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CN113337602A - Mdm2抑制剂的治疗方法和生物标志物 - Google Patents

Mdm2抑制剂的治疗方法和生物标志物 Download PDF

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CN113337602A
CN113337602A CN202110226401.9A CN202110226401A CN113337602A CN 113337602 A CN113337602 A CN 113337602A CN 202110226401 A CN202110226401 A CN 202110226401A CN 113337602 A CN113337602 A CN 113337602A
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CN
China
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cancer
lkb1
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stk11
mdm2 inhibitor
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CN202110226401.9A
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翟一帆
杨大俊
吴一龙
孙浩
方东
唐秋琼
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Suzhou Yasheng Pharmaceutical Co ltd
Ascentage Pharma Group Co Ltd
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Yasheng Pharmaceutical Group Hong Kong Co ltd
Suzhou Yasheng Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明提供了用于预测MDM2抑制剂在治疗癌症患者中的疗效的生物标记物。还提供用于评估生物标记物的组合物(例如试剂盒)和使用生物标记物预测癌症患者对MDM2抑制剂的反应的方法。这些信息可用于确定癌症患者的预后和治疗方案。

Description

MDM2抑制剂的治疗方法和生物标志物
技术领域
本发明涉及MDM2抑制剂的治疗方法和生物标志物，以治疗抑制MDM2和MDM2相关蛋白可以获益的病症和疾病。
背景技术
人鼠双微体2蛋白(MDM2)是p53肿瘤抑制剂的重要负调节剂。p53响应多种细胞损伤而介导生长停滞，衰老和凋亡，从而预防癌症。MDM2通过多种机制直接与p53相互作用并使其失活。因此，阻断MDM2-p53相互作用，以重新激活p53的功能，是一种有前途的抗癌治疗策略(ChèneP，Nature Reviews Cancer，2003，3：102)。
然而，对抗癌疗法的临床反应通常仅限于一部分患者。为了使抗癌治疗的效率最大化，已经提出了基于分子生物标记物的个性化化疗。然而，如何鉴定能够预测对抗癌疗法反应的预测性生物标志物仍然是一个挑战。因此，需要持续开发生物标志物以预测靶向MDM2-p53相互作用的化合物的抗癌功效。
发明内容
在整个本公开中，冠词“一”，“一个”和“该”在本文中用于指代该冠词的语法对象中的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一种方法”是指一种方法或一种以上方法。
在整个本公开中，本文引用的所有参考文献均全文引入。
本申请的发明人现已发现，MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐，在具有某些生物标志物特征的癌症患者的给药中特别有效。特别地，令人惊讶地发现，在患有具有某些生物标志物特征的癌症的受试者中用MDM2抑制剂治疗可以导致应答率增加，更完整的回归应答者，肿瘤生长延迟以及耐药型肿瘤转化为响应型。
一个方面，本公开提供了一种识别患有癌症的受试者的方法，该受试者可能对用MDM2抑制剂的治疗有反应，该方法包括：
a)提供来自受试者的生物样品；
b)在生物样品中确定功能性的LKB/STK11是否不足；和
c)基于生物学样品中发现功能性的LKB1/STK11缺乏，确定受试者可能对MDM2抑制剂的治疗有反应。
在一些实施例中，该方法还包括：
d)以治疗有效量向鉴定为可能对用MDM2抑制剂的治疗有反应的受试者施用治疗有效量的MDM2抑制剂。
在另一方面，本公开提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：
a)从受试者的生物学样品中确定功能性LKB1/STK11是否不足；和
b)基于所述生物样品中发现的功能性LKB1/STK11的缺乏，向所述受试者施用治疗有效量的MDM2抑制剂。
在另一方面，本发明提供一种治疗癌症受试者的方法，所述方法包括向所述受试者投与治疗有效量的MDM2抑制剂，其中所述受试者已被确定在来自所述受试者的生物样品中存在功能性LKB1/STK11缺陷。在一些实施例中，受试者从免疫疗法或化疗复发或对其难治。在一些实施例中，免疫疗法为PD-1/PD-L1阻断疗法。在一些实施例中，已确定受试者进一步具有KRAS突变。
