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CN113412123A - 用于免疫应答增强的患者的治疗性用途的肽-mhc-i-抗体融合蛋白 - Google Patents

用于免疫应答增强的患者的治疗性用途的肽-mhc-i-抗体融合蛋白 Download PDF

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CN113412123A CN201980090511.8A CN201980090511A CN113412123A CN 113412123 A CN113412123 A CN 113412123A CN 201980090511 A CN201980090511 A CN 201980090511A CN 113412123 A CN113412123 A CN 113412123A
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virus
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C·菲舍尔
R·克洛切克
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Robert Koch Institute
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F Hoffmann La Roche AG
Robert Koch Institute
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Abstract

本发明涉及一种肽‑MHC‑I‑抗体融合蛋白，所述肽‑MHC‑I‑抗体融合蛋白作为施用至患者的治疗性药物使用，其中所述患者体内的针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答已经得到增强。所述治疗性药物可用于多组分试剂盒中并且与增强性药物以及任选地与诱导性药物联合施用。所述诱导性药物和所述增强性药物可以用于使所述患者对于使用所述肽‑MHC‑I‑抗体融合蛋白进行的治疗敏感的方法中。所述药物可以用于治疗疾病，诸如癌症或病毒感染。

Description

用于免疫应答增强的患者的治疗性用途的肽-MHC-I-抗体融 合蛋白
技术领域
本发明涉及一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白用于作为治疗性药物施用至患者，其中患者体内的针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答已经得到增强。该治疗性药物可用于多组分试剂盒中并且与增强性药物以及任选地与诱导性药物联合施用。该诱导性药物和增强性药物可以用于使患者对于使用该肽-MHC-I-抗体融合蛋白进行的治疗敏感的方法中。该药物可以用于治疗疾病，诸如癌症或病毒感染。
背景技术
肽-MHC-I-抗体融合蛋白及其用于治疗癌症和病毒感染的用途从WO 2012/175508、WO 2014/083004和WO 2014/096015获知。本领域已知的所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含与I类MHC-I分子复合的T细胞应答引发肽(例如，病毒衍生肽)，并且其中所述复合物偶联至靶细胞结合抗体(参见，例如，图1中的示例性融合蛋白)。因此，靶细胞结合抗体结合至(发生病变的)靶细胞允许在靶细胞表面上呈递载肽MHC-I复合物。这允许将患者的肽特异性T效应细胞导向靶细胞以便介导细胞死亡。这种作用方式需要肽特异性T效应细胞的存在。在具有低水平肽特异性T细胞的患者中，可能预期对于使用此类肽-MHC-I-抗体融合蛋白的疗法的低应答。需要改进肽-MHC-I-抗体融合蛋白的治疗性应用。
趋化因子受体XCR1在树突状细胞(DC)上被特异性地表达，树突状细胞参与将抗原交叉呈递至T效应细胞(Kroczek等人Front Immunol.2012Feb 10；3：14)。
WO 2009/065561公开了一种用于将物质递送到XCR1阳性细胞中的系统。该递送系统包括XCR1结合组分，例如，抗XCR1抗体或其片段。该物质可以是(多)肽。该物质结合至递送系统的XCR1结合组分。
WO 2015/140172和WO 2015/140175公开了一种用于延长针对抗原性蛋白质的细胞毒性免疫应答的方法。该方法包括向患者施用载肽抗原呈递细胞(APC)；即通过其I类MHCI分子与佐剂联合来呈递抗原肽的APC。在使患者的针对所述抗原的T细胞活化后0小时至14天施用。该方法可包括进一步施用一种或多种白细胞介素，包括复合的IL-2或IL-2突变蛋白。
发明内容
本发明涉及一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
该肽-MHC-I-抗体融合蛋白作为治疗性药物使用，
其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经在患者体内诱导了针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中所诱导的针对病毒衍生肽的免疫应答已在患者体内通过增强性药物得到增强。
随着包含在所述融合蛋白中的肽-MHC-I复合物被展示在靶细胞的表面上，肽-MHC-I-抗体融合蛋白的治疗性应用模拟了靶细胞中的病毒感染。通过这种方式介导天然抗病毒的CD8 T细胞驱动的免疫应答。在体外细胞因子的有限和选择性释放方面，天然抗病毒T细胞群的参与可能会限制不良反应，从而获得更好的安全特性(Schmittnaegel M，等人Cancer Immunol Res.2015；3：764-76)。利用本发明的医学用途，在用肽-MHC-I-抗体融合蛋白实际治疗之前，通过使肽特异性T细胞活化来改善天然T细胞应答，从而改善治疗效力。因此，通过使肽特异性T细胞活化介导来诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答。通过在用肽-MHC-I-抗体融合蛋白实际治疗之前增强肽特异性T细胞，即使在最初具有低水平肽特异性T细胞的患者中，也可以触发对治疗的应答。
一方面，已经诱导或通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染来诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化。WO2015/140172和WO 2015/140175中公开了合适的方法。两篇用文献均通过引用并入本文。这种免疫应答可以被增强，以提高患者体内病毒衍生肽特异性CD8 T细胞的比率。
因此，一方面，本发明涉及一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
该肽-MHC-I-抗体融合蛋白用作治疗性药物，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经在患者体内诱导了针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中在该患者体内诱导的针对病毒衍生肽的免疫应答已经通过增强性药物得到增强，
其中已经通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染而诱导针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化；并且/或者
其中增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
一方面，本发明涉及一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白作为治疗性药物使用，
其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经通过诱导性药物在患者体内诱导了针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中在该患者体内诱导的针对病毒衍生肽的免疫应答已经通过增强性药物得到增强。
其中该诱导性药物包含：
(a)抗体或其变体或片段，其特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至所述抗体或其变体或片段，
并且其中增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
一方面，本发明涉及一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白作为治疗性药物使用，
其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经通过诱导性药物在患者体内诱导了针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中在该患者体内诱导的针对病毒衍生肽的免疫应答已经通过增强性药物得到增强。
其中该诱导性药物包含：
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，其特异性地结合至XCR1；以及
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段，
并且其中增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
本发明的另一方面是一种多组分试剂盒，其包括增强性药物和治疗性药物，
该增强性药物包含：
(a)表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及
(b)Th1佐剂，该佐剂是危险信号；
其中该增强性药物增强患者体内的针对病毒衍生肽的免疫应答，
并且
该治疗性药物包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
该试剂盒可以进一步包含诱导性药物，该诱导性药物在患者体内诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答。
该试剂盒可以用作药物，其中治疗性药物待施用至针对病毒衍生肽的免疫应答增强的患者，并且其中所述诱导性药物通过疫苗接种诱导该患者体内的针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，特别地，其中诱导性药物如上文定义。
本发明的另一方面是一种抗体-肽融合蛋白，该抗体-肽融合蛋白包含：
(a)抗体，其特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及和
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至所述抗体；
该抗体-肽融合蛋白用作诱导性药物，其中该抗体-肽融合蛋白将在疫苗接种中与以下物质联合施用至患者：
表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及支持Th1介导的应答的佐剂，
其中疫苗接种是联合疗法的第一步骤，其中疫苗接种将在联合疗法的第二步骤之前施用，包含肽-MHC-I-抗体融合蛋白的治疗性药物将在第二步骤中被施用至患者，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
本发明的另一方面是一种多组分试剂盒，其包含诱导性药物和增强性药物，
该诱导性药物如上文定义，并且
该增强性药物如上文定义，
该试剂盒用于使患者对于使用包含以下项的肽-MHC-I-抗体融合蛋白进行的治疗敏感的方法中
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
在本发明的一个实施例中，诱导性药物已经与Th1佐剂联合施用或与Thl佐剂联合施用，所述Th1佐剂是危险信号。
在本发明的另一个实施例中，在患者体内具有延长的半衰期的白细胞介素-2(IL-2)或IL-2变体已经在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用或在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用。
在本发明的又另一实施例中，Th1佐剂是聚肌胞苷酸(poly I：C)。
此外，在本发明的另一个实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞和佐剂已经在针对该病毒衍生肽使患者的T细胞活化之后4天至11天施用或在针对该病毒衍生肽使患者的T细胞活化之后4天至11天施用。
在本发明的另一个实施例中，治疗性药物在病毒衍生肽特异性CD8+ T细胞水平由于施用增强性药物而升高时施用，优选地，其中治疗性药物在从施用增强性药物起29天内，特别是20天内，尤其是14天内施用。更优选地，治疗性药物在增强后短时间内施用，诸如在施用增强性药物后3天内、2天内或1天内施用或在其后立即施用。
在本发明的又另一实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体特异性地结合至选自由癌细胞和病毒感染细胞组成的组的靶细胞。
在本发明的又另一实施例中，该肽-MHC-I-抗体融合蛋白或多组分试剂盒用于治疗癌症或病毒感染。
本发明的另一方面是一种用于治疗癌症的方法，其中该方法包括以下步骤：
使用增强性药物增强针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，该增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号；以及
施用有效量的肽-MHC-I-抗体融合蛋白给有需要的患者，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
本发明的另一方面是一种用于治疗病毒感染的方法，其中该方法包括以下步骤：
用诱导性药物诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答；
使用增强性药物增强针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，该增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号；以及
施用有效量的肽-MHC-I-抗体融合蛋白给有需要的患者，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
本发明的另一方面是肽-MHC-I-抗体融合蛋白的用途，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
该肽-MHC-I-抗体融合蛋白用于制造用于治疗癌症或病毒感染的药物，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经在患者体内诱导了针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中在该患者体内诱导的针对病毒衍生肽的免疫应答已经通过增强性药物得到增强。
根据本发明，在患者体内诱导的针对病毒衍生肽的免疫应答通过增强性药物得到增强。增强性药物优选地包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。增强使得患者体内病毒衍生肽特异性CD8 T细胞比率得以提高。使用肽-MHC-I-抗体融合蛋白进行的后续疾病疗法，例如，如WO 2012/175508、WO2014/083004和WO 2014/096015中公开的，可以例如通过抑制转移灶的形成而得以改进。病毒衍生肽特异性T细胞初始水平较低的患者对于使用此类肽-MHC-I-抗体融合蛋白的疗法的应答可能更好。
附图说明
图1：实例中使用的示例性肽-MHC-I-抗体融合蛋白的示意图。
图2：在暴露于经pMHC-I-IgG处理的靶细胞后，根据实例3在FACS中测得的表达IFNγ的CD8+ T细胞的频率。
图3：如实例4中评估的，在与来自经m38疫苗接种的小鼠的新鲜分离的脾细胞孵育后由pMHC-I-IgG介导的特异性肿瘤细胞裂解。
图4：根据实例5，评估预防性治疗后的转移灶负荷。
图5：根据实例6评估实验性肺转移灶治疗性治疗后的转移灶负荷。
具体实施方式
(a)定义
除非本文另有定义，否则与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。通常，与本文所述的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域公知的和常用的。
除非本文另有定义，否则术语“包括”应包括术语“由......组成”。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
来自任何脊椎动物物种抗体(免疫球蛋白)的“轻链”基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以配属为两种不同的类型中的一种，这两种类型分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。野生型轻链通常包含两个免疫球蛋白结构域，通常是一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。
存在几种不同类型的“重链”，它们定义了抗体的类别或同种型。野生型重链包含一系列免疫球蛋白结构域，通常具有一个对于结合至抗原而言很重要的可变结构域(VH)和几个恒定结构域(CH1、CH2、CH3等)。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH、F(ab′)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。根据其重链的恒定区的氨基酸序列不同，将抗体分为以下类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，诸如IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有五种抗体类别中找到的轻链恒定区(CL)称为κ(卡帕)和λ(兰姆达)。如本文所用的“恒定结构域”来自人源，其来自亚类(同种型)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链K或λ区。这种恒定结构域和区在现有技术中是众所周知的，例如Kabat等人《免疫学兴趣蛋白质序列(第五版》(Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed.，PublicHealth Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区，该C端区含有恒定区的至少一部分。例如，在天然抗体中，Fc结构域由两个相同的蛋白质片段构成，它们来自IgG、IgA和IgD同种型中抗体两条重链的第二个和第三个恒定结构域；IgM和IgE Fc结构域在每条多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2至CH结构域4)。在一个实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。在某些实施例中，人抗体来源于非人转基因哺乳动物，例如小鼠、大鼠或兔子。在某些实施例中，人抗体来源于杂交瘤细胞系。
如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如从宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或从转人免疫球蛋白基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体，或使用重组表达载体转染到宿主细胞中表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变区和恒定区。根据本发明的重组人抗体已经进行了体内体细胞超突变。因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是下述序列，尽管衍生自人类种系VH序列和VL序列并与之相关，但在天然条件下可以不存在于体内人类抗体种系品目中。
如本文所用，术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示配体(例如，其抗原或其抗原片段)实际结合且源自抗体的抗体分子的区域。抗原结合位点包括抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(Vl)，或VH/VL对。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1至3卷中所述的亚组。在一个实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组κI。在一个实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人(出处同上)中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如非人抗体，是指已经经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指其氨基酸组成相同的多个抗体分子的制备物。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由经二硫键键合的两条相同轻链和两条相同重链组成。从N端至C端，每条重链均具有可变区(VH)，亦称为可变重链结构域或重链可变结构域，随后为三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，自N-末端至C-末端，各轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域，继之以恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链基于其恒定结构域的氨基酸序列，可以归属于两种类型中的一种，所述两种类型称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如，Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
本申请内使用的术语“恒定结构域”或“恒定区”表示除可变区之外的抗体结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但表现出多种效应子功能。
表位是与抗体结合的抗原区域。术语“表位”包括能够特异性结合至抗体的任何多肽决定簇。在某些实施例中，表位决定簇包括分子诸如氨基酸的化学活性表面基团、聚糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中，可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施例中，当抗体优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原时，该抗体被称为特异性结合抗原。
如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”是指在体外测定中，优选地在使用纯化的野生型抗原进行的等离子体共振测定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中，抗体与抗原表位的结合。
抗体与抗原结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合速率常数)、kD(解离常数)和KD(kD/ka)定义。在一个实施例中，结合或特异性地结合是指10-8mol/l或更小的结合亲和力(KD)，在一个实施例中为10-8M至10-13mol/l。因此，抗体以10-8mol/l或更低的结合亲和力(KD)特异性地结合其特异性的每种抗原，例如，结合亲和力(KD)为10- 8mol/l至10-13mol/1。在一个实施例中，结合亲和力(Kd)为10-9mol/1至10-13mol/l。
如本文所用的术语“氨基酸”表示具有位于羧基基团的α-位的氨基部分的有机分子。氨基酸的实例包括精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸。在各种情况下采用的氨基酸任选地为L型氨基酸。术语“带正电”或“带负电”氨基酸是指在pH 7.4时氨基酸侧链的电荷。可根据共同的侧链特性将氨基酸分组：
(1)疏水性；正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
表-具有特定性质的氨基酸
Figure BDA0003182486960000121
Figure BDA0003182486960000131
如本文所用，重链和轻链的所有恒定区和结构域的氨基酸位置是根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中描述的Kabat编号系统编号的，并且在本文中被称为“根据Kabat等人编号”。对于恒定重链结构域(CH1、铰链、CH2和CH3)，使用Kabat EU索引编号系统(参见第661-723页)并且在本文中称为“根据Kabat EU索引编号”。
多特异性抗体多肽链内的氨基酸取代(或突变)是通过将适当的核苷酸变化引入抗体DNA或通过核苷酸合成来制备的。然而，此类修饰只能在非常有限的范围内进行，例如如上所述。例如，修饰不会改变上述抗体特征，诸如IgG同种型和抗原结合，但可以进一步提高重组生产的产率、蛋白质稳定性或促进纯化。在某些实施例中，提供了具有一或多个保守性氨基酸取代的抗体变体。
如本文所用，术语“三级结构”是指根据本发明的抗体的几何形状。三级结构包括包含抗体结构域的多肽链主链，而氨基酸侧链以多种方式相互作用和键合。
“多肽”是由通过肽键接合的氨基酸组成的聚合物，无论是天然产生的还是合成产生的。少于约25个氨基酸残基的多肽可称为“肽”，而由两种或多种多肽组成或包含一种超过100个氨基酸残基的多肽的分子可称为“蛋白质”。多肽还可包含非氨基酸组分，诸如碳水化合物基团、金属离子或羧酸酯。非氨基酸组分可以由表达多肽的细胞添加，并且可以随着细胞的类型而变化。多肽在本文中根据它们的氨基酸骨架结构或编码其的核酸来定义。诸如碳水化合物基团之类的加成通常未指定，但仍然可能存在。
如本文所用，术语“病毒衍生肽”是指衍生自病毒的肽。在此语境中，术语“来源于”是指肽与病毒的天然存在的T细胞表位相同(即共享相同的氨基酸序列)。换言之，病毒衍生肽的氨基酸序列与病毒蛋白抗原的氨基酸序列的部分序列相同。尽管用于本发明的病毒衍生肽与相应的天然存在的T细胞表位具有相同的氨基酸序列，但包含在根据本发明使用的融合蛋白中的病毒衍生肽通常是合成来源的。
人类巨细胞病毒HCMV(＝人类疱疹病毒5，HHV-5)是最大的人类病毒之一。其基因组包含大约230,000bp的线性双链DNA，并编码超过160种蛋白质(Davison，A.J.等人，J.Gen.Virol.84(2003)17-28)。
病毒衍生肽与蛋白质例如抗体的“共价偶联”或“共价结合”，是指通过涉及病毒衍生肽的原子和所述蛋白质的原子之间共享电子对的化学键进行的偶联。
