CN113416713A - 一种重组腺病毒的构建及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种表达山羊SLAM(goat SLAM，gSLAM)的重组腺病毒(rAD‑gSLAM)，利用其感染羊源原代细胞并可表达gSLAM受体，提高该细胞对PPRV的易感性，为PPRV的分离培养及与宿主细胞相互作用等研究提供重要的研究工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物制品，具体涉及一种病毒载体的构建及应用。
背景技术
小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是一种由PPR病毒(PPRV)引起的急性、高度接触性传染病。PPR主要感染小反刍兽，如绵羊和山羊，其中山 羊比绵羊更容易感染该疾病，新生和幼小动物比成年动物更易受到影响。OIE将 其列为必须通报的动物疫病，在我国被列为一类动物传染病。PPR首次被报告是 1942年在非洲的科特迪瓦，目前该疾病主要发生在非洲(最南部国家除外)、阿 拉伯半岛、中亚和中东、东亚以及东南亚等地。2015年，为有效保障养羊业稳 定发展，中国农业部制定了《全国小反刍兽疫消灭计划(2016-2020年)》。
腺病毒载体(Adenovirus，Ad)由于安全性高、宿主范围广泛、病毒颗粒相对 稳定等优点，已成为最常用的病毒载体之一。尤其是5型腺病毒载体，其E1区 缺失造成病毒复制缺陷，不会引起宿主损伤，已广泛应用在如狂犬病病毒、流感 病毒、埃博拉病毒等诸多病毒以及寄生虫疫苗研究上，并获得良好免疫效果。现 已验证的PPRV受体有信号淋巴细胞激活分子 (Signalling lymphocyte activation molecule，SLAM)和脊髓灰质炎病毒受体 4(Nectin4)。SLAM也称作CD150，它是多种麻疹病毒属病毒的细胞受体，麻疹 病毒属病毒的H蛋白通过与SLAM结合开启感染过程，它主要在淋巴细胞、巨 噬细胞及树突状细胞等细胞中表达。有学者构建了表达犬SLAM受体的Vero 细胞系，野生型犬瘟热病毒能良好生长并且该细胞系可稳定表达，并可用于增 强小反刍兽疫的感染复制。吴锦艳等(吴锦艳，田宏、蒙学莲等.慢病毒介导稳定 表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立.[J].畜牧兽医学 报,2019,50(1):218-226.)利用慢病毒介导技术将山羊SLAM基因整合到Vero细胞 获得了稳定表达SLAM的Vero细胞系，与病毒在Vero细胞上复制相比，病变 周期明显缩短。
小反刍兽疫病毒的分离和培养主要是在Vero细胞上进行，如果采用羊源细 胞作为其分离培养细胞及研究模型，更利于小反刍兽疫病毒的生长稳定性及与宿 主相互作用的研究。然而目前羊源细胞系非常稀少，且没有一种适用于PPRV。 原代羔羊肾细胞和肺脏细胞等可用于PPRV的分离，但通常需要盲传数代，易感 性不高，制约了PPRV的分离效率以及与宿主相互作用的研究。如果羊原代细胞 能够表达SLAM受体，则会提高病毒易感性，更适合用于PPRV的分离培养及 其它研究。由于原代细胞不易做成稳定表达SLAM的细胞系，因此只能通过腺 病毒等载体一过性感染来表达受体来实现。
发明内容
本发明首先提供一种表达山羊SLAM(goat SLAM，gSLAM)的重组腺病毒 (rAD-gSLAM)，利用该重组腺病毒感染羊源原代细胞并可表达gSLAM受体，提 高羊源原代细胞对PPRV的易感性，为PPRV的分离培养及与宿主细胞相互作 用机理等的研究提供了重要的研究工具。
进一步优选，本发明构建的表达山羊来源SLAM的腺病毒rAD-gSLAM属 于5型复制缺陷型腺病毒，由于其E1区缺失造成病毒复制缺陷，不会引起宿主 损伤，病毒构建时间快速，一般在4周之内构建完成，进一步优选3周之内构 建完成。
本发明成功构建的表达gSLAM的重组腺病毒(rAD-gSLAM)，为PPRV疫 苗的研制和强毒株在羊源细胞上的生长、复制提供了重要的工具，为小反刍兽 疫病毒在亲本动物体外的感染与免疫机制研究奠定了重要的研究基础。
