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CN113383016B - 结合人IL-1β的抗体、其制备方法和用途 - Google Patents

结合人IL-1β的抗体、其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种全新结构的可结合人IL‑1β的抗体或其抗原结合片段，其具有良好的阻断IL‑1β与其受体相结合，从而下调IL‑1β活性的生物学功能，可应用于制备治疗IL‑1β过表达介导的免疫类疾病(例如关节炎、骨质疏松、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合症等)的药物，具有良好的临床应用前景。

Description

结合人IL-1β的抗体、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及抗体领域，更具体地，本发明公开了一种结合人IL-1β的抗体；
本发明还涉及上述抗体的制备方法和用途。
背景技术
白介素1蛋白包括白介素1α(IL-1α)和白介素1β(IL-1β)。IL-1β是一种多功能性细胞因子，介导多种淋巴细胞的生长和分化，并参与与调控多种炎症反应过程。IL-1β在体内的分泌水平受IL-1家族如IL-1α及IL-1R抑制剂(IL-1Ra)等的调控。
多种免疫细胞如巨噬细胞表达IL-1α和分泌IL-1β。IL-1β受体有IL-1I型受体(IL-1RI)和IL-1II型受体(IL-1RII)。其中，IL-1RI几乎所有有核细胞均有表达，IL-1β结合IL-1RI进而引起IL-1受体(IL-1R)辅助蛋白(IL-1RAcP)的聚集并形成复合物，从而激活信号通路；IL-1RII同时以细胞膜表面表达和可溶性形式存在于体内，IL-1β结合IL-1RII后将下调IL-1β的活性。
多种研究表明，IL-1β的过表达是引起多种免疫类疾病的主要原因如Cryopyrin蛋白相关综合征、肿瘤坏死因子受体相关周期性综合症、全身型幼年特发性关节炎、高免疫球蛋白D综合证(HIDS)/甲羟戊酸激酶缺乏症(MKD)、骨质疏松、骨关节炎以及其他炎症性关节炎。在多种炎症及自发免疫类疾病中，血清中IL-1β的含量随着病情的恶化及严重程度而升高(Pascual V,Allantaz F,et al.,Role of interleukin-1(IL-1)in the pathogenesisof systemic onset juvenile idiopathic arthritis and clinical response to IL-1blockade.J Exp Med 2005；201:1479-86)。另外有研究表明，IL-1β在TH17细胞分化成熟中起重要促进作用(de Jong E,Suddason T,Lord GM.Translational mini-reviewseries on Th17 cells:development of mouse and human T helper 17cells.Clin ExpImmunol.2010Feb,159(2):148-58)。成熟的TH17细胞能分泌IL-17，促进多种免疫类疾病如银屑病的发生。因此IL-1β抑制剂能阻断IL-1信号通路，在治疗骨质疏松、炎症性关节炎及其他免疫类疾病治疗中具有重要作用。
因此研发出有效的抗IL-1β抗体来满足患者的用药需求一直是本领域的人员着力解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的发明人经过了大量试验，从抗原免疫、杂交瘤筛选、抗体表达纯化到生物活性鉴定，筛选获得到了一系列结合人IL-1β的抗体。本发明对候选鼠源抗体和人源化抗体开展了体内药理学研究，结果显示，鼠源抗体19E4、18H11、9D5都可以明显降低IL-1β诱导的小鼠关节炎病变，人源化抗体18H11 H1L1在剂量10mg/kg下,能明显改善小鼠患肢的行走行为以及明显减少患肢膝关节的肿胀面积。因此，本发明公开的具有全新结构的结合人IL-1β的抗体有望成为治疗关节炎、骨质疏松、及其他免疫类疾病的潜在治疗药物。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，该抗体的重链互补决定区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3；其轻链互补决定区L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的氨基酸序列分别为SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。
其中，本发明公开的结合人IL-1β的抗体为鼠源抗体18H11，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：7，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：8。
其中，本发明公开的结合人IL-1β的抗体为人源化抗体18H11H1L1，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：10。
其中，本发明公开的结合人IL-1β的抗体为人源化抗体18H11H2L2，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：11，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：12。
其中，本发明公开的结合人IL-1β的抗体为人源化抗体18H11H3L3，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：13，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：14。
其中，本发明所述的抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体或单域抗体。
本发明的第二个目的在于提供编码所述结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子。
其中，编码鼠源抗体18H11重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：15，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：16。
其中，编码人源化抗体18H11H1L1重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：17，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：18。
其中，编码人源化抗体18H11H2L2重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：19，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：20。
其中，编码人源化抗体18H11H3L3重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：21，编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：22。
本发明的第三个目的在于提供含有所述核苷酸分子的表达载体。
本发明的第四个目的在于提供含有所述表达载体的宿主细胞。
本发明的第五个目的在于提供所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而得到所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段；
(b)分离并纯化(a)所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第六个目的在于提供含有所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。所述药物组合物含有如上任一项所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
本发明的第七个目的在于提供所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段或所述的药物组合物的用途。所述用途是用于制备治疗由于IL-1β的过表达引起的多种免疫类疾病的药物，如关节炎、骨质疏松或银屑病等。根据本发明的优选实施例，所述用途是用于制备治疗关节炎的药物。
本发明的第八个目的在于提供一种结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区H-CDR2包括C53A突变位点，所述抗体18H11-Hu-C53A的重链互补决定区H-CDR2(IMGT编码方式)：ISAYNGDT，其氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示。
本发明也提供上述抗体与人IL-1β的结合表位：主要结合表位分别为SEQ ID NO：23的第120位的色氨酸W和第122位的异亮氨酸I，其次为第112位的苯丙氨酸F、第123位的丝氨酸S和第124位的苏氨酸T。
有益效果：
1、本发明筛选获得的结合人IL-1β的抗体能够特异性与人IL-1β结合，ELISA测试结果表明，其中鼠源抗体18H11的EC50与阳性对照抗体相当，人源化抗体18H11H1L1的EC50优于阳性对照抗体。
2、本发明筛选获得的结合人IL-1β的抗体能够有效地竞争性阻断IL-1β与其相关受体的结合，其中，鼠源抗体18H11和人源化抗体18H11H1L1的EC50均与阳性对照抗体相当。
3、本发明筛选获得的结合人IL-1β的抗体能够有效地抑制由IL1β诱导的MRC-5细胞分泌IL-6。其中，鼠源抗体18H11和人源化抗体18H11H1L1抑制由IL-1β诱导细胞的IL-6分泌效果较阳性对照抗体更优。
4、本发明筛选获得的结合人IL-1β的抗体18H11H1L1，经Fortebio Kinetics分析，其抗体亲和力与阳性对照抗体相当。
5、本发明筛选获得的结合人IL-1β的抗体能够明显降低IL-1β诱导的小鼠关节炎病变。其中，鼠源抗体18H11和人源化抗体18H11H1L1在小鼠行为学评分、关节肿胀影响/膝关节面积、体重影响等方面的治疗效果与阳性对照抗体相当。
6、本发明获得的以18H11 H1L1的重链为模板，在H-CDR2包含C53A位点的突变抗体18H11-Hu-C53A，其比野生型抗体具有更好的热稳定性。
本发明中，术语“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白G(IgG)”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。本发明的抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体的抗原结合片段等。本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体等。
本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明中，术语“鼠源抗体”是指来源于大鼠或小鼠的抗体，优选小鼠。本发明的鼠源抗体为使用人IL-1β为抗原免疫小鼠并进行杂交瘤细胞筛选获得。更优选的，本发明的鼠源抗体包括19E4、18H11、9D5。最优选的，本发明的鼠源抗体为18H11。