如本文所用，“肽”是通过肽键连接的氨基酸单体的短链。与MHC I类结合的肽的长度通常为8个至12个氨基酸。因此，如本文所用的“病毒衍生肽”通常包含8个至12个氨基酸。
“表位”是被免疫系统(例如，抗体、B细胞或T细胞)识别的蛋白质抗原的部分。“T细胞表位”呈递在细胞表面上，在该处它结合至MHC分子。MHC I可呈递的T细胞表位可以被细胞毒性CD8 T淋巴细胞(CD8 T细胞或CTL)的T细胞受体结合。MHC I可呈递的T细胞表位通常是长度为8个至12个氨基酸的肽。I类MHC分子和与其结合的肽在本文中也称为“肽-MHC-I复合物”或简称为“复合物”。
I类MHC分子是异源二聚体，由两条多肽链α(由结构域α1、α2和α3组成)和β2-微球蛋白(b2m)组成。两条链通过b2m与α3结构域的相互作用非共价地连接。
如本文所用，“肽-MHC-I-抗体融合蛋白”是包含偶联至抗体的载肽MHC-I复合物的重组融合蛋白，例如，如WO 2012/175508、WO 2014/083004和WO 2014/096015中所公开的和如图1中的示例性示意图所示的。肽-MHC-I-抗体融合蛋白是通过本领域已知的重组方法和手段产生的，例如，来自WO 2012/175508、WO 2014/083004和WO 2014/096015。“肽-MHC-I-抗体融合蛋白”包括“多肽”，该“多肽”在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。因此，I类MHC分子以及病毒衍生肽的所有组分都提供在单个多肽链上，使得包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的多肽也称为“单链肽-MHC-I-复合物”。
关于多肽的“融合”和“联接”是指通过肽键直接或通过一个或多个肽连接基连接的组分。如本文所用，术语“肽连接基”表示氨基酸序列的肽，其优选地为合成来源的。通常，肽联接基由甘氨酸和丝氨酸等柔性残基组成，使得相邻的蛋白质结构域可以相对于彼此自由移动。因此，根据本发明使用的典型肽联接基是甘氨酸-丝氨酸连接基，即由甘氨酸和丝氨酸残基的模式组成的肽联接基。本文使用的肽连接基的氨基酸序列通常具有8个至50个氨基酸残基的长度。典型的肽连接基是甘氨酸-丝氨酸连接基。
包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的单链肽-MHC-I-复合物可包含二硫桥。在这种情况下，第一肽连接基(即联接病毒衍生肽与β2-微球蛋白的肽连接基)的半胱氨酸残基与I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
如本文所用，“诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答”是指患者的自然发生的病毒感染或施用至患者的导致病毒衍生肽特异性CD8 T细胞活化的治疗，从而导致诱导针对患者体内的载病毒衍生肽的细胞的细胞免疫应答。所施用的治疗被称为“诱导性药物”。合适的方法是，例如，在WO 2015/140172和WO 2015/140175中公开的。一个示例性的“诱导性药物”是结合至XCR1的分子，例如，抗体或淋巴细胞趋化因子(或其片段或变体)，其中该分子偶联至病毒衍生肽。针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答也可由天然病毒感染诱导。例如，欧洲和美国约有50％的人口慢性感染hCMV。对于已经表现出CD8 T细胞免疫应答的患者(例如，四聚体技术可测量的所有CD8 T细胞的0.005％以上)，不需要主动免疫/疫苗接种(用本文定义的诱导性药物治疗)。特异于hCMV的CD8+细胞毒性T细胞的水平趋向于随着年龄的增长而上升，并且在某些情况下可以达到几个百分点。该水平通常在1％左右，而且可能明显更低。其余约50％的人群没有被hCMV感染，并且因此没有任何预先存在的针对这种病毒的蛋白质的CD8+ T细胞毒活性。在人体系统中进行有效的疫苗接种(例如，通过在体内将抗原靶向XCR1+DC)可以预期产生大约0.03％至0.1％的抗原特异性CD8+ T细胞(相对于所有CD8 T细胞)。
如本文所用，“增强针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答”是指施用至患者的治疗导致患者体内病毒衍生肽特异性CD8 T细胞的数量增加。所施用的治疗被称为“增强性药物”。一种示例性“增强性药物”包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th-1佐剂，该佐剂是危险信号。所诱导的针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答可能不足以使用治疗性药物有效地根除癌组织。如上所述诱导后，病毒衍生肽特异性CD8+ T细胞毒活性的水平通常太低，以致于不能用根据本发明的治疗性药物进行有效治疗。例如，在这些慢性感染的人中，低水平的hCMV特异性CD8+ T细胞毒活性很可能不足以使用治疗性药物有效地根除癌组织。这同样适用于已使用诱导性药物进行疫苗接种的患者。重复疫苗接种通常不会显著提高抗原特异性CD8+ T细胞的百分比。这意味着与hCMV慢性感染相比，主动免疫通常不会达到更高水平的基于抗原特异性CD8+ T细胞的细胞毒性。在疫苗接种或自然感染后，免疫应答可以被高度增强，例如通过施用(i)表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及(ii)Th1佐剂，该佐剂是危险信号。表达I类MHC的抗原呈递细胞可以是例如自体PBMC。对PBMC可替代地，还可以使用体外扩增的T细胞或B细胞。载肽自体细胞对诱导的病毒衍生肽特异性(例如，hCMV特异性)CD8+ T细胞的增强(重新活化)扩增了抗原特异性CD8 T细胞，也使它们更具细胞毒性。额外施用适当形式的IL-2进一步扩增了抗原特异性CD8 T细胞。同时，这些T细胞变得更具细胞毒性(通过IL-2的作用)。如上所述，对于已经表现出CD8 T细胞免疫应答的患者，不需要主动免疫/疫苗接种(即用本文定义的诱导性药物治疗)。事实上，通过将抗原靶向XCR1+树突状细胞进行主动免疫不会显著提高这些患者的抗原特异性CD8+ T细胞的水平。因此，通过如上所述增强免疫应答，可以非常显著地简化这些患者的治疗并使其更具成本效益。通过施用增强性药物可以非常有效地增强低水平的抗原特异性(活性或记忆)CD8+ T细胞。包含表达I类MHC的抗原呈递细胞(其中MHC-I结合至肽)和作为危险信号的Th-1佐剂的增强性药物，以及关于增强针对肽的细胞毒性免疫应答的进一步细节，描述于申请EP 18213650中。
如本文所用，“含肽融合蛋白”是包含淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段和病毒衍生肽的重组融合蛋白。XCL1，也称为ATAC、淋巴细胞趋化因子或SCM-1，是趋化因子C家族的唯一成员。活化诱导的、T细胞衍生的和趋化因子相关的细胞因子(ATAC)被克隆到人体内(Müller等人，1995，Eur.J.Immunol.25，1744-48)，并独立地作为小鼠体内的淋巴细胞趋化因子(Kelner等人，1994，Science 266，1395-99)和人体内的SCM-1(Yoshida等人，1995，FEBS Lett.360，155-9)。根据趋化因子ATAC/淋巴细胞趋化因子/SCM-1的命名法，现在定名为“XCL1”。XCL1主要由活化的CD8+ T细胞、Th1 CD4+ T细胞以及由NK细胞分泌。在人类中，已描述了一种定名为XCL2的XCL1变体，其中全长蛋白质的位置28和29处的氨基酸天冬氨酸和赖氨酸分别交换为组氨酸和精氨酸(Yoshida等人，1996，FEBS Lett.395，82-8)，也可用于本发明。在WO 2009/065561的实例8中描述了生产生物活性形式的XCL1的示例性方法。可以使用类似的方法来生产其他生物活性形式的XCL1，例如，其他物种的那些。XCL1是XCR1的配体。
淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或其片段能够特异性地结合至XCR1以诱导针对与其结合的病毒衍生肽的免疫应答。几个物种的XCL1的氨基酸序列(包括人类：GenBank登录号P47992；小鼠：GenBank登录号P47993；和大鼠：GenBank登录号P51672)是已知的。此外，称为K4.1HHV8(GenBank登录号AAB62672.1)的特异性XCLR1激动剂也是已知的，它是一种病毒趋化因子样蛋白质。可以使用任何这些天然存在的XCR1配体或任何其他天然存在的XCRl配体。
如本文所用，“含肽融合蛋白”可包含任何天然存在的XCL1的功能活性变体。术语“变体”包括片段、通过一个或多个氨基酸添加、缺失和/或取代衍生的变体和包括任何天然存在的XCL1或其部分的分子，特别是蛋白质，例如融合蛋白。融合蛋白的XCL1部分可以在C端、N端或C端和N端，尤其是仅在C端侧接氨基酸残基。功能活性片段的特征在于通过一个或多个氨基酸缺失衍生自任何天然存在的XCR1配体，特别是XCL1。缺失可以在C端、N端和/或内部。优选地，片段是通过至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9，10个、20个、30个、40个、50个或60个，更优选通过至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9，10个、15个、20个、25个或30个，甚至更优选至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个，再更优选至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，最优选1个、2个、3个、4个或5氨基酸缺失而获得的。本发明的功能活性片段的特征在于具有与其来源的配体所展示的生物活性相似的生物活性，包括与XCR1结合和介导病毒衍生肽的内化的能力。如果天然存在的XCR1配体(特别是XCL1)的片段的活性(结合以及内化)达到至少10％，优选地至少25％，更多优选至少50％，甚至更优选至少70％，再更优选至少80％，尤其是至少90％，特别是至少95％，最优选地至少99％的XCL1活性而没有序列改变，则该片段在本发明的语境中具有功能活性。可以以任何所需长度设计或获得这些片段，包括长度小至约18个至50个氨基酸。天然存在的XCR1配体(特别是XCL1)的功能活性片段的特征也可能在于其他结构特征。因此，在本发明的一个优选实施例中，功能活性片段由至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、再更优选至少90％、甚至更优选地至少95％、最优选地99％的XCR1配体的氨基酸组成。如上定义的功能活性片段可以通过一个或多个氨基酸缺失而衍生自肽。缺失优选地在C端和/或内部。本发明的另一个优选实施例涉及XCL1变体，其中XCR1配体是XCR1配体的功能活性变体，并且其中该变体与XCR1配体具有至少50％的序列同一性。在更优选的实施例中，功能活性变体与XCL1具有至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％、再更优选地至少90％、甚至更优地选至少95％、最优选99％的序列同一性。功能活性变体通过天然存在的XCRl配体中的序列改变获得，其中具有序列改变的XCR1配体保留未改变的XCR1配体的功能，例如，具有与天然存在的XCR1配体展示的生物活性相似的生物活性，包括结合至XCR1和介导物质ii)内化的能力。此类序列改变可包括但不限于保守取代、缺失、突变和插入。可以评估功能活性变体的这些特征，例如，如上所述。在本发明的一个再更优选的实施例中，的功能活性变体通过保守取代衍生自天然存在的XCR1配体。保守取代是发生在与其侧链和化学性质相关的氨基酸家族内的取代。此类家族的实例是具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳香族侧链、具有不带电荷的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等的氨基酸。在一个实施例中，肽中包括一个保守取代。在另一个实施例中，肽中包括两个或更少的保守取代。在进一步的实施例中，肽中包括三个或更少的保守取代。
如本文所用，“抗体-肽融合蛋白”是包含特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)和病毒衍生肽的抗体或其变体或其片段的重组融合蛋白。根据WO 2009/065561 A2中公开的一般概念，抗体-肽融合蛋白的作用方式是将病毒衍生肽递送至专职抗原呈递细胞，即表达XCR1的树突状细胞。
趋化因子(C基序)受体1(“XCR1”)存在于专职抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞(DC)的表面上，并且可用于选择性地将物质递送到这些细胞中。当与作为危险信号的Th1佐剂一起施用时，将物质靶向递送至表达XCR1的DC可在哺乳动物/人体内诱导有效的Th1免疫应答。除非另外指明，否则如本文所用的术语“XCR1”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然XCR1，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工XCR1，以及通过细胞中加工产生的任何形式的XCR1。该术语还涵盖XCR1的天然存在变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人XCR1的氨基酸序列在SEQ ID NO：1(来自NCBI；登录号NP_001019815)中示出。
特异性地结合至XCR1的抗体在例如EP 2 641 915 A1中公开。特异性地结合至XCR1的抗体可以通过本领域已知的一般方法和手段提供，例如，通过筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库或通过免疫接种。特异性地结合至XCR1的抗体在本文中也称为“抗XCR1抗体”。
抗XCR1抗体或其变体或其片段能够特异性地结合至XCR1以诱导针对与其结合的病毒衍生肽的免疫应答。在本发明的一个实施例中，特异性地结合至XCR1的抗体或其变体或片段可与病毒衍生肽一起使用，其中该肽共价地偶联至所述抗体或其变体或片段，以便诱导针对病毒衍生肽的免疫应答。变体或片段具有功能活性，即功能活性变体/片段(a)的特征在于通过一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代，诸如C端、N端和/或内部缺失、添加和/或取代衍生自任何抗XCR1抗体，并且(b)的特征在于具有与作为其来源的抗XCR1抗体所展示的生物活性相似的生物活性，包括结合至XCR1的能力。针对XCR1生成的抗体可通过将XCR1或其片段直接注射到动物体内或通过将XCR1或其片段施用至动物(优选地是非人动物)而获得。如此获得的抗体随后将结合至XCR1。对于单克隆抗体的制备，可以使用本领域已知的提供由连续细胞系(例如，杂交瘤细胞系)培养物产生的抗体的任何技术。该变体基本上限定为与淋巴细胞趋化因子变体类似。
抗XCR1抗体可以通过筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库来分离。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16：498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8：1177-1194(2016)；Bazan等人，HumanVaccines and Immunotherapeutics 8：1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviewsin Biotechnology 36：276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology 178：1-37(O’Brien等人编辑，Human Press，Totowa，NJ，2001)中和Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo编辑，Human Press，Totowa，NJ，2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12：433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12：725-734(1993)中所描述的。最后，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227：381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。
本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods inMolecular Biology 503：135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology1319：155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889：73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25：5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94：4937-4942(1997)中。
在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
根据本发明使用的融合蛋白是通过重组方式产生的。用于重组生产蛋白质的方法在本领域中广为人知，包括在原核和真核细胞中表达蛋白质，随后分离抗体并通常纯化至药用纯度。为了在宿主细胞中表达上述融合蛋白，通过标准方法将编码相应多肽链的核酸插入表达载体中。在适当的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞中回收抗体(裂解后的上清液或细胞)。蛋白质重组生产的一般方法在现有技术中是众所周知的，并且描述在例如以下综述文章中：Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880。
药理学领域的佐剂是指本身几乎没有药理作用或没有药理作用，但同时给予其他药物可能会增加疗效或效力的药物。在免疫学中，佐剂是一种药剂，虽然它本身没有任何特异性抗原作用，但可以刺激免疫系统，增加对疫苗的应答。在现有技术的一些文件中，细胞因子，诸如IL-2，在T细胞应答的背景下被错误地定名为“佐剂”。这种错误的指定既可归因于对术语“佐剂”的错误使用，该术语通常被认为是指改变其他药剂的作用而自身给予时几乎没有直接作用的药剂。然而，已知细胞因子(诸如IL-2)自身具有多种作用，并且不表示根据本发明的“佐剂”。无论如何，细胞因子诸如IL-2不是根据本发明的“作为危险信号的Th1佐剂”。因此，在本发明的另一个优选实施例中，作为危险信号的Th1佐剂不是细胞因子。在本发明的另一个更优选的实施例中，作为危险信号的Th1佐剂不是IL-2。
“作为危险信号的Th1佐剂”应理解为选自病原体相关分子模式(PAMP，例如，LPS)、PAMP的衍生物(例如，作为LPS的衍生物的MPL和GLA)或人工化合物(诸如肽、蛋白质、脂质、脂蛋白、碳水化合物、核酸或小分子)，模拟PAMP并使一个或多个模式识别受体(PRR)活化。此类人工化合物的实例是poly(I：C)，其模拟双链病毒RNA并使TLR3活化；或CpG，其模拟未甲基化的细菌DNA并使TLR7/8活化；或小分子激动剂。表1列出了一些已知的模式识别受体(PRR)，其诱导Th1/Tc1免疫应答；以及相应的天然PAMP或危险信号佐剂，其诱导和支持Th1/Tc1细胞毒性应答。值得注意的是，根据条件，TLR2和TLR5可能可替代地诱导非细胞毒性Th2T细胞应答。作为本发明的“作为危险信号的Thl佐剂”，优选表1中列出的作为危险信号的Th1佐剂。
表1
Figure BDA0003182486960000231
Figure BDA0003182486960000232
作为危险信号的Th1佐剂可以在时间上和/或空间上单独施用或与增强性药物一起施用。当在时间和空间上单独施用时，作为危险信号的Th1佐剂优选地在施用增强性药物后24小时内施用。当与增强性药物在时间上一起施用时，作为危险信号的Th1佐剂可以共价或非共价地附接到用于增强性药物的细胞上，也可以不附接到该细胞上，并且可以与细胞处于相同的组合物或处于单独的组合物中，诸如单独的小瓶或容器中。
在本发明的一个实施例中，作为危险信号的Th1佐剂被模式识别受体(PRR)识别。在本发明的一个实施例中，作为危险信号的Th1佐剂是病原体相关分子模式(PAMP)或模拟该模式。
在本发明的一个实施例中，作为危险信号的Th1佐剂经全身、局部、静脉内、皮下、腹膜内、瘤内或皮内施用和/或通过注射施用。
在作为用于本发明的危险信号的Th1佐剂的一个实施例中，
模式识别受体(PRR)选自STING、RIG-I、MD5、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9，和/或
病原体相关分子模式(PAMP)选自cGAMP、c-di-GMP、c-di-AMP、dsRNA、MALP-2、肽聚糖、脂肽、脂磷壁酸、脂多糖(LPS)、RSV融合蛋白、鞭毛蛋白、ssRNA、咪唑喹诺酮和CpG多脱氧核苷酸或CpG寡脱氧核苷酸，和/或
作为危险信号的Th1佐剂选自STING激动剂，优选地选自STING活化环状二核苷酸或小分子；RIG-I激动剂，优选地选自poly(I：C)、polyICLC、poly I：C12U、polyI：C12C、基于RNA的RIG-I激动剂和小分子RIG-I激动剂；MD5激动剂，优选地选自poly(I：C)、polyICLC、poly I：C12U、polyI：C12C、基于RNA的MD5激动剂和小分子MD5激动剂；TLR2激动剂，优选地选自Pam3CSK4、Pam2Cys、Pam3Cys、脂蛋白、孔蛋白、毒素和小分子TLR2激动剂；TLR3激动剂，优选地选自poly(I：C)、polyICLC、ARNAX、poly I：C12U、polyI：C12C、进一步的dsRNA模拟物、dsRNA和小分子TLR3激动剂；TLR4激动剂，优选地选自MPLA和GLA及其调配物、小分子TLR4激动剂；TLR4激动剂，优选地选自鞭毛蛋白及其衍生物和小分子TLR5激动剂；TLR7激动剂，优选地选自咪唑喹诺胺、鸟苷类似物、ssRNA和小分子TLR7激动剂；TLR8激动剂，优选地选自咪唑喹诺胺、鸟苷类似物、ssRNA和小分子TLR8激动剂；TLR9激动剂，优选地选自CpG多脱氧核苷酸或寡脱氧核苷酸或其变体以及短DNA寡核苷酸。
根据本发明的融合蛋白(和任何其他药物或本文提及的治疗剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
用于本发明的用途的融合蛋白将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。融合蛋白不是必须地而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的药剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的抗体的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，用于本发明的用途的融合蛋白的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病类型、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和病程、是否以预防或治疗目的施用融合蛋白、既往疗法、患者的临床病史和对融合蛋白的应答以及主治医师的判断。融合蛋白适当地一次性或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的所用的融合蛋白可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用至患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。融合蛋白的一个示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约两次至约二十次，或例如约六次剂量的抗体)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。然而，其他剂量方案可能有用。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
术语“与......联合施用”、“共同施用”、“共施用”、“联合疗法”、“与......一起施用”或“联合治疗”是指施用如本文所述的肽-MHC-I-抗体融合蛋白、和抗体-肽融合蛋白以及载病毒衍生肽的表达I类MHC的抗原呈递细胞和支持如本文所述的Th1介导的应答的佐剂，作为单独的调配物/应用而施用至同一患者。
在一个实施例中，
(a)肽-MHC-I-抗体融合蛋白，和/或
(b)抗体-肽融合蛋白，和/或
(c)装载了病毒衍生肽的表达I类MHC的抗原呈递细胞，和作为危险信号的Th1佐剂，
作为单独的调配物并且以不同的应用方案施用。
共同施用的量和共同施用的时间将取决于所治疗患者的类型(物种、性别、年龄、体重等)和状况以及所治疗疾病或病症的严重程度。
如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变型，诸如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施例中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
药剂(例如，药物制剂)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下有效实现所期望的治疗或预防结果的量。
如本文所用，术语“患者”、“受试者”或“个体”优选地是指需要治疗癌症或病毒感染的人类。然而，术语“患者”、“受试者”或“个体”也可以指需要治疗的非人类动物，例如，哺乳动物诸如小鼠、狗、猫、马、牛、猪、羊和非人灵长类动物等。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“白细胞介素-2”或“IL-2”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然IL-2，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括未加工的IL-2以及通过细胞中加工产生的任何形式的IL-2。该术语还涵盖天然存在的IL-2变体，例如剪接变体或等位基因变体。示例性人IL-2的氨基酸序列示出于SEQ ID NO：2中。未加工的人IL-2另外包含具有SEQ IDNO：3所示氨基酸序列(MYRMQLLSCIALSLALVTNS，前导序列)的N端20个氨基酸信号肽，该信号肽在成熟IL-2分子中不存在。