在一些实施例中，所述测定包括检测生物样品中LKB1/STK11中存在的一个或多个失活突变，其中LKB1/STK11中存在的一个或多个失活突变指示功能性LKB1/STK11中的缺陷。
一些实施例中，LKB1/STK11中的一个或多个失活突变包括缺失，插入，取代或其降低LKB1/STK11的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的上述任何组合。
在一些实施例中，LKB1/STK11中的一个或多个失活突变包含选自表1所列举的突变。
在一些实施例中，所述确定包括确定相对于参考水平，生物学样品中LKB1/STK11的水平是否降低，并且降低的LKB1/STK11的水平指示LKB1/STK11的功能性缺陷。
在一些实施例中，所述确定包括确定LKB1/STK11的启动子在生物样品中是否被超甲基化，其中超甲基化的LKB1/STK11启动子指示LKB1/STK11的功能性缺陷。
在一些实施例中，所述确定还包括在生物样品中确定功能性p53的存在或不存在，其中功能性p53的存在指示施用MDM2抑制剂治疗的可能性。
在一些实施例中，被鉴定为可能对用MDM2抑制剂的治疗有反应的受试者或将要施用MDM2抑制剂的受试者在生物样品中具有或进一步被确定具有功能性p53。
在一些实施例中，功能性p53包含野生型p53。
在一些实施例中，所述确定还包括在生物样品中确定KRAS中一种或多种突变的存在，其中KRAS中存在一种或多种突变指示对MDM2抑制剂治疗产生反应的可能性。
在一些实施例中，待与MDM2抑制剂一起施用的受试者的生物样品中或需进一步确定KRAS中是否具有一种或多种突变。
在一些实施例中，通过扩增测定，杂交测定，测序测定或免疫测定来测量i)LKB1/STK11的功能性缺陷，ii)p53功能性的存在或不存在，和/或iii)KRAS中的一个或多个突变。
在一些实施例中，生物样品包含癌细胞或非癌细胞。
在一些实施例中，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。
在一些实施例中，癌症是胃癌(例如胃癌)，胆管癌，肺癌，黑素瘤，乳腺癌(例如浸润性乳腺癌)，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌，肝癌(例如肝细胞癌)，膀胱癌，胰腺癌，肾癌，食道癌，头颈癌，甲状腺癌，皮肤鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤。神经母细胞瘤，膀胱癌，子宫癌，黑色素瘤，骨肉瘤，淋巴瘤(例如壁炉细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤)，白血病(例如T细胞淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病)，多发性骨髓瘤，子宫癌，大肠癌，肺腺癌，子宫癌肉瘤，肺鳞状细胞癌，宫颈癌，食道癌，肉瘤，生色团，肾细胞癌(RCC)，透明细胞RCC，乳头状RCC，葡萄膜黑色素瘤，睾丸生殖细胞瘤，低级别神经胶质瘤(LGG)，间皮瘤，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)，胸腺瘤腺样囊性癌(ACC)。
一些实施例中，所述癌症选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如，肺腺癌，肺鳞状细胞癌或肺大细胞癌。
在一些实施例中，受试者从免疫治疗复发或对免疫疗法难治。免疫疗法可以包括免疫检查点分子的调节剂。免疫检查点分子的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIM-3、LAG3、CD160、2B4、TGFβ、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、NKG2C、SLAMF7、NKp80、B7-H3、LFA-1、1COS、4-1BB、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT或CD83配体，且优选地，免疫检查点分子为PD-1，PD-L1或CTLA-4。免疫检查点分子的调节剂可以是抗体、抗体Fab片段、二价抗体、抗体药物缀合物、单链抗体、融合蛋白或四价抗体，优选地，免疫检查点分子的调节剂是单克隆抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，免疫检查点分子的调节剂为pembrolizumab、ipilimumab、nivolumab、atezolizumab、avelumab、durvalumab、AGEN-1884、BMS-986016、CS1001(WO2017020858A1，全部并入本文中)、CS-1002、LAG525、MBG453、MEDI-570、OREG-103/BY40、lirilumab、tremelimumab、JS001，SHR-1210、BGB-A317、IBI-308、REGN2810、JS003、SHR-1316、KN035或BMS-936559，优选地，免疫检查点分子的调节剂是pembrolizumab。
在一些实施例中，免疫疗法为PD-1/PD-L1阻断疗法。PD-1/PD-L1阻断疗法可包括，例如，抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