本发明中，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段，其中的供体抗体可以是具有预期特异性、亲和性或反应性的非人源(例如，小鼠、大鼠或兔)抗体。此外，受体抗体的构架区(FR)的一些氨基酸残基也可被相应的非人源抗体的氨基酸残基替换，或被其他抗体的氨基酸残基替换，以进一步完善或优化抗体的性能。关于人源化抗体的更多详细内容，可参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000)。优选的，本发明的人源化抗体由鼠源抗体18H11的CDR区和来源自人抗体的非CDR区重组。更优选的，本发明的人源化抗体包括18H11 H1L1、18H11H2L2和18H11 H3L3。最优选的，本发明的人源化抗体为18H11 H1L1。
本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)等。
本发明中，术语“抗原结合片段”是指能够与人IL-1β特异性结合的抗体的片段。本发明的抗原结合片段的例子包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)等。Fab片段是用木瓜蛋白酶消化抗体产生的片段。F(ab’)2片段是用胃蛋白酶消化抗体产生的片段。Fv片段是由抗体的重链可变区和轻链可变区紧密非共价关联的二聚物组成。单链抗体(scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成的抗体。单域抗体(sdAb)又称为纳米抗体(nanobody)或重链抗体，仅由重链构成，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域。
本发明中，术语“结合”、“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(Surface Plasmon Resonance，缩写SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
本发明中，术语“表位”和“人IL-1β表位”是指位于人IL-1β上并与抗体特异性结合相关的区域。
本发明中，术语“表达载体”可以为pTT5，pSECtag系列，pCGS3系列，pCDNA系列载体等，以及其它用于哺乳动物表达系统的载体等，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
本发明中，术语“宿主细胞”是指适用于表达上述表达载体的细胞，可以是真核细胞，如哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统均可用于本发明的融合蛋白的表达，CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese Hamster Ovary)，HEK293，COS、BHK等及上述细胞的衍生细胞均可适用于本发明。
本发明中，术语“细胞”和“细胞系”可互换使用。
本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的结合人IL-1β的抗体可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的结合人IL-1β的抗体的氨基酸核心序列的构像完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
本发明中，术语“IL-1β过表达的疾病”是指处于异常疾病状态的细胞中IL-1β的表达水平高于相同组织类型的正常细胞中的IL-1β表达水平。本发明的IL-1β过表达的疾病包括但不限于骨质疏松、骨关节炎以及其他炎症性关节炎、银屑病等多种免疫类疾病。
以下实施例是对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
本说明书中，缩写的术语含义说明如下：
Figure BDA0003000658000000051
Figure BDA0003000658000000061
附图说明
图1为IL1β-hFc纯化结果图，其中，M：蛋白质分子量标准，1：上纯化柱前，2：上纯化柱后穿透，3-9：纯化柱洗脱。IL1β-hFc蛋白理论大小43.7kDa，蛋白二聚体分子量约为87kDa。
图2为IL1RI(1-332)-HIS培养上清纯化结果图，M：蛋白质分子量标准，1：上纯化柱前，2：上纯化柱后穿透，3-4：纯化柱洗脱。
图3为IL1b-His纯化结果图，M：蛋白质分子量标准，FT：上纯化柱后穿透，load：上纯化柱前，1-7：纯化柱洗脱。IL1b-His蛋白理论大小18.2kDa，蛋白不存在二聚体分子。
图4为PcAb纯化结果图，M：蛋白质分子量标准，1：非还原的抗体，2：还原的抗体，3：BSA对照。PcAb蛋白理论大小150kDa，抗体重链分子量约为45kDa，轻链分子量约为30kDa。
图5为通过ELISA的方法测定鼠源抗体与抗原IL1β结合亲和力的结果。
图6为通过ELISA的方法测定鼠源抗体与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力结果。
图7为通过ELISA的方法测定鼠源抗体抑制由IL1β诱导的MRC5细胞分泌IL-6的结果图。
图8为鼠源抗体19E4、18H11以及9D5对小鼠的行为学的影响结果。与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与阳性药组比较，ΔP<0.01；n＝8(正常组n＝7)。
图9为鼠源抗体19E4、18H11以及9D5对小鼠的膝关节肿胀的影响结果。与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01；与阳性药组比较，ΔP<0.01；与18H11组比较，▲P<0.05；n＝8(正常组n＝7)。
图10为通过ELISA的方法测定人源化抗体与抗原IL1β结合亲和力的结果。
图11为通过ELISA的方法测定人源化抗体与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力结果。
图12为通过ELISA的方法测定人源化抗体抑制由IL1β诱导的MRC5细胞分泌IL-6的结果图。
图13为结合人IL-1β抗体18H11 H1L1和18H11对Lenti-IL-1β-NIH/3T3诱导的小鼠膝关节炎模型小鼠病理性行为的影响结果。
图14为结合人IL-1β抗体18H11 H1L1和18H11对Lenti-IL-1β-NIH/3T3诱导的小鼠膝关节炎模型小鼠膝关节面积的影响结果。
图15为各突变抗体SDS-PAGE蛋白电泳结果。
图16为各突变抗体及18H11 H1L1(WT)与IL1β结合的EC50。
图17为测定抗体抑制由IL-1β诱导MRC-5细胞的IL-6分泌活性。
图18为测定各样品与IL-1β结合亲和力。
图19为测定各样品抑制由IL-1β诱导MRC-5细胞分泌IL-6的活性。
图20为18H11-Hu-C53A与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力检测。
图21为各不同剂量抗体对鼠IL-6分泌的抑制作用。
图22为ELISA的方法测定18H11-Hu-C53A的跨种属免疫反应性。
图23为18H11-Hu-C53A对家族成员蛋白IL-1alpha、IL-1R2和IL-1RA的选择性的测定。
图24-图27为18H11-Hu-C53A对IL-1β的结合表位确定。
图24为18H11-Hu-C53A与IL-1β-A1-F99-His和IL-1β-A1-W120-His的亲和力；
图25显示18H11-Hu-C53A与第111-115位氨基酸的结合力测定；
图26显示18H11-Hu-C53A与第116-120位氨基酸的结合力测定；
图27显示18H11-Hu-C53A与第120-124位氨基酸的结合力测定。
具体实施方式
实施例1抗原及候选抗体的制备
1.1IL1β-hFc和IL1RI-his的制备
(1)将人源IL1-beta(NCBI Reference Sequence:NP_000567.1)氨基酸序列与TEV-hIgG1Fc(hFc:Ig gamma-1chain C region，ACCESSION：P01857，106-330)进行融合设计如下(IL1b-TEV-hIgG1Fc)：
氨基酸序列：(SEQ ID NO：23)
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSSKLENLYFQGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
其中，ENLYFQG为TEV酶切识别位点。
(2)将人源IL1RI(1-332)(NCBI Reference Sequence:NP_000868.1)氨基酸序列与His X6 tag进行融合设计如下(IL1RI(1-332)-His)：
氨基酸序列：(SEQ ID NO：24)
MKVLLRLICFIALLISSLEADKCKEREEKIILVSSANEIDVRPCPLNPNEHKGTITWYKDDSKTPVSTEQASRIHQHKEKLWFVPAKVEDSGHYYCVVRNSSYCLRIKISAKFVENEPNLCYNAQAIFKQKLPVAGDGGLVCPYMEFFKNENNELPKLQWYKDCKPLLLDNIHFSGVKDRLIVMNVAEKHRGNYTCHASYTYLGKQYPITRVIEFITLEENKPTRPVIVSPANETMEVDLGSQIQLICNVTGQLSDIAYWKWNGSVIDEDDPVLGEDYYSVENPANKRRSTLITVLNISEIESRFYKHPFTCFAKNTHGIDAAYIQLIYPVTHHHHHH
(3)将上述设计的融合蛋白(IL1b-TEV-hIgG1Fc和IL1RI(1-332)-His)所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化(IL1b-TEV-hIgG1Fc N端需要加信号肽)，并委托金斯瑞公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-IL1b-TEV-hIgG1Fc和pUC57simple-IL1RI(1-332)-His质粒。
(4)将上述两个质粒进行酶切后(Xba I和BamH I)，电泳回收得到基因片段IL1b-TEV-hIgG1Fc和IL1RI(1-332)-His分别与pcDNA3.1线性化载体(XbaI&BamHI)进行连接反应重组构建获得pcDNA3.1-IL1b-TEV-hIgG1Fc和pcDNA3.1-IL1RI(1-332)-His质粒。
(5)将上面构建的两个重组质粒分别转染FreeStyleTM293-F Cells细胞(Invitrogen)7天后，将培养液进行高速离心(4000rpm 20min)、微孔滤膜抽真空过滤(0.45um微孔滤膜)，根据厂家提供的操作方法分别采用Protein A柱和Ni柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTA Purifier10,GE)进行纯化，得到纯化的IL1b-TEV-hIgG1Fc和IL1RI(1-332)-His融合蛋白。
实验结果如图1和图2。图1是IL1β-hFc(IL1b-TEV-hIgG1Fc)纯化结果图，显示IL1β-hFc蛋白用Protein A柱(HiTrap Protein A HP，GE)富集纯化后洗脱，得到的蛋白发生部分聚体，回收洗脱样品浓缩换液，-80℃保存。图2是IL1RI(1-332)-HIS培养上清纯化结果图，IL1RI(1-332)-HIS蛋白用Ni Sepharose excel柱(GE HealthcareLife Sciences)纯化后洗脱，回收洗脱样品浓缩换液，-80℃保存。
1.2IL1β-his的制备
(1)将人源IL1-beta(NCBI Reference Sequence:NP_000567.1)氨基酸序列与HisX6 tag进行融合设计如下(IL1b-His)：
氨基酸序列：(SEQ ID NO：25)
MAPVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSSHHHHHH
(2)将上述设计的融合蛋白所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，并委托金斯瑞公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-IL1b-His质粒。
