CN113332421A

CN113332421A - 一种猪链球菌病疫苗

Info

Publication number: CN113332421A
Application number: CN202110752883.1A
Authority: CN
Inventors: 肖琦; 赵霞玲; 黄小国; 钱雯娴; 温立斌; 祝昊丹; 倪艳秀; 周俊明; 王丹丹; 牛家强; 何孔旺
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-07-02
Filing date: 2021-07-02
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-07-02
Also published as: WO2023273829A1; CN113332421B; US20240033339A1; LU503542A1; LU503542B1; US11957743B2

Abstract

本发明提供一种猪链球菌病疫苗，涉及兽用疫苗领域。该猪链球菌病疫苗，抗原是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。本发明还提供所述猪链球菌病疫苗的制备方法，包括如下步骤：将白油和硬脂酸铝混合，得到白油佐剂；在氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白的水溶液中加入吐温‑80，混匀，得抗原溶液；将抗原溶液与白油佐剂按照体积比为0.5‑1.5:2混合，乳化，得到所述疫苗。本发明猪链球菌病疫苗免疫的动物可有效抵抗猪链球菌2型、3型、31型攻毒，疫苗保护率均达到了100%，是一种通用性较好的猪链球菌病疫苗，显著降低了生产成本和接种工作量，同时也可减少免疫动物的应激。

Description

一种猪链球菌病疫苗

技术领域

本发明涉及兽用疫苗领域，具体涉及一种猪链球菌病疫苗。

背景技术

猪链球菌是一种重要人兽共患病原菌，引起严重的食品安全问题，常年来滥用抗生素导致出现耐药性，这对预防和治疗猪链球菌感染构成了挑战。但是，研究人员使用针对猪链球菌的全细菌疫苗对动物进行免疫，结果发现全细菌灭活疫苗对不同血清型猪链球菌提供的免疫保护作用有限。

现有技术中缺乏能够保护猪链球菌3型和31型攻毒的猪链球菌病疫苗，更缺乏能够同时保护2型、3型和31型攻毒的猪链球菌病疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪链球菌病疫苗，能够同时保护猪链球菌2型、3型和31型攻毒。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种猪链球菌病疫苗，抗原是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

在本发明中，所述疫苗中的佐剂为白油。

本发明还提供所述猪链球菌病疫苗的制备方法，包括如下步骤：将白油和硬脂酸铝混合，得到白油佐剂；在氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白的水溶液中加入吐温-80，混匀，得抗原溶液；将抗原溶液与白油佐剂按照体积比为0.5-1.5:2混合，乳化，得到所述疫苗。

在本发明中，所述蛋白是将其编码基因插入载体后导入宿主菌，诱导表达后所得。

在本发明中，所述蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明中，所述白油和硬脂酸铝的质量比为90-120:2.5。

在本发明中，所述蛋白水溶液的浓度为0.9-1.2mg/mL。

在本发明中，吐温-80的体积为蛋白水溶液体积的2-6％。

本发明的有益效果：本发明猪链球菌病疫苗对免疫动物的猪链球菌2型、3型、31型攻毒，保护率均达到了100％，是一种通用性较好的猪链球菌病疫苗，显著降低了生产成本和接种工作量，同时也可减少免疫动物的应激反应。

附图说明

图1蛋白A编码基因和对照蛋白编码基因的PCR扩增产物电泳图，其中1～3：蛋白A编码基因PCR扩增产物、对照蛋白编码基因PCR扩增产物、阴性对照；M:DL2000 DNA Marker。

图2重组质粒酶切鉴定电泳图，其中1～2:分别是重组质粒1和对照重组质粒酶切产物；M1:DL2000 DNA Marker；M2:DL5000 DNA Marker。

图3蛋白A及对照蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳，其中1～5分别为：对照重组菌3(导入了空载pET-32a(+))、重组菌2裂解液上清、重组菌2裂解液沉淀悬浮液、对照重组菌2裂解液上清、对照重组菌2裂解液沉淀悬浮液；M:蛋白质分子量标准(KDa)。

图4纯化后的蛋白A及对照蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中1～3分别为：纯化后的对照重组菌3表达的蛋白、蛋白A和对照蛋白；M:蛋白质分子量标准(KDa)。