如本文所用的术语“IL-2突变体”或“突变IL-2多肽”旨在涵盖各种形式的IL-2分子的任何突变形式，包括全长IL-2、截短形式的IL-2，以及IL-2与另一分子诸如通过融合或化学缀合连接的形式。当关于IL-2使用时，“全长”旨在表示成熟的天然长度IL-2分子。例如，全长人IL-2是指具有133个氨基酸的分子(参见例如SEQ ID NO：2)。各种形式的IL-2突变体表征为具有至少一种影响IL-2与CD25相互作用的氨基酸突变。该突变可涉及对通常位于该位置的野生型氨基酸残基的取代、缺失、截短或修饰。通过氨基酸取代获得的突变体是优选的。除非另外指明，否则IL-2突变体在本文中可称为IL-2突变肽序列、IL-2突变多肽、IL-2突变蛋白质或IL-2突变类似物。优选地，IL-2突变体是在患者中具有延长的半衰期的IL-2变体(也见下文)。
如本文所用，“复合IL-2”或“IL-2cx”理解为非共价地结合至结合分子的IL-2蛋白，特别是阻断其结合至高亲和力IL-2受体链(CD25)的抗体或抗体片段。在一个优选的实施例中，抗体是人源化抗体或人抗体。在一个优选的实施例中，IL-2是人I1-2，更优选地是人野生型IL-2。IL-2可以合成地合成或使用合适的宿主重组地合成，更优选地是IL-2是重组地制备的。在一个优选的实施例中，与未复合IL-2与CD25的结合相比，复合IL-2与CD25的结合降低至少35％，更优选地至少50％，甚至更优选地至少75％，最优选地至少90％或95％，诸如100％。可以使用本领域技术人员已知的表面等离子体共振光谱法将与CD25的结合确定为Kd值。下面和EP 18213650中描述了关于复合IL-2的更多细节(参见第4页最后一段到第5页第4段以及图1至3和实例1至3)。
IL-2突变蛋白被理解为IL-2蛋白，特别是人IL-2蛋白，其与wt IL-2蛋白相比发生突变，并与CD122结合，但表现出与wt IL-2蛋白相比降低的与CD25的结合。在一个优选的实施例中，与wt IL-2蛋白与CD25的结合相比，与CD25的结合降低至少35％，更优选至少50％，甚至更优选至少75％，最优选至少90％或95％，诸如100％。特别地，可以使用本领域技术人员已知的表面等离子体共振光谱法将与CD25的结合确定为亲和力，表示为Kd值。此外，可以使用表面等离子体共振光谱法确定与CD122的结合。在一个优选的实施例中，IL-2突变蛋白与CD122的结合为wt IL-2蛋白与CD122的结合的至少10％，优选地至少35％，更优选地至少50％，甚至更优选地至少90％或95％，诸如100％或更多。用于本发明的特别优选的IL-2突变蛋白公开于Carmenate，Journal of Immunology 2013中。特别地，可以使用wt IL-2的R38、F42、Y45、E62突变蛋白，优选地可以使用wt IL-2的R38A、F42A、Y45A、E62A突变蛋白，该突变蛋白可以进一步包含C125突变，诸如C125S突变。可根据本发明使用的另一种特别优选的IL-2突变蛋白在Klein等人2014中描述。用于本发明的用途或方法的药物的更优选实施例中，复合白细胞介素2(Il-2cx)、复合白细胞介素15(Il-15cx)、复合白细胞介素4(Il-4cx)、复合白细胞介素7(IL-7cx)或IL-2突变蛋白重复施用，特别是重复施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、1、12、13或14次，甚至更优选地其中复合白细胞介素2(IL-2cx)、复合白细胞介素15(IL-15cx)、复合白细胞介素4(IL-4cx)、复合白细胞介素7(IL-7cx)或IL-2突变蛋白每1天或2天施用一次，和/或在5天至1个月的期间内，甚至更优选地在1周至2周的期间内重复施用。
如本文所用的术语“氨基酸突变”表示涵盖氨基酸取代、缺失、插入和修饰。可以进行取代、缺失、插入和修饰的任何组合以获得最终构建体，前提条件是所述最终构建体具有所需特征，例如减少的与CD25的结合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基酸的氨基末端和/或羧基末端缺失和插入。末端缺失的实例是全长人IL-2的位置1中的丙氨酸残基的缺失。优选的氨基酸突变是氨基酸取代。出于改变例如IL-2多肽的结合特征的目的，非保守氨基酸取代，即用具有不同结构和/或化学性质的另一种氨基酸取代一种氨基酸，是特别优选的。优选的氨基酸取代包括用亲水性氨基酸取代疏水性氨基酸。氨基酸取代包括用非天然存在的氨基酸或用二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟基脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟基赖氨酸)进行替代。可以使用本领域熟知的遗传或化学方法来产生氨基酸突变。遗传方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。设想通过除基因工程之外的方法(诸如化学修饰)改变氨基酸侧链基团的方法也是有用的。
如本文所用，“野生型”形式的IL-2是IL-2的一种形式，所述野生型形式与突变IL-2多肽在其他方面相同，不同之处在于野生型形式在突变IL-2多肽的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸。例如，如果IL-2突变体是全长IL-2(即IL-2未与任何其他分子融合或缀合)，则该突变体的野生型形式是全长天然IL-2。如果IL-2突变体是IL-2与IL-2下游编码的另一种多肽(例如抗体链)之间的融合体，则该IL-2突变体的野生型形式是与相同的下游多肽融合的、具有野生型氨基酸序列的IL-2。此外，如果IL-2突变体是IL-2的截短形式(IL-2的非截短部分内的突变或修饰的序列)，则该IL-2突变体的野生型形式是具有野生型序列的类似截短的IL-2。出于比较各种形式的IL-2突变体与相应的野生型形式的IL-2的IL-2受体结合亲和力或生物活性的目的，术语野生型涵盖这样形式的IL-2，所述形式的IL-2包含与天然存在的天然IL-2相比不影响IL-2受体结合的一个或多个氨基酸突变，例如将对应于人IL-2的残基125的位置处用半胱氨酸取代丙氨酸。在一些实施例中，用于本发明目的的野生型IL-2包含氨基酸取代C125A(参见SEQ ID NO：3)。在根据本发明的某些实施例中，与突变IL-2多肽相比较的野生型IL-2多肽包含如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在其他实施例中，与突变IL-2多肽相比较的野生型IL-2多肽包含如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“CD25”或“IL-2受体的α亚基”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD25，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如人)之类的哺乳动物，以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工CD25，以及通过细胞中加工产生的任何形式的CD25。该术语还涵盖天然存在的CD25变体，例如剪接变体或等位基因变体。在某些实施例中，CD25是人CD25。示例性人CD25的氨基酸序列(具有信号序列、Avi-标签和His-标签)显示在SEQ ID NO：278中。
如本文所用的术语“高亲和力IL-2受体”是指异源三聚形式的IL-2受体，其由受体γ亚基(也称为共同细胞因子受体γ亚基、γc或CD132)、受体β亚基(也称为CD122或p70)和受体α亚基(也称为CD25或p55)组成。相比之下，术语“中间亲和力IL-2受体”是指仅包含γ亚基和β亚基，而不含α亚基的IL-2受体(综述请参见例如Olejniczak和Kasprzak，Med SciMonit 14，RA179-189(2008))。
(b)具体实施方式
本发明涉及一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白作为治疗性药物使用，
其中所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经在所述患者体内诱导了针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中所诱导的针对所述病毒衍生肽的免疫应答已在所述患者体内通过增强性药物得到增强。
在一个实施例中，通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染来诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化
另外地或可替代地，增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
在一个实施例中，诱导性药物包含
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，其特异性地结合至XCR1；以及
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段。
在另一个实施例中，诱导性药物包含：
(a)抗体或其变体或片段，其特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至所述抗体或其变体或片段。
本发明的另一方面是一种多组分试剂盒，其包括增强性药物和治疗性药物，
该增强性药物包含：
(a)表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及
(b)Th1佐剂，该佐剂是危险信号；
其中该增强性药物增强患者体内的针对病毒衍生肽的免疫应答，
并且
该治疗性药物包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含所述病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
该试剂盒可以进一步包含诱导性药物，该诱导性药物诱导患者体内的针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答。
该试剂盒可以用作药物，其中治疗性药物待施用至针对病毒衍生肽的免疫应答增强的患者，其中增强性药物增强患者体内的针对病毒衍生肽的免疫应答，并且其中诱导性药物通过疫苗接种诱导患者体内的针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，特别地，其中诱导性药物如上文定义。
本发明的另一方面是一种多组分试剂盒，其包含诱导性药物和增强性药物，
该诱导性药物如上文定义，并且
该增强性药物如上文定义，
该试剂盒用于使患者对于使用包含以下项的肽-MHC-I-抗体融合蛋白进行的治疗敏感的方法中
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
在本发明的一个实施例中，诱导性药物已经与Th1佐剂联合施用或与Th1佐剂联合施用，所述Th1佐剂是危险信号。
在本发明的另一个实施例中，在患者体内具有延长的半衰期的白细胞介素-2(IL-2)或IL-2变体已经在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用或在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用。
在本发明的又另一实施例中，Th1佐剂是聚肌胞苷酸(poly I：C)。
然而，在本发明的另一个实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞和佐剂已经在针对该病毒衍生肽诱导患者的T细胞之后3天至14天施用或在针对该病毒衍生肽诱导患者的T细胞之后3天至14天施用，优选地之后4天至10天施用。
在本发明的另一个实施例中，治疗性药物在病毒衍生肽特异性CD8+ T细胞水平由于施用增强性药物而升高时施用，优选地，其中治疗性药物在从施用增强性药物起29天内，特别是20天内，尤其是14天内施用。更优选地，治疗性药物在增强后短时间内施用，诸如在施用增强性药物后3天内、2天内或1天内施用或在其后立即施用。
在本发明的又另一实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体特异性地结合至选自由癌细胞和病毒感染细胞组成的组的靶细胞。
在本发明的又另一实施例中，该肽-MHC-I-抗体融合蛋白或多组分试剂盒用于治疗癌症或病毒感染。
肽-MHC-I-抗体融合蛋白
以下段落包括进一步定义该肽-MHC-I-抗体融合蛋白的实施例。
(i)的抗体
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是全长抗体。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是单特异性抗体。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是二价抗体。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是多特异性抗体。在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是双特异性抗体。
多特异性抗体是对至少两个不同位点(即，不同抗原上的不同表位或相同抗原上的不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。在某些实施例中，结合特异性中的一种针对表达在靶细胞上的抗原，并且另一种(两种或更多种)特异性针对任何其他抗原。在某些实施例中，双特异性抗体可结合表达在靶细胞上的抗原的两个(或更多个)不同的表位。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两种免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello，Nature 305：537(1983))及“杵臼结构”工程化(参见例如，美国专利5,731,168，以及Atwell等人，J.Mol.Biol.270：26(1997))。多特异性抗体还可以通过以下方式来制备：工程化用于制备抗体Fc-异二聚体分子的静电操纵效应(参见例如，WO 2009/089004)；使两个或更多个抗体或片段交联(参见例如，美国专利4,676,980，以及Brennan等人，Science，229：81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用用于避免轻链错配问题的常用轻链技术(参见例如，WO 98/50431)；使用用于制备双特异性抗体片段的“双体抗体”技术(参见例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，J.Immunol.，152：5368(1994))；以及如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中所述制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，包括例如“章鱼抗体”或者DVD-Ig(参见例如，WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他示例可以在WO 2010/115589、WO 2010/112193、WO 2010/136172、WO2010/145792和WO 2013/026831中找到。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重作用Fab”或“DAF”，其包含结合至表达在靶细胞上的抗原以及另一种不同抗原的抗原结合位点或者包含结合至表达在靶细胞上的抗原的两个不同表位的抗原结合位点(参见例如，US2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以以不对称形式提供，其中在具有相同抗原特异性的一个或多个结合臂中有结构域互换，即通过交换VH/VL结构域(参见例如，WO 2009/080252和WO2015/150447)、CH1/CL结构域(参见例如，WO 2009/080253)或完整的Fab臂(参见例如，WO2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人，PNAS，108(2011)1187-1191，以及Klein等人，MAbs 8(2016)1010-20)。在一个实施例中，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换型Fab片段”是指这样的Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区被交换。交叉Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的多肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。还可以通过将荷电或非荷电的氨基酸突变引入结构域界面以指导正确的Fab配对，以对不对称Fab臂进行工程化。参见例如WO 2016/172485。
多特异性抗体的各种其他分子形式是在本领域中已知的并且包括在本文中(参见例如Spiess等人，Mol Immunol 67(2015)95-106)。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体包含一种或多种免疫球蛋白类别的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类别包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，在IgG和IgA的情况下，还包括它们的亚型。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体属于IgG类或IgE类。在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体属于人IgG1同种型或人IgG2同种型。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是具有突变L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1同种型或人IgG2同种型。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是具有突变D265A和N297A(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1同种型或人IgG2同种型。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是具有突变P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1同种型或人IgG2同种型。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体是具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1同种型或人IgG2同种型。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体在CH3结构域中包含支持抗体重链异二聚化的氨基酸突变。在一个实施例中，恰好包含(ii)的一种多肽的肽-MHC-I-抗体融合蛋白在CH3结构域中包含支持抗体重链异二聚化的氨基酸突变。
已经描述了进行CH3修饰以支持异二聚化的几种方法，例如，在WO 96/27011、WO98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中，这些专利在此引入作为参考。通常，在本领域已知的方法中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域均以互补方式进行工程化改造，使得包含一个工程化改造CH3结构域的重链不再与另一条相同结构的重链同二聚化(例如，CH3工程化改造的第一重链不能再与另一条CH3工程化改造的第一重链同二聚化；并且CH3工程化改造的第二重链不能再与另一条CH3工程化改造的第二重链同二聚化)。因此，包含一个工程化改造CH3结构域的重链被迫与包含以互补方式工程化改造的CH3结构域的另一条重链异二聚化。对于本发明的该实施例，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域通过氨基酸取代以互补方式工程化，使得第一重链和第二重链被迫异二聚化，而第一重链和第二重链不能再同二聚化(例如，出于空间原因)。
在一个实施例中，(i)的抗体包含包括CH3结构域的第一重链和包括CH3结构域的第二重链，第一重链和第二重链的CH3结构域通过所谓的“杵臼结构”技术进行工程化改造，在此通过引入并入本文的以下文献详细描述了该技术提供的几个实例，例如WO 96/027011；Ridgway，J.B.，等人，Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant，A.M.，等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；以及WO 98/050431。在“杵臼结构”技术中，在抗体的三级结构中，在第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域之间形成的界面内，工程化改造了每个CH3结构域上的特定氨基酸，以分别在一条重链的CH3结构域中产生一个突起(“杵”)并且在另一条重链的CH3结构域中产生一个空腔(“臼”)。在抗体的三级结构中，一条重链的CH3结构域中引入的突起可定位在另一条重链的CH3结构域中引入的空腔中。每条重链可在其CH3结构域中包含“杵”，而另一条重链在其CH3结构域中包含“臼”。
在一个实施例中，(i)的抗体在每个CH3结构域中包含多达五个支持抗体重链异二聚化的突变。
在(i)的抗体的三级结构的一个实施例中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于各自抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域各自的氨基酸序列各自包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，
(i)其中在位于一条重链的CH3结构域界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被侧链体积大于原始氨基酸残基的氨基酸残基取代，从而在界面内生成突起，其中该突起位于一条重链的CH3结构域中，并且其中该突起可定位在位于界面内另一条重链的CH3结构域中的空腔中；并且
(ii)其中在位于另一条重链的CH3结构域界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被侧链体积小于原始氨基酸残基的氨基酸残基取代，从而在界面内生成空腔，其中该空腔位于一条重链的CH3结构域中，并且其中位于一条重链的CH3结构域中的界面内突起可定位在该空腔中。
换言之，该实施例涉及肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中(i)的抗体的一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域各自在包含抗体CH3结构域之间的原始界面的界面处相会；其中所述界面被改变以促进抗体的形成，其中该改变的特征在于：
(iii)一条重链的CH3结构域被改变，使得在与抗体内另一条重链的CH3结构域的原始界面相会的一条重链的CH3结构域的原始界面内，一个氨基酸残基被替换为一个具有更大侧链体积的氨基酸残基，从而在一条重链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可定位在另一条重链的CH3结构域界面内的空腔中；和
(iv)另一条重链的CH3结构域被改变，使得在与抗体内第一CH3结构域的原始界面相会的第二CH3结构域的原始界面内，一个氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，从而在第二CH3结构域的界面内生成空腔，第一CH3结构域的界面内的突起可定位在该空腔内。
根据该实施例的抗体在本文中也称为“CH3(KiH)工程化改造的抗体”(其中缩写“KiH”代表“杵臼结构技术”)。
在一个实施例中，所述具有比原始氨基酸残基更大侧链体积的氨基酸残基选自R、F、Y和W；并且其中所述具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的氨基酸残基选自A、S、T和V。
在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被W取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被S取代，位置368处的氨基酸L被A取代，并且位置407处的氨基酸Y被V取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被W取代，位置409处的氨基酸R被D取代，并且位置370处的氨基酸K被E取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被S取代，位置368处的氨基酸L被A取代，位置407处的氨基酸Y被V取代，位置399处的氨基酸D被K取代，并且位置357位处的氨基酸E被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
除了通过“杵臼结构”技术改造第一重链和第二重链的CH3结构域外，二硫桥的引入进一步稳定了异二聚体(Atwell，S.，等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35；Merchant，A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681)。因此额外引入二硫桥进一步增加了根据本发明的抗体的产率。
在一个实施例中，在位于一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且在位于另一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中该第二氨基酸面向该界面内的第一氨基酸；因此，可以通过引入半胱氨酸残基而在一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域之间形成二硫桥。