在一些实施例中，已确定受试者进一步具有KRAS突变。在不希望受任何理论约束的情况下，相信本文提供的MDM2抑制剂(例如式(I)化合物，尤其是化合物C)对治疗具有LKB1/STK11和KRAS共突变的癌症有效。在肺腺癌中，KRAS也经常与LKB1/STK11共突变，这种共突变已被认为是PD-1阻断治疗的主要原发性耐药性驱动因素(Skoulidis F等，CancerDiscov，(2018)8:822)。在某些实施例中，已确定受试者具有野生型或功能性p53。
在另一方面，本发明提供了一种在有需求的受试者中，诱发铁死亡的方法，包括向受试者施用有效量的MDM2抑制剂。
在另一方面，本发明提供了一种治疗或改善需要铁死亡的受试者中有益于铁死亡的疾病的效果的方法，包括向受试者施用有效量的MDM2抑制剂以诱导铁死亡。
在另一方面，本发明提供了一种治疗被鉴定为具有铁死亡敏感状况或癌症的受试者的方法，包括向该受试者施用有效量的MDM2抑制剂以诱导铁死亡。
在一些实施例中，通过增加脂质活性氧(ROS)来确定铁死亡的诱导。在一些实施例中，个体被鉴定为具有能够调节SLC7A11表达的野生型p53或p53突变体。
在一些实施例中，铁死亡敏感病症或癌症的特征在于活性或过度活性的脂质ROS产生。
在一些实施例中，铁死亡敏感病症或癌症的特征在于，具有一个或多个功能性或过度活性基因或基因产物，这些基因或基因产物选自血红素载体蛋白1、整合素、铁蛋白、铁转运刺激因子(SFT)、铁反应元件结合蛋白(IRP)、转铁蛋白、DMT1、ACSL4、CARS、ALOX、ATP5G3、CHAC1、CS、DPP4、GLS2、LPCAT3、NCOA4、RPL8、SAT1、TFRC和TTC35/EMC2。
在一些实施例中，过度激活的基因或基因产物过度表达或具有激活突变。
在一些实施例中，对铁死亡敏感的病症或癌症的特征在于在一个或多个基因或基因产物中具有降低的活性，所述基因或基因产物选自以下组：ZEB2、AKR1C1-3、SLC7A11、SLC3A2、GPX4、CD44v、CBS、CISD1、FANCD2、GCLC/GCLM、GSS、HMGCR、HSPB1/5、NFE2L2和SQS。
在一些实施方案中，对铁死亡敏感的癌症的特征在于在SLC7A11和/或GPX4活性降低。
在一些实施方案中，具有降低的活性的基因或基因产物表达不足或具有失活突变。
在一些实施方案中，对铁死亡敏感的病状或癌症的特征在于高间充质细胞状态。
在一些实施方案中，高间充质细胞状态的特征在于选自CD133，CD44，VIM，FN1，ZEB1，TWIST1，SNAI2和CDH2的一个或多个基因上调。
在一些实施例中，铁死亡敏感病症或癌症的特征在于以下一个或多个基因：RAS(例如KRAS和/或HRAS)、TFRC或MRP1的过度表达或激活突变。
在一些实施例中，受试者进一步被鉴定为在生物样品中具有功能性p53(例如野生型53)和/或KRAS中的一个或多个突变。
在一些实施例中，受试者被鉴定为在功能性LKB1/STK11中存在缺陷。
在一些实施例中，对铁死亡敏感的病症或癌症包括肺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、急性髓细胞白血病、肝细胞癌、横纹肌肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、卵巢癌、脑癌或乳腺癌。
在一些实施例中，MDM2抑制剂在抑制MDM2与p53结合方面具有不超过1μM(例如，不超过500nM、400nM、300nM、200nM、150nM、100nM、50nM、20nM、10nM或5nM)的IC50，如通过荧光偏振MDM2结合测定法所确定。
在一些实施例中，MDM2抑制剂包含如式(I)所示的化学结构式：
Figure BDA0002956500870000061
或者药学上可接受的盐，其中
Figure BDA0002956500870000062
选自包括以下基团的组
Figure BDA0002956500870000071
B是C4-7碳环；
R1为H，取代或未取代的C1-4烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，ORa或NRaRb；
n为0、1或2；
R2，R3，R4，R5，R7，R8，R9和R10独立地选自H，F，Cl，CH3和CF3；
R6是
Figure BDA0002956500870000072
或是
Figure BDA0002956500870000073
Ra是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rb是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rc和Rd是环B的一个碳原子上的取代基，其中
Rc是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；
Rd是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；要么
Rc和Rd与它们所连接的碳一起形成4至6元螺环取代基，可选地含有一个氧原子；和
Re是-C(＝O)ORa，-C(＝O)NRaRb或-C(＝O)NHSO2CH3。
在一些实施例中
Figure BDA0002956500870000074
是
Figure BDA0002956500870000075
B是
Figure BDA0002956500870000076
或
Figure BDA0002956500870000077
和
Rc和Rd是F和F,H和H,OH和CH3,OH和H,CH3和CH3,CH和OH,H和OH,CH2CH3和CH2CH3,或CH2OH和CH2OH.
在一些实施例中,
Figure BDA0002956500870000081
是H,CH3,或CH2CH3.