图5蛋白A及对照蛋白的Western Blot图，其中图A中的一抗为猪链球菌2型免疫小鼠后得到的高免血清、图B中的一抗为猪链球菌3型免疫小鼠后得到的高免血清、图C中的一抗为猪链球菌31型免疫小鼠后得到的高免血清；其中泳道1为蛋白A，泳道2为对照蛋白，M为蛋白质分子量标准(KDa)。

图6显示了小鼠血清抗体效价，其中横坐标为首免后天数，纵坐标为抗体效价，蛋白A、对照蛋白分别是指蛋白A疫苗免疫组和对照蛋白疫苗免疫组，攻毒对照是指攻毒对照组。

图7各组小鼠脾脏中IL-4相对表达量，蛋白A、对照蛋白分别表示蛋白A疫苗免疫组和对照蛋白疫苗免疫组，攻毒组是指攻毒对照组；**表示与攻毒对照组相比，P<0.01；***表示与攻毒对照组相比，P<0.001。

图8各组小鼠脾脏中IFN-γ相对表达量，蛋白A、对照蛋白分别表示蛋白A疫苗免疫组和对照蛋白疫苗免疫组，攻毒组是指攻毒对照组；*表示与攻毒对照组相比，P<0.05；**表示与攻毒对照组相比，P<0.01。

图9各组小鼠脾脏中TNF-α相对表达量，蛋白A、对照蛋白分别表示蛋白A疫苗免疫组和对照蛋白疫苗免疫组，攻毒组是指攻毒对照组；*表示与攻毒对照组相比，P<0.05；ns表示与攻毒对照相比，P＞0.05，差异不显著。

具体实施方式

1.试验动物

BALB/c雌性小鼠购自上海市实验动物研究中心。

2.主要试剂

Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I购自Omega公司；限制性内切酶、T4DNA ligase购自Takara Bio；异丙基-b-D-硫代半乳糖苷购自生工生物工程股份有限公司；总RNA小提试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；Ni-TED琼脂糖纯化树脂购自BBI生命科学有限公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

3.主要仪器

分光光度计(型号Evolution 200)为赛默飞世尔科技公司产品；冷冻恒温振荡器(型号THZ-C-L)为太仓市强生实验设备有限公司产品；恒温培养箱(型号DNP-9272)为上海精密实验设备有限公司产品；PCR仪(型号

nexus)为eppendoef公司产品；电泳仪(型号DYY-11)为北京市六一仪器厂产品；全自动数码凝胶成像仪器(型号Tanon3500)、化学发光仪(型号Tanon 5200)为天根生化科技有限公司产品；超声破碎仪(型号XO-1000D)为南京先欧仪器制造厂产品；半干转印槽(型号Trans-Blot SD 1703940)为美国Bio-Rad公司产品；全自动酶标仪(型号ELx800)为美国宝特BIO-TEK公司产品。

4.试剂配制

100mg/mL氨苄青霉素配制：将100mg氨苄抗生素粉末溶于1mL蒸馏水，并用0.22μL滤器过滤，-20℃保存。

Binding buffer：20Mm、pH7.4的磷酸盐缓冲液500mL，加尿素240g，搅拌至溶解。

包被液：将Na₂CO₃ 1.59g、NaHCO₃ 2.93g和NaN₃ 0.2g溶于水，然后用水定容至1000mL，密封盖好，4℃保存。

洗涤液(PBST)：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄.12H₂O 3.58g、KH₂PO₄ 0.27g、0.5mL吐温-20溶于水，然后用水定容至1000mL。

封闭液：在洗涤液(PBST)中加入终浓度为5％(质量百分浓度)的脱脂奶粉，混匀。

终止液：2M的H₂SO₄水溶液。

实施例1制备疫苗抗原的重组菌的构建

为了找到有效的猪链球菌病通用型疫苗的抗原，通过免疫蛋白组学方法，筛选了大量的抗原，最终发现：蛋白A作为免疫原制备的疫苗能够保护猪链球菌2型、3型和31型攻毒，蛋白A的基因序列如SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

1.PCR引物

设计引物A-P1、A-P2，用于扩增蛋白A的编码基因。另外，设计引物B-P1、B-P2扩增对照蛋白的编码基因，对照蛋白的基因序列如SEQ ID NO:3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。引物的具体序列见表1，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1引物序列