在一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置356处的氨基酸E或位置354处的氨基酸S被C取代，而在另一条重链的CH3结构域中，位置349处的氨基酸Y被C取代(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，所述具有比原始氨基酸残基更大侧链体积的氨基酸残基选自R、F、Y和W；并且在位于一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且在位于另一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中该第二氨基酸面向该界面内的第一氨基酸；因此，可以通过引入半胱氨酸残基而在一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域之间形成二硫桥。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，所述具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的氨基酸残基选自A、S、T和V；并且在位于一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且在位于另一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中该第二氨基酸面向该界面内的第一氨基酸；因此，可以通过引入半胱氨酸残基而在一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域之间形成二硫桥。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，所述具有比原始氨基酸残基更大侧链体积的氨基酸残基选自R、F、Y和W；所述具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的氨基酸残基选自A、S、T和V；并且在位于一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且在位于另一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中该第二氨基酸面向该界面内的第一氨基酸；因此，可以通过引入半胱氨酸残基而在一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域之间形成二硫桥。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，所述具有比原始氨基酸残基更大侧链体积的氨基酸残基选自R、F、Y和W；并且在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置356(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E或位置354(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸S被C取代，并且在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置349(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被C取代。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，所述具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的氨基酸残基选自A、S、T和V；并且在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置356(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E或位置354(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸S被C取代，并且在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置349(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被C取代。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，所述具有比原始氨基酸残基更大侧链体积的氨基酸残基选自R、F、Y和W；并且所述具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的氨基酸残基选自A、S、T和V；并且在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置356(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E或位置354(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸S被C取代，并且在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置349(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被C取代。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被W取代，并且位置356(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E或位置354(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸S被C取代；并且在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被S取代，位置368(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸L被A取代，位置407(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被V取代，并且位置349(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被C取代。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被W取代，并且位置349(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被C取代；并且在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被S取代，位置368(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸L被A取代，位置407(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被V取代，并且位置356(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E或位置354(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸S被C取代。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被W取代，位置409(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸R被D取代，位置370(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸K被E取代，并且位置356(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E或位置354(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸S被C取代；并且在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被S取代，位置368(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸L被A取代，位置407(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被V取代，位置399(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸D被K取代，位置357(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E被K取代，并且位置349(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被C取代。
在一个实施例中，在所述CH3(KiH)-工程化抗体内，在一条重链(包含“杵”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被W取代，位置409(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸R被D取代，位置370(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸K被E取代，并且位置349(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被C取代；并且在另一条重链(包含“臼”的重链)的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸T被S取代，位置368(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸L被A取代，位置407(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸Y被V取代，位置399(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸D被K取代，位置357(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E被K取代，并且位置356(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸E或位置354(根据Kabat EU所引编号)处的氨基酸S被C取代。
除了“杵臼结构技术”之外，用于修饰抗体的重链的CH3结构域以实施异源二聚化的其他技术也是本领域中已知的。这些技术，尤其是在WO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的技术，在本文中被认为是“杵臼结构技术”与根据本发明的抗体的组合的替代方案。
因此，该实施例涉及包含抗体的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中在抗体的三级结构中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于相应的抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域的相应氨基酸序列和第二重链的CH3结构域的氨基酸序列各自包含位于所述抗体的三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，其中在位于一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第一氨基酸被带正电荷的氨基酸取代，并且在位于另一条重链的CH3结构域中的界面中的一组氨基酸中，第二氨基酸被带负电荷的氨基酸取代。根据该实施例的抗体在本文中也称为“CH3(+/-)工程化改造的抗体”(其中缩写“+/-”代表在相应CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在根据本发明的所述CH3(+/-)工程化改造的抗体的一个实施例中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在所述CH3(+/-)工程化改造的抗体的一个实施例中，带正电荷的氨基酸选自K和R，而带负电荷的氨基酸选自E或D。
在所述CH3(+/-)工程化改造的抗体的一个实施例中，带正电荷的氨基酸是K，而带负电荷的氨基酸是E。
在所述CH3(+/-)工程化改造的抗体的一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置409(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸R被D取代，并且位置370(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K被E取代；并且在另一条重链的CH3结构域中，位置399(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸D被K取代，并且位置357(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸E被K取代。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体内，使用WO2013/157953中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在所述CH3工程化改造的抗体的一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被K取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置351(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被D取代。在所述CH3工程化改造的抗体的另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被K取代，并且位置351(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被K取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置351(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被D取代。
在所述CH3工程化改造的抗体的另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被K取代，并且位置351(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被K取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置351(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被D取代。此外，以下取代中的至少一者包含在另一条重链的CH3结构域中：位置349(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸Y被E取代，位置349(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸Y被D取代，以及位置368(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被E取代。在一个实施例中，位置368(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被E取代。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体内，使用WO2012/058768中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在所述CH3工程化改造的抗体的一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置351(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被Y取代，并且位置407(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸Y被A取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被A取代，并且位置409(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K被F取代。在另一个实施例中，除了上述取代外，在另一条重链的CH3结构域中，位置411(原为T)、399(原为D)、400(原为S)、405(原为F)、390(原为N)和392(原为K)处的氨基酸中的至少一者被取代。优选的取代是：
(a)用选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸取代位置411(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T；
(b)用选自R、W、Y和K的氨基酸取代位置399(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸D；
(c)用选自E、D、R和K的氨基酸取代位置400(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸S；
(d)用选自I、M、T、S、V和W的氨基酸取代位置405(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸F；
(e)用选自R、K和D的氨基酸取代位置390(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸N；
(f)用选自V、M、R、L、F和E的氨基酸取代位置392(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K；
在所述CH3工程化改造的抗体的另一个实施例(根据WO2012/058768进行工程化改造)中，在一条重链的CH3结构域中，位置351(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸L被Y取代，并且位置407(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸Y被A取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被V取代，并且位置409(根据KabatEU索引编号)处的氨基酸K被F取代。在所述CH3工程化改造的抗体的另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置407(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸Y被A取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被A取代，并且位置409(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K被F取代。在所述最后一个上述实施例中，在所述另一条重链的CH3结构域中，位置392(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K被E取代，位置411(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被E取代，位置399(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸D被R取代，并且位置400(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸S被R取代。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体内，使用WO 2011/143545中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在所述CH3工程化改造的抗体的一个实施例中，将氨基酸修饰引入到两条重链的CH3结构域中的位置368和/或409处。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体内，使用WO 2011/090762中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。WO 2011/090762涉及根据“杵臼结构”技术的氨基酸修饰。在所述CH3(KiH)工程化改造的抗体的一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被W取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置407(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸Y被A取代。在所述CH3(KiH)工程化改造的抗体的另一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置366(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸T被Y取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置407(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸Y被T取代。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体(该抗体属于IgG2同种型)内，使用WO 2011/090762中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体内，使用WO 2009/089004中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在所述CH3工程化改造的抗体的一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置392(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K或N被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)；而在另一条重链的CH3结构域中，位置399处的氨基酸D、位置356处的氨基酸E或D、或者位置357(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸E被带正电荷的氨基酸取代(在一个优选实施例中被K或R取代，在一个优选实施例中被K取代，在一个优选实施例中，位置399或356处的氨基酸被K取代)。在一个进一步实施例中，除了上述取代之外，在一条重链的CH3结构域中，位置409(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K或R被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选实施例被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)。在一个更进一步的实施例中，除了上述取代之外或作为上述取代可替代地，在一条重链的CH3结构域中，位置439处的氨基酸K和/或370(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K彼此独立地被带负电荷的氨基酸取代(在一个优选实施例中被E或D取代，在一个优选实施例中被D取代)。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体内，使用WO 2007/147901中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。在所述CH3工程化改造的抗体的一个实施例中，在一条重链的CH3结构域中，位置253(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K被E取代，位置282(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸D被K取代，并且位置322(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K被D取代；并且在另一条重链的CH3结构域中，位置239(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸D被K取代，位置240(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸E被K取代，并且位置292(根据Kabat EU索引编号)处的氨基酸K被D取代。
在一个实施例中，在包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体内，使用WO 2007/110205中描述的方法来支持抗体的第一重链和第二重链的异二聚化。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含特异性地结合至选自癌细胞或病毒感染细胞的组的靶细胞的抗体。在一个实施例中，靶细胞是癌细胞。在一个实施例中，靶细胞是非实体瘤的癌细胞。
在一个实施例中，癌细胞选自与以下癌症类型之一相关的癌细胞：淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，包括以上癌症中的任一种的难治型。在一个实施例中，癌细胞选自与以下癌症类型之一相关的癌细胞：淋巴瘤、淋巴细胞白血病、骨癌和霍奇金病。
(ii)的多肽：
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白的(ii)的多肽以其C端融合至(i)的抗体的一条重链的N端。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白的(ii)的多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、第一肽连接基、β2-微球蛋白、第二肽连接基和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白的(ii)的多肽以其C端通过第三肽连接基融合至(i)的抗体的一条重链的N端。
在一个实施例中，肽连接基(第一肽连接基、第二肽连接基或第三肽连接基)包含8个至50个氨基酸残基。在一个实施例中，肽连接基(第一肽连接基、第二肽连接基或第三肽连接基)包含8个至25个氨基酸残基。
在一个实施例中，第一肽连接基和第二肽连接基的长度相同。在一个实施例中，第一肽连接基和第二肽连接基的氨基酸序列相同。
在一个实施例中，肽连接基是甘氨酸-丝氨酸连接基。在本发明的一个实施例中，肽连接基是由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。在本发明的一个实施例中，甘氨酸-丝氨酸连接基具有以下结构
(GxS)n或(GxS)nGm
其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，x＝3或4，n＝2、3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3。