本发明构建的表达gSLAM的重组腺病毒(rAD-gSLAM)已经提交保藏，保 藏日期为2020年12月04日，保藏号为CCTCC NO:V202087，保藏单位：中 国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学。
第二方面，本发明提供一种工具细胞，用于分离培养PPRV病毒，该工具 细胞是指被重组腺病毒(rAD-gSLAM)感染的原代细胞或传代细胞并可进一步表 达gSLAM受体。所述原代细胞是指羊源细胞，例如原代羔羊肾细胞、睾丸细胞 和肺脏细胞等；所述传代细胞是指常规用于分离PPR病毒的细胞，例如Vero 细胞或OIE推荐的PPR病毒分离的细胞等。
本发明结果表明，rAD-gSLAM感染Vero细胞后可提高PPRV疫苗株和强 毒株的感染能力，发生明显融合现象，并可大幅提高强毒株的复制滴度，减少 复制压力从而降低突变的概率。强毒感染Vero/rAD-gSLAM，24h病毒滴度就能 够达到高峰，大幅减少了病毒复制时间，更利于临床样本的高通量分离和检测。 同样，羔羊原代睾丸细胞在感染rAD-gSLAM后，PPRV疫苗株和强毒株的感染 和复制能力同样得到了提高；同时作为羊源的细胞，更适合用于PPRV临床样 品的分离，减少病毒传代的突变概率。
第三方面，本发明提供培养和分离PPRV病毒的方法，将PPRV病毒接种于 本发明的工具细胞进行培养分离。
第四方面，本发明提供重组腺病毒(rAD-gSLAM)在PPRV病毒培养分离以及 与PPRV病毒相关研究中的用途。
第五方面，本发明提供制备重组腺病毒(rAD-gSLAM)的方法，该方法包括如 下步骤：
1、根据pIRES3-gSLAM质粒序列设计引物gSLAM-F。
2、以pIRES3-gSLAM质粒为模板，利用gSLAM-F/R PCR扩增gSLAM片 段；以合成的mCherry基因为模板，利用mCherry-F/R PCR扩增mCherry片段。 pShuttle-CMV质粒经SalⅠ酶切，酶切产物及PCR产物gSLAM和mCherry纯化 回收后，利用ClonExpress MultiS OneStep Cloning Kit将上述两个片段克隆至穿 梭质粒pShuttle-CMV(约7.5kb)，经测序得到正确的重组穿梭载体 pShuttle-gSLAM-mCherry。将重组穿梭载体经PmeI线性化后，转化至含有 pAdEasy-1的BJ5183感受态中进行同源重组，在卡那霉素抗性的培养基上进行 筛选，挑取单克隆，用PacI酶切鉴定后，最终得到重组的腺病毒载体，命名为 pAd-gSLAM-mCherry。
3、利用Lipofectamine 3000转染试剂将PacI酶切线性化的质粒 pAd-gSLAM-mCherry转染293A细胞，转染后利用荧光显微镜观察，待细胞出 现细胞病变(cytopathiceffect，CPE)时收集细胞，释放出腺病毒rAD-gSLAM。
本发明的重组腺病毒(rAD-gSLAM)，免去了不同细胞构建不同细胞系的繁琐 步骤，同时还具备适合原代细胞、感染率高、对感染细胞的状态无影响、成本低、 易于制备等优点。腺病毒能在较短时间扩增到较高滴度，在本发明的一实施方式 中，构建的重组腺病毒滴度能达到109TCID50/mL，不用浓缩纯化即能实现MOI 3 感染细胞，便于使用，满足95％以上细胞感染表达受体。
重组慢病毒瞬时感染也可以在原代细胞上进行受体表达，但是慢病毒感染谱 比腺病毒窄，表达效率弱于腺病毒，病毒包装繁琐而不易于制备，病毒滴度低， 更适合用于构建稳定表达细胞系，在原代细胞上瞬时表达受体，腺病毒更有优势。
本发明构建重组腺病毒rAD-gSLAM已经提交保藏，保藏日期为2020年12 月04日，保藏号为CCTCC NO:V202087，保藏单位：中国典型培养物保藏中心， 地址：中国武汉武汉大学。
附图说明
图1：重组腺病毒构建示意图
图2：rAD-gSLAM感染Vero细胞表达gSLAM蛋白
(A)重组腺病毒rAD-gSLAM感染Vero细胞24h和120h在荧光显微镜 下显示自发红色荧光。
(B)M:预染蛋白Marker；1:Vero细胞；2:rAD-gSLAM感染Vero细胞后 gSLAM的表达.