注：表1中标注横线为酶切位点。

2.提取猪链球菌DNA

按照常规方法提取猪链球菌的DNA。

3.PCR扩增蛋白A和对照蛋白的编码基因

以猪链球菌3型JSHZ(公开于申请号为202011000342.5的发明专利申请)的DNA为模板，采用各目标蛋白的引物，分别PCR扩增蛋白A编码基因和对照蛋白编码基因。PCR反应体系如表2所示。

表2目的基因PCR反应体系

反应物名称	用量
		Green Tap Mix	25μL
上游引物	2μL
		下游引物	2μL
猪链球菌DNA	1μg
		dd H<sub>2</sub>O	加水至50μL

PCR扩增程序如下：95℃3min；95℃15s，退火温度(蛋白A退火温度为63℃，对照蛋白退火温度60℃)15s，72℃90s，35个循环；72℃5min。

PCR程序结束后，取8μL PCR扩增产物，采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

蛋白A编码基因和对照蛋白编码基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定见图1。从图1可见，蛋白A编码基因扩增产物在1407bp处出现了特异性目的条带，对照蛋白编码基因扩增产物在1236bp处出现了特异性目的条带，都符合预期大小。

5.目的片段的回收

使用Omega公司的GeL Extraction Kit试剂盒分别对蛋白A编码基因和对照蛋白编码基因的PCR扩增产物进行回收。

6.目的基因及pET-32a(+)载体的酶切与连接

首先，将回收的蛋白A编码基因PCR扩增产物和pET-32a(+)载体，分别采用限制性内切酶EcoRV和XhoI进行双酶切(酶切体系见表3)，在37℃酶切1h，取酶切产物进行琼脂糖电泳，采用胶回收试剂盒回收目的片段。按表4的连接体系，在目的片段双酶切胶回收DNA、载体双酶切胶回收DNA中加入T4 DNA Ligase和10×T4 DNA Ligase Buffer进行连接，置于16℃连接2h，得到携带蛋白A编码基因的重组质粒1。另外，按照携带蛋白A编码基因的重组质粒1的构建方法，构建携带对照蛋白编码基因的对照重组质粒。

表3酶切体系

表4连接体系

试剂	用量
		目的片段双酶切胶回收DNA	0.3pmoL
载体双酶切胶回收DNA	0.03pmoL
		T4 DNA Ligase	1μL
10×T4 DNA Ligase Buffer	2.5μL

7.连接产物转化至Trans 5α化学感受态细胞

分别将重组质粒1和对照重组质粒转化至Trans 5α化学感受态细胞(购自全式金生物技术有限公司)，具体步骤如下：

(1)取出Trans 5α化学感受态细胞置于冰中融化。

(2)取2μL的重组质粒加入到50μL的Trans 5α化学感受态细胞中，用手轻拨EP管底部，置于冰中静置30min，然后42℃热激45s，立即置于冰上静置2min，加入700μL的无抗性液体LB培养基，置于37℃、200r/min振荡培养1h。

(3)5000r/min离心3min，弃去上清400μL后，重新涡旋振荡，取100μL均匀涂布在含有氨苄抗性的LB固体培养基上，置于37℃恒温培养过夜。

8.阳性克隆的鉴定

从标题7中LB固体培养基上挑取单菌落，置于5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下振荡培养12～16h，取1μL进行菌液PCR验证。将成功导入了重组质粒1的阳性克隆命名为重组菌1。将成功导入了对照重组质粒的阳性克隆命名为对照重组菌1。

9.提取质粒

采用Omega公司的Plasmid Mini Kit I试剂盒分别提取重组菌1和对照重组菌1中的重组质粒。

10.重组质粒的酶切鉴定

将提取的重组质粒1和对照重组质粒分别采用限制性内切酶EcoRV和XhoI进行双酶切，酶切完成后，进行琼脂糖电泳鉴定。结果如图2所示，重组质粒1的酶切产物在1407bp和5886bp出现了特异性条带，对照重组质粒在1236bp和5886bp出现了特异性条带，说明外源基因和pET-32a(+)载体分别扩增出相应的目的条带。此外，基因组测序证实了目的基因插入正确。

11.连接产物转化至Trans BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞

分别将重组质粒1和对照重组质粒转化至Trans BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞(购自全式金生物技术有限公司)，具体方法如下：