在一个实施例中，上述定义的甘氨酸-丝氨酸连接基中，x＝3，n＝3、4、5或6，并且m＝0、1、2或3；或者x＝4，n＝2、3、4或5，并且m＝0、1、2或3。在一个优选实施例中，x＝4且n＝2或3，并且m＝0。在一个优选实施例中，x＝4且n＝2。在一个实施例中，肽连接基是(G4S)2。
在一个实施例中，在肽-MHC-I-抗体融合蛋白的(ii)的多肽内，在第一肽连接基的半胱氨酸残基与I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包括恰好一个多肽，该多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含一个或两个多肽，该多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3，其中在第一肽连接基的半胱氨酸残基与I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含两个多肽，该多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3，其中在第一肽连接基的半胱氨酸残基与I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含病毒衍生病毒，所述病毒选自人巨细胞病毒、腺病毒、人疱疹病毒1、人疱疹病毒2、人疱疹病毒4(爱泼斯坦-巴尔病毒)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒16型、人乳头瘤病毒18型、人乳头瘤病毒31型、人乳头瘤病毒33型、人乳头瘤病毒35型、人乳头瘤病毒39型、人乳头瘤病毒45型、人乳头瘤病毒51型、人乳头瘤病毒52型、人乳头瘤病毒56型、人乳头瘤病毒58型、人乳头瘤病毒59型、人乳头瘤病毒68型、人乳头瘤病毒73型、人乳头瘤病毒82型、人T细胞嗜淋巴细胞病毒I型、人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、牛痘病毒、登革热病毒。
在一个实施例中，病毒衍生肽选自NLVPMVATV(SEQ ID NO：04)、VLEETSVML(SEQ IDNO：05)、NLVPMVATV(SEQ ID NO：06)、RIFAELEGV(SEQ ID NO：07)、IIYTRNHEV(SEQ ID NO：08)、VLAELVKQI(SEQ ID NO：09)、AVGGAVASV(SEQ ID NO：10)、TVRSHCVSK(SEQ ID NO：11)、IMREFNSYK(SEQ ID NO：12)、GPISHGHVLK(SEQ ID NO：13)、ATVQGQNLK(SEQ ID NO：14)、VYALPLKML(SEQ ID NO：15)、AYAQKIFKIL(SEQ ID NO：16)、QYDPVAALF(SEQ ID NO：17)、YVKVYLESF(SEQ ID NO：18)、DIYRIFAEL(SEQ ID NO：19)、VFETSGGLVV(SEQ ID NO：20)、KARDHLAVL(SEQ ID NO：21)、QARLTVSGL(SEQ ID NO：22)、KARAKKDEL(SEQ ID NO：23)、QIKVRVDMV(SEQ ID NO：24)、RRRHRQDAL(SEQ ID NO：25)、ARVYEIKCR(SEQ ID NO：26)、KMQVIGDQY(SEQ ID NO：27)、NVRRSWEEL(SEQ ID NO：28)、CPSQEPMSIYVY(SEQ ID NO：29)、KPGKISHIMLDVA(SEQ ID NO：30)、ELRRKMMYM(SEQ ID NO：31)、IPSINVHHY(SEQ ID NO：32)、FEQPTETPP(SEQ ID NO：33)、YAYIYTTYL(SEQ ID NO：34)、QEFFWDANDIY(SEQ ID NO：35)、YEQHKITSY(SEQ ID NO：36)、QEPMSIYVY(SEQ ID NO：37)、SEHPTFTSQY(SEQ ID NO：38)、QAIRETVEL(SEQ ID NO：39)、TRATKMQVI(SEQ ID NO：40)、DALPGPCI(SEQ ID NO：41)、CEDVPSGKL(SEQ ID NO：42)、HERNGFTVL(SEQ ID NO：43)、PTFTSQYRIQGKL(SEQ ID NO：44)、QMWQARLTV(SEQ ID NO：45)、HELLVLVKKAQL(SEQ ID NO：46)、DDYSNTHSTRYV(SEQ ID NO：47)、SLYNTVATL(SEQ ID NO：48)、GLCTLVAML(SEQ ID NO：49)、GILGFVFTL(SEQ ID NO：50)、STNRQSGRQ(SEQ ID NO：51)、LLFGYPVYV(SEQ ID NO：52)、FAEGFVRAL(SEQ ID NO：53)、LIVIGILIL(SEQ ID NO：54)、or ILHTPGCV(SEQ ID NO：55)、WYAQIQPHW(SEQ ID NO：56)、AFSGVSWTM(SEQ IDNO：57)、ILIGVVITW(SEQ ID NO：58)、MMIPTVVAF(SEQ ID NO：59)、PFPQSNAPI(SEQ ID NO：60)、LLLTLLATV(SEQ ID NO：61)、IVLEHGSCV(SEQ ID NO：62)、LLFKTENGV(SEQ ID NO：63)、PLNEAIMAV(SEQ ID NO：64)、NLVRLQSGV(SEQ ID NO：65)、LVISGLFPV(SEQ ID NO：66)、LLLVAHYAI(SEQ ID NO：67)、LALLAAFKV(SEQ ID NO：68)、VILAGPMPV(SEQ ID NO：69)、HVLGRLITV(SEQ ID NO：70)、VTEHDTLLY(SEQ ID NO：71)、NTDFRVLEL(SEQ ID NO：72)、CVETMCNEY(SEQ ID NO：73)或其包含1个至3个氨基酸交换、添加和/或缺失的变体。
在一个实施例中，病毒衍生肽是源自人巨细胞病毒(huCMV)的肽。在一些实施例中，该肽具有如SEQ ID NO：4的氨基酸序列NLVPMVATV。在一些实施例中，该肽具有如SEQ IDNO：74的氨基酸序列SSPPMFRV。
在一个实施例中，病毒衍生肽由5个至15个氨基酸组成。在一个实施例中，病毒衍生肽由7个至12个氨基酸组成。在一个实施例中，病毒衍生肽由7个至10个氨基酸组成。
在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的病毒衍生肽与包含在抗体-肽融合蛋白中的病毒衍生肽相同。在一个实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的病毒衍生肽和包含在抗体-肽融合蛋白中的病毒衍生肽由相同的氨基酸序列组成。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含选自HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*4402、HLA-C*0401、HLA-C*0501、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、HLA-B*1301、HLA-B*1521、HLA-B*5601、HLAB*5602、HLA-C*0102、HLA-C*0401、HLA-C*0403、HLA C*1502、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA C*0202、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0702、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA B*1504、HLA-C*0102、HLA-C*0304、HLA-C*0702和HLA C*0801组成的组的I类MHC分子。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含选自由HLA-A*0201、或HLA-A*1101、或HLA-A*2402、或HLA-A*340101、或HLA C*0304、或HLA-C*0401、或HLA-C*070组成的组的I类MHC分子。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含选自由HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*4402、HLA-C*0401、HLA-C*0501、HLA-C*0701和HLA-C*0702组成的组的I类MHC分子。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含选自由HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、HLA-B*1301、HLA-B*1521、HLA-B*5601、HLA B*5602、HLA-C*0102、HLA-C*0401、HLA-C*0403和HLA C*1502组成的组的I类MHC分子。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含选自由HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA C*0202、HLA-C*0304、HLA-C*0401和HLA-C*0702组成的组的I类MHC分子。
在一个实施例中，肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含选自由HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA B*1504、HLA-C*0102、HLA-C*0304、HLA-C*0702和HLA C*0801组成的组的I类MHC分子。
抗体-肽融合蛋白
以下段落包括进一步定义该肽-MHC-I-抗体融合蛋白的实施例。
抗XCR1抗体
在一个实施例中，抗体-肽融合蛋白包含特异性地结合至人XCR-1的抗体。
合适的单克隆抗XCRl抗体是例如WO 2009/065561中公开的mAb 6F8或选自WO2013/032032中公开的人源化抗人XCR1抗体HK1L2和HK5L5。
特异性地结合至XCR1的抗体可以通过将XCR1或其片段直接注射到动物体内或通过将XCR1或其片段施用至动物(优选地是非人动物)来获得。如此获得的抗体然后将结合至XCR1。对于单克隆抗体的制备，可以使用本领域已知的提供由连续细胞系(例如，杂交瘤细胞系)培养物产生的抗体的任何技术。合适的单克隆抗体的生产也在WO 2009/065561的实例7中详述，其通过引用并入本文。描述用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可适用于生产针对XCR1的单链抗体。此外，转基因小鼠或其他生物体诸如其他哺乳动物可用于表达针对XCR1的人源化抗体。
可通过筛选组合文库中具有一种或多种所需活性的抗体来分离特异性地结合至XCR1的抗体。用于筛选组合文库的方法综述于例如Lerner等人，Nature Reviews 16：498-508(2016)中。例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选此类文库以获得具有所需结合特征的抗体。此类方法综述于例如Frenzel等人，mAbs 8：1177-1194(2016)；Bazan等人，Human Vaccines and Immunotherapeutics 8：1817-1828(2012)和Zhao等人，Critical Reviews in Biotechnology 36：276-289(2016)中，以及Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人编辑，Human Press，Totowa，NJ，2001)中和Marks和Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo编辑，Human Press，Totowa，NJ，2003)中。
在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的所有组成成分通过聚合酶链式反应(PCR)单独克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以从所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如在Winter等人，Annual Review of Immunology 12：433-455(1994)中所描述的。噬菌体通常将抗体片段展示为单链Fv(scFv)片段或Fab片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆所有天然组成成分(例如，来自人的所有天然组成成分)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的抗体的单一来源，而无需任何免疫，如由Griffiths等人在EMBO Journal 12：725-734(1993)中所描述的。最后，还通过以下方式来合成天然文库：克隆来自干细胞的未重排的V基因区段；以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并完成体外重排，如由Hoogenboom和Winter在Journal of Molecular Biology 227：381-388(1992)中所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：美国专利号5,750,373；7,985,840；7,785,903和8,679,490以及美国专利公开号2005/0079574、2007/0117126、2007/0237764和2007/0292936。
本领域已知用于筛选具有一种或多种所需活性的抗体的组合文库的方法的其他实例包括核糖体和mRNA展示，以及对细菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞进行抗体展示和选择的方法。用于酵母表面展示的方法综述于例如Scholler等人，Methods inMolecular Biology 503：135-56(2012)和Cherf等人，Methods in Molecular biology1319：155-175(2015)以及Zhao等人，Methods in Molecular Biology 889：73-84(2012)中。用于核糖体展示的方法描述于例如He等人，Nucleic Acids Research 25：5132-5134(1997)和Hanes等人，PNAS 94：4937-4942(1997)中。
在本文中从人抗体文库分离出的抗体或抗体片段被认为是人抗体或人抗体片段。
根据本发明，特异性地结合至XCR1的抗体共价地偶联至病毒衍生肽。与病毒衍生肽相关的实施例在上文涉及肽-MHC-I-抗体融合蛋白的章节中提出。那些实施例也适用于偶联至抗XCR1抗体的病毒衍生肽。在一个实施例中，存在于肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的病毒衍生肽和存在于抗体-肽融合蛋白中的病毒衍生肽衍生自同一病毒。在一个实施例中，存在于肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的病毒衍生肽和存在于抗体-肽融合蛋白中的病毒衍生肽是相同的。在一个实施例中，抗体-肽融合体中存在的病毒衍生肽具有与结合至表达I类MHC的抗原呈递细胞的病毒衍生肽相同的氨基酸序列。
表达I类MHC的抗原呈递细胞
根据本发明的“表达I类MHC的抗原呈递细胞”可以是任何合适的表达I类MHC的抗原呈递细胞。在一个实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞是血细胞，在一个实施例中是外周血单核细胞(PBMC)，在一个实施例中是单核细胞或淋巴细胞。在一个实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞是患者的单核细胞或淋巴细胞。在一个实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞是分离自患者的单核细胞或淋巴细胞。
依据本发明的实施例，增强步骤包括向患者施用载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞。
多种方法可用于获得本发明实施例的步骤i)的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞。
在一个优选的实施例中，这可以在体外通过外部装载包含目标抗原的肽来进行，该肽诸如实例中的SIINFEKL(SEQ ID NO：86)，其作为蛋白质OVA中的包含表位的模型肽。通常，将细胞与肽在合适的流体诸如水溶液或培养基中孵育一定时间段，诸如10分钟至24小时或48小时，特别是20分钟至12小时。
由于在MHC-I的情境中呈递的肽通常具有8、9、10或11个氨基酸的长度，即该长度是在MHC-I的情境中与肽结合所必需的，用于外部装载的肽优选地具有该长度。
因此，在本发明的药物用途或方法的进一步优选实施例中，本发明实施例中步骤i)的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞是通过在体外将至少一种I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞与所述肽一起孵育而获得的。
在体外外部装载细胞的情况下，可以通过本领域已知的方法选择肽序列。可以通过本领域已知的方法在体外进行细胞外部装载，例如，通过提供肽的水溶液，将溶液加入细胞中(细胞优选地在缓冲溶液或培养基中)，将细胞与肽一起孵育以实现具有相应肽的MHC-I的高饱和度，以及任选地例如用水溶液洗涤细胞。
如下文更详细地描述的进行所述培养，以实现装载衍生自包含抗原的蛋白质的肽。如下所述，外部装载和内部装载方法都是可能的。例如，可以通过在存在外部添加的肽的情况下培养来进行外部装载。在内部装载程序的情况下，诸如通过使用融合至包含抗原的蛋白质的细胞穿透肽，可能优选地需要更多时间以允许细胞加工蛋白质并在MHC-I的情境下呈递所得肽。
由于MHC-I分子在人群中的异质性，在人体内进行MHC-I外部装载肽存在某些限制。因此，优选地在不同个体中使用衍生自相同抗原的不同肽(例如来自黑素瘤的TRP-1流感病毒核蛋白)进行增强。这个问题可以通过“内部”装载带有MHC-I的细胞来克服，该细胞使用的是包含许多抗原表位的完整蛋白质或长肽。为此，将未加工的含抗原的蛋白质或其包含抗原或表位的片段引入带有MHC-I的细胞中，然后将其酶促分解(“加工”)成多个不同的肽，该肽然后在MHC-I(和MHC-II)的情境下被呈递在表面上。
可以通过技术人员已知的多种物理或化学方法，诸如但不限于电穿孔、强制内吞作用、注射和细胞穿透肽，来实现未加工的含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段向细胞中的转运。
另一种在内部装载带有MHC-I的细胞的方法是用编码含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段的核酸诸如DNA或RNA装载它们。可以通过任何化学、物理或生物学手段将核酸引入细胞，该手段诸如但不限于，用经重组修饰以携带编码含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段的生物体进行电穿孔、注射、转染或感染。一旦编码的蛋白质被细胞机器表达，它就被加工并在MHC-I(和MHC-II)的情境下呈递在细胞表面上，并且细胞变成根据本发明的载肽细胞。技术人员知道合适的DNA和RNA构建体以及基于DNA或RNA的表达系统。例如，合适的RNA构建体或基于RNA的表达系统优选地进一步包含允许翻译并因此在目标细胞中表达蛋白质的元件。例如，合适的DNA构建体或基于DNA的表达系统优选地进一步包含允许转录和翻译并因此在目标细胞中表达蛋白质的元件。任选地，此类系统还包括合适的元件，其允许分别复制DNA或RNA构建体，或基于DNA或RNA的表达系统。
例如，能够在I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞中表达目标蛋白质(在这种情况下是包含抗原的蛋白质或其包含-抗原的片段)的病毒系统和非病毒表达系统适用于该目的。
因此，在用于本发明的用途或方法的药物的进一步优选实施例中，步骤i)的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞通过以下方式获得：
应用物理、化学或生物方法将含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段、或编码含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段的核酸引入至少一种I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞中，
在核酸的情况下，允许至少一种细胞将包含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段表达到至少一种I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞中，知
允许至少一种细胞加工抗原并在MHC-I的情境下呈递肽。
特别地，以下实施例对于获得此类细胞是优选的：
a.将至少一种I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞与含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段一起孵育，和允许至少一种细胞加工抗原并在MHC-I的情境下呈递肽，或者
b.将至少一种I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞暴露于病毒系统，该病毒系统能够(i)感染所述细胞和(ii)在细胞中表达包含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段，和允许至少一种细胞加工含抗原的蛋白质抗原或其包含抗原的片段，和
允许至少一种细胞在MHC-I的情境下呈递肽，
或者
c.用DNA或RNA或基于DNA或RNA的表达系统转染至少一种I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞，该表达系统包含编码含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段的核酸，和
允许至少一种细胞表达并加工含抗原的蛋白质抗原或其包含抗原的片段，和
允许至少一种细胞在MHC-I的情境下呈递肽，或者
d.将至少一种I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞与包含细胞穿透肽(CPP)和含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段的化合物一起孵育，和
允许至少一种细胞加工所述化合物，和
允许至少一种细胞在MHC-I的情境下呈递肽。
包含细胞穿透肽(CPP)和包含抗原的蛋白质或其含抗原的片段的化合物被理解为以下化合物：其中细胞穿透肽(CPP)与含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段化学连接，任选地通过合适的连接基化学连接。这种连接基可以是例如肽连接基，例如长度为1个至50个，优选地1个至20个，更优选地1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的肽连接基，然而，也可以使用其他连接基。在一个优选的实施例中，该化合物是包含细胞穿透肽(CPP)和包含抗原的蛋白质或其片段的融合蛋白，该融合蛋白可以任选地包含合适的肽连接基。在一个实施例中，该化合物是由细胞穿透肽(CPP)和包含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段组成的融合蛋白，其中所述细胞穿透肽(CPP)和包含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段通过肽键连接。在优选的实施例中，在该化合物中，细胞穿透肽(CPP)位于包含抗原的蛋白质或其包含抗原的片段的N端或C端。
优选的是，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞不是在体外培养较长时间(例如超过3周)的源自细胞系的细胞或从哺乳动物获得的细胞，因为细胞的体外培养时间较长会导致此类细胞的表型发生变化。因此，优选使用原代细胞，即获自哺乳动物并且未在体外培养或在体外培养最多3周、20天、14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天或3天的细胞。
因此，在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞是原代细胞。
代替使用原代细胞如本文所述的PBMC、T细胞、B细胞或单核细胞进行增强，还可以使用体外扩增至高细胞数的原代细胞进行增强。这些扩增的细胞要么在外部装载肽，要么在内部装载蛋白质；可替代地，它们将暴露于编码肽或蛋白质的载体，如本文详细描述的。例如，可以从少量PBMC样品开始，然后通过体外培养最多3周，诸如最多14天，从样品中扩增T细胞或B细胞。无论是否事先分离T细胞或B细胞，此过程都是可能的。使用GMP兼容的封闭系统并使用T细胞或B细胞活化系统，体外扩增过程在技术上是可行的。对于T细胞，T细胞受体复合物由合适的试剂触发，例如通过添加(a)生长因子，特别是生长因子的混合物，通常包括IL-2，来确保T细胞的扩增。对于B细胞，B细胞受体复合物由合适的试剂触发，然后加入合适的生长因子。在将T细胞或B细胞扩增至高细胞数(诸如1x109至10x1010)后，如本文详细描述的，细胞在短时间段(诸如最多2天)内在外部装载肽或在内部装载长肽或蛋白质、或长肽或蛋白质的表达系统，并且与作为危险信号的Th1佐剂一起用于增强程序。
在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞是选自单核细胞、T细胞和B细胞的细胞。
例如，单核细胞、T细胞、B细胞或其混合物可以装载肽。PBMC样品由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。外周血中含有0.5％至1％的微量DC，它们不被视为PBMC细胞。当PBMC样品用作用于增强作用的样品时，与PBMC样品中99％至99.5％的绝大多数MHC-I呈递细胞相比，少数污染DC在功能上无关紧要。因此，就增强功能而言，PBMC样品仅被视为T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞的混合物。