图3：rAD-gSLAM感染Vero细胞对PPRV的感染和复制的影响
图4：rPPRV/GFP和PPRV/CN/HLJ/13的生长曲线
图5：PPRV在感染rAD-gSLAM的LT细胞上的生长
Mock：未感腺病毒的对照LT细胞；箭头所指为细胞融合。
具体实施方式
通过以下实施例来进一步说明本发明。
材料和方法
材料
Vero细胞、293A细胞、pShuttle-CMV质粒由本实验室保存；原代羔羊睾丸 细胞(Lamb Testicular，LT)由本实验室制备保存；pIRES3-gSLAM质粒由本实验 室构建；小反刍兽疫中国流行株PPRV/CN/HLJ/13是在中国农业科学院哈尔滨 兽医研究所国家动物疫病防控高级别生物安全实验室生物安全三级防护条件下 分离和保存；rPPRV/GFP为表达绿色荧光蛋白的重组PPR病毒，其亲本毒为 PPRV Nigeria75/1疫苗株，由本实验室构建保存；AD为不带外源基因的腺病毒， 由本实验保存。
主要试剂
Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit、U+Probe Master Mix、Dh5α感受态、XL10感受态均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；各种限制性内切酶购自NEB 公司；BJ5183感受态购自北京博迈德基因技术有限公司；Lipofectamine 3000 转染试剂盒购自Invitrogen公司；质粒大提试剂盒购自天根生化科技有限公司； Flag单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG购自Thermo；增强化学发光显影 试剂购自Merck-Millipore；其余常用实验室试剂为国产分析纯。
引物：
根据pIRES3-gSLAM质粒序列设计引物gSLAM-F： CTAGAGATCTGGTACCGTCGACGCCGCCACCATGGACCACAAG/gSLAM-R： GCTTTAACAGAGAGAAGTTCGTGGCGCCGCTTCCCTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGACGGACTCGGGCA C，用于扩增目的基因gSLAM。根据GeneBank登 录的mCherry基因(登录号：MF169983.1)合成mCherry基因，并设计引物 mCherry-F:GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAG AAAACCCCGGGCCCAT GGTGAGCAAGGGCGAG/mCherry-R:AGGCTCGAGCGGCCGCGTCGACCTAC TTGTACAGCTCGTCCA TG(斜体部分为SalⅠ酶切位点)，用于扩增目的基因 mCherry。根据pShuttle-CMV质粒序列设计引物JD-F： CTAGAGATCTGGTACCGTC/JD-R：AGGCTCGAGCGGCCGCGTC，用于鉴定 重组腺病毒。引物和基因均由吉林省库美生物科技有限公司合成。
实施例1：pAd-gSLAM-mCherry重组腺病毒载体的构建与鉴定
以pIRES3-gSLAM质粒为模板，利用gSLAM-F/R PCR扩增gSLAM片段； 以合成的mCherry基因为模板，利用mCherry-F/R PCR扩增mCherry片段。 pShuttle-CMV质粒经SalⅠ酶切，酶切产物及PCR产物gSLAM和mCherry纯化 回收后，利用ClonExpress MultiS OneStep Cloning Kit将上述两个片段克隆至穿 梭质粒pShuttle-CMV(约7.5kb)，经测序得到正确的重组穿梭载体 pShuttle-gSLAM-mCherry。将重组穿梭载体经PmeI线性化后，转化至含有 pAdEasy-1的BJ5183感受态中进行同源重组，在卡那霉素抗性的培养基上进行 筛选，挑取单克隆，用PacI酶切鉴定后，最终得到重组的腺病毒载体，命名为 pAd-gSLAM-mCherry(图1)。
实施例2：重组腺病毒AD-gSLAM的包装、鉴定
利用Lipofectamine 3000转染试剂将2.5μg PacI酶切线性化的质粒 pAd-gSLAM-mCherry转染293A细胞，转染后7d利用荧光显微镜观察，待细胞 出现细胞病变(cytopathiceffect，CPE)时收集细胞，反复冻融并剧烈震荡细胞3 次，释放出腺病毒rAD-gSLAM。提取腺病毒DNA，利用鉴定引物JD-F/R进行 PCR鉴定。将收集到的病毒液再感染293A细胞扩增并传代，取第3代病毒滴定 后分装，存于-70℃。
经测序鉴定结果显示重组穿梭质粒pShuttle-gSLAM-mCherry正确构建。 PmeI线性化的重组穿梭载体pShuttle-gLAM-mCherry与腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组，得到重组腺病毒质粒 pAd-gSLAM-mCherry，经PacI酶切后得到约30kb和4.5kb大小的片段，表明重 组腺病毒质粒正确构建。将重组腺病毒提取DNA，经PCR鉴定可扩增出约 1800bp大小的条带，与预期相符，表明该重组腺病毒携带的外源基因为gSLAM。
实施例3：重组腺病毒感染细胞后外源基因表达的检测
以rAD-gSLAM(MOI 3)感染6孔细胞培养板中密度约为90％Vero细胞，分 别于感染后24h和120h在倒置荧光显微镜下观察细胞。rAD-gSLAM感染Vero细 胞(Vero/rAD-gSLAM)48h后收获细胞及上清，以Flag单克隆抗体(MAb)(1:1000) 为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG(1:2000)为二抗，采用western blot检测gSLAM 基因的表达情况。