(1)取出Trans BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞置于冰中融化。

(2)取2μL的重组质粒加入到50μL的Trans BL21(DE3)pLysS化学感受态细胞中，用手轻拨EP管底部，置于冰中静置30min，然后42℃热激45s，立即置于冰上静置2min，加入700μL的无抗性液体LB培养基，置于37℃、200r/min条件下振荡培养1h。

(3)将培养后的菌液在5000r/min离心3min，弃去上清400μL后，重新涡旋振荡，取100μL均匀涂布在含有氨苄抗性的LB固体培养基上，置于37℃恒温培养过夜。

(4)挑取单菌落置于5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，在37℃、200r/min振荡培养12～16h，取1μL进行菌液PCR验证。将成功导入重组质粒1的Trans BL21(DE3)pLysS，命名为重组菌2。将成功导入了对照重组质粒的Trans BL21(DE3)pLysS，命名为对照重组菌2。

另外，采用上述相同方法，将pET-32a(+)载体转化至Trans BL21(DE3)pLysS，得到对照重组菌3。

二.蛋白的表达及纯化

1.诱导表达

分别诱导表达重组菌2、对照重组菌2和对照重组菌3。具体方法如下：按体积比为1：100将重组菌种子液加入到含有100mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养到OD值为0.4～0.6时，加入终浓度为0.8mmoL/L的IPTG，然后置于16℃、150r/min振荡培养箱中诱导培养16h。待诱导完毕后，取4mL菌液12000r/min离心3min，弃掉上清，加入PBS缓冲液重悬，反复洗涤2～3次，然后加入500μL的PBS缓冲液重悬，置于冰上超声对菌体进行破碎，直至液体变澄清。超声完毕，12000r/min离心10min，分别收集裂解液上清和裂解液沉淀，将裂解液沉淀采用Binding buffer重悬，得到裂解液沉淀悬浮液。

2.SDS-PAGE电泳

取上步所得各菌诱导后裂解液上清、裂解液沉淀悬浮液各48μL于新的EP管中，加入12μL 5×SDS凝胶上样缓冲液，100℃加热10min，取10μL进行SDS-PAGE电泳。结果如图3所示，蛋白A在70KDa处出现了特异性条带，对照蛋白在62KDa处出现了特异性条带，且蛋白A和对照蛋白都主要在上清中表达，即主要是可溶性表达，且表达量高。

3.蛋白的纯化及Western Blot

将重组菌2、对照重组菌2和对照重组菌3分别按照本实施例标题二(蛋白的表达及纯化)中标题1方法诱导表达，获得各重组菌裂解液上清，用0.45μm的滤器过滤，然后采用BBI生命科学有限公司的Ni-TED琼脂糖纯化树脂柱子进行纯化，分别得到蛋白A和对照蛋白及对照重组菌3表达的蛋白。具体纯化方法见Ni-TED琼脂糖纯化树脂柱子说明书。

将纯化后的蛋白A、对照蛋白及对照重组菌3表达的蛋白采用SDS-PAGE电泳进行检测。结果见图4，蛋白A在70KDa处出现了特异性条带，对照蛋白在62KDa处出现了特异性条带，均无杂带，纯度较高。

同时，将纯化后的蛋白A和对照蛋白经SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜(购自美国GE公司)，加入含5％脱脂奶粉的PBST室温封闭2h，分别以猪链球菌2型、3型、31型免疫小鼠后得到的高免血清为一抗，在室温下分别孵育2h；以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，在室温下孵育1h，最后在ECL溶液作用下显色曝光，结果见图5。

实施例2蛋白A的免疫效力

1.小鼠主动免疫

将纯化后的蛋白A采用如下方法制备成疫苗：白油117.5mL，硬脂酸铝2.5g，混合后用力振荡，高压灭菌，冷却至50℃左右，再用力摇匀至透明均质状，即得白油佐剂；取1.08mg/mL纯化后的蛋白A水溶液，加入蛋白A水溶液体积4％的灭菌吐温-80，充分混匀，即得抗原溶液。将抗原溶液与白油佐剂按照体积比为1:2混合，乳化，得到蛋白A疫苗。