例如，单核细胞、T细胞、B细胞可以直接使用PBMC样品装载，或者细胞类型或其混合物可以在从合适的来源诸如PBMC样品纯化后装载。
因此，在一个优选的实施例中，细胞是PBMC细胞或不同PBMC细胞的混合物。
载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)细胞可以是同种异体细胞或自体细胞。在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞是自体细胞。
在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞不是肿瘤细胞或过度增殖细胞。优选地不使用此类细胞以避免患者体内任何不希望的过度增殖。
如上所述，优选不使用树突状细胞类的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞。因此，在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞不是树突状细胞(DC)。
在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞经全身性施用。
在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞经静脉内施用，诸如通过静脉内注射或输液施用。
在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞以介于1x108个至100x109个之间的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞的剂量施用。更优选的剂量范围是介于5x108至50x109、5x108至20x109、5x108至10x109、5x108至5x109、5x108至20x108之间、介于5x108至10x108之间、介于1x109至100x109、1x109至50x109、1x109至20x109、1x109至10x109、1x109至5x109、1x109至2x109之间和介于1x108至2x109个之间的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞的剂量。
如上所述，可以使用包含2种或更多种不同细胞类型的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞群。在优选的实施例中，此类群体是PBMC样品，其包含细胞类型T细胞、B细胞和单核细胞。
因此，在本发明的另一个优选实施例中，在步骤i)中施用载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞群。
在本发明的更优选的实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHCI)呈递细胞群是PBMC样品。
在本发明的另一个更优选的实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞群包含T细胞和/或B细胞。
本发明的实施例利用作为危险信号的Th1佐剂。在本发明的某一实施例使用超过一种的作为危险信号的Th1佐剂的情况下，这些作为危险信号的Th1佐剂彼此独立地选择并且可以相同或不同。
因此，在一个实施例中，从患者获得表达I类MHC(I类主要组织相容性复合物)的抗原呈递细胞并在体外培养2小时至3天之间，更优选地2小时至2天之间。
在一个实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞是原代PBMC，其任选地在体外培养最多3天。在一个实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞是选自单核细胞、T细胞和B细胞的细胞。在一个实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞是T细胞或B细胞。例如，单核细胞、T细胞、B细胞或其混合物可以装载肽。PBMC样品由T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞组成。外周血中仅有0.5％至1％的树突状细胞(DC)，它们不被视为PBMC细胞。当使用PBMC样品时，与PBMC样品中99％至99.5％的绝大多数MHC-I呈递细胞相比，少数污染DC在功能上无关紧要。因此，就增强功能而言，PBMC样品仅被视为T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞的混合物。在一个实施例中，如本文所用的“表达I类MHC的抗原呈递细胞”不是树突状细胞。例如，单核细胞、T细胞、B细胞可以直接使用PBMC样品装载，或者细胞类型或其混合物可以在从合适的来源诸如PBMC样品纯化后装载。因此，在一个优选的实施例中，细胞是PBMC细胞或不同PBMC细胞的混合物。表达I类MHC的抗原呈递细胞可以是同种异体细胞或自体细胞。在本发明的另一个优选实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞是自体细胞。如本文所用的“表达I类MHC的抗原呈递细胞”不是肿瘤细胞或病原性过度增殖细胞。
载肽PBMC(外周血单核细胞)是优选的细胞，它允许一种简单的增强方法。也可以应用其他自体细胞，例如体外扩增的B细胞或T细胞。这可以例如在封闭系统中以一种相当自动化的方式完成。出于颗粒原因和调节目的，不合适的细胞包括树突状细胞、体外生成的树突状细胞、从患者体内取出的肿瘤组织或肿瘤细胞系。
表达I类MHC的抗原呈递细胞可以全身性施用，诸如静脉内施用，例如通过静脉注射或输液施用。
在本发明的另一个优选实施例中，载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞以介于1x108个至100x109个之间的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞的剂量施用。更优选的剂量范围是介于5x108至50x109、5x108至20x109、5x108至10x109、5x108至5x109、5x108至20x108之间、介于5x108至10x108之间、介于1x109至100x109、1x109至50x109、1x109至20x109、1x109至10x109、1x109至5x109、1x109至2x109之间和介于1x108至2x109个之间的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞的剂量。
在通过治疗诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答的情况下，优选地在诱导性药物后5至9天内将增强性药物施用至患者。可以重复增强，例如数次，中间间隔数周以提高增强效率。
融合蛋白的表达
根据本发明使用的融合蛋白可以通过本领域已知的重组方法产生。可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所述。肽-MHC-I-抗体融合蛋白可以使用如WO 2012/175508、WO 2014/083004和WO 2014/096015中描述的重组方法产生。
药物制剂
如本文所述的根据本发明使用的融合蛋白的药物制剂通过将具有所需纯度的此类融合蛋白与一种或多种任选的药用载体混合来制备(Remington′s PharmaceuticalSciences 16th edition，Osol，A.Ed.(1980))，为冻干制剂或水溶液的形式。可接受的运载体在所采用的剂量和浓度下对受者无毒；并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药用载体进一步包括间质药物分散剂，诸如可溶中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0003182486960000591
Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利号2005/0260186和2006/0104968中。在一个方面中，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶(诸如软骨素酶)组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958中。水性抗体制剂包括在美国专利号6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一者中的制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合而制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中；在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白、微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中；或在粗乳液中。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980)中。
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，无菌可以通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
治疗方法和组合物
本文提供的任何肽-MHC-I抗体融合蛋白可用于治疗性方法中和/或用作治疗性药物，即为了治疗疾病而使用。
本文提供的融合蛋白(和任何进一步的药物或药剂)可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，并且如果需要的话用于局部治疗、病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。投配可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种投配时间安排，包括但不限于在各个时间点处的单次或多次施用、推注施用，以及脉冲输注。
本文提供的融合蛋白将以符合良好医学实践的方式配制、投配和施用。在这种情况下需要考虑的因素包括所治疗的特定疾患、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、疾患的原因、药剂的递送部位、施用方法、施用的时间安排，以及执业医师已知的其他因素。融合蛋白不是必须地而是任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论的疾患的药剂共同配制。此类其他药剂的有效量取决于所用制剂中存在的融合蛋白的量、疾患或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以任何剂量且通过经验/临床上确定为合适的任何途径使用。
对于预防或治疗疾病，本发明的融合蛋白的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他额外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病类型、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和病程、是否以预防或治疗目的施用融合蛋白、既往疗法、患者的临床病史和对融合蛋白的应答以及主治医师的判断。融合蛋白适当地一次性或在一系列治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的融合蛋白可以是例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注而施用至患者的初始候选剂量。取决于上述因素，一种典型的日剂量的范围可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直至发生所需的疾病症状抑制。融合蛋白的一个示例性剂量的范围为约0.05mg/kg至约10mg/kg。因此，可以向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或它们的任何组合)的一种或多种剂量。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周施用(例如，使得患者接受约2至约20或例如约6个剂量的融合蛋白)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一种或多种较低剂量。
本发明的组合物可以是多组分试剂盒，其涉及独立但功能上相互作用的单独组分的并置。多组分试剂盒可以由至少两种如本文所述的以下药物组成：治疗性药物、增强性药物和诱导性药物。提供这些组分形成了功能统一体，如上所述。
肽-MHC-I-抗体融合蛋白或多组分试剂盒可用于单一治疗性施用，即每种药物仅一次。然而，疗法也可以循环施用，每个周期包括增强性药物和治疗性药物的施用。周期之间可能有休息时间，以便患者休养。典型的持续时间为一个月、6周、两个月或三个月。通常，在周期内或周期之间监测待治疗的疾病。
诱导和增强细胞毒性免疫应答
在一个实施例中，针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答在患者中通过增强性药物得到增强。增强性药物可以包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
细胞的施用可以通过技术人员已知的方法进行，特别是使用各种施用途径。在优选的实施例中，细胞为活细胞。通常，将细胞制备为细胞在水溶液中的悬浮液，诸如生理上可接受的水溶液，其优选被缓冲。例如，此类溶液是生理上可接受的具有生理盐水浓度的缓冲溶液。表达载肽I类MHC的抗原呈递细胞被全身性施用。在一个实施例中，表达载肽I类MHC的抗原呈递细胞通过静脉内、腹膜内或通过鞘内注射或可替代地皮下施用，或通过在患者患有肿瘤的情况下施用至肿瘤中。在一个实施例中，表达载肽I类MHC的抗原呈递细胞被静脉内施用。
待施用的细胞量可根据各种因素诸如抗原和患者而变化。例如，要施用的细胞的上限量可能受到最初可从患者获得的用于产生表达I类MHC的抗原呈递细胞的细胞量的限制。通常，可以将介于1x106至100x109个之间的细胞施用于人类。例如，剂量介于1x108和100x109之间的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞。更优选的剂量范围是介于5x108至50x109、5x108至20x109、5x108至10x109、5x108至5x109、5x108至20x108之间、介于5x108至10x108之间、介于1x109至100x109、1x109至50x109、1x109至20x109、1x109至10x109、1x109至5x109、1x109至2x109之间和介于1x108至2x109个之间的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞的剂量可施用至人类患者。然而，如上所述，优选施用更高量的表达I类MHC的抗原呈递细胞。
在一个实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞被全身性地施用，特别是静脉内、腹膜内或通过鞘内注射施用，并且向所述患者施用介于1x106至100x109个之间的表达I类MHC的抗原呈递细胞。因此，在用于本发明的用途或方法的药物的又进一步的优选实施例中，将介于1x107至4x108个之间的表达I类MHC的抗原呈递细胞施用至所述患者，更优选地，剂量为介于5x108至50x109、5x108至20x109、5x108至10x109、5x108至5x109、5x108至20x108之间、介于5x108至10x108之间、介于1x109至100x109、1x109至50x109、1x109至20x109、1x109至10x109、1x109至5x109、1x109至2x109之间和介于1x108至2x109之间的载肽I类主要组织相容性复合物(MHC-I)呈递细胞。如上文和实例中所述，在3天至14天，优选地4天至10天的时间范围内施用表达I类MHC的抗原呈递细胞，导致细胞毒性应答的增强和/或延长。优选地，细胞在时间范围内仅施用一次。
在一个实施例中，在施用诱导性药物(例如，抗体-肽融合蛋白或XCL1-肽融合蛋白)之后，在3天至14天，优选地4天至10天的时间范围内施用表达I类MHC的抗原呈递细胞。在一个实施例中，在施用诱导性药物(例如，抗体-肽融合蛋白或XCL1-肽融合蛋白)之后，在5天至9天的时间范围内施用表达I类MHC的抗原呈递细胞。
佐剂是支持Th1介导的免疫应答的佐剂。在一个实施例中，支持Th1介导的免疫应答的佐剂是poly I：C(聚肌胞苷酸)。
在一个实施例中，在患者体内具有延长的半衰期的白细胞介素-2(IL-2)或IL-2变体已经在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用或在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用。在一个实施例中，IL-2的施用在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后进行。在一个实施例中，IL-2(在一个实施例中为Il-2cx)在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞后0小时至10天，优选地0小时至5天的时间范围内施用，优选地在施用I类MHC表达抗原呈递细胞后24小时内施用。在一个实施例中，IL-2组分必须连续施用(例如，每8小时施用或真正连续施用)。IL-2应用的最长持续时间估计约为1周(可能最多2周)。
在本发明的一个优选实施例中，施用了与hIL-2相比在患者体内具有延长的循环半衰期的hIL-2变体，其中该hIL-2变体能够结合高亲和力IL-2受体链(CD25)。令人惊讶地发现，当向患者施用与hIL-2相比在患者体内具有延长的循环半衰期的hIL-2变体时，实现了细胞毒性免疫应答的强烈增强，其中该hIL-2变体能够结合高亲和力IL-2受体链(CD25)，其中步骤ii)的hIL-2变体的施用在施用载肽I类主要组织相容性复合物(MHC I)呈递细胞后5天内开始，并且其中步骤ii)的hIL-2变体至少每天施用一次或连续地施用，并且在随后的至少2天内施用。
在本发明的一个优选实施例中，hIL-2变体在人体内具有至少2小时的循环半衰期并且/或者包含至少一个hIL-2部分。
因此，hIL-2变体可包含1、2、3、4、5或更多个hIL-2部分。
“与hIL-2相比，在人体内具有延长的循环半衰期的hIL-2变体”在本申请中也称为“具有延长的半衰期的IL-2”或“IL-2ext”。细胞因子是已知由于肾脏中的肾小球滤过而具有短半衰期的分子。据报道，hIL-2在人体内的半衰期为几分钟。先前已经确定，细胞因子的半衰期可以通过将其连接到充当“支架”的更大的、功能惰性的分子而在体内显著延长。该支架增加了所附接的细胞因子的流体力学体积，从而防止其从体内快速排泄。各种此类支架是本领域技术人员已知的。“与hIL-2相比，在人体内具有延长的循环半衰期的hIL-2变体”或“IL-2ext”因此被理解为包含非共价地或共价地(优选共价地)结合至支架的人IL-2(hIL-2)的分子，并且在人类患者体内显示至少2小时的半衰期。本发明的“IL-2ext”能够结合至高亲和力IL-2受体链CD25。在一个优选的实施例中，“IL-2ext”结合至高亲和力(CD25)IL-2受体和低亲和力(CD122)IL-2受体两者。在一个优选的实施例中，人IL-2(hIL-2)以重组方式或化学方式共价地结合至支架。
适用于本发明的常用支架是本领域已知的，并且包括免疫球蛋白，包括完整抗体、抗体的Fc区和其他抗体形式，诸如没有Fc区的抗体(双体抗体)、单链Fv(scFV)融合体、Fab-scFv融合体和其他增加细胞因子的半衰期的抗体衍生形式。此类抗体仅用于增加体内半衰期。因此，抗体部分优选地不特异性地识别患者身体的表位。因此，在优选的实施例中，用作支架的此类抗体不特异性地识别患者的表位。因此，在一个实施例中，“抗体”理解为包含至少一个Ig样结构域，优选地包含至少一个抗原结合结构域的蛋白质。在一个优选的实施例中，至少一个抗原结合结构域包含VH和/或VL结构域。在使用抗体的情况下，该抗体优选地不能够特异性地结合至或识别人抗原。此类抗体是本领域已知的并且用于实例中。
其他优选的支架是功能惰性的大的人蛋白质，例如人血清白蛋白。IL-2可以结合至的进一步优选的支架是聚合物诸如PEG或聚合物模拟物诸如亲水性和柔性多肽链，如在XTEN或PASylation技术中使用的。增加IL-2半衰期的进一步优选的支架是碳水化合物，诸如葡聚糖、聚唾液酸、透明质酸、糊精或羟乙基淀粉。
因此，与IL-2相比，本发明中使用的IL-2变体优选地表现出增加的分子量。
因此，在本发明的另一个优选实施例中，IL-2变体具有至少30kDa的分子量，并且/或者其中IL-2变体中的IL-2部分共价地连接至具有至少为15kDa的分子量的化学部分。
优选地，IL-2变体具有至少40kDa、50kDa、80kDa、100kDa或200KDa的分子量。例如，分子量可以最高约3000kDa、2000kDa或1000kDa。
优选地，IL-2变体中的IL-2部分共价地连接至具有至少25kDa、35kDa、65kDa、85kDa或185kDa的分子量的化学部分。例如，化学部分的分子量可以最高约3000kDa、2000kDa或1000kDa。
在本发明的另一个优选实施例中，IL-2变体选自聚乙二醇化的Il-2、连接至透明质酸的IL-2和与至少一种肽或蛋白质融合的Il-2，优选地，其中与至少一种肽或蛋白质融合的IL-2是与Fc融合的IL-2、与XTEN融合的IL-2、与免疫球蛋白(优选不能够特异性地结合至人抗原的抗体)融合的IL-2、与转铁蛋白融合的IL-2、与白蛋白(优选人血清白蛋白)融合的IL-2、与PEG融合的IL-2、与高氨基酸聚合物(HAP)融合的IL-2、与脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS)聚合物融合的IL-2、与碳水化合物(更优选地选自葡聚糖、聚唾液酸、透明质酸、糊精和羟乙基淀粉(HES))融合的IL-2或与弹性蛋白样肽(ELP)融合的IL-2。因此，在一个优选的实施例中，“支架”选自PEG部分(诸如PEG50、PEG1000或PEG2000)、XTEN、透明质酸、至少一种肽或蛋白质、不能够特异性地结合至人抗原的免疫球蛋白、Fc、转铁蛋白、白蛋白、重组PEG、高氨基酸聚合物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸(PAS)聚合物、碳水化合物(更优选地选自葡聚糖、聚唾液酸、透明质酸、糊精和羟乙基淀粉(HES))和弹性蛋白样肽(ELP)。
在与作为蛋白质的支架共价连接的情况下，IL-2可以通过支架的氨基酸侧链连接至N端、C端或内部。在与作为抗体的支架共价连接的情况下，IL-2可以通过重链和/或轻链的氨基酸侧链连接至轻链或其片段的C端、重链或其片段的C端、轻链或其片段的N-端、重链或其片段的N端、或内部。在与作为Fc分子的支架共价连接的情况下，IL-2可以通过Fc蛋白质的氨基酸侧链连接至N端、C端或内部。例如，可以使用包含分别与轻链或重链融合的两个IL-2部分的抗体。
Fc分子可以是具有天然Fc序列的Fc分子或基因工程化改造的Fc分子。
本发明中使用的IL-2变体的IL-2部分可以重组地或合成地制备。野生型人IL-2的核苷酸序列和氨基酸序列是技术人员已知的，并且分别公开在例如2018年6月3日更新的Genbank Entrez Reference 3558和2018年5月23日最后修订的UniProt ReferenceUniProtKB-P60568中。本发明使用的hIL-2变体的人IL-2部分优选成熟IL-2，其缺乏信号肽。本发明使用的hIL-2变体的人IL-2部分可以经糖基化或未糖基化。可用于本发明的hIL-2变体的人IL-2部分是可商购的，包括用于药物用途，并且它被授权作为阿地白介素(aldesleukin)用于人类患者。阿地白介素是一种重组未糖基化的去丙氨酰基-1、丝氨酸-125人白细胞介素-2，在大肠杆菌中重组地产生。
Figure BDA0003182486960000661
是一种重组人IL-2，在酵母中产生。
在优选的实施例中，用于本发明的hIL-2变体的人IL-2部分是阿地白介素、
Figure BDA0003182486960000662
或野生型IL-2。阿地白介素是
Figure BDA0003182486960000663
的活性成分。阿地白介素是成熟的人IL-2的未糖基化变体，与成熟的人IL-2相比，阿地白介素包含两个氨基酸修饰：第一个氨基酸(丙氨酸)的缺失以及位置125处的半胱氨酸被丝氨酸取代。
成熟的hIL-2蛋白的分子量约为15kDa。
一般而言，只要IL-2变体的副作用是患者耐受的或可接受的，则优选在随后的几天内继续每天至少施用一次或连续施用。在IL-2变体的副作用是患者耐受的或可接受的情况下，则可以至少每天施用一次或连续施用IL-2变体，最多10、15、20或21天或甚至更久。
因此，在本发明的另一个优选实施例中，IL-2变体在随后的至少3或4天内施用，和/或在随后的2至21天之间施用。优选地，IL-2变体在随后的至少3、4、5、6、7、8、9或10天内施用。在另一个优选的实施例中，IL-2变体在随后施用3至21天、4至21天、5至21天、3至15天、4至15天、5至15天、30至10天、4至10天或5至10天之间的天数，诸如随后施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天。
本发明实施例的IL-2变体的施用在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞后5天内开始。优选地，IL-2变体的施用在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞的当天或在所述日期之后1天、2天、3天或4天内开始。
IL-2变体可以通过多种途径施用。在本发明的一个优选实施例中，IL-2变体被全身性、局部、静脉内、皮下、腹膜内、瘤内、瘤周或皮内施用，更优选通过局部、静脉内、皮下、腹膜内、瘤内、瘤周或皮内注射施用。
在本发明的另一个优选实施例中，IL-2变体以每天10至400μgIL-2/kg BW的剂量施用。例如，IL-2变体以每天10、20、30、40或50至100、200、300、400或800μg IL-2变体/kgBW的剂量施用。
此外，根据施用途径，IL-2变体可以以技术人员已知的制剂提供。例如，当打算用于注射诸如静脉内或腹膜内注射时，可提供溶液或干燥、干燥的或冻干的IL-2变体。干燥、干燥的或冻干的IL-2变体可以在使用前重构。溶液优选为水溶液，诸如水性缓冲盐水溶液。包含IL-2变体的制剂优选包含一种或多种药用赋形剂诸如水、缓冲剂诸如磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠、和/或甘露醇。药用赋形剂是技术人员已知的。
在一个实施例中，IL-2或其变体(尤其是具有延长的半衰期的变体，诸如Il-2cx)在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后重复施用，在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后0小时至14天的时间范围内重复使用。