在一些实施例中，R2为H；R3是卤素；R4和R5为H。
在一些实施例中，R7为氟；R8，R9和R10各自为H；Re为-C(＝O)OH，-C(＝O)NH2或-C(＝O)NHSO2CH3。
在一些实施例中，MDM2抑制剂是选自以下的化合物
Figure BDA0002956500870000082
Figure BDA0002956500870000091
Figure BDA0002956500870000101
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，MDM2抑制剂是
Figure BDA0002956500870000102
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，MDM2抑制剂选自依沙那林(RG7388)，RG7112，HDM201，KRT-232，AMG 232，BI907828，SAR-405838(MI-77301)，MK-8242(SCH 900242))，DS3032-b，ALRN-6924和CGM097；或上述任何一项的化合物的可药用盐。
在一些实施例中，该方法还包括进一步施用有效量的一种或多种其他疗法。
在一些实施例中，一种或多种另外的疗法包括化学疗法，靶向的癌症疗法或使用免疫检查点分子的调节剂的疗法。
在一些实施例中，一种或多种其他疗法包括给予抗PD-1抗体，Bcl-2抑制剂，FAK抑制剂，MEK抑制剂或MET抑制剂。
在一些实施例中，Bcl-2抑制剂是具有下式的化合物D，或其药学上可接受的盐
Figure BDA0002956500870000111
化合物D：(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸。化合物D的合成的方法可参照WO2014/113413A1说明书的记载进行制备。
在一些实施例中，FAK抑制剂是具有下式的化合物E，或其药学上可接受的盐
Figure BDA0002956500870000112
化合物E：(5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2,4-二胺)，根据WO 2018/044767中描述的生产方法合成，其通过将其引用，整体并入本文并用于所有目的，以及或者类似的方法。
在一些实施例中，MEK抑制剂是曲美替尼，又称为Trametinib。
在一些实施例中，附加疗法包含不诱导铁死亡的抗癌剂。
在一些实施例中，附加疗法包含铁死亡诱导剂。
在一些实施例中，铁死亡诱导剂包含RSL3、阿替瑞他明、青蒿琥酯、丁硫氨酸亚砜肟、BAY 87-2243、细胞色素酶(e)、DP17伊拉斯汀、FIN56、兰帕立松、哌嗪偶联伊拉斯汀、咪唑酮伊拉斯汀、他汀类、柳氮磺胺吡啶、索拉非尼或阿法瑞林A。
在一些实施例中，铁死亡诱导剂为仑伐替尼(Lenvatinib)，他汀类药物为阿伐他汀(Atorvastatin)，或阿托伐他汀。
另一方面，本发明提供了一种用于预测癌症患者对MDM2抑制剂治疗的反应性的试剂盒，其包括：
a)一种或多种用于检测LKB1/STK11功能性中是否存在缺陷的试剂。
在一些实施例中，试剂盒还包括：
b)一种或多种用于检测p53功能性(例如野生型p53)是否存在的试剂。
在一些实施例中，试剂盒进一步包括：
c)一种或多种用于检测KRAS中一种或多种突变的试剂。
附图说明
图1A显示在肺腺癌中高频率发生LKB1/STK11突变，图1B显示TP53可能与LKB1/STK11在肺腺癌中共突变。
图2显示LKB1/STK11突变体A549，NCI-H2122和NCI-H460对化合物C敏感。
图3A显示化合物C处理后A549细胞系中相对脂质ROS水平结果。图3B显示化合物C处理后NCL-H460细胞系中相对脂质ROS水平结果。图3C显示化合物C处理后NCL-H1944细胞系中相对脂质ROS水平结果。图3D显示化合物C处理后NCL-H1666细胞系中相对脂质ROS水平结果。图3E显示化合物C处理后DV90细胞系中相对脂质ROS水平结果。图3F显示化合物C处理后NCL-H292细胞系中Western blot检测结果。图3G显示化合物C处理后DV90细胞系中Western blot检测结果。图3H显示化合物C处理后NCL-H226细胞系中Western blot检测结果。
图4为流式细胞分析结果。
图5为化合物处理细胞株后细胞凋亡结果。
图6A为A549细胞系WB结果，图6B为细胞存活率结果，图6C为流式细胞仪检测结果，图6D为用流式细胞仪Attune-NxT流式细胞仪检测脂质ROS结果。
图7为细胞凋亡和相对脂质ROS测试结果。
图8为化合物C，Trametinib单独或联合用药处理72小时细胞生存能力检测结果。
图9为化合物C，Trametinib单独或联合用药处理72小时细胞生存能力检测结果。
图10为化合物C，Trametinib单独或联合用药处理72小时细胞生存能力检测结果。
图11为化合物C，化合物D单独或联合用药处理72小时细胞生存能力检测结果。
图12为化合物C，化合物D单独或联合用药处理72小时细胞生存能力检测结果。
图13为化合物C，化合物D单独或联合用药处理72小时细胞生存能力检测结果。
图14为化合物c治疗LU5209，肿瘤体积变化结果。
图15为化合物C，Atorvastain和lenvatinib单独或联合处理后，肿瘤体积变化结果。
图16为化合物C，Atorvastain和lenvatinib单独或联合处理后，实验动物体重变化结果。
图17为化合物C，化合物E单独或联合处理后，肿瘤体积变化结果。
图18为化合物C，化合物E单独或联合处理后，实验动物体重变化结果。
图19为化合物C，RSL3，Atorvastain单独或联合处理后，肿瘤体积变化结果。
图20为化合物C，RSL3，Atorvastain单独或联合处理后，实验动物体重变化结果。
图21显示了本公开中提到的SEQ ID号的生物标志物的DNA编码序列和蛋白质(氨基酸)序列。