采用上述相同方法，以对照蛋白替换蛋白A制备成相应的疫苗，记为对照蛋白疫苗。对照蛋白疫苗和蛋白A疫苗中抗原浓度相同。

按照蛋白A疫苗的制备方法，以相同体积的PBS缓冲液(浓度为0.01M、pH 7.4)替代蛋白A，其他不变，制备空白疫苗。

将4周龄BALB/c雌鼠随机分为4组，每组18只，包括2个试验组(蛋白A疫苗免疫组和对照蛋白疫苗免疫组)、空白疫苗对照组和攻毒对照组。各试验组分别免疫对应疫苗，每只小鼠免疫的疫苗中抗原蛋白的剂量为60μg，每只小鼠腹腔注射疫苗的体积为200μL；空白疫苗对照组小鼠，每只接种200μL的空白疫苗。一免后14天，各组小鼠采用一免的相同方法进行二免。攻毒对照组小鼠，不免疫。

2.小鼠的免疫攻毒保护

蛋白A疫苗免疫组、对照蛋白疫苗免疫组和空白疫苗对照组小鼠，二免后两周攻毒，每个免疫组和对照组均随机分为3组，每组5只，分别采用猪链球菌2型、3型、31型进行攻毒；同时，攻毒对照组亦随机各分成3组，每组5只，分别用猪链球菌2型、3型、31型进行攻毒。各组小鼠攻毒后连续观察7天，记录小鼠的临床症状及死亡情况，结果见表5。其中，攻毒对照组小鼠攻毒后表现出明显的临床症状，精神萎靡不振，被毛杂乱，扎堆，攻毒猪链球菌2型、3型全部死亡，攻毒猪链球菌31型死亡4只。空白疫苗对照组攻毒猪链球菌2型、3型、31型全部死亡。试验组攻毒后部分小鼠出现了被毛杂乱，扎堆，精神不振的症状，但均在48-72h内症状消失；其中，蛋白A疫苗免疫组攻毒猪链球菌2型、3型、31型均未出现死亡情况，存活率为100％；对照蛋白疫苗免疫组攻毒猪链球菌2型、31型未出现死亡，存活率为100％，但是，攻毒猪链球菌3型，死亡了2只，存活率仅为60％。

表5各蛋白对小鼠的免疫攻毒保护率

小鼠分组	猪链球菌2型攻毒	猪链球菌3型攻毒	猪链球菌31型攻毒
				蛋白A疫苗免疫组	100％(5/5)	100％(5/5)	100％(5/5)
对照蛋白疫苗免疫组	100％(5/5)	60％(3/5)	100％(5/5)
				空白疫苗对照组	0(0/5)	0(0/5)	0(0/5)
攻毒对照组	0(0/5)	0(0/5)	20％(1/5)

注：表5中括号内，按照存活只数/攻毒总只数的方式表示。

3.ELISA检测小鼠血清抗体效价

在小鼠首免后14天和28天，随机选择每组的3只小鼠，采用眼眶采血，离心收集血清，并储存在-20℃。使用间接ELISA测定血清抗体滴度。

针对蛋白A的小鼠血清抗体效价的检测方法，具体如下：将蛋白A采用包被液配制成浓度为0.3135μg/mL的溶液，包被酶联板，每孔100μL，置于4℃过夜孵育，洗涤液洗涤3次，每次3min；然后每孔中加入150μL的封闭液，37℃封闭30min，洗涤液洗涤；将蛋白A疫苗免疫组小鼠待测血清做2倍倍比稀释(稀释度由1:400～1:6553600)，每孔加入100μL血清稀释液，置于37℃反应1h；洗涤液洗涤3次，加入1:4000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP(购自北京全式金生物，产品编号HS201-01)，每孔100μL，37℃反应1h；洗涤液洗涤3次后，每孔加入100μL的TMB显色液(购自湖州英创生物科技有限公司，产品编号TMB-S-001)，避光反应15min后，每孔加入50μL终止液，在酶标仪上测定OD₄₅₀值。采用常规方法，计算抗体效价。