(3)将上述质粒进行酶切后(Nco I和Xho I)，电泳回收得到基因片段并与pET28a线性化载体(NcoI&XhoI)进行连接反应重组构建获得pET28a-IL1b-His质粒。
(4)将上面构建好的质粒转化BL21(DE3)感受态获得表达菌株，挑克隆鉴定正确后扩大培养。OD值达到0.8-1.0时，加入终浓度1mM IPTG(Amresco)16度诱导20h；离心收菌，用buffer A(50mM Tris-HCl,300mM NaCl,10mM Imidazole,5mM B-ME,10％glycerol,pH8.0(控内毒素))重悬菌体再高压破碎，高速离心1h，0.45μm微孔滤膜抽真空过滤获得上清。根据厂家提供的操作方法采用Ni亲和层析柱HisTrap FF(蛋白纯化液相色谱系统/AKTAPurifier 10,GE)进行纯化，得到纯化的IL1b-His融合蛋白。
实验结果如图3IL1b-His纯化结果图。IL1b-His蛋白用Ni亲和层析柱富集纯化后洗脱，回收洗脱样品浓缩换液，-80℃保存，后续QC检测结果显示没有聚体出现。
1.3IL1β-his-bio和IL1RI-his-bio的制备
(1)准备好待标记的蛋白：
IL-1β-His:分子量为18572.14g/mol，浓度1.068mg/ml，体积1000μL，总量为1068μg,制备方法见实施例1.2。
IL1RI(1-332)-His：分子量为36859g/mol，浓度1.22mg/ml，体积1065μL，总量为1.3mg,制备方法见实施例1.1。
(2)将商购的生物素(分子量为557g/mol，Thermo)粉末放置室温平衡约15min，准确称量3mg，溶解于540μL的去内毒素的水中，浓度为5560ng/ml。混匀备用。
(3)计算需要加入到蛋白中的生物素的体积(μL)：
需要的生物素的体积＝(待标记的蛋白的ng数/待标记的蛋白的分子量)*20*557/5560ng/ml。
(4)分别加入相应体积的5560ng/ml的生物素溶液到待标记的2种蛋白的溶液中，冰上静置1h。
(5)通过HiTrap Desalting柱(GE)，在蛋白纯化仪AKTA Purifier UPC 100(GE)中进行换液成PBS，并去掉游离的生物素，将蛋白分装，液氮速冻后进入-80℃保存。
1.4阳性对照抗体PcAb的制备
(1)根据已有的人源IL1-beta(NCBI Reference Sequence:NP_000567.1)蛋白序列及参照专利US8273350 B2抗人IL1-beta的抗体序列，PcAb抗体序列如下：
PcAb的重链可变区氨基酸序列：(SEQ ID NO：26)QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSVYGMNWVRQAPGKGLEWVAIIWYDGDNQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNGLRAEDTAVYYCARDLRTGPFDYWGQGTLVTVSS
PcAb的重链恒定区氨基酸序列：(SEQ ID NO：27)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
PcAb的轻链可变区氨基酸序列：(SEQ ID NO：28)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAAAYYCHQSSSLPFTFGPGTKVDIK
PcAb的轻链恒定区氨基酸序列：(SEQ ID NO：29)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(2)将上述的抗体序列所对应的氨基酸序列进行密码子人工优化，并委托金斯瑞公司合成优化后的DNA，克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，获得pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL质粒。
(3)将质粒pUC57simple-PCABH，pUC57simple-PCABL进行酶切后(Xba I和BamHI)，电泳回收得到的基因片段PCABH，PCABL并与pcDNA3.1载体进行连接反应重组构建获得pcDNA3.1-PCABH，pcDNA3.1-PCABL。
(4)将上面构建的重组质粒pcDNA3.1-PCABH，pcDNA3.1-PCABL转染FreeStyleTM293-F细胞7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用Protein A柱(蛋白纯化液相色谱系统/AKTA Purifier 10,GE)进行纯化，得到纯化后的抗体PCAB。
实验结果如图4PcAb纯化结果图。PcAb蛋白用Protein A柱富集纯化后洗脱，回收洗脱样品浓缩换液，-80℃保存。
1.5鼠源抗体的制备
(1)根据抗原与佐剂的体积为1:1的比例对免疫原IL1β-his(制备方法见实施例1.2)进行乳化，首次免疫使用弗氏完全佐剂(FCA，Sigma，F5881-10×10ml)进行乳化抗原；相隔2周开始第二次免疫，使用弗氏不完全佐剂(FIA，Sigma，F5881-10×10ml)乳化抗原，皮下5点注射，每只小鼠(BALB/C小鼠，SPF级，雌性，6周龄)注射的抗原的量为50μg，每个注射点注射的体积为50μL。
(2)在第二次免疫后10天，对小鼠剪尾采集少量血液样本进行血清效价检测，经间接ELISA检测血清效价滴度达到1:81000或者以上，小鼠进行加强免疫。
(3)处死经过加强免疫的小鼠，解剖分离出脾脏并在细胞筛网上研磨制备成单细胞悬液，与骨髓瘤细胞SP2/0-14Ag以5:1的比例混合，离心敲散细胞团后在37℃水浴中缓慢滴加PEG/DMSO SOLUTION(Sigma)作用完成细胞融合，常规离心(1500rpm)处理后用含1×HAT(50×，Sigma)，15％胎牛血清(Gibco)，1×青链霉素的IMDM培养基(Hyclone)进行重悬并且铺到96孔细胞培养板中培养。
(4)用间接ELISA直接对96孔细胞培养板进行筛选，初筛得到的阳性克隆孔用间接ELISA方法进行第二轮三点稀释筛选，以及第三轮用原液进行竞争ELISA筛选，最终筛选得到目的阳性克隆。
(5)细胞融合筛选得到的目的阳性克隆用有限稀释法进行两轮亚克隆，每一轮亚克隆都用间接ELISA方法进行筛选，最后得到稳定细胞株。
(6)获得的稳定细胞株用含低IgG胎牛血清的IMDM培养基进行培养，最后细胞培养基上清经过纯化得到单克隆抗体。
实施例2鼠源抗体的测试
2.1鼠源抗体与抗原IL1β结合亲和力测试(ELISA)
(1)将Streptavidin(1.0mg/ml,生工)用CBS(0.05M包被碳酸缓冲盐溶液)稀释成2μg/ml，50μL/孔进行包被，4℃过夜孵育。PBST洗涤1次。
(2)加入0.2μg/ml的IL-1β-his-bio(制备方法见实施例1.3)，50μL/孔，37℃30min。PBST(洗板液)洗涤3次。
(3)加入1％BSA in PBS(BSA干粉1g，加入PBS将溶液定容到100ml)进行封闭，300μL/孔，37℃30min。PBST洗涤3次。
(4)将抗体(鼠源抗体制备方法见实施例1.5，对照抗体PcAb制备方法见实施例1.4)稀释成1μg/ml，再3倍往下稀释共7个浓度梯度，稀释液为零点对照。50μL/孔，37℃30min。PBST洗涤3次。
5个鼠源抗体信息如下：
抗体名称 浓度(μg/ml)
KF021ZP4 9D5 2.17
KF021ZP4 18B1 1.56
KF021ZP4 18E1 1.5
KF021ZP4 18H11 0.4
KF021ZP4 19E4 0.14
(5)加入二抗HRP conjugated Goat Anti Mouse IgG(1:5000)(酶标二抗使用液配制：使用移液器取Goat Anti Mouse IgG(H+L),HRP二抗母液1μL，加入到5ml的1％BSA缓冲液中，振荡混匀。即1:5000稀释二抗，现配现用。)和HRP conjugated Goat Anti HumanIgG(1：5000)(酶标二抗使用液配制：使用移液器取Goat Anti Human IgG，HRP二抗母液1μL，加入到5ml的1％BSA缓冲液中，振荡混匀。即1:5000稀释二抗，现配现用。)，50μL/孔，37℃30min。PBST洗涤4次。
(6)每孔加入50μL TMB(Neogen)进行显色，室温遮光反应5min后用终止液终止反应，450nm处读数。
实验结果见表1和图5。结果表明：KF021ZP4 9D5，KF021ZP4 18B1，KF021ZP4 18E1，KF021ZP4 18H11，KF021ZP4 19E4与IL-1β-his-bio均有结合。
表1鼠源抗体与抗原IL1β结合亲和力测试结果
抗体名称 结合EC<sub>50</sub>(nM)
KF021ZP4 9D5 0.036
KF021ZP4 18B1 1.013
KF021ZP4 18E1 0.833
KF021ZP4 18H11 0.174
KF021ZP4 19E4 0.726
KF021ZP4 PcAb 0.062
2.2鼠源抗体与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力测试(ELISA)
(1)将IL-1β-hFc(制备方法见实施例1.1)稀释成4μg/ml，50μL/孔，4℃孵育过夜。PBST洗涤1次。
(2)加入1％BSA in PBS进行封闭，300μL/孔，37℃30min。PBST洗涤3次。
(3)将抗体(同实施例2.1)稀释成2μg/ml(终浓度为1μg/ml)，再3倍往下稀释共7个浓度梯度，稀释液为零点对照。50μL/孔，室温孵育10min。加入0.08μg/ml的IL1RI(1-332)-his(终浓度为0.04μg/ml，制备方法见实施例1.1)，50μL/孔，与抗体充分混匀后放入37℃孵育30min。PBST洗涤3次。
(4)加入二抗Mouse anti His,HRP conjugated(1:8000)，50μL/孔，37℃30min。PBST洗涤4次。
(5)每孔加入50μL TMB进行显色，室温遮光反应5min后用终止液终止反应，450nm处读数。
实验结果见表2和图6。结果表明：KF021ZP4 9D5，KF021ZP4 18B1，KF021ZP4 18E1，KF021ZP4 18H11，KF021ZP4 19E4能有效地阻断IL-1β-hFc与IL1RI(1-332)-his的结合。
表2鼠源抗体与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力测试结果
Figure BDA0003000658000000121
Figure BDA0003000658000000131
2.3鼠源抗体抑制由IL1β诱导细胞的IL6分泌检测
(1)将生长状态良好的MRC-5细胞(中国科学院细胞中心)用胰酶(Gibco)消化后，计数，接种至96孔板中，生长过夜。
(2)按照试验要求设计阴性对照组(MRC-5细胞+IL-1β+mIgG或MRC-5细胞+IL-1β+hIgG)、阳性对照组(MRC-5细胞+IL-1β+PcAb)、试验组(MRC-5细胞+IL-1β+不同浓度的抗体)，将细胞置于37度细胞培养箱培养24h。
其中：
IL-1β(Sino，浓度588nM)；
阳性抗体PcAb(制备方法见实施例1.4，浓度3.4mg/mL)；
抗体9D5(制备方法见实施例1.5，浓度2.17mg/mL)；
抗体18E1(制备方法见实施例1.5，浓度1.8mg/mL)；
抗体18B1(制备方法见实施例1.5，浓度1.56mg/mL)；
抗体18H11(制备方法见实施例1.5，浓度0.4mg/mL)；
抗体19E4(制备方法见实施例1.5，浓度0.14mg/mL)；
(3)24h后取细胞上清进行IL-6检测，用ELISA试剂盒(达科为)进行定量检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。