具体实施方式
I.定义
根据本公开并且如本文所使用，除非另有明确说明，否则以下术语具有以下含义。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语，符号和其他科学或医学术语或术语旨在具有化学和医学领域技术人员通常理解的含义。
这里使用的术语“生物标志物”或“生物标记物”是指作为某种生物状态或条件的可测量标志物的生物分子。本文中使用的术语“生物标志物”表示包含感兴趣的多核苷酸或多肽(例如由感兴趣的多核苷酸编码)。本文提供的生物标志物的实例可以是基因(例如基因组DNA、cDNA)或基因的产物，例如从该基因转录的mRNA和由该基因编码的蛋白质。本文提供的生物标志物的具体实例包括LKB1/STK11、p53和KRAS。
如本文所用，“MDM2”是鼠双微体2的缩写。术语MDM2旨在涵盖MDM2基因以及MDM2基因产物(例如mRNA，蛋白质)。人MDM2的示例性序列在NCBI登录号为ABT17086，ABT17084.1，ABT17085.1或ABT17083.1下可获得。
关于生物标志物的术语“水平”是指样品中存在的感兴趣的生物标志物的量或数量。这样的量或数量可以用绝对术语，即样品中生物标志物的总量，或以相对术语，即样品中生物标志物的浓度或百分比来表示。可以在DNA水平(例如，由染色体区域中基因的数量或拷贝数表示)，RNA水平(例如，mRNA量或数量)或蛋白质水平测量生物标志物的水平(例如蛋白质或蛋白质复合物的量或数量)。
关于生物标志物的术语“活性”是指如本文所述的蛋白质的生物活性(例如，催化或调节能力)。
如本文所用，关于受试者对治疗的反应的“可能性”和“可能”是对受试者中发生治疗反应的可能性的度量。它可以与“概率”互换使用。可能性指的是大于推测但小于确定性的概率。因此，如果理性的人使用常识，训练或经验得出的结论是，在给定情况下，则可能发生治疗反应。在一个实施例中，术语“可能性”和“可能”表示发生治疗反应的可能性的百分比。在一些实施例中，具有被鉴定为“可能应答”的癌症的受试者是指具有大于30％的机会，大于40％的机会，大于50％的机会，大于60％的机会，大于70％的机会，超过80％的机率，超过90％的机率的癌症受试者对治疗有反应。
在受试者对癌症疗法的治疗反应的上下文中使用的术语“反应性”或“反应”可互换使用，并且是指受试者对治疗的有益反应，而不是不利反应，即不良反应事件。在受试者中，有益反应可以根据许多临床参数来表达，包括可检测到的肿瘤丢失(完全缓解)，肿瘤大小和/或癌细胞数量减少(部分缓解)，肿瘤生长停滞(稳定疾病)，增强抗肿瘤免疫反应，可能导致肿瘤消退或排斥；在某种程度上减轻了与肿瘤有关的一种或多种症状；增加治疗后的生存时间；和/或治疗后给定时间点死亡率降低。肿瘤大小和/或癌细胞数量和/或肿瘤转移的持续增加表明缺乏对治疗的有益反应，并因此降低了反应性。
如本文所用，“癌症”或“肿瘤”是一个广泛的细胞恶性肿瘤的通用名称，其特征是细胞生长不受调控、缺乏分化，以及侵袭局部组织和转移的潜力或能力。这些肿瘤，恶性肿瘤的患病率以不同程度影响着身体的每一个组织和器官。肿瘤是指具有典型致癌细胞特征的细胞，如不受控制的增殖、不朽、转移潜能、快速生长和增殖速度，以及某些特征性的形态学特征。癌细胞通常以肿瘤的形式存在，但这些细胞可能单独存在，也可能作为独立的细胞在血流中循环，如白血病细胞。
如本文所用，“复发”是指受试者的疾病恢复到以前的疾病状态，特别是在明显恢复或部分恢复后症状的恢复。除另有说明外，复发状态是指在先前治疗包括但不限于化学治疗或免疫治疗之前，病情恢复或复发的过程。
如本文所用，“难治性”是指疾病或症状对治疗的抵抗或无反应性(例如，即使给予治疗，肿瘤细胞的数量也会增加)。除非另有说明，术语“难治性”是指对任何先前治疗包括但不限于化学疗法或免疫疗法的抵抗或无反应性。
如本文所用，“免疫疗法”系指包含免疫检查点分子的调节剂的疗法(例如抗癌疗法)。
如本文所用，“医药上可接受”成分是指适合与人类和/或动物一起使用，且不具有与合理的效益/风险比相称的不当副作用(例如毒性、刺激性和过敏反应)的成分。
术语“测定”、“测量”和“检测”可以互换使用，指定量和半定量测定或定性测定。
术语“杂交”是指至少部分互补的核酸分子链的结合、双工互补或配对。当存在足够的互补性以避免与非目标核酸序列的非特异性结合时，核酸链可以特异性地与目标核酸链杂交。
术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，或脱氧核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、控制区，任何序列、核酸探针和引物的分离RNA。核酸分子可以是线性的或环状的。
术语“互补性”是指通过传统的Watson-Crick或其他非传统类型在核酸序列和另一核酸序列之间进行碱基配对的能力。互补性可以是部分的，也可以是全部的。当一个或多个核酸碱基不符合碱基配对规则时，就发生了部分互补。互补百分比表示核酸分子中的核酸碱基配对百分比，它可以与第二个核酸序列(例如，10个碱基中的5、6、7、8、9、10个碱基配对为50％、60％>、70％>、80％>、90％和100％互补)形成碱基对(例如，Watson-Crick碱基配对)。
本文中使用的术语“预后”是指对疾病或条件的未来过程或结果的预测或预判。
一般来说，“蛋白质”是一种多肽(即至少两个氨基酸通过肽键相互连接)。蛋白质可以包括氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以其他方式处理或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(有或无信号序列)，或者可以是其功能部分。普通技术人员将进一步认识到，蛋白质有时可以包括多个多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式连接.