针对对照蛋白的小鼠血清抗体效价的检测方法，具体如下：将对照蛋白采用包被液配制成浓度为5μg/mL的溶液，包被酶联板，每孔100μL，置于4℃过夜孵育，洗涤液洗涤3次，每次3min；然后每孔中加入150μL的封闭液，37℃封闭30min，洗涤液洗涤；将对照蛋白疫苗免疫组小鼠待测血清做2倍倍比稀释(稀释度由1:400～1:6553600)，每孔加入100μL血清稀释液，置于37℃反应1h；洗涤液洗涤3次，加入1:4000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG-HRP(购自北京全式金生物，产品编号HS201-01)，每孔100μL，37℃反应1h；洗涤液洗涤3次后，每孔加入100μL的TMB显色液(购自湖州英创生物科技有限公司，产品编号TMB-S-001)，避光反应15min后，每孔加入50μL终止液，在酶标仪上测定OD₄₅₀值。采用常规方法，计算抗体效价。

结果如图6，蛋白A疫苗免疫组和对照蛋白疫苗免疫组小鼠，在二免14天后均可检测到特异性的抗体且抗体水平较高。

6.qRT-PCR检测相关细胞因子表达量

(1)脾脏中提取RNA

二免14天后，每组小鼠随机选择3只，采用Magen公司的HiPure Total RNA MiniKit试剂盒提取各组小鼠脾脏中的RNA。

(2)将RNA反转录为cDNA

采用Vazyme公司的HiScript II RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂，将步骤(1)中各RNA分别反转录为cDNA。具体方法如下：按照表6，在RNase-free离心管中配制混合液，用移液器轻轻吹打混匀，在42℃放置2min。然后，加入4μL的5×HiScript II RTSuperMix for qPCR，用移液器轻轻吹打混匀，按照表7中程序进行逆转录反应，得到cDNA。

表6逆转录反应体系

试剂	用量
		模板RNA	1pg～1μg
4×gDNA wiper Mix	4μL
		RNase-free ddH<sub>2</sub>O	补足体积至16μL

表7逆转录反应程序

温度	时间
		50℃	15min
85℃	5s

(3)qRT-PCR方法检测细胞因子

以步骤(2)所得各组小鼠脾脏cDNA为模板，分别用细胞因子IL-4、IFN-γ和TNF-α扩增引物(表8)、SYBR-Green-PCR试剂盒进行qRT-PCR定量扩增，利用荧光定量检测各组小鼠脾脏中细胞因子的mRNA相对于内参基因GAPDH mRNA的表达量。以GAPDH基因作为内参基因，用2^-ΔΔCt法比较各试验组与攻毒对照组的差异。由于PCR反应体系中加入荧光基团，因此利用荧光信号的变化能够实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

按照表9，配制各qPCR反应体系，按照如下程序进行荧光定量PCR扩增：95℃预变性30s；95℃10s，60℃30s，40个循环；95℃15s，95℃60s，95℃15s。其中细胞因子IL-4、IFN-γ、TNF-α和GAPDH基因引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，见表8。

表8细胞因子引物序列

表9 qPCR反应体系

反应物	用量
		2×ChamQ Universal SYBR Qrcr Master Mix	10μL
正向引物	0.4μL
		反向引物	0.4μL
cDNA	2μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足体积至20μL

如图7所示，与攻毒对照组小鼠相比，对照蛋白疫苗免疫组脾脏中表达量差异极为显著(P＜0.01)，蛋白A疫苗免疫组脾脏中IL-4表达量的差异显著(P＜0.05)。

如图8所示，蛋白A疫苗免疫组和对照蛋白疫苗免疫组脾脏中IFN-γ相对表达量，在二免14天后与攻毒对照组相比差异显著(P＜0.05)。

如图9所示，蛋白A疫苗免疫组脾脏中TNF-α相对表达量在二免14天后与攻毒对照组相比差异显著(P＜0.05)，对照蛋白疫苗免疫组差异不显著(P＞0.05)。

从上述试验可以看到，疫苗免疫后，用猪链球菌2型、3型和31型攻毒小鼠，蛋白A疫苗和对照蛋白疫苗均能够显著提高小鼠血清中IgG抗体水平，但是蛋白A疫苗对猪链球菌2型、3型和31型的攻毒保护率达到了100％，而对照蛋白疫苗仅对猪链球菌2型和31型攻毒后的保护率达到了100％，对猪链球菌3型攻毒后的保护率只有60％，也就是对猪链球菌3型攻毒后并不能有效保护。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种猪链球菌病疫苗