在一个实施例中，IL-2(在一个实施例中为Il-2cx)在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞后0小时至9天，在一个实施例中为0小时至5天的时间范围内施用。优选地，IL-2变体的施用在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞的当天或在所述日期之后1天、2天、3天或4天内开始。
在又一方面，本发明提供了一种用于治疗选自癌症和病毒感染的疾病的方法。
本发明的用于治疗疾病的方法包括以下步骤
增强针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，之后
施用有效量的肽-MHC-I-抗体融合蛋白给有需要的患者，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
在一个实施例中，通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染来诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化；并且/或者增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
在一个实施例中，诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答的方法的使针对病毒衍生肽的T细胞活化的步骤包括施用有效量的抗体-肽融合蛋白，所述抗体-肽融合蛋白包含：
(a)抗体或其变体或片段，所述抗体或其变体或片段特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至该抗体或其变体或片段。
在一个实施例中，诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答的方法的使针对病毒衍生肽的T细胞活化的步骤包括施用有效量的抗体-肽融合蛋白，所述抗体-肽融合蛋白包含：
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，其特异性地结合至XCR1；以及
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段。
在本发明的一个实施例中，诱导性药物与Th1佐剂联合施用，所述佐剂是危险信号。
在本发明的另一个实施例中，在患者体内具有延长的半衰期的白细胞介素-2(IL-2)或IL-2变体在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用。
在本发明的又另一实施例中，Th1佐剂是聚肌胞苷酸(poly I：C)。
然而，在本发明的另一个实施例中，表达I类MHC的抗原呈递细胞和佐剂在使患者的针对该病毒衍生肽的T细胞活化之后3天至14天施用，优选地之后4天至10天施用。
在本发明的另一个实施例中，只要病毒衍生肽特异性CD8+ T细胞水平由于施用增强性药物而升高，就施用治疗性药物，优选地，其中治疗性药物在从施用增强性药物起29天内，特别是20天内，尤其是14天内施用。更优选地，治疗性药物在增强后短时间内施用，诸如在施用增强性药物后3天内、2天内或1天内施用或在其后立即施用。
在本发明的又另一实施例中，包含在肽-MHC-I-抗体融合蛋白中的抗体特异性地结合至选自由癌细胞和病毒感染细胞组成的组的靶细胞。
在本发明的又另一实施例中，该肽-MHC-I-抗体融合蛋白或多组分试剂盒用于治疗癌症或病毒感染。
在一个实施例中，该疾病是癌症。在一个实施例中，该癌症是非实体肿瘤。
在本发明的一个实施例中，其中所治疗的疾病是癌症，该癌症选自由以下组成的组：肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastriccancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆管癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊椎轴肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜瘤、成髓细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤、淋巴瘤和淋巴细胞白血病。在一个实施例中，该癌症选自淋巴瘤、淋巴细胞白血病、骨癌和霍奇金病。
在一个实施例中，该疾病是病毒感染。在一个实施例中，该疾病是慢性病毒感染。在一个实施例中，病毒感染选自HBV、HCV和HPV感染。
上文关于本发明的医学用途所列出的进一步实施例也适用于治疗方法。
(c)本发明的具体实施例
下面列出本发明的具体实施例。
1.一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，
其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白作为治疗性药物使用，
其中所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经在所述患者体内诱导了针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中所诱导的针对所述病毒衍生肽的免疫应答已在所述患者体内通过增强性药物得到增强。
2.根据实施例1所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答是通过疫苗接种诱导的，包括以下步骤
其中已经通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染而在患者体内诱导了针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化。
3.根据实施例1或2所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
4.根据实施例3所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中该诱导性药物包含：
(a)抗体或其变体或片段，所述抗体或其变体或片段特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至所述抗体。
5.根据实施例3所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中该诱导性药物包含：
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，所述淋巴细胞趋化因子或其变体或片段特异性地结合至XCR1；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段。
6.一种多组分试剂盒，其包含增强性药物和治疗性药物，所述增强性药物包含：
(a)表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及
(b)Th1佐剂，该佐剂是危险信号佐剂；
其中所述增强性药物增强患者体内的针对病毒衍生肽的免疫应答，并且
该治疗性药物包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含所述病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
7.根据实施例6所述的多组分试剂盒，其进一步包含诱导性药物，所述诱导性药物诱导患者体内的针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答。
8.根据实施例6或7所述的多组分试剂盒，其用作药物，其中治疗性药物待施用至针对病毒衍生肽的免疫应答增强的患者，其中增强性药物增强患者体内的针对病毒衍生肽的免疫应答，并且其中诱导性药物通过疫苗接种诱导患者体内的针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，特别地，其中诱导性药物如实施例4或5中定义。
9.一种多组分试剂盒，所述多组分试剂盒包含诱导性药物和增强性药物，
诱导性药物如实施例4或5中定义，并且
增强性药物如实施例6中定义
用于使患者对于使用根据实施例1至5中任一项所述的肽-MHC-I-抗体融合蛋白进行的治疗敏感的方法中。
10.根据实施例2至5中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，或根据实施例8或9所述使用的多组分试剂盒，其中诱导性药物已经与Th1佐剂联合施用或与Th1佐剂联合施用，Th1佐剂是危险信号。
11.根据实施例3至5或实施例10中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据实施例8至10中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中在患者体内具有延长的半衰期的白细胞介素-2(IL-2)或IL-2变体已经在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用或在施用表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用。
12.根据实施例3至5或实施例10至11中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据实施例8或实施例10至11中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中Th1佐剂是聚肌胞苷酸(poly I：C)。
13.根据实施例3至5或实施例10至12中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据实施例8或实施例10至12中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中表达I类MHC的抗原呈递细胞和佐剂已经在针对病毒衍生肽诱导患者的T细胞之后3天至14天施用或在针对病毒衍生肽诱导患者的T细胞之后3天至14天施用，优选地之后4天至10天施用。
14.根据实施例1至5或实施例10至13中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据实施例8或实施例10至13中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中治疗性药物在病毒衍生肽特异性CD8+ T细胞水平由于施用增强性药物而升高时施用，优选地，其中治疗性药物在从施用增强性药物起29天内，特别是20天内，尤其是14天内施用，更优选地，其中治疗性药物在增强之后短时间内施用，诸如在施用增强性药物之后3天内、2天内或1天内施用或在其后立即施用。
15.根据实施例1至5或实施例10至14中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据实施例8或实施例10至14中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白中包含的抗体特异性地结合至选自由癌细胞和病毒感染细胞组成的组的靶细胞。
16.根据实施例1至5或实施例10至15中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据实施例8或实施例10至15中任一项所述使用的多组分试剂盒，用于治疗癌症或病毒感染。
17.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(ii)的多肽在其C端融合至(i)的抗体的一条重链的N端。
18.根据前述实施例中之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其包含在N端至C端方向包含病毒衍生肽、第一肽连接基、β2-微球蛋白、第二肽连接基以及I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3的多肽。
19.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(ii)的多肽在其C端通过第三肽连接基融合至(i)的抗体的一条重链的N端。
20.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中在第一肽连接基的半胱氨酸残基与I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。
21.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白包括恰好一个多肽，该多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
22.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白包括一个或两个多肽，该多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
23.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白包括两个多肽，该多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
24.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含来自巨细胞病毒(huCMV)的肽。
25.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中病毒衍生肽由5个至15个氨基酸组成。
26.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体是全长抗体。
27.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体属于IgG类或IgE类。
28.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
29.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体属于人IgG1同种型或人IgG2同种型。
30.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体是具有突变L234A和L235A(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1同种型或人IgG2同种型。
31.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体是具有突变D265A和N297A(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1同种型或人IgG2同种型。
32.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体是具有突变P329G(根据Kabat EU索引编号)的人IgG1或人IgG2同种型。
33.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体是具有突变L234A、L235A和P329G的人IgG1或人IgG2同种型。
34.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒(即当肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含恰好一个MHC多肽时)，其中(i)的抗体在CH3结构域中包含支持抗体重链异二聚化的氨基酸突变。
35.根据实施例34所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中(i)的抗体在每个CH3结构域中包含最多五个支持抗体重链异二聚化的突变。
36.根据实施例34或35所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中在(i)的抗体的三级结构的一个实施例中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域形成位于各自抗体CH3结构域之间的界面，其中第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域各自的氨基酸序列各自包含位于抗体三级结构中的所述界面内的一组氨基酸，
(a)其中在位于一条重链的CH3结构域界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被侧链体积大于原始氨基酸残基的氨基酸残基取代，从而在界面内生成突起，其中该突起位于一条重链的CH3结构域中，并且其中该突起可定位在位于界面内另一条重链的CH3结构域中的空腔中；并且
(b)其中在位于另一条重链的CH3结构域界面中的一组氨基酸中，至少一个氨基酸残基被侧链体积小于原始氨基酸残基的氨基酸残基取代，从而在界面内生成空腔，其中该空腔位于一条重链的CH3结构域中，并且其中位于一条重链的CH3结构域中的界面内突起可定位在该空腔中。
37.根据实施例36所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中所述具有比原始氨基酸残基更大侧链体积的氨基酸残基选自R、F、Y和W；并且其中所述具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的氨基酸残基选自A、S、T和V。
38.根据实施例34至37之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中在一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被W取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被S取代，位置368处的氨基酸L被A取代，并且位置407处的氨基酸Y被V取代(根据Kabat EU索引编号)。
39.根据实施例34至38之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中在一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被W取代，位置409处的氨基酸R被D取代，并且位置370处的氨基酸K被E取代；而在另一条重链的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T被S取代，位置368处的氨基酸L被A取代，位置407处的氨基酸Y被V取代，位置399处的氨基酸D被K取代，并且位置357位处的氨基酸E被K取代(根据Kabat EU索引编号)。
40.根据实施例34至39之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中在位于一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第一氨基酸被半胱氨酸取代；并且在位于另一条重链的CH3结构域的界面上的一组氨基酸中，第二氨基酸被半胱氨酸取代，其中该第二氨基酸面向该界面内的第一氨基酸；因此，可以通过引入半胱氨酸残基而在一条重链的CH3结构域与另一条重链的CH3结构域之间形成二硫桥。
41.根据实施例34至40之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中在一条重链的CH3结构域中，位置356处的氨基酸E或位置354处的氨基酸S被C取代，而在另一条重链的CH3结构域中，位置349处的氨基酸Y被C取代(根据Kabat EU索引编号)。
42.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含选自HLA-A*0101、HLA-A*0201、HLA-A*0301、HLA-B*0702、HLA-B*0801、HLA-B*4402、HLA-C*0401、HLA-C*0501、HLA-C*0701、HLA-C*0702、HLA-A*0201、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA-A*340101、HLA-B*1301、HLA-B*1521、HLA-R*5601、HLAB*5602、HLA-C*0102、HLA-C*0401、HLA-C*0403、HLA C*1502、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA C*0202、HLA-C*0304、HLA-C*0401、HLA-C*0702、HLA-A*1101、HLA-A*2402、HLA B*1504、HLA-C*0102、HLA-C*0304、HLA-C*0702和HLA C*0801组成的组的I类MHC分子。
43.根据实施例18至42之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中肽连接基是甘氨酸-丝氨酸连接基。
44.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中抗体-肽融合蛋白包含特异性地结合至人XCR-1的抗体。
45.根据前述实施例之一所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白/多组分试剂盒，其中疾病是癌症或病毒感染。
46.一种用于治疗癌症的方法，其中该方法包括以下步骤
增强针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，之后
施用有效量的肽-MHC-I-抗体融合蛋白给有需要的患者，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
47.根据实施例46所述的用于治疗癌症的方法，
其中，通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染来诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化；并且/或者其中增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
48.根据实施例47所述的用于治疗癌症的方法，
其中该诱导性药物包含：
(a)抗体或其变体或片段，所述抗体或其变体或片段特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至所述抗体。
49.根据实施例47所述的用于治疗癌症的方法，
其中该诱导性药物包含：
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，所述淋巴细胞趋化因子或其变体或片段特异性地结合至XCR1；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段。
50.一种用于治疗病毒感染的方法，
增强针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，之后
施用有效量的肽-MHC-I-抗体融合蛋白给有需要的患者，其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(iii)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(iv)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
51.根据实施例50所述的用于治疗病毒感染的方法，
其中，通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染来诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化；并且/或者其中增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
52.根据实施例50所述的用于治疗病毒感染的方法，其中诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答的方法的使针对病毒衍生肽的T细胞活化的步骤包括施用有效量的抗体-肽融合蛋白，所述抗体-肽融合蛋白包含：
其中该诱导性药物包含：
(a)抗体或其变体或片段，所述抗体或其变体或片段特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至所述抗体。
53.根据实施例50所述的用于治疗病毒感染的方法，
其中该诱导性药物包含：
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，所述淋巴细胞趋化因子或其变体或片段特异性地结合至XCR1；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段。
54.肽-MHC-I-抗体融合蛋白的用途，
其中该肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，其在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
该肽-MHC-I-抗体融合蛋白用于制造用于治疗癌症或病毒感染的药物，
其中所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经在所述患者体内诱导了针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中所诱导的针对所述病毒衍生肽的免疫应答已在所述患者体内通过增强性药物得到增强。
55.根据实施例54所述的用途，
其中，通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染
来诱导针对病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，从而使针对病毒衍生肽的T细胞活化；并且/或者增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及Th1佐剂，该佐剂是危险信号。
56.根据实施例55所述的用途，
其中该诱导性药物包含：
(a)抗体或其变体或片段，所述抗体或其变体或片段特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至所述抗体。
57.根据实施例55所述的用途，
其中该诱导性药物包含：
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，所述淋巴细胞趋化因子或其变体或片段特异性地结合至XCR1；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段。
58.抗体-肽融合蛋白的用途，所述抗体-肽融合蛋白包含：
(i)抗体，其特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(ii)病毒衍生肽，其中该肽共价地偶联至所述抗体；