IL-6的检测结果见图7。实验结果表明：IL-1β能够诱导MRC-5细胞分泌IL-6，抗体9D5、18E1、18B1、18H11和19E4能够抑制IL-1β，有效地阻断IL-1β刺激MRC-5细胞分泌IL-6这一过程。其中，9D5、18H11和19E4在阻断由IL-1β诱导的IL-6分泌的效果更优。
选择亲和力更优的9D5、18H11和19E4三个鼠源抗体进行体内药理研究。
实施例3鼠源抗体体内药理研究
主要材料：
1)实验动物
Balb/c小鼠：SPF级，雌性，4-6周龄，29只，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证：11400700113776。
Balb/c小鼠：SPF级，雌性，6-8周龄，18只，来源：广东省医学实验动物中心，动物质量合格证：44007200023548。
2)细胞
NIH/3T3(ATCC，细胞代数为第15代)
Lenti-IL-1β-NIH/3T3(本实验室转染，细胞代数为第11代)
3)抗体
阴性对照：Anti-HEL(Akesobio)
阳性对照：PcAb
候选抗体：9D5、18H11、19E4
氯化钠注射液(浙江天瑞药业有限公司)
实验步骤：
1)药物配制
抗体Anti-HEL2mg/ml(用于模型组)：取原液(浓度：4.88mg/ml)0.984ml(4.8mg)加入到1.416ml氯化钠注射液中，共2.4ml。抗体PcAb 2mg/ml(用于阳性药组)：取原液(浓度：7.65mg/ml)0.627ml(4.8mg)加入到1.773ml氯化钠注射液中，共2.4ml。抗体9D5 2mg/ml(用于9D5组)：取原液(浓度：5.70mg/ml)0.842ml(4.8mg)加入到1.558ml氯化钠注射液中，共2.4ml。抗体18H11 2mg/ml(用于18H11组)：取原液(浓度：3.31mg/ml)1.450ml(4.8mg)加入到0.950ml氯化钠注射液中，共2.4ml。抗体19E4 2mg/ml(用于19E4组)：取原液(浓度：6.26mg/ml)0.767ml(4.8mg)加入到1.633ml氯化钠注射液中，共2.4ml。
2)动物分组
将47只小鼠根据体重随机分成5组，分别为：正常组(氯化钠注射液，10ml/kg，n＝7)，模型组(Anti-HEL，20mg/kg，n＝8)，阳性药组(PcAb，20mg/kg，n＝8)，19E4组(19E4，20mg/kg，n＝8)，18H11组(18H11，20mg/kg，n＝8)，9D5组(9D5，20mg/kg，n＝8)。
3)给药：尾静脉注射给药。
4)细胞接种
将Balb/c小鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后，在小鼠左侧膝关节部位接种相应的细胞悬液，其中正常组接种NIH/3T3(细胞接种数量为5万个/只)，其他组别(模型组、阳性药组、19E4组、18H11组以及9D5组)接种Lenti-IL-1β-NIH/3T3(细胞接种数量为5万个/只)。
5)体重测量：接种后第3天和第5天对小鼠进行体重测量。
6)行为学评分和膝关节测量
接种后第5天，对小鼠进行行为学评分，同时安乐死处理小鼠，进行解剖，用游标卡尺测量膝关节白膜的长度与宽度。
行为学评分标准：
0分：小鼠活动正常，可双侧活动。
1分：小鼠行走异常，可双侧活动。
2分：小鼠患肢短暂触地，可双侧活动。
3分：小鼠患肢不能触地，单侧活动。
实验结果
1)抗体19E4、18H11以及9D5对小鼠的行为学的影响
实验结果如图8。模型组相对于正常组小鼠有明显的行为异常(P<0.01)。给药后，与模型组比较，阳性药可明显降低小鼠行为异常(P<0.01)，3个候选抗体(19E4、18H11、9D5)同时明显降低小鼠行为异常现象(P<0.01)。与阳性药组相比，19E4降低小鼠行为异常的药效劣于阳性药组(P<0.05)，18H11和9D5降低小鼠行为异常的药效与阳性药相当(P>0.05)；18H11和9D5降低小鼠行为异常药效相当(P>0.05)。
2)抗体19E4、18H11以及9D5对小鼠的膝关节肿胀的影响
实验结果如图9。模型组引起小鼠膝关节肿胀面积明显高于正常组(P<0.01)。给药后，阳性药明显降低小鼠吸膝关节肿胀面积(P<0.01)，3个候选抗体(19E4、18H11、9D5)同时明显降低小鼠膝关节肿胀面积(P<0.01)。与阳性药药效相比，19E4降低小鼠膝关节肿胀面积比阳性药差(P<0.01)，18H11降低小鼠膝关节肿胀面积与阳性药等效(P>0.05)，9D5降低小鼠膝关节肿胀面积比阳性药弱(P<0.05)。18H11降低小鼠关节肿胀程度优于9D5(P<0.05)。
3)抗体19E4、18H11以及9D5对小鼠的体重的影响
实验结果见表3，模型组小鼠体重比正常组明显下降(P<0.01)。阳性药对小鼠体重影响不明显，(P<0.01)；19E4降低小鼠体重比模型组稍弱；18H11及9D5对小鼠体重影响不明显，与阳性药等效(P>0.05)；18H11和9D5对小鼠体重的影响等效(P>0.05)。
表3 19E4、18H11以及9D5对小鼠的体重的影响(±SD，n＝8)
Figure BDA0003000658000000151
与正常组比较，**P<0.01，*P<0.05；与模型组比较，##P<0.01，#P<0.05；与阳性组比较，ΔΔP<0.01；n＝8(正常组n＝7)。
本实验结果表明，候选抗体19E4、18H11、9D5都可以明显降低IL-1β诱导的小鼠关节炎病变，其中候选抗体18H11和9D5与阳性对照抗体PcAb药效相当。综合小鼠行为学评分和膝关节肿胀的实验数据，在本实验条件下18H11比9D5优效。
经测序，候选抗体18H11、19E4、9D5的序列信息如下：
18H11重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
19E4重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：30所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示。
9D5重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：36所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示。
实施例4重组抗体的制备和亲和力测试
4.1重组抗体18H11(RE)、19E4(RE)、9D5(RE)的制备
将18H11、19E4、9D5的重链cDNA序列(重链可变区序列如SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:35所示；恒定区序列为immunoglobulin gamma 2b heavy chainprecursor[Mus musculus]140-475，ACCESSION:ACX70084.1)和轻链cDNA序列(轻链可变区序列如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:37所示；恒定区为antibody kappa lightchain,partial[Mus musculus],106-213GenBank:BAB33404.1)分别克隆到pUC57simple(金斯瑞公司提供)载体中，分别获得pUC57simple-18H11H/19E4H/9D5.12H和pUC57simple-18H11L/19E4L/9D5.12L质粒。
分别将质粒pUC57simple-18H11H/19E4H/9D5.12H和pUC57simple-18H11L/19E4L/9D5.12L进行酶切(HindIII&EcoRI)，电泳回收得到的重链轻链分别亚克隆到pcDNA3.1载体中，提取重组质粒共转染293F细胞。细胞培养7天后，将培养液通过高速离心、微孔滤膜抽真空过滤后，上样至HiTrap MabSelectSuRe柱，用Elution Buffer一步洗脱蛋白，回收目标样品并用HiTrap Desalting换液至PBS。
4.2重组抗体的亲和力测试
参照实施例2.1和2.2的方法，开展重组抗体18H11(RE)、19E4(RE)、9D5(RE)与抗原IL1β结合亲和力测试(ELISA)，以及重组抗体与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力测试(ELISA)。
测试结果表明：重组抗体18H11(Re)，19E4(Re)和9D5(Re)与IL1β均有结合，具有与鼠源抗体18H11，19E4和9D5及阳性对照抗体PCAb相当的结合活性；重组抗体18H11(Re)，19E4(Re)和9D5(Re)均能有效地阻断IL1β与IL1RI的结合，其中18H11(Re)与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力与鼠源抗体18H11及阳性对照抗体PCAb相当。
实施例5人源化抗体的构建
本发明根据鼠源抗体18H11的序列，将重链和轻链可变区被分为14个结构上有意义的肽段，并与已知的结构在PDB数据库的抗体对应段相比较。从多个序列比对中选定出具有最高的序列同源性的那个对应的段来模拟这一段的结构。然后将所有模拟的结构段组合来构建可变区的结构。通过对该模型进行多轮的能量最小化来获得一个可靠的抗体结构模型。
在建立结构模型的同时，用鼠源的VH和VL区氨基酸序列在数据库中与人源的种系序列进行比较，选择一个具有最高同源性的序列。通过在上述获得的三维立体结构模型中对每个存异的氨基酸进行了非常仔细地检查，确定其是否对结构完整性和CDR区有潜在影响。人源序列中的一致氨基酸也被考虑进去以确保序列的最大人源化。在确定最终序列前，还搜寻了潜在糖基化位点并在不影响抗体结合力的情况下去除。最终人源化的基因命名为18H11 H1、18H11 H2、18H11 L1、18H11 L2等(抗体恒定区序列，来自NCBI的数据库，重链恒定区为Ig gamma-1chain C region，ACCESSION:P01857，轻链恒定区为Ig kappa chain Cregion，ACCESSION:P01834)。
人源化抗体18H11 H1L1的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，核苷酸序列如SEQID NO：18所示。
人源化抗体18H11 H2L2的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，核苷酸序列如SEQID NO：20所示。
人源化抗体18H11 H3L3的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，核苷酸序列如SEQID NO：22所示。
其中，重链互补决定区的氨基酸序列为HCDR1：GYLFTGYY(SEQ ID NO：1)、HCDR2：ISCYNGDT(SEQ ID NO：2)和HCDR3：SRSDYYGTSDY(SEQ ID NO：3)，轻链互补决定区的氨基酸序列为LCDR1：SSVSY(SEQ ID NO：4)、LCDR2：TTS(SEQ ID NO：5)和LCDR3：QQRIIYPPT(SEQ IDNO：6)。
实施例6人源化抗体的测试
6.1人源化抗体与抗原IL1β结合亲和力测试(ELISA)
将IL-1β-his用CBS稀释包被，4℃过夜孵育。PBST洗涤1次。加入1％BSA in PBS进行封闭，37℃30min。PBST洗涤3次。将抗体(表4)进行梯度稀释，37℃30min。PBST洗涤3次。加入二抗HRP conjugated Goat Anti Human IgG(1：5000)(酶标二抗使用液配制：使用移液器取Goat Anti Human IgG，HRP二抗母液1μL，加入到5ml的1％BSA缓冲液中，振荡混匀。即1:5000稀释二抗，现配现用。)，37℃30min。PBST洗涤4次。每孔加入50μLTMB进行显色，室温遮光反应5min后用终止液终止反应，450nm处读数。
表4三个人源化抗体信息
抗体名称 浓度(mg/ml)
KF021ZP4 18H11 H1L1 5.0
KF021ZP4 18H11 H2L2 1.5