<130> 20210702

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 猪链球菌

<400> 1

atgagttcag gcaaaattac tcaggttgtc ggaccagttg tagacgttgc gtttgcagca 60

gaagataaac ttcctgagat taacaacgca ctcgttgtat ataaaaatga tgattccaaa 120

caaaaagtcg tgcttgaagt ggctttggaa cttggtgatg gcgttgtacg gaccattgcc 180

atggaatcaa cggatggatt gacacgtggg atggaagttc tcgatacagg tcgtcctatc 240

tcagttccag tcggtaaaga aaccttgggt cgtgtcttca atgtgttggg agataccatt 300

gaccttgaag agtcttttcc ggcagatttt gaacgtgagc ctatccataa gaaagcgcca 360

gcttttgacg aattatctac ttcaagcgaa attttggaaa cagggattaa ggttatcgac 420

ctcctagcac cttatctaaa aggtggtaag gttggtctct tcggtggtgc cggtgttggt 480

aaaaccgttc ttatccaaga attgattcac aatattgccc aagaacacgg tggtatctct 540

gtgtttaccg gagttggcga gcgtacccgt gaagggaacg atctttactg ggaaatgaaa 600

gaatcaggtg ttattgaaaa aacggccatg gtatttggtc agatgaatga gccaccagga 660

gcccgtatgc gggttgctct tactggtttg accattgcgg aatacttccg tgatgtggaa 720

gggcaggatg ttcttctgtt catcgacaat atcttccgtt tcactcaggc tggttcagaa 780

gtgtctgccc tcttgggccg tatgccatca gccgttggtt atcagccaac acttgcaact 840

gagatgggac aattgcagga gcgtattacc tcaaccaaga agggttctgt tacatctatt 900

caggctattt acgtacctgc agatgactat acagacccag ctccagcgac agctttcgct 960

cacttggact cgactaccaa cttggaacgt aagttgactc agcttggtat ctaccctgcg 1020

gtggatccgt tggcgtcatc atctcgtgcg ctttctccac aaattgttgg tgaagagcac 1080

tatacagtgg ctatggaagt aaaacgtgtt cttcaacgtt accaagaatt gcaagatatt 1140

attgccattc tcggtatgga tgaattatca gatgaagaga agaccttggt tggtcgcgct 1200

cgtcgtatcc aattcttcct ctctcaaaac ttcaacgttg cggagcaatt tacaggtatg 1260

ccaggttctt atgtgccagt agcagaaacg gtgaaaggct ttaaggaaat cttggacggc 1320

aaacacgacc atctaccaga agatgccttc cgaaatgttg gttcaattga ggatgtggtc 1380

gctaaagctg ctaaaatgaa attctag 1407

<210> 2

<211> 468

<212> PRT

<213> 猪链球菌

<400> 2

Met Ser Ser Gly Lys Ile Thr Gln Val Val Gly Pro Val Val Asp Val

1 5 10 15

Ala Phe Ala Ala Glu Asp Lys Leu Pro Glu Ile Asn Asn Ala Leu Val

20 25 30

Val Tyr Lys Asn Asp Asp Ser Lys Gln Lys Val Val Leu Glu Val Ala

35 40 45

Leu Glu Leu Gly Asp Gly Val Val Arg Thr Ile Ala Met Glu Ser Thr

50 55 60

Asp Gly Leu Thr Arg Gly Met Glu Val Leu Asp Thr Gly Arg Pro Ile

65 70 75 80

Ser Val Pro Val Gly Lys Glu Thr Leu Gly Arg Val Phe Asn Val Leu

85 90 95

Gly Asp Thr Ile Asp Leu Glu Glu Ser Phe Pro Ala Asp Phe Glu Arg

100 105 110

Glu Pro Ile His Lys Lys Ala Pro Ala Phe Asp Glu Leu Ser Thr Ser

115 120 125

Ser Glu Ile Leu Glu Thr Gly Ile Lys Val Ile Asp Leu Leu Ala Pro

130 135 140

Tyr Leu Lys Gly Gly Lys Val Gly Leu Phe Gly Gly Ala Gly Val Gly

145 150 155 160

Lys Thr Val Leu Ile Gln Glu Leu Ile His Asn Ile Ala Gln Glu His

165 170 175

Gly Gly Ile Ser Val Phe Thr Gly Val Gly Glu Arg Thr Arg Glu Gly

180 185 190

Asn Asp Leu Tyr Trp Glu Met Lys Glu Ser Gly Val Ile Glu Lys Thr

195 200 205

Ala Met Val Phe Gly Gln Met Asn Glu Pro Pro Gly Ala Arg Met Arg

210 215 220

Val Ala Leu Thr Gly Leu Thr Ile Ala Glu Tyr Phe Arg Asp Val Glu

225 230 235 240

Gly Gln Asp Val Leu Leu Phe Ile Asp Asn Ile Phe Arg Phe Thr Gln

245 250 255