该肽-MHC-I-抗体融合蛋白用于制造用于治疗癌症或病毒感染的药物，其中抗体-肽融合蛋白与增强性药物联合施用，所述增强性药物包含：
(a)表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中MHC-I结合至病毒衍生肽；以及
(b)Th1佐剂，所述Th1佐剂是危险信号佐剂；
其中增强性药物增强患者体内的针对病毒衍生肽的免疫应答。
氨基酸序列的描述
Figure BDA0003182486960000791
Figure BDA0003182486960000801
Figure BDA0003182486960000811
Figure BDA0003182486960000821
Figure BDA0003182486960000831
Figure BDA0003182486960000841
Figure BDA0003182486960000851
Figure BDA0003182486960000861
Figure BDA0003182486960000871
Figure BDA0003182486960000881
Figure BDA0003182486960000891
Figure BDA0003182486960000901
Figure BDA0003182486960000911
实例
提供以下实例以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明范畴的前提下，可以对阐明的程序进行修改。
材料和一般方法
细胞系
稳定地转染小鼠黑素瘤细胞系B16-F10(ATCC)和小鼠结直肠癌细胞系MC38(Cityof Hope National Medical Center)以表达小鼠成纤维细胞活化蛋白(FAP)。令B16-F10细胞在补充有10％胎牛血清的RPMI中生长，用嘌呤霉素选择；令MC38细胞在补充有10％胎牛血清、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸的DMEM中生长。
实例1：
提供特异性地结合至成纤维细胞活化蛋白(FAP)的肽-MHC-I-抗体融合蛋白
为了生成示例性肽-MHC-I-抗体融合蛋白单克隆抗体28H1，它是一种非内化抗成纤维细胞活化蛋白(FAP)抗体，对小鼠和人FAP两者具有高皮摩尔亲和力，用于提供进行靶向的结合位点。28H1的鼠源化版本用于靶向表达鼠FAP的工程化改造的肿瘤细胞系。28H1抗体的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列在SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81中描述。
生成了两种不同的肽-MHC-I-抗体融合蛋白：
(a)一种包含抗原肽mCMV衍生肽m38的融合蛋白(序列：SSPPMFRV，SEQ ID NO：74，该融合蛋白在本文中称为“m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG”)；和
(b)一种包含对照九聚肽IE3的融合蛋白(序列：RALEYKNL，SEQ ID NO：75，该对照融合蛋白在本文中称为“IE3-pMHC-I-抗-FAP-IgG”)。
简而言之，肽-MHC-I-抗体融合蛋白在N端至C端方向包含相应的肽、第一连接基(序列：GCGGS(G4S)2，SEQ ID NO：82)、鼠β-2-微球蛋白、第二连接基(序列：(G4S)4，SEQ IDNO：83)、携带Y84C突变的H-2Kb小鼠I类MHC复合物的α1-3结构域)、第三连接基(序列：GS)，然后是抗体重链可变结构域和无效应子的突变IgG2c恒定结构域(分子示意图见图1)。包含肽和I类MHC结构域的多肽通过第一连接基(连接基的位置2)与MHC重链(I类MHC重链的位置Y84C)之间的人工二硫桥进行稳定化。抗体轻链的同种型是小鼠κ。抗体重链的恒定结构域被突变以去除所有Fcγ介导的效应子功能(LALA突变：L234A、L235A和DAPG突变：D270A，P329G)。肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含一个包含肽和I类MHC结构域的多肽，导致该分子包含两条不同的重链。为了促进两条重链的异二聚化，在CH3结构域中引入了杵臼结构突变。融合至包含肽和I类MHC结构域的多肽的重链带有“臼”突变：T366S、M368A、Y407V；未融合的重链带有“杵”突变：T366W。为了稳定两条重链的异二聚化，在两条抗体重链之间引入了额外的二硫桥：Y349C表示“臼”，P354C表示“杵”抗体重链。
两种融合蛋白各自的三个多肽链的氨基酸序列如下表所示：
Figure BDA0003182486960000931
如前所述进行蛋白质生产(Bacac M，Klein C，Umana P.CEA TCB：A novel head-to-tail 2：1T cell bispecific antibody for treatment of CEA-positive solidtumors.Oncoimmunology.2016；5：e1203498；Schmittnaegel M，Hoffmann E，Imhof-JungS，Fischer C，Drabner G，Georges G，等人A New Class of Bifunctional MajorHistocompatibility Class I Antibody Fusion Molecules to Redirect CD8 TCells.Mol Cancer Ther.2016；15：2130-42)。简而言之，在Hek293细胞中进行瞬时转染，然后进行蛋白A亲和色谱和体积排阻色谱。纯化的蛋白质在pH 6.0的20mM组氨酸和140mM氯化钠中缓冲。通过SDS-PAGE、体积排阻色谱和电喷雾电离质谱分析纯化的蛋白质。
分子的功能评估如下：
小鼠替代肽-MHC-I-抗体融合蛋白以预期的产量、蛋白质纯度和质量表达。流式细胞术分析证实抗原结合得以维持，并且I类MHC复合物被成功递送至靶细胞表面(数据未显示)。
实例2：
提供包含mCMV衍生肽和抗XCR1抗体的抗体-肽融合蛋白和疫苗接种
如前所述，通过将免疫显性mCMV-肽靶向XCR1+树突状细胞进行疫苗接种(HartungE，Becker M，Bachem A，Reeg N，Jakel A，Hutloff A，等人Induction of potent CD8 Tcell cytotoxicity by specific targeting of antigen to cross-presentingdendritic cells in viVo Via murine or human XCR1.J Immunol.2015；194：1069-79)。
先前描述的特异性地结合至表达鼠XCR1的细胞的单克隆抗体MARX10用作靶向抗体(WO2015140175，本文使用的MARX10抗体包含SEQ ID NO：84的重链氨基酸序列和SEQ IDNO：85的轻链氨基酸序列)。为了提供抗体-肽融合蛋白，将mCMV m38肽“SSPPMFRV”(SEQ IDNO：74)通过酶促分选酶偶联与抗XCR1抗体MARX10的C端融合(Clancy KW，MelVin JA，McCafferty DG.Sortase transpeptidases：insights into mechanism，substratespecificity，and inhibition.Biopolymers.2010；94：385-96；Madej MP，Coia G，Williams CC，Caine JM，Pearce LA，Attwood R，等人Engineering of an anti-epidermalgrowth factor receptor antibody to single chain format and labeling bySortase A-mediated protein ligation.Biotechnol Bioeng.2012；109：1461-70)。包含m38肽和MARX10抗体的抗体-肽融合蛋白在本文中也称为“m38-MARX10”。
对于疫苗接种，向C57BL/6N小鼠静脉注射5μg m38-MARX10和10μg聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I：C)，InvivoGen)，如前所述(WO2015140175和Hartung，E.，等人，J Immunol，2015.194(3)：p.1069-79)。五天后，通过静脉注射10x106个载SSPPMFRV肽的脾细胞和50μgPoly(I：C)(InvivoGen)使肽特异性CD8+ T细胞重新活化。接下来的三天，每天向小鼠腹膜内注射与抗体复合的IL-2(2.5μg重组鼠IL-2和10μg抗体)，这导致SSPPMFRV特异性CD8+ T细胞的进一步扩增(WO 2015/140175)。为了制备载肽细胞，将同源脾细胞在37℃于提供有5％CO2的加湿培养箱中在10μM的摩尔肽(SSPPMFRV)浓度下孵育1至2小时。为了去除未结合的肽，用PBS洗涤脾细胞两次，然后在注射入小鼠之前重悬于PBS中。通过使纯化的重组鼠IL-2(PeproTech)与抗小鼠IL-2抗体.JES6-5H4(BioLegend)在室温反应4小时或在4℃反应过夜来制备复合IL-2。疫苗接种和扩增后，从小鼠身上抽取血液以使用流式细胞术评估CD8+ T细胞应答。
m38特异性CD8+ T细胞的数量在第9天首先增加到15.0％的峰值，然后在第18天和第25天之间持续下降到大约4.4％，最后在第40天下降到平均2.5％。m38-H-2Kb特异性CD8+T细胞是CD44+/CD62L-/CD127+效应细胞。该疫苗接种方案始终达到1％至4％m38特异性CD8+ T细胞的水平。
实例3：
由特异性地结合至FAP的肽-MHC-I-抗体融合蛋白介导的CD8 T细胞活化
在体外IFNγ活化测定中测试实例1中生成的肽-MHC-I-抗体融合蛋白(“pMHC-I-IgG”)活化CD8+ T细胞的能力。
分离来自经疫苗接种的小鼠的脾细胞(实例2)，并以1∶1的比率与表达mFAP的MC38靶细胞混合。加入pMHC-I-IgG(m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG和IE3-pMHC-I-抗-FAP-IgG对照)，孵育六小时后，通过流式细胞术分析CD8 T细胞。使用载m38肽的肿瘤细胞作为阳性对照。孵育六小时后，通过流式细胞术分析脾细胞的T细胞标记物和IFNγ产生。细胞用荧光染料偶联抗体染色，用于检测细胞内IFNγ。
结果在图2中示出。例示性说明了将载mCMV衍生m38肽
Figure BDA0003182486960000951
mCMV m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG(●)或mCMV IE3-pMHC-I-抗-FAP-IgG(■)的MC38-mFAP肿瘤细胞和未装载的肿瘤细胞与从经mCMV m38疫苗接种的小鼠新鲜分离的脾细胞(◆)一起孵育后，在FACS中测量的表达IFNγ的CD8+ T细胞的频率。所有图表均显示平行测试(n＝2)的平均值，误差线表示标准偏差。
m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG可以活化所有CD8+ T细胞中的大约6％，这代表了m38特异性CD8+ T细胞群的10％。载m38肽的靶细胞介导了整个CD8+ T细胞群中约12％的活化。含有对照肽IE3的pMHC-I-IgG几乎不介导CD8+ T细胞的IFNγ活化，表明效应细胞的活化是严格地肽特异性的。在没有效应分子的情况下，脾细胞与肿瘤细胞的共孵育也不会导致CD8+T细胞的任何IFNγ活化。此外，我们发现，与经过pMHC-I-IgG处理的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞的肽负载仅在较高浓度(5nM)下达到最大IFNγ活化，经过pMHC-I-IgG处理的肿瘤细胞在较低浓度(1nM)下达到最大IFNγ活化。
实例4：
特异性地结合至FAP的肽-MHC-I-抗体融合蛋白介导的肿瘤细胞消除的体外评估
为了证明pMHC-I-IgG能够诱导肿瘤细胞的浓度依赖性和靶特异性裂解，如前所述，在实时细胞分析仪xCELLigence(罗氏(Roche))中的细胞毒性测定中测试了特异性靶细胞消除(Schmittnaegel M，Levitsky V，Hoffmann E，Georges G，Mundigl O，Klein C，等人Committing Cytomegalovirus-Specific CD8 T Cells to Eliminate Tumor Cells byBifunctional Major Histocompatibility Class I Antibody FusionMolecules.Cancer Immunol Res.2015；3：764-76)。
简而言之，将重组表达mFAP的贴壁肿瘤细胞系MC38培养48小时，以0.25∶1的效应细胞：靶细胞比率添加来自经m38疫苗接种小鼠的脾细胞。以0.1nM至100nM的不同浓度添加pMHC-I-IgG。使用载m38肽的肿瘤细胞作为阳性对照。实时测量靶细胞裂解的动力学。对三个平行测试样品进行长达48小时的测量。仅使用效应细胞测量从靶细胞的自发释放。特异性裂解百分比(％)计算为[(细胞指数自发释放-细胞指数试样)/(细胞指数自发释放)]x100。
载m38肽的肿瘤细胞被迅速消除。m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG显示出之前观察到的细胞杀伤的延迟开始(Schmittnaegel M，Levitsky V，Hoffmann E，Georges G，Mundigl O，Klein C，等人Committing Cytomegalovirus-Specific CD8 T Cells to EliminateTumor Cells by Bifunctional Major Histocompatibility Class I Antibody FusionMolecules.Cancer Immunol Res.2015；3：764-76)。具有不存在相应T细胞的不相关对照肽的IE3-pMHC-I-抗-FAP-IgG在高浓度下也不会触发细胞杀伤。
结果在图3中示出。在与来自经m38疫苗接种的小鼠的新鲜分离的脾细胞孵育后由pMHC-I-IgG介导的特异性肿瘤细胞裂解。例示性说明了装载mCMV IE3-pMHC-I-抗-FAP-IgG(▲)、mCMV m38肽(◆)或mCMV m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG
Figure BDA0003182486960000971
的MC38-mFAP细胞的孵育。测量靶细胞随时间推移的裂解。显示了化合物浓度为25nM时细胞裂解的动力学(图3A)。显示了在所有测试浓度下在40小时后的肿瘤细胞消除(图3B)。所有图表均显示平行测试(n＝3)的平均值，误差线表示标准偏差。
实例5：
抑制由特异性地结合至FAP的肽-MHC-I-抗体融合蛋白介导的肺转移灶形成(预防性设置)
在实例5和6中，评估了pMHC-I-IgG对肺肿瘤进展的治疗效果。实例5显示了预防性设置，而实例6显示了治疗性设置。
对C57BL/6N小鼠进行免疫以诱导对mCMV的m38表位的内源性CD8+ T细胞应答。
对于体内评估，从查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)获得7至8周大的C57BL/6N小鼠。为了诱导实验性肺转移灶(Fidler IJ，Nicolson GL.Organ selectivityfor implantation survival and growth of B16 melanoma variant tumor lines.JNatl Cancer Inst.1976；57：1199-202)，将总体积为100μl(HBSS)的2x10E5个经mFAP转染的B16黑素瘤细胞静脉注射到小鼠的侧尾静脉中。为了生成效应细胞，如实例2中所述，用靶向XCR1的疫苗接种对动物进行免疫。在本实例中使用的预防性设置中，在肿瘤攻击前24小时用治疗性蛋白质对动物进行预治疗，然后三天后进行一次治疗性治疗。然后以3天的间隔对小鼠进行两次治疗。
更准确地说，在外周血中m38-H-2Kb特异性CD8+ T细胞平均为3.2％的免疫应答峰值时，小鼠接受了静脉内注射的5mg/kg pMHC-I-IgG或2mg/kg TCB治疗。治疗后24小时，小鼠经静脉内注射接受2x10E5个表达mFAP的B16-F10黑素瘤细胞的攻击。静脉注射肿瘤细胞两天后，使用m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG和抗-FAP-TCB分子进行第二次治疗。
每天监测动物的一般健康状况。当达到停止标准(诸如健康状况不佳，体重减轻＞20％)时，处死小鼠。
在注射肿瘤细胞后第21天处死动物并分离肺。通过计数肺表面可见转移灶和通过qPCR定量TRP-2表达来评估转移负荷。
结果在图4中示出。在注射肿瘤细胞后21天收获肺后计数可见的肺转移灶。在注射肿瘤细胞之前24小时或注射之后两天，用PBS、m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG(●)或IE3-pMHC-I-anti-FAP-IgG(对照)治疗经MCMV m38疫苗接种的小鼠(▲)和未疫苗接种的(◆)小鼠两次。所有图表均显示每组不同动物的中位数(n＝6至10)，误差线表示在生长21天后肺转移灶计数的四分位距(图4A)或肺中TRP-2的qPCR量化(图4B)。
用m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG治疗几乎消除了所有小鼠的所有转移(转移灶数量分别为1和0，TRP-2表达水平分别为2和1)。
实例6：
通过特异性地结合至FAP的肽-MHC-I-抗体融合蛋白介导的肺转移灶的治疗性治疗来抑制肿瘤扩散(治疗性设置)
为了评估pMHC-I-IgG在治疗性设置下对肺肿瘤进展的治疗效果，使用了如实例5所述的类似实验设置。不同之处在于，在治疗性设置下，静脉注射后黑素瘤细胞可以在肺部生长九天。
简而言之，向M38肽免疫的C57BL/6N小鼠静脉注射2x10E5个经mFAP转染的B16-F10黑素瘤细胞。九天后，当肺转移灶已经建立时，在mCMV m38-H-2Kb特异性CD8+ T细胞平均为11.8％的CD8+ T细胞峰值期间，以三天的间隔用5mg/kg pMHC-I-IgG治疗动物两次。
结果在图5中示出。在转移生长的第21天收获肺后对可见的肺转移灶进行计数(图5A)。TRP-2表达通过qPCR量化(图5B)。用PBS、mCMV IE3-pMHC-I-抗-FAP-IgG对照(●，左)或mCMV m38-pMHC-I-抗-FAP-IgG(●，右)治疗经MCMV m38疫苗接种的小鼠(▲)和未疫苗接种的小鼠(◆)两次。在注射B16-mFAP黑素瘤细胞后九天开始治疗。所有图表均显示每组不同动物的中位数(n＝8至10)，误差线表示四分位距。所有图表均显示箱线图，其中每组不同动物的中位数(n＝8至10)和指示最大值和最小值的须。
用pMHC-I-IgG对已经建立的肺转移进行治疗性治疗减少了转移灶的数量。经疫苗接种的对照组显示每个肺具有的转移灶中位数为43(SEM：12.5，STDEV 39.7)，并且TRP-2表达水平中位数为103(SEM：278.0，STDEV 680.9)；而经pMHC-I-IgG治疗的肺具有的斑点中位数为16(SEM：5.0，STDEV 15.7)，并且TRP-2表达水平中位数为43(SEM：11.5，STDEV 30.4)。用含有对照肽IE3的pMHC-I-IgG治疗的经m38疫苗接种的组显示出45的转移性生长(SEM：17.8，STDEV 56.3)，与经疫苗接种的媒介物组的转移性生长类似，表明肿瘤细胞裂解是借助于pMHC-I-IgG募集疫苗接种诱导的m38-H-2Kb特异性CD8+ T细胞特异性地介导的。实验证明，当B16-F10肿瘤细胞已经在肺中驻留时，使用pMHC-I-IgG可以延迟和减少转移灶生长。可以表明抗体与靶向肿瘤细胞的结合得以维持，因为肿瘤细胞在体内保持了mFAP的表达(数据未显示)。
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Claims (16)

1.一种肽-MHC-I-抗体融合蛋白，
其中所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3；
所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白作为治疗性药物使用，
其中所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白待施用于患者，其中已经在所述患者体内诱导了针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，并且其中所诱导的针对所述病毒衍生肽的免疫应答已在所述患者体内通过增强性药物得到增强。
2.根据权利要求1所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，
其中已经通过使用诱导性药物进行疫苗接种和/或通过使用病毒进行感染而在所述患者体内诱导了针对所述病毒衍生肽的所述细胞毒性免疫应答，从而使针对所述病毒衍生肽的T细胞活化。
3.根据权利要求1或2所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，其中所述增强性药物包含：表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中所述MHC-I结合至所述病毒衍生肽；以及Th1佐剂，所述Th1佐剂是危险信号。
4.根据权利要求3所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，
其中所述诱导性药物包含：
(a)抗体或其变体或片段，所述抗体或其变体或片段特异性地结合至趋化因子(C基序)受体1(XCR1)；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至所述抗体。
5.根据权利要求3所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，
其中所述诱导性药物包含：
(a)淋巴细胞趋化因子(XCL1)或其变体或片段，所述淋巴细胞趋化因子或其变体或片段特异性地结合至XCR1；以及
(b)所述病毒衍生肽，其中所述肽共价地偶联至XCL1或其变体或片段。
6.一种多组分试剂盒，所述多组分试剂盒包括增强性药物和治疗性药物，
-所述增强性药物包含：
(a)表达I类MHC的抗原呈递细胞，其中所述MHC-I结合至病毒衍生肽；以及
(b)Th1佐剂，所述Th1佐剂是危险信号佐剂；
其中所述增强性药物增强患者体内的针对病毒衍生肽的免疫应答，并且
-所述治疗性药物包含：
(i)抗体，所述抗体特异性地结合至靶细胞；以及
(ii)多肽，所述多肽在N端至C端方向包含所述病毒衍生肽、β2-微球蛋白和I类MHC分子的胞外结构域α1、α2和α3。
7.根据权利要求6所述的多组分试剂盒，所述多组分试剂盒进一步包括诱导性药物，所述诱导性药物在所述患者体内诱导针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答。
8.根据权利要求6或7所述的多组分试剂盒，所述多组分试剂盒作为药物使用，其中所述治疗性药物待施用至针对所述病毒衍生肽的免疫应答增强的患者，其中所述增强性药物增强患者体内的针对所述病毒衍生肽的免疫应答，并且其中所述诱导性药物通过疫苗接种诱导所述患者体内的针对所述病毒衍生肽的细胞毒性免疫应答，特别地，其中所述诱导性药物如权利要求4或5中所定义。
9.一种多组分试剂盒，所述多组分试剂盒包括诱导性药物和增强性药物，
-所述诱导性药物如权利要求4或5中所定义，并且
-所述增强性药物如权利要求6中所定义
所述多组分试剂盒用于使患者对于使用根据权利要求1至5中任一项所述的肽-MHC-I-抗体融合蛋白进行的治疗敏感的方法中。
10.根据权利要求2至5中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白，或根据权利要求8或9所述使用的多组分试剂盒，其中所述诱导性药物已经与Th1佐剂联合施用或与Th1佐剂联合施用，所述Th1佐剂是危险信号。
11.根据权利要求3至5或权利要求10中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据权利要求8至10中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中在所述患者体内的具有延长的半衰期的白细胞介素-2(IL-2)或IL-2变体已经在施用所述表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用或在施用所述表达I类MHC的抗原呈递细胞之后施用。
12.根据权利要求3至5或权利要求10至11中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据权利要求8或权利要求10至11中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中所述Th1佐剂是聚肌胞苷酸(poly I：C)。
13.根据权利要求3至5或权利要求10至12中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据权利要求8或权利要求10至12中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中所述表达I类MHC的抗原呈递细胞和所述佐剂已经在针对所述病毒衍生肽诱导所述患者的T细胞之后3天至14天施用或在针对所述病毒衍生肽诱导所述患者的T细胞之后3天至14天施用，优选地之后4天至10天施用。
14.根据权利要求1至5或权利要求10至13中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据权利要求8或权利要求10至13中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中所述治疗性药物在病毒衍生肽特异性CD8+ T细胞水平由于施用所述增强性药物而升高时施用，优选地，其中所述治疗性药物在从施用所述增强性药物起29天内，特别是20天内，尤其是14天内施用，更优选地，其中所述治疗性药物在所述增强之后短时间内施用，诸如在施用所述增强性药物之后3天内、2天内或1天内施用或在其后立即施用。
15.根据权利要求1至5或权利要求10至14中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据权利要求8或权利要求10至14中任一项所述使用的多组分试剂盒，其中所述肽-MHC-I-抗体融合蛋白中包含的所述抗体特异性地结合至选自由癌细胞和病毒感染细胞组成的组的靶细胞。
16.根据权利要求1至5或权利要求10至15中的一项所述使用的肽-MHC-I-抗体融合蛋白或根据权利要求8或权利要求10至15中任一项所述使用的多组分试剂盒，其用于治疗癌症或病毒感染。
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