除非另有说明，否则本文中所使用的癌症“治疗”或“治疗方法”一词是指逆转、减轻、抑制或部分或完全阻止受试者中肿瘤、肿瘤转移或其他致癌或肿瘤细胞的生长。
如本文所用，“组合疗法”被理解为使用单独的制剂或单一的药物制剂给药两种或多种活性剂，或以任何顺序连续给药，使得两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性存在一段时间。本文设想，一种活性剂(例如，MDM2抑制剂)可以提高第二种药剂的活性，例如，可以使靶细胞(例如，癌细胞)对第二种药剂的活性敏感。联合疗法不要求药物同时、以相同的频率或以相同的给药途径给药。
术语“给药”、“施用”或“用药”，上述三者可以通用。包括向受试者系统或受试者体内或受试者上的特定区域递送药物成分或制剂的任何方法。给药可以是局部的，也可以是系统的。在某些实施例中，通过口服途径或注射途径(例如，静脉、肌肉、皮下、髓内、鞘内、脑室内、腹腔内、鼻腔内或眼内注射；直接注射到肿瘤；或静脉注射)。在某些实施例中，给药途径包括肺部给药、栓剂和经皮或经皮应用。给药可以由许多协同工作的人员代理或执行。给药包括，例如，给受试者开药和/或直接或通过另一受试者提供服用特定药物的指示，可以通过自我递送，例如通过口服、皮下递送、通过中心线静脉递送等方式。或由训练有素的专业人士递送，如静脉递送、肌内递送、瘤内递送、持续输注等。
如本文所用，术语“受试者”是指人类或任何非人类的动物或哺乳动物(例如，小鼠，大鼠，兔子，狗，猫，牛，猪，绵羊，马或灵长类动物)。在许多实施例中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指代医疗提供者提出以诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”互换使用。受试者可以患有疾病或病症或易患该疾病或病症，但是可以或可以不显示该疾病或病症的症状。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指以适用于任何治疗的合理的益处/风险比产生某种所需的局部或全身治疗作用的化合物的量。当施用于预防疾病时，该量足以避免或延迟疾病的发作。治疗有效量或有效量不需要治疗或预防疾病或病症的发生。在某些实施例中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数，溶解度等。
如本文所用，术语“烷基”是指直链和支链的饱和C1-10烃基，包括但不限于甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，2,2-二甲基丙基，正己基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，2,2-二甲基丁基，2,3-二甲基丁基，3，3-二甲基丁基和2-乙基丁基。
术语Cm-n表示指定的基团具有从“m”至“n”的碳原子范围，包括端点“m”和“n”。
术语“亚烷基”是指具有取代基的烷基。烷基，例如甲基，或亚烷基，例如-CH 2-，可被一个或多个，通常是1-3个独立选择的卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，羟基，烷氧基，硝基，氰基，烷基氨基或氨基取代。
如本文所用，关于化学基团的术语“取代的”是指化学基团上的一个或多个氢原子独立地被一个或多个取代基取代。如本文所用，术语“取代基”具有本领域已知的普通含义，并且是指与母体基团共价连接或酌情稠合的化学部分。
如本文所用，术语“螺环”是指具有两个仅通过一个碳原子连接的环的环系统。这样的环状部分可以基本上是碳环或杂环。螺环体系不包括其他具有共同两个或多个碳原子的双环化合物，例如萘。
如本文所用，术语“卤代”或“卤素”被定义为氟，氯，溴或碘。
如本文所用，术语“环烷基”是指包含三至八个碳原子的单环或双环，饱和或部分不饱和的环系统，包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基，任选地被一个或多个取代。例如独立地选择的卤素，三氟甲基，三氟甲氧基，羟基，烷氧基，硝基，氰基，烷基氨基或氨基中的一个或多个，典型地为一至三个。
如本文所用，术语“杂环烷基”是指包含4至12个总原子的单环或双环，饱和或部分不饱和的环系统，其中1-5个原子独立地选自氮，氧和硫和其余的原子是碳。杂环烷基的非限制性示例是氮杂环丁烷基，吡咯烷基，哌啶基，哌嗪基，二氢吡咯基，吗啉基，硫代吗啉基，二氢吡啶基，氧杂环庚基，二氧杂环庚基，硫代环庚基，二氮杂环庚基，其各自独立地被一个或多个选自以下的一个或多个取代，环原子上的C1-6烷基，C 1-6烷氧基，氰基，氨基，氨基甲酰基，硝基，羧基，C 2-7烯基，C 2-7炔基等。
在本申请中所有出现一系列列举的数值的情况下，应理解，任何列举的数值可以是数值范围的上限或下限。还应当理解，本发明涵盖所有这样的数值范围，即具有上限和下限的组合的范围，其中上限和下限中的每一个的数值可以是任何数值。本文叙述的数值。本文提供的范围应理解为包括该范围内的所有值。例如，将1-10理解为包括所有值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，以及适当的分数。类似地，由“至少”界定的范围应理解为包括所提供的较低值和所有较高数字。