重组腺病毒以MOI 3感染Vero细胞后24h，约95％以上细胞能够被感染并 表达红色荧光蛋白，感染120h后细胞表达红色荧光且无细胞病变(图2A)，表明 重组腺病毒感染Vero细胞不产生细胞病变。收获感染48h的细胞进行免疫印迹 试验，结果显示，在约55ku附近出现特异性条带，与预期相符(图2B)。以上结 果表明该重组腺病毒感染细胞能表达gSLAM蛋白
实施例4：rAD-gSLAM感染Vero后对PPRV感染的影响试验
待12孔细胞培养板中的Vero细胞密度约90％时，以MOI 3感染 rAD-gSLAM，设感染AD的Vero细胞作对照，24h后分别感染rPPRV/GFP和 PPRV/CN/HLJ/13，感染后48h在倒置荧光显微镜下观察细胞病变。
试验分别设感染AD(Vero/AD)和正常的Vero细胞作对照。同时分别于感染 后24h、48h、72h、96h、120h收获细胞及上清，反复冻融3次后提取RNA做模 板，进行qPCR，分别绘制rPPRV/GFP和PPRV/CN/HLJ/13的生长曲线。针对 PPRV Nigeria75/1株(基因登录号X74443)和PPRV/CN/HLJ/13株(本实验室测 序)N基因设计qPCR探针及引物：探针为 N13-75-probe:FAM-5'-CAAGTATGAGAGATACCATGAACCGCCG-3'-Tamra，上 游引物为N13-75-f:5'-AACTGAGAAGGTGGGTTAAATACAC-3'，下游引物为 N13-75-r:5'-ACAATATAGTTGTCAATGTCGCAGA-3'。反应体系及反应程序按照 U+Probe Master Mix说明书进行操作。应用Excel软件进行统计学分析，组间比 较采用t检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
rAD-gSLAM以MOI 3感染Vero细胞24h后分别感染rPPRV/GFP、 PPRV/CN/HLJ/13，荧光显微镜观察结果显示，rPPRV/GFP能感染Vero和 Vero/rAD-gSLAM，但在Vero/rAD-gSLAM上有大量荧光并形成明显的细胞融合， 而阴性对照细胞仅有零星荧光且无明显细胞融合；PPRV/CN/HLJ/13能在 Vero/rAD-gSLAM上形成明显的细胞融合，而阴性对照细胞无细胞融合(图3)。表 明感染rAD-gSLAM的Vero细胞有利于PPRV的感染和复制。
实施例5：PPRV在感染rAD-gSLAM的LT上的生长试验
rAD-gSLAM以MOI 3感染LT细胞，设LT和感染AD的LT为对照，24h 后以MOI 0.1分别感染rPPRV/GFP和PPRV/CN/HLJ/13，37℃及5％CO2的培 养箱中培养，不同时间在荧光倒置显微镜下观察不同细胞的感染情况。
感染后不同时间qPCR检测结果显示rPPRV/GFP在Vero/rAD-gSLAM上及 对照细胞上的生长动力学差异不显著，无统计学意义(p>0.05)；PPRV/CN/HLJ/13 在Vero/rAD-gSLAM上的复制明显强于PPRV/CN/HLJ/13在对照细胞上的复制 (p<0.05,差异显著)，并且其滴度在24h即达到高峰，而PPRV/CN/HLJ/13在对照 细胞上复制相对较慢，第72h达到高峰时的拷贝数约为感染rAD-gSLAM组高 峰时的1/48(图4)。结果表明gSLAM的表达对PPRV/CN/HLJ/13的复制有明显 增强作用，对rPPRV/GFP的复制增强作用较小。
感染rAD-gSLAM之后的LT，在感染rPPRV/GFP和PPRV/CN/HLJ/13后利 用荧光显微镜观察可见，72h均有明显细胞融合出现，而观察对照LT细胞和感 染AD的LT细胞在感染rPPRV/GFP或者PPRV/CN/HLJ/13均无明显的细胞融合 出现，其中rPPRV/GFP病毒复制较弱，仅有零星感染的荧光细胞， PPRV/CN/HLJ/13未见明显感染迹象(图5，箭头所指为细胞融合和CPE)。表明 rAD-gSLAM增加了PPRV病毒在羊源原代细胞上的感染和复制能力。
Claims (8)
1.一种重组腺病毒，其是表达山羊来源SLAM(goat SLAM，gSLAM)的重组腺病毒(rAD-gSLAM)，保藏号为CCTCC NO:V202087。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其中所述表达山羊来源SLAM的腺病毒rAD-gSLAM属于5型复制缺陷型腺病毒，其E1区缺失造成病毒复制缺陷。
3.一种工具细胞，所述工具细胞是指被权利要求1或2所述重组腺病毒(rAD-gSLAM)感染的原代细胞或传代细胞并可进一步表达gSLAM受体。
4.如权利要求3所述的工具细胞，所述原代细胞是指羊源细胞，选自原代羔羊肾细胞、原代羔羊睾丸细胞和原代羔羊肺脏细胞。
5.如权利要求3所述的工具细胞，；所述传代细胞是指常规用于分离PPR病毒的细胞，选自Vero细胞或OIE推荐的PPR病毒分离的细胞。
6.一种制备权利要求1所述重组腺病毒(rAD-gSLAM)的方法，该方法包括如下步骤：
(1)、根据pIRES3-gSLAM质粒序列设计引物gSLAM-F；
(2)、以pIRES3-gSLAM质粒为模板，利用gSLAM-F/R PCR扩增gSLAM片段；以合成的mCherry基因为模板，利用mCherry-F/R PCR扩增mCherry片段。pShuttle-CMV质粒经SalⅠ酶切，酶切产物及PCR产物gSLAM和mCherry纯化回收后，利用ClonExpress MultiS One StepCloning Kit将上述两个片段克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV，经测序得到正确的重组穿梭载体pShuttle-gSLAM-mCherry，将重组穿梭载体经PmeI线性化后，转化至含有pAdEasy-1的BJ5183感受态中进行同源重组，在卡那霉素抗性的培养基上进行筛选，挑取单克隆，用PacI酶切鉴定后，最终得到重组的腺病毒载体，命名为pAd-gSLAM-mCherry；