Ala Gly Ser Glu Val Ser Ala Leu Leu Gly Arg Met Pro Ser Ala Val

260 265 270

Gly Tyr Gln Pro Thr Leu Ala Thr Glu Met Gly Gln Leu Gln Glu Arg

275 280 285

Ile Thr Ser Thr Lys Lys Gly Ser Val Thr Ser Ile Gln Ala Ile Tyr

290 295 300

Val Pro Ala Asp Asp Tyr Thr Asp Pro Ala Pro Ala Thr Ala Phe Ala

305 310 315 320

His Leu Asp Ser Thr Thr Asn Leu Glu Arg Lys Leu Thr Gln Leu Gly

325 330 335

Ile Tyr Pro Ala Val Asp Pro Leu Ala Ser Ser Ser Arg Ala Leu Ala

340 345 350

Pro Gln Ile Val Gly Glu Glu His Tyr Ala Val Ala Met Glu Val Lys

355 360 365

Arg Val Leu Gln Arg Tyr Gln Glu Leu Gln Asp Ile Ile Ala Ile Leu

370 375 380

Gly Met Asp Glu Leu Ser Asp Glu Glu Lys Thr Leu Val Gly Arg Ala

385 390 395 400

Arg Arg Ile Gln Phe Phe Leu Ser Gln Asn Phe Asn Val Ala Glu Gln

405 410 415

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Gly Phe Lys Glu Ile Leu Asp Gly Lys His Asp His Leu Pro Glu Asp

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Lys Met Lys Phe

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 猪链球菌

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tatgcagcta aagaagcgat tgctaatgca cagctggata cagagacagt ggatagtgac 300

cgttttggcg ttatcttatc aacaggtatc ggtggtattt tggaaattga agagcaagtg 360

gctcggatga acgaaaaagg tccaaaacgc attcgtccca tggctcttcc aaaagctctt 420

ccaaatatgg cggccggaaa tattgccatg caggtcggtg ccaatggtgt ctgcaagtgt 480

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attccatttg acaaggaccg caatggtttt gtcatgggag agggttccgc ggttttagta 720

ttggaaagtt tggaacacgc agaggcgcgt ggagcgacga ttttggctga aatcgttggt 780

tatggaaata cctgcgatgc ttaccacatg acttctccac atccagaagg tctgggtgct 840

attaaggcca tgaagttggc catttcagaa gcaggtttag agccagctga tattgattac 900

atcaatgccc atggcacttc gacaccggct aatgaaaaag gggaaagcca agctatcgta 960

tctgtcttcg gcaagaacac gccagtttct tctaccaagt ccttcactgg tcacttgttg 1020

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ccaaagacag ctggtacgac agaattatct gaagatattg aagcggatgt catttatgga 1140

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<210> 4

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<212> PRT

<213> 猪链球菌

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180 185 190

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Pro His Pro Glu Gly Leu Gly Ala Ile Lys Ala Met Lys Leu Ala Ile

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Asn Ser Val Ile Ala Phe Lys Arg Trp Glu Ala

405 410

Claims

1.一种猪链球菌病疫苗，其特征在于抗原是氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白。

2.根据权利要求1所述疫苗，其特征在于所述疫苗中的佐剂为白油。

3.权利要求1所述猪链球菌病疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将白油和硬脂酸铝混合，得到白油佐剂；在氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白的水溶液中加入吐温-80，混匀，得抗原溶液；将抗原溶液与白油佐剂按照体积比为0.5-1.5:2混合，乳化，得到所述疫苗。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于所述蛋白是将其编码基因插入载体后导入宿主菌，诱导表达后所得。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述蛋白编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于所述白油和硬脂酸铝的质量比为90-120:2.5。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于所述蛋白水溶液的浓度为0.9-1.2mg/mL。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于吐温-80的体积为蛋白水溶液体积的2-6%。