr Val Pro Ile Ser Cys Met

420 425 430

Asn Thr Ala Val Ala Phe Trp Gly Pro Asp Ala Arg Glu Phe Arg Pro

435 440 445

Glu Arg Trp Leu Asn Glu Asp Gly Leu Pro Lys Lys Ala Gln Glu Ile

450 455 460

Gln Gly His Arg His Leu Leu Thr Phe Val Asp Gly His Arg Ile Cys

465 470 475 480

Leu Gly Arg Gly Phe Ala Leu Ala Glu Phe Lys Ala Val Leu Gly Val

485 490 495

Leu Ile Lys Asn Tyr Gln Phe Glu Leu Pro Asp Gly Pro Glu Thr Lys

500 505 510

Ile Glu Phe Cys Arg Gly Val Leu Pro Arg Pro Arg Val Val Gly Glu

515 520 525

Lys Gly Ala Asn Leu Pro Met Arg Val Arg Arg Ala Asp

530 535 540

<210> 3

<211> 1515

<212> DNA

<213> GL21117

<400> 3

atggcgacgt tggaggaccc tcaggcgctc atcctcgctg gtgtcgcgac cctagtcgca 60

atatggatag tacgatggaa gaccaaccca ctaagttcga ttcccaccgt cggtggatcg 120

gatgcgccag ggctgtcgat attggcatgg ctcaacttct tgcgccgcgg gaaggacttg 180

ctccaggagg gttaccaaaa gtatcatggc tcgacgttca agatcgctct tttcgaccaa 240

tggcttgttg tgttttccgg gtccaatatg gtcgacgagc ttatgaggcg gcccgatagt 300

gagttatcgt tcttggaggg cattgaagaa gtagtccaca tgaagtacac tgtcgggcac 360

gaagccttgg gcgacccgta ccacgtcggg attatcaaag agaagcttac gcgcatgctt 420

cctaccgttc tcccggactt gaccgaagag ttggcgatat ccgtgcaaga atacatcccc 480

acccaaggcg acgaatggac cgccgtgaat gtgatgacga cgatgcaaaa gatcgtcgcc 540

agggccagca accgtgtctt cgtcggactt ccactttgtc gcaatgagga gtttttggca 600

ttgccccttc gcttcacgtt ggatgtgatg aaagacatgg tagtcatgag catcactccg 660

gacattttga agaggcccgt tggtcatctg gttagcaacg caaggcggac tatggcgcaa 720

gccatgaagt atatccaacc tgtgatcgcc gagaggaagg cgaacatgaa ggacttgggt 780

gaggactggt ccgacaagcc gaatgacgtg cttcagtggg tcatcgacga agccgtccgc 840

cggaaccact ccgacgtcag cgtcgtcgag cgaatattcc tcgtcaactt tgcagccatc 900

cacacctcct ccaccaacat gacccatgtg ctttacgacc tggcctcaag accggagtgt 960

attcaaccac tccgagagga gatcgaaggt atcgtcgcaa cagacggttg gagcaagtca 1020

gccattgcca agatgtggaa gcttgacagc ctgttcaggg agtcttcgcg gtaccacggg 1080

atctccctca ttggcctgat gcgcaagtcc gtgaaagaca tcaccctcag cgacgggacg 1140

ttcatcccga agggcaccgt gctcgcgact gctgcgcggc cgatgcacca cgacggctcg 1200

aaatacgcca acgcggacgt gctcgacccg ttccgcttcg agaggatgcg gcacggcgag 1260

ggcgagggcc tgaagcacca gttcgtcaac acttccaacg acttcgtctc cttcggccac 1320

ggcaagcacg catgcccggg acggttcttc gcggcgagcg agctgaaggc gctgctcgcg 1380

tacatcctca tcaactacga tatcaagctt gggggggacg gcacccggcc ggcgaacttt 1440

tactatggca cgaacgtcgt cccgtctgtc accggacagg tgctgttcag gaaacggcat 1500

gcgcaggctt cttga 1515

<210> 4

<211> 504

<212> PRT

<213> GL21117

<400> 4

Met Ala Thr Leu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ile Leu Ala Gly Val Ala