KF021ZP4 18H11 H3L3 5.24
实验结果见表5和图10。结果表明：18H11 H1L1，18H11 H2L2，18H11 H3L3与IL-1β-his均有结合。
表5人源化抗体与抗原IL1β结合亲和力测试结果
抗体名称 结合EC<sub>50</sub>(nM)
18H11 H1L1 0.046
18H11H2L2 0.074
18H11H3L3 0.191
KF021ZP4 PCAb 0.169
6.2人源化抗体与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力测试(ELISA)
将IL-1β-hFc用CBS稀释包被，4℃孵育过夜。PBST洗涤1次。加入1％BSA in PBS进行封闭，37℃30min。PBST洗涤3次。将抗体(表4)进行梯度稀释室温孵育10min，加入IL1RI(1-332)-his，与抗体充分混匀后放入37℃孵育30min。PBST洗涤3次。加入Mouse anti His,HRP conjugated(cwbio)，37℃30min。PBST洗涤4次。每孔加入50μL TMB进行显色，室温遮光反应5min后用终止液终止反应，450nm处读数。
实验结果见表6和图11。结果表明：18H11 H1L1，18H11 H2L2，18H11 H3L3能有效地阻断IL-1β-hFc与IL1RI(1-332)-his的结合。
表6人源化抗体与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力测试结果
抗体名称 结合EC<sub>50</sub>(nM)
18H11 H1L1 0.520
18H11H2L2 0.683
18H11H3L3 1.251
KF021ZP4 PCAb 0.516
6.3人源化抗体抑制由IL1β诱导细胞的IL6分泌检测
(1)将生长状态良好的MRC-5细胞(中国科学院细胞中心)用胰酶(Gibco)消化后，计数，接种至96孔板中，生长过夜。
(2)IL-1β和PcAb以及待检测的抗体37度孵育20min，加到细胞作用24小时。其中：
IL-1β(Sino，浓度588nM)；
阳性抗体PcAb(浓度3.4mg/mL)；
对照抗体hIgG(浓度4.88mg/mL)
待测抗体18H11H1L1(浓度5mg/mL)
待测抗体18H11H2L2(浓度1.5mg/ml)；
(3)24h后取细胞上清进行IL-6检测，用ELISA试剂盒(达科为)进行定量检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。
IL-6的检测结果见图12。实验结果表明：IL-1β能够诱导MRC-5细胞分泌IL-6，抗体18H11H1L1和18H11H2L2能够抑制IL-1β，有效地阻断IL-1β刺激MRC-5细胞分泌IL-6这一过程。其中，抗体18H11H1L1抑制由IL1β诱导细胞的IL6分泌效果较阳性对照抗体更优，抗体18H11H2L2与阳性对照抗体相当。
6.4人源化抗体18H11 H1L1的亲和力检测(Fortebio Kinetics)
采用Fortebio Octet Qke分子相互作用仪检测抗体与IL1β的亲和力，使用EDC/sulfo-NHS激活AR2G传感器，时间300s。5μg/mL抗体(10mM乙酸钠，pH6.0稀释)固定在传感器表面，时间300s。传感器使用1M乙醇胺，pH8.5封闭，时间300s。传感器在PBST缓冲液中平衡，时间300s。固定在传感器上的抗体与IL1β-his结合，IL1β-his浓度为1.56-100nM(使用PBST两倍梯度稀释)，时间300s，抗原抗体在PBST缓冲液中解离，时间600s。数据以1:1模型拟合分析，得到亲和力常数。
实验结果见表7。结果表明：人源化抗体18H11H1L1的亲和力结果优于阳性对照抗体。
表7人源化抗体18H11 H1L1的亲和力结果
抗体名称 KD(M) kon(1/Ms) kon Error kdis(1/s) kdis Error Rmax(nM)
KF021ZP4 18H11 H1L1 1.42E-10 3.36E+05 3.79E+03 4.78E-05 5.44E-06 0.1380-0.1905
KF021ZP4 PCAB 1.79E-10 5.89E+05 7.84E+03 1.05E-04 5.97E-06 0.1289-0.1756
实施例7人源化抗体的体内药理研究
本实验目的是检测人源化抗体18H11 H1L1、鼠源抗体18H11对Lenti-IL-1β-NIH/3T3诱导的小鼠膝关节炎模型的治疗作用。
主要材料
1)实验动物
Balb/c小鼠；级别：SPF级；年龄：5-7周；性别：雌性；体重：15-20g；数量：40只；来源：广东省医学实验动物中心；动物质量合格证号：44007200032490。
2)细胞
NIH/3T3：来源：ATCC；细胞代数：第24代。
Lenti-IL-1β-NIH/3T3：来源：Akesobio；细胞代数：第21代。
3)抗体
阴性对照：Anti-HEL(Akesobio)
阳性对照：PcAb
候选抗体：18H11 H1L1、18H11
氯化钠注射液(广东利泰制药股份有限公司)
实验方法
1)细胞培养
从液氮中取出NIH/3T3(P19)、Lenti-IL-1β-NIH/3T3(P16)细胞，在37℃水浴中快速融化复苏，将细胞悬液加入到含有10％FBS(Gibco)和1％Pen/Strep(Gibco)的DMEM完全培养基(Gibco)中，在37℃，5％CO2培养箱中培养；接着按细胞的常规培养方法对NIH/3T3、Lenti-IL-1β-NIH/3T3进行传代培养，每次传代对Lenti-IL-1β-NIH/3T3细胞添加Blasticidin SHCl(Gibco)进行筛选。
2)IL-1β检测
根据Human IL-1βPrecoated ELISA kit(深圳市达科为生物工程有限公司)的说明书检测Lenti-IL-1β-NIH/3T3细胞上清液的IL-1β含量。
3)分组和给药
动物分组：40只Balb/c小鼠称重后随机分为5组，即Normal组、Isotype Control组、PcAb组、18H11 H1L1组、18H11组，每组8只。
剂量设计：给药剂量：10mg/kg；给药容量：10ml/kg；给药浓度：1mg/ml；给药途径：尾静脉注射；给药频率：一次，接种前给药。
药物配制：
模型组：精确量取Anti-HEL(4.9mg/ml)0.490ml，用1.91ml生理盐水稀释，备用；
PcAb组:精确量取KF021ZP4 PcAb(4.75mg/ml)0.505ml，用1.895ml生理盐水稀释，备用；
18H11 H1L1组:精确量取KF021ZP4 18H11 H1L1(3.16mg/ml)0.759ml，用1.641ml生理盐水稀释，备用；
18H11组:精确量取KF021ZP4 18H11(3.37mg/ml)0.712ml，用1.688ml生理盐水稀释，备用；
动物给药：细胞接种前，根据小鼠的体重，模型组尾静脉注射Anti-HEL，PcAb组尾静脉注射PcAb，18H11 H1L1组尾静脉注射18H11 H1L1，18H11组尾静脉注射18H11，正常组尾静脉注射等体积生理盐水。
4)细胞收集
当NIH/3T3、Lenti-IL-1β-NIH/3T3细胞达到所需接种数量时，开始收集细胞(细胞密度不应超过培养瓶面积的80％)。在生物安全柜内，吸掉旧的培养基，PBS清洗一次后加入适量的0.05％Trypsin-EDTA(1x)(Gibco)室温消化1分钟，然后加入含有10％FBS的DMEM完全培养基终止消化，细胞悬液于1200rpm/min离心4分钟，去上清，使用无血清的DMEM培养基重悬并计数，将细胞浓度调整至200万/ml，置于冰上备用。
5)造模(细胞接种)
小鼠麻醉后，正常组接种NIH/3T3细胞于小鼠右侧膝关节腔内，25μl/只，即接种细胞数5万/只，其余各组接种Lenti-IL-1β-NIH/3T3细胞于小鼠右侧膝关节腔内，25μl/只，即接种细胞数5万/只，接种后对膝关节处伤口进行缝合，并涂拭稀释20倍的青霉素，防止伤口感染。6)行为学评分以及膝关节面积的测量
细胞接种后第5天，对各组小鼠进行行为学评分，行为学评分标准为：0分，小鼠活动正常，可双侧活动；1分，小鼠行走异常，可双侧活动；2分，小鼠患肢短暂触地，可双侧活动；3分，小鼠患肢不能触地，单侧活动；评分后各组小鼠安乐死并用游标卡尺测量小鼠患肢膝关节滑膜的长(mm)和宽(mm)，并计算出膝关节面积(mm2)。
7)实验统计分析方法
数据以均数±标准差
Figure BDA0003000658000000211
表示，组间比较采用GraphPad统计学处理软件处理后，进行单因素方差分析评价结果，P<0.05有显著性差异，P<0.01有非常显著性差异。
实验结果
1)抗体18H11 H1L1、18H11对小鼠行为学评分
如图13。与正常组相比，模型组小鼠病理性的行为异常明显增加(P<0.01)。给药后，阳性药组(PcAb组)、18H11 H1L1组和18H11组均能够有效抑制小鼠患肢的异常行走行为(P<0.01)；18H11 H1L1、18H11药效与阳性药相当。
2)抗体18H11 H1L1、18H11对小鼠膝关节面积的影响
如图14。与正常组相比，模型组小鼠膝关节面积明显增加(P<0.01)，膝关节肿胀。给药后，阳性药组(PcAb组)、18H11 H1L1组和18H11组均能够有效抑制小鼠患肢膝关节的肿胀面积(P<0.01)；18H11 H1L1、18H11药效与阳性药相当。
本实验结果表明，在Lenti-IL-1β-NIH/3T3建立的膝关节炎模型中，PcAb、18H11H1L1、18H11三个抗体在剂量10mg/kg下,均能明显改善小鼠患肢的行走行为以及明显减少患肢膝关节的肿胀面积；18H11 H1L1和18H11抗体的药效与阳性药相当。
实施例8突变抗体的制备
以18H11 H1L1的重链为模板，设计引物将重链的第53位半胱氨酸(C，位于重链互补决定区H-CDR2内)进行PCR分别突变成丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)。向PCR结束后的反应体系中加入0.5μLDpn I酶(New England BioLabs,Cat#R0176L)，置于37℃中反应消化30min，反应完成后在冰上放置5min，开始转化，次日挑菌、测序，并选取正确突变的克隆，分别与18H11 H1L1的轻链共转染293-F细胞，7天后，将培养液进行高速离心、微孔滤膜抽真空过滤，根据厂家提供的操作方法采用Protein A柱进行纯化，获得各突变抗体。各突变抗体SDS-PAGE蛋白电泳结果如图15所示，WT即18H11 H1L1。
实施例9突变抗体的亲和力测试(ELISA)
参照实施例6.1的方法，开展各突变抗体与抗原IL1β结合亲和力测试。
各突变抗体及18H11 H1L1(WT)与IL1β结合的EC50分别如图16和对应表所示。
实施例10突变抗体抑制由IL-1β诱导细胞的IL-6分泌检测
实验方法参照实施例6.3，我们根据实施例9的实验结果选取与IL-1β结合亲和力较好的抗体，测定其抑制由IL-1β诱导MRC-5细胞的IL-6分泌活性。
如图17所示，结果表明相对于其他突变抗体，18H11-Hu-C53I(即C53I)和18H11-Hu-C53A(即C53A)抑制IL-1β诱导MRC-5细胞分泌IL-6的活性较好，IC50分别为2.416nM和2.323nM。
实施例11突变抗体的热稳定性检测
将18H11-Hu-C53I、18H11-Hu-C53A和18H11 H1L1样品置于40℃水浴锅作用28d，并分别于不同的时间点取样，在取完最后一个时间点的样品后，参照实施例6.1和6.3分别测定各样品与IL-1β结合亲和力及抑制由IL-1β诱导MRC-5细胞分泌IL-6的活性。
结果如图18所示，各样品的EC50见图中表格，我们可知样品于40℃水浴，从0d至28d，18H11 H1L1与IL-1β结合亲和力衰减约2.6倍，18H11-Hu-C53A衰减约1.4倍，18H11-Hu-C53I衰减约2.7倍。