如本文所用，“大约”应理解为在特定领域中包括在平均值的三个标准偏差之内或在公差的标准范围之内。在某些实施例中，大约应理解为不大于0.5的变化。
冠词“一”和“一个”在本文中用于指代该冠词的语法对象中的一个或多个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或一个以上元件。
术语“包括”在本文中用来表示短语“包括但不限于”并且与它们互换使用。类似地，“诸如”在本文中意指短语“诸如但不限于”并且可互换地使用。
除非上下文清楚地另外指出，否则术语“或”在本文中被包含性地用来表示术语“和/或”，并且可以与术语“和/或”互换使用。
II.病人的鉴别，治疗和预后
本文描述了鉴定可能对MDM2抑制剂的治疗有反应的癌症患者的方法，用MDM2抑制剂治疗的癌症患者的方法，以及预测癌症患者对用MDM2抑制剂治疗的反应性的试剂盒。
先前已经描述了MDM2抑制剂作为抗癌治疗剂(参见，例如，美国专利号9,745,314，其全部内容通过引用并入本文)，并且正在人类中作为单一疗法或与治疗疾病和病症的标准抗癌药联合使用，其中抑制MDM2以及和MDM2相关蛋白的活性为癌症治疗提供了益处。发明人惊奇地发现的，在功能性LKB1/STK11缺乏的患有癌症的受试者可能对MDM2抑制剂的治疗有反应。
在一方面，本文提供一种鉴定患有癌症的受试者的方法，该受试者可能对用MDM2抑制剂的治疗有反应。在某些实施例中，该方法包括：提供来自受试者的生物样品；和在生物样品中确定功能性LKB1/STK11是否不足；并根据生物学样品中发现的功能性LKB1/STK11缺乏症，确定受试者可能对MDM2抑制剂的治疗有反应。在某些实施例中，该方法进一步包括向鉴定为可能对MDM2抑制剂的治疗有反应的受试者施用治疗有效量的MDM2抑制剂。
在另一方面，本文提供选择患有癌症的受试者以用MDM2抑制剂治疗的方法。在某些实施例中，该方法包括：提供来自受试者的生物样品；和在生物样品中确定：功能性LKB1/STK11是否存在不足或缺陷；然后根据生物样品中发现的功能性LKB1/STK11的不足或缺陷，来选择要使用MDM2抑制剂治疗的对象。在某些实施例中，该方法进一步包括将治疗有效量的MDM2抑制剂给予所选择的受试者。
在另一方面，本文提供了预测患有癌症的受试者对用MDM2抑制剂治疗的反应性的可能性的方法。在某些实施例中，该方法包括：提供来自受试者的生物样品；以及在生物样品中确定功能性LKB1/STK11是否不足；并根据生物学样品中发现的功能性LKB1/STK11的缺乏来预测受试者可能对MDM2抑制剂的治疗有反应。
在另一方面，本文提供了用MDM2抑制剂治疗患有癌症的受试者的方法。在某些实施例中，该方法包括：在来自受试者的生物样品中确定功能性LKB1/STK11是否缺乏；基于所述生物样品中发现的功能性LKB1/STK11的不足，以治疗有效量向所述受试者给予MDM2抑制剂。
在另一方面，本文提供了一种用MDM2抑制剂治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的MDM2抑制剂，其中该受试者已被确定：来自受试者的生物样品中缺乏功能性LKB1/STK11。
如本文所用，“LKB1/STK11”是指丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK11，其还已知为例如：极化相关蛋白LKB1，肝激酶B1，肾癌抗原NY-REN-19，PJS。术语LKB1/STK11旨在涵盖LKB1/STK11基因(例如，基因组DNA，cDNA)，以及LKB1/STK11基因产物(例如，从基因转录的mRNA，该基因编码的蛋白质)。术语“LKB1/STK11”，“LKB1”和“SKT11”可以互换使用。人LKB1/STK11的示例序列可在UniProtKB数据库中获得，登录号为Q15831(STK11-HUMAN)，在GenBank数据库中，NCBI登录号为AAB97833.1。
如本文所用，术语LKB1/STK11旨在涵盖野生型LKB1/STK11和LKB1/STK11的变体。在某些实施例中，野生型LKB1/STK11的基因包含SEQ ID NO：1的DNA序列。在某些实施例中，野生型LKB1/STK11的蛋白质包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
如本文所用，术语“变体”是指与相应的野生型基因或其产物具有基本上同源的序列(例如，编码序列)并且具有与所述野生型基因的同源的功能性的基因或基因产物的野生型对应物。通常，通过序列比对程序确定，本文公开的特定生物标记的变体将与生物标志物的序列具有至少约50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，为94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的同一性。变体可以包括例如等位基因变体，保守取代变体和同源物，其可以通过本领域已知的方法分离/产生并表征。