1 5 10 15

Thr Leu Val Ala Ile Trp Ile Val Arg Trp Lys Thr Asn Pro Leu Ser

20 25 30

Ser Ile Pro Thr Val Gly Gly Ser Asp Ala Pro Gly Leu Ser Ile Leu

35 40 45

Ala Trp Leu Asn Phe Leu Arg Arg Gly Lys Asp Leu Leu Gln Glu Gly

50 55 60

Tyr Gln Lys Tyr His Gly Ser Thr Phe Lys Ile Ala Leu Phe Asp Gln

65 70 75 80

Trp Leu Val Val Phe Ser Gly Ser Asn Met Val Asp Glu Leu Met Arg

85 90 95

Arg Pro Asp Ser Glu Leu Ser Phe Leu Glu Gly Ile Glu Glu Val Val

100 105 110

His Met Lys Tyr Thr Val Gly His Glu Ala Leu Gly Asp Pro Tyr His

115 120 125

Val Gly Ile Ile Lys Glu Lys Leu Thr Arg Met Leu Pro Thr Val Leu

130 135 140

Pro Asp Leu Thr Glu Glu Leu Ala Ile Ser Val Gln Glu Tyr Ile Pro

145 150 155 160

Thr Gln Gly Asp Glu Trp Thr Ala Val Asn Val Met Thr Thr Met Gln

165 170 175

Lys Ile Val Ala Arg Ala Ser Asn Arg Val Phe Val Gly Leu Pro Leu

180 185 190

Cys Arg Asn Glu Glu Phe Leu Ala Leu Pro Leu Arg Phe Thr Leu Asp

195 200 205

Val Met Lys Asp Met Val Val Met Ser Ile Thr Pro Asp Ile Leu Lys

210 215 220

Arg Pro Val Gly His Leu Val Ser Asn Ala Arg Arg Thr Met Ala Gln

225 230 235 240

Ala Met Lys Tyr Ile Gln Pro Val Ile Ala Glu Arg Lys Ala Asn Met

245 250 255

Lys Asp Leu Gly Glu Asp Trp Ser Asp Lys Pro Asn Asp Val Leu Gln

260 265 270

Trp Val Ile Asp Glu Ala Val Arg Arg Asn His Ser Asp Val Ser Val

275 280 285

Val Glu Arg Ile Phe Leu Val Asn Phe Ala Ala Ile His Thr Ser Ser

290 295 300

Thr Asn Met Thr His Val Leu Tyr Asp Leu Ala Ser Arg Pro Glu Cys

305 310 315 320

Ile Gln Pro Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly Ile Val Ala Thr Asp Gly