如图19所示，结果表明18H11-Hu-C53I、18H11-Hu-C53A和18H11 H1L1(即18H11-Hu-WT)经40℃水浴，从0d至28d，18H11 H1L1抑制IL-1β诱导MRC-5细胞分泌IL-6的活性下降约2.9倍，18H11-Hu-C53I下降约6.2倍，18H11-Hu-C53A下降约1.5倍。各样品的IC50见图中表格。
综上可知，18H11-Hu-C53A的相对热稳定性优于18H11 H1L1和18H11-Hu-C53I。
实施例12 18H11-Hu-C53A与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力检测
参照实施例6.2的方法，开展突变抗体18H11-Hu-C53A与IL1RI竞争结合抗原IL1β的亲和力测试。
如图20所示，18H11 H1L1、18H11-Hu-C53A及PCAb阻断IL1β与IL1RI结合的IC50分别为0.028nM、0.028nM和0.030nM，表明18H11-Hu-C53A也能有效地阻断IL1β与IL1RI的结合，其活性与18H11 H1L1及阳性对照抗体PCAb相当。
实施例13 18H11-Hu-C53A的亲和力测试(Biacore)
通过Biacore测定18H11 H1L1、18H11-Hu-C53A及PCAb与IL1β的结合动力学参数，方法如下：采用捕获法，Protein A芯片(购自GE公司，批号10261132)捕获0.5μg/mL抗体，设置contact time(接触时间)为75s，flow rate(流速)为10μL/min，regeneration contacttime(再接触时间)为30s。抗原作为分析物，设置contact time(接触时间)为180s，dissociation time(解离时间)为900s，flow rate(流速)为30μL/min，regenerationcontact time(再接触时间)为30s。测试结果显示的各动力学参数如表8所示。
表8突变抗体18H11-Hu-C53A的亲和力结果
样品 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
PcAb 1.69E+06 1.04E-04 6.16E-11
18H11H1L1 8.18E+05 8.12E-05 9.93E-11
18H11-Hu-C53A 5.59E+05 9.81E-05 1.75E-10
实施例1418H11-Hu-C53A的体内药效测定
取适应性培养一周的Balb/c雌性小鼠(5-7周，15-20g)，按照体重平均分成7组，每组8只；腹腔注射抗体18H11-Hu-C53A，剂量如下：2.5mg/kg，0.5mg/kg，0.1mg/kg，对照组注射PBS或同亚型对照IgG。注射抗体24h后，对各小鼠皮下注射5μg的重组人IL-1β-His；并于注射IL-1β后的4h对各组小鼠采血；4℃分离血清，通过ELISA测定血清中鼠IL-6的表达水平，以确定各不同剂量抗体对鼠IL-6分泌的抑制作用。
结果如图21所示，与PBS组相比(阴性对照组，PBS作为对照，实际值为0)，18H11-Hu-C53A在2.5mg/kg剂量下对鼠IL-6分泌的抑制率高达91.06％，0.5mg/kg剂量下对鼠IL-6分泌的抑制率为73.11％，0.1mg/kg剂量下对鼠IL-6分泌的抑制率为29.46％。
实施例1518H11-Hu-C53A的跨种属免疫反应性的测定
本实施例通过ELISA的方法测定了18H11-Hu-C53A的跨种属免疫反应性。
将猕猴和大鼠的IL-1β蛋白即Macaca-IL-1β(NCBI Reference Sequence：NP_001270498.1)和Rat-IL-1β(NCBI Reference Sequence：NP_113700.2)按照0.2μg/孔包被96孔ELISA板，测定18H11-Hu-C53A对这两个种属IL-1β的交叉反应，其它具体实验方法参照实施例6.1。Macaca-IL-1β、Rat-IL-1β的制备方法参照实施例1.1。
结果如图22所示，表明18H11-Hu-C53A可以很好的识别猕猴的IL-1β蛋白，EC50为0.025nM而不能识别大鼠的IL-1β蛋白。
实施例1618H11-Hu-C53A对家族成员蛋白IL-1alpha、IL-1R2和IL-1RA的选择性的测定
将人的IL-1alpha、IL-1R2和IL-1RA蛋白(均购自Sino Biological公司，货号分别为10128-HNCH-20、10111-H08H-50和10123-HNAE-100)，按照0.2μg/孔包被96孔ELISA板，测定18H11-Hu-C53A对这些蛋白的选择性，其它具体实验方法参照实施例6.1。
结果如图23所示，表明18H11-Hu-C53A对IL-1R2和IL-1RA均无交叉反应，对IL-1α(IL-1alpha)的EC50为0.652nM，对IL-1β(IL-1beta)的EC50为0.026nM。这些结果表明18H11-Hu-C53A能特异性的识别人IL-1β。
实施例1718H11-Hu-C53A对IL-1β的结合表位确定
根据IL-1β(SEQ ID NO：23的第1-153位)的空间结构将其分成两个蛋白片段进行表达纯化，即IL-1β-A1-F99-His(第1位丙氨酸A至第99位苯丙氨酸F，C-端带有6×His标签)和IL-1β-A1-W120-His(第1位丙氨酸A至第120位色氨酸W，C-端带有6×His标签)。用包被液将IL-1β-A1-F99-His、IL-1β-A1-W120-His和IL-1β-WT-His(即IL-1β-his)分别稀释成0.5μg/mL，包被ELISA板，测定18H11-Hu-C53A与各蛋白的亲和力，具体方法参照实施例6.1。
如图24所示，结果表明18H11-Hu-C53A与IL-1β-A1-F99-His完全不结合，而对IL-1β-A1-W120-His还有一定的亲和力，但要低于IL-1β-WT-His。因此，接下来设计引物对IL-1β的第99位氨基酸F和第120位氨基酸W之间及后者附近的其他氨基酸通过丙氨酸扫描(Alanine scanning)进行逐个单点突变，并进行表达纯化，参照上述方法以确定18H11-Hu-C53A的结合表位。
代表性的实验结果分别如图25、图26和图27所示，可以得知对18H11-Hu-C53A与IL-1β结合影响最大的氨基酸，即主要结合表位分别为第120位的色氨酸W和第122位的异亮氨酸I，其次为第112位的苯丙氨酸F、第123位的丝氨酸S和第124位的苏氨酸T。
序列表
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 结合人IL-1β的抗体、其制备方法和用途
<130> SH363-21P450286CN
<160> 38
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
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<213> Mus musculus
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<212> PRT
<213> Homo
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Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Phe Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
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Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Homo
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ile Ile Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> Homo
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Phe Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Phe Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Homo
<400> 12
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ile Ile Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Leu Phe Thr Gly Tyr
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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Trp Ile Ser Cys Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ser Arg Ser Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Thr Leu Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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gaagtgcagc tccagcagag cggaccagaa ctggtgaaga ccggagccag cgtgaagatc 60
tcctgcaaag ccagcggcta tctgttcacc ggctactaca tgcattgggt gaagcagagc 120
cacggcaaga gcctcgagtg gatcggcttc atctcctgct acaacggcga caccacctac 180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccaccttc accgtggaca ccagcagcaa caccgcctac 240
atgcagttca acagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actattgcag ccggagcgac 300
tactacggca caagcgacta ttggggacag ggcacaaccc tgaccgtgtc tagc 354
<210> 16
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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cagatcgtgc tgacccagag cccagccatc atgagcgcta gccccggcga gaaagtgacc 60
atcacctgta gcgcctctag cagcgtgtcc tacatgcatt ggttccagca gaagcccggc 120
accagcccaa agctctggat ctacaccacc agcacactgg ccagcggagt gccagctaga 180
ttcagcggaa gcggcagcgg cacatcttat agcctgacca tcagcaggat ggaggccgaa 240
gacgcagcca cctactattg ccagcagcgg atcatctacc ctcctacctt tggcggcggc 300
acaaagctgg agatcaag 318
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<212> DNA
<213> Homo
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caggtgcagc tggtgcagag cggagcagaa gtggtgaagc caggagccag cgtgaagatc 60