(3)、利用Lipofectamine 3000转染试剂将PacI酶切线性化的质粒pAd-gSLAM-mCherry转染293A细胞，转染后利用荧光显微镜观察，待细胞出现细胞病变时收集细胞，释放出腺病毒rAD-gSLAM。
7.权利要求1或2所述的重组腺病毒在制备病毒相关研究的试剂中的用途。
8.权利要求3-5所述的工具细胞作为分离和/或培养PPRV病毒的载体细胞的用途。
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|---|---|
| CN (1) | CN113416713A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116790674A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-22 | 北京赛尔富森生物科技有限公司 | 一种麻疹病毒攻毒动物模型及其建立方法 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090264300A1 (en) * | 2005-12-01 | 2009-10-22 | Nuevolution A/S | Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries |
| EP2136209A1 (en) * | 2007-03-05 | 2009-12-23 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for examination of action of anti-cancer agent utilizing splicing defect as measure |
| CN103981192A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-08-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达山羊α干扰素的重组腺病毒及其构建方法和应用 |
| CN106591373A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-04-26 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam的制备方法 |
| CN106755089A (zh) * | 2016-08-22 | 2017-05-31 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用 |
| CN106755110A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-31 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法 |
| US20170166903A1 (en) * | 2012-07-25 | 2017-06-15 | The Broad Institute, Inc. | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
| CN106967748A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-21 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达pprv h/f蛋白疫苗的构建 |
| WO2017173384A1 (en) * | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Kite Pharma, Inc. | Chimeric receptors and methods of use thereof |
| TW201825118A (zh) * | 2016-11-30 | 2018-07-16 | 美商艾堤爾製藥公司 | 抗-hrs抗體及用於治療癌症之組合療法 |
| CN109576306A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-04-05 | 西北农林科技大学 | 利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法 |
| CN110724690A (zh) * | 2019-09-03 | 2020-01-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种山羊slam基因的克隆与原核表达方法 |
| CN114457042A (zh) * | 2021-07-08 | 2022-05-10 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 小反刍兽疫病毒强毒反向遗传系统及动物感染模型 |
-
2021
- 2021-05-11 CN CN202110512838.9A patent/CN113416713A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20090264300A1 (en) * | 2005-12-01 | 2009-10-22 | Nuevolution A/S | Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries |
| EP2136209A1 (en) * | 2007-03-05 | 2009-12-23 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method for examination of action of anti-cancer agent utilizing splicing defect as measure |
| US20170166903A1 (en) * | 2012-07-25 | 2017-06-15 | The Broad Institute, Inc. | Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof |
| CN103981192A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-08-13 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达山羊α干扰素的重组腺病毒及其构建方法和应用 |
| WO2017173384A1 (en) * | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Kite Pharma, Inc. | Chimeric receptors and methods of use thereof |
| CN106755089A (zh) * | 2016-08-22 | 2017-05-31 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用 |
| TW201825118A (zh) * | 2016-11-30 | 2018-07-16 | 美商艾堤爾製藥公司 | 抗-hrs抗體及用於治療癌症之組合療法 |
| CN106755110A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-05-31 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam/V的制备方法 |
| CN106591373A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-04-26 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种用于增强PPRV复制的敏感细胞亚克隆Vero/Slam的制备方法 |
| CN106967748A (zh) * | 2017-03-29 | 2017-07-21 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达pprv h/f蛋白疫苗的构建 |
| CN109576306A (zh) * | 2018-11-30 | 2019-04-05 | 西北农林科技大学 | 利用pAd-Easy1腺病毒载体系统构建牛MEF2A基因过表达病毒的方法 |
| CN110724690A (zh) * | 2019-09-03 | 2020-01-24 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种山羊slam基因的克隆与原核表达方法 |
| CN114457042A (zh) * | 2021-07-08 | 2022-05-10 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 小反刍兽疫病毒强毒反向遗传系统及动物感染模型 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| WU JINYAN 等: "Establishment of Vero/SLAM Cell Lines with Stable Expression SLAM to Enhanced PPRV Replication Using the Lentiviral Expression System SLAM to Enhanced PPRV Replication Using the Lentiviral Expression System", 《CHINESE JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY SCIENCES》 * |
| 吴锦艳 等: "慢病毒介导稳定表达增强小反自兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立", 《畜牧兽医学报》 * |
| 唐镇生 主编: "《分子外科与基因治疗》", 31 July 1999, 上海医科大学出版社 * |
| 王园园等: "SLAMF7-SLAMF7信号通路在肿瘤进展中的作用及相关机制", 《肿瘤防治研究》 * |
| 褚云馨 等: "小反刍兽疫病毒疫苗毒株N75-1感染细胞源外泌体对山羊SLAM表达的影响", 《畜牧兽医学报》 * |
| 陈合凤 等: "表达山羊SLAM受体的重组腺病毒的构建及在增强PPRV感染羊源原代细胞中的应用", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116790674A (zh) * | 2023-08-18 | 2023-09-22 | 北京赛尔富森生物科技有限公司 | 一种麻疹病毒攻毒动物模型及其建立方法 |
| CN116790674B (zh) * | 2023-08-18 | 2023-11-10 | 北京赛尔富森生物科技有限公司 | 一种麻疹病毒攻毒动物模型及其建立方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210921 |
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