325 330 335

Trp Ser Lys Ser Ala Ile Ala Lys Met Trp Lys Leu Asp Ser Leu Phe

340 345 350

Arg Glu Ser Ser Arg Tyr His Gly Ile Ser Leu Ile Gly Leu Met Arg

355 360 365

Lys Ser Val Lys Asp Ile Thr Leu Ser Asp Gly Thr Phe Ile Pro Lys

370 375 380

Gly Thr Val Leu Ala Thr Ala Ala Arg Pro Met His His Asp Gly Ser

385 390 395 400

Lys Tyr Ala Asn Ala Asp Val Leu Asp Pro Phe Arg Phe Glu Arg Met

405 410 415

Arg His Gly Glu Gly Glu Gly Leu Lys His Gln Phe Val Asn Thr Ser

420 425 430

Asn Asp Phe Val Ser Phe Gly His Gly Lys His Ala Cys Pro Gly Arg

435 440 445

Phe Phe Ala Ala Ser Glu Leu Lys Ala Leu Leu Ala Tyr Ile Leu Ile

450 455 460

Asn Tyr Asp Ile Lys Leu Gly Gly Asp Gly Thr Arg Pro Ala Asn Phe

465 470 475 480

Tyr Tyr Gly Thr Asn Val Val Pro Ser Val Thr Gly Gln Val Leu Phe

485 490 495

Arg Lys Arg His Ala Gln Ala Ser

500

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> HF-CYP5150L8-F

<400> 5

ggcaaaggaa taatctcgag tcatgtaatt agttatgtca 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> HF-CYP5150L8-R

<400> 6

cgagcggtct aaggcggttt acttctcgta ggaacaattt 40

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> HF-CYP5150L8-CX-F

<400> 7

atttcgatga tgcagcttgg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> HF-CYP5150L8-CX-R

<400> 8

acatcaaaat ccacattctc 20

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> GL20421-F

<400> 9

taattttaat caaaaagttt atgatcatcc cagtagacat 40

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> GL20421-R

<400> 10

attaatttga attaacgttt tcagtctgca cgacgcaccc 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> GL21117-F

<400> 11

taattttaat caaaaagttt atggcgacgt tggaggaccc 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> GL21117-R

<400> 12

attaatttga attaacgttt tcaagaagcc tgcgcatgcc 40

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> P450-CX-F

<400> 13

gccaatactt cacaatgttc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> P450-CX-R

<400> 14

tcattttgtc attgaccttc 20

Claims

1.编码细胞色素P450酶或其催化活性片段的核酸分子，其特征在于，包括如SEQ IDNo.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

2.一种细胞色素P450酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4所示；或者，与SEQ ID No.2或SEQ ID NO.4具有65％以上的同源性。

3.一种重组的宿主细胞，其特征在于，其包括编码权利要求2所述的细胞色素P450酶的异源核酸分子；

优选地，所述重组的宿主细胞是将宿主细胞进行改造，使其能够产生灵芝三萜类化合物；

优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞，例如，细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞；例如，所述宿主细胞是酵母属(Saccharomycesgenus)细胞、毕赤酵母属(Pichiagenus)细胞或大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞。

4.权利要求1所述核酸分子或者权利要求2所述细胞色素P450酶或者重组的宿主细胞在合成灵芝三萜类化合物中的应用；

优选地，所述灵芝三萜类化合物为式(I)或式(II)所示的化合物：

优选地，SEQ ID No.1所示的核酸分子或其编码的细胞色素450酶或含有该基因的宿主细胞用于合成式(I)所示的灵芝三萜类化合物；

优选地，SEQ ID No.3所示的核酸分子或其编码的细胞色素450酶或含有该基因的宿主细胞用于合成式(II)所示的灵芝三萜类化合物。

5.一种灵芝三萜类化合物的合成方法，其特征在于，包括：将权利要求2所述细胞色素P450酶与灵芝酸HLDOA接触，生成灵芝三萜类化合物；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述合成方法为异源生物合成方法；

优选，所述细胞色素P450酶通过培养重组的宿主细胞进行表达，所述重组的宿主细胞包括编码权利要求2所述的细胞色素P450酶的异源核酸分子；

优选，培养所述重组的宿主细胞，表达细胞色素P450酶，并催化灵芝酸HLDOA生成所述灵芝三萜类化合物；

优选，所述重组的宿主细胞为重组的酿酒酵母，通过发酵方式培养所述酿酒酵母，从发酵液中分离所述灵芝三萜类化合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组的酿酒酵母发酵用的发酵培养基为YPD24发酵培养基，所述培养基含有遗传霉素G418和潮霉素(Hygromycin)。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中，遗传霉素G418的浓度为200～800mg/L，潮霉素(Hygromycin)的浓度为100～500mg/L。

9.根据权利要求5-8任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为20-40℃。

10.式(I)所示的灵芝三萜类化合物：