agctgcaaag ccagcggcta tctgttcacc ggctactaca tgcattgggt gaagcaggcc 120
ccaggcaaag gactggagtg gatcgggttc attagctgct acaacggcga caccacctac 180
aaccagaagt tccagggcaa ggccaccttc accgtggata ccagcaccaa caccgcctac 240
atggagttca acagcctgac cagcgaggac accgccgtgt actattgcag ccggagcgac 300
tactacggca caagcgacta ttggggccag ggaacaaccc tgaccgtgtc tagc 354
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<400> 18
gaaatcgtgc tgacccagag cccagctacc atgagcgcct ctccaggaga gagagtgacc 60
atctcttgca gagccagcag cagcgtgtcc tacatgcatt ggttccagca gaagccagga 120
caggccccac gcctctggat ctacacaaca agcaccctgg ccaccggagt gccagctaga 180
ttcagcggaa gcggcagcgg cacagattat accctgacca tcagcaggat ggagccagag 240
gacgcagcca cctactattg ccagcagcgg atcatctacc ctcctacctt tggcggcggc 300
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caggtgcagc tggtgcagtc aggagcagaa gtggtgaagc ccggagccag cgtgaaagtg 60
tcttgcaagg ccagcggcta tctgttcacc ggatactaca tgcattgggt ccggcaggcc 120
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Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys
1 5 10 15
Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln
20 25 30
Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln
35 40 45
Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu
50 55 60
Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu
85 90 95
Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe
100 105 110
Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu
115 120 125
Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr
130 135 140
Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser Lys Leu Glu Asn Leu Tyr Phe
145 150 155 160
Gln Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
165 170 175
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
180 185 190
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
195 200 205
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
210 215 220
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
225 230 235 240
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
245 250 255
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
260 265 270
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
275 280 285
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
290 295 300
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
305 310 315 320
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
325 330 335
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
340 345 350
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
355 360 365
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
370 375 380
Pro Gly Lys
385
<210> 24
<211> 338
<212> PRT
<213> Synthetic
<400> 24
Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile Ser
1 5 10 15
Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu
20 25 30
Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro
35 40 45
Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr
50 55 60
Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys
65 70 75 80
Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys
100 105 110
Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe
115 120 125
Lys Gln Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr
130 135 140
Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp
145 150 155 160
Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly
165 170 175
Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly
180 185 190
Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro
195 200 205
Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr
210 215 220
Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu
225 230 235 240
Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro
260 265 270
Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg
275 280 285
Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg
290 295 300
Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile
305 310 315 320
Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr His His His His
325 330 335
His His
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Met Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln
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Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu
20 25 30
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35 40 45
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Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu
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Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala
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Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser His His His His His His
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<213> Homo
<400> 26
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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<212> PRT
<213> Homo
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
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195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
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245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo
<400> 28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo
<400> 29
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 30
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Ser Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 31
gatgtgcagc tcgtggaatc aggaggagga ctggtgcagc ccggcggcag cagaaagctg 60
tcttgcgccg ccagcggctt cacctttagc accttcggaa tgcattgggt ccggcaggct 120
ccagagaagg gactcgagtg ggtggcctac atcagcagcg gcagctacac catctactac 180
gccgacaccg tgcggggaag attcaccatc agccgggaca accccaagaa caccctgttc 240
ctgcagatga ccagcctgag gagcgaggat accgccatgt actattgcgc cagagacgac 300
tacgacgtgt cctactacgc catggactat tggggacagg gcacaagcgt gacagtgtct 360
agc 363
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 32
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 33
<211> 336
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 33
gatatcgtgc tgacccagtc tccagcctct ctggcagtgt ctctgggcca gagagccaca 60
atctcttgca gagcctccga gagcgtggag tactacggca ccagcctcat gcagtggtac 120
cagcagaaac ccggacagcc tcctaagctg ctgatctacg ccgcctctaa cgtggagagc 180
ggagtgccag ccagattcag cggaagcgga agcggcaccg acttcagcct gaacatccac 240
ccagtggagg aggacgacat cgccatgtac ttctgccagc agagcaggaa agtgccctct 300
ctgacctttg gcgccggaac caagctggaa ctgaag 336
<210> 34
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 34
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Val Ser Asn Tyr Val Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 35
gacgtgcagc tcgtggagtc cggaggaggg ctggtgcagc ccggaggaag ccggaagctg 60
tcctgtgccg cctctggctt caccttttct acatttggca tgcactgggt gaggcaggcc 120
ccagagaagg ggctggagtg ggtggcctac atcagctccg gctcttatac cacatactat 180
gccgacaccg tgcggggcag attcacaatc agccgggata accctaagaa taccctgttt 240
ctgcagatga cctccctgag gtctgaggat acagccatgt actattgcgc ccgcgacgat 300
tacgacgtgt ctaactacgt gatggattat tgggggcagg gcaccagcgt gacagtgtct 360
agc 363
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 36
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr
20 25 30
Gly Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ile Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Val Pro Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 336
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 37
gatatcgtgc tgacccagtc tccagcctct ctggcagtgt ctctgggcca gagagccaca 60
atctcttgca gagcctccga gagcgtggag tactacggca ccagcctcat gcagtggtac 120
cagcagaaac ccggacagcc tcctaagctg ctgatctacg ccgcctctaa cgtggagagc 180
ggagtgccag ccagattcac aggaagcgga agcggcaccg tattcagcct gaacatccac 240
ccagtggagg aggacgacat cgccatgtac ttctgccagc agagcaggaa agtgccctct 300
ctgacctttg gcgccggaac caagctggaa ctgaag 336
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> Synthetic
<400> 1
Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asp Thr
1 5

Claims (15)

1.结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链互补决定区H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3，所述的H-CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，所述的H-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的H-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，和
(b)轻链互补决定区L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3，所述的L-CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，所述的L-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述的L-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.如权利要求1所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体是鼠源抗体或人源化抗体。
3.如权利要求2所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体是鼠源抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
4.如权利要求2所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗体是人源化抗体，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为：
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：10所示；
重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示、轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：12所示；或
重链可变区的氨基酸序列如或SEQ ID NO：13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：14所示。
5.如权利要求1所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述的抗原结合片段包括Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段、单链抗体或单域抗体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区H-CDR2包括C53A突变位点，其H-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO：38所示。
7.核苷酸分子，其特征在于，所述的核苷酸分子编码如权利要求1-6中任一项所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段。
8.如权利要求7所述的核苷酸分子，其特征在于，所述的核苷酸分子编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列为：
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示、编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示、编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示、编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；或
编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示。
9.表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求7-8中任一项所述的核苷酸分子。
10.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求9所述的表达载体。
11.如权利要求1-6中任一项所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)在表达条件下，培养如权利要求10所述的宿主细胞，从而表达所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段；
(b)分离并纯化(a)所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段。
12.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1-6中任一项所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
13.如权利要求1-6中任一项所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段或如权利要求12所述的药物组合物在制备治疗IL-1β过表达引起的免疫类疾病的药物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述IL-1β过表达引起的免疫类疾病为关节炎、骨质疏松或银屑病。
15.如权利要求1所述的结合人IL-1β的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段与人IL-1β的结合表位为：SEQ ID NO：23的第120位的色氨酸、第122位的异亮氨酸、第112位的苯丙氨酸、第123位的丝氨酸和第124位的苏氨酸。
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