LKB1/STK11通过激活靶标(包括直接通过磷酸化作用的5'-腺苷单磷酸激活蛋白激酶(AMPK)和与AMPK相关的激酶)在各种过程中发挥作用，例如细胞代谢，细胞极性，凋亡和DNA损伤应答(Williams T.，et al。，Trends in cell Biology，(2008)18：193)。
术语“功能性LKB1/STK11”是指野生型LKB1/STK11和任意LKB1/STK11变体具有至少30％，40％，50％，60％，优选至少70％，80％，更优选至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高的野生型LKB1/STK11活性。
如本文所用，关于生物标志物(例如LKB1/STK11)的“缺乏”，缺陷或“不足”是指生物标志物的活性或水平不足，并且可以包括例如小于正常活性或水平，或者生物标志物的活性或水平不存在或为空。如本文所用，术语“功能性LKB1/STK11的不足”是指生物学样品中功能性LKB1/STK11的水平或活性不足。
III.样品制备
在某些实施例中，本文提供的方法包括提供来自受试者的生物样品。
可从受试者获得适合进行本文提供的方法的任何生物样品。如本文所用，“生物样品”是指通过从受试者采样而任选地进行额外处理而获得的生物样品。在某些实施例中，样品可以是包含癌细胞或非癌细胞的生物学样品。例如，非癌细胞可以来自与发现癌细胞相同的组织或器官。例如，在一些实施例中，生物学样品是通过肿瘤活检或细针抽吸，从肿瘤组织获得的新鲜或存档的样品。在一些实施例中，样品可以是含有癌细胞或非癌细胞(例如，外周血单核细胞(PBMC))的任何生物流体。按照通常在医院或诊所之后，例如在活检期间遵循的标准方案从受试者收集样品。生物样品的实例包括但不限于体液，例如血液，血浆，血清，尿液，阴道液，子宫或阴道冲洗液，多种液体，腹水，脑脊髓液，唾液，汗液，眼泪，痰，支气管肺泡灌洗液液体等，以及组织，例如活检组织(例如，活检的骨组织，骨髓，乳腺组织，胃肠道组织，肺组织，肝组织，前列腺组织，脑组织，神经组织，脑膜组织，肾组织，子宫内膜组织，子宫颈扩散，淋巴结组织，肌肉组织或皮肤组织)，石蜡包埋组织。在另一个实施例中，生物样品包含细胞，组织，血液，血浆，血清，尿液，漱口水，粪便，唾液及其任何组合。在另一个实施例中，生物学样品是血液，血浆，血清或尿液。在一个优选的实施例中，生物样品是血液。在另一个优选的实施例中，生物学样品是肿瘤组织。
在某些实施例中，可以通过用于确定至少一种生物标志物(例如LKB1/STK11)的遗传状态，活性或水平的方法进一步处理样品。
在某些实施例中，该方法还包括从生物液体样品(例如外周血样品)或从受试者获得的组织样品中分离或提取癌细胞(例如循环肿瘤细胞)。癌细胞可以通过免疫磁分离技术来分离，例如可利用IMMUNICON公司(宾夕法尼亚州，亨廷顿谷)提供的技术。
在某些实施例中，可以对组织样品进行处理以进行原位杂交。例如，可以在将组织样品固定在玻璃显微镜载玻片上之前利用石蜡包埋，然后用溶剂(通常为二甲苯)脱蜡。
在某些实施例中，如果要测量生物标志物的RNA或DNA水平，该方法还包括从样品中分离核酸。各种提取方法适用于从细胞或组织中分离DNA或RNA，例如苯酚和氯仿提取，以及其他各种方法，例如AUSUBEL等人，CURRENT PROTOCOLS OF MOLECULAR BIOLOGY(1997)JOHN WILEY&SONS，以及SAMBROOK和RUSSELL，《分子克隆：实验室手册》第3版。(2001)中所述。
市售试剂盒也可用于分离RNA，包括例如NucliSens提取试剂盒(Biomerieux，Marcy l'Etoile，法国)，QIAampTM微型血液试剂盒，Agencourt GenfindTM，
Figure BDA0002956500870000231
微型柱(Qiagen)，
Figure BDA0002956500870000232
RNA微型试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和EppendorfPhase Lock Gels TM。具有经验的技术人员可以按照制造商的规程或说明书轻松提取或分离RNA或DNA。
IV.生物标志物的确定、测量和检测
在某些实施例中，本文提供的方法包括在生物学样品中确定功能性LKB1/STK11是否不足。功能性LKB1/STK11的不足或缺乏可能是由于，例如，LKB1/STK11中存在一个或多个失活突变，LKB1/STK11的启动子或其他顺式调控元件中存在负性改变(例如，高甲基化)，复制减少LKB1/STK11的数目，LKB1/STK11的mRNA水平或蛋白水平降低，和/或LKB1/STK11的蛋白活性降低。
在某些实施例中，可以通过LKB1/STK11中一种或多种失活突变的存在来指示功能性LKB1/STK11的缺陷。因此，本文提供的方法可以包括检测生物学样品中LKB1/STK11中一种或多种失活突变的存在的步骤，其中STK 11中失活突变的存在指示功能性STK 11的缺陷。
如本文所用，关于生物标志物的术语“失活突变”是指导致生物标志物的基因或基因产物的功能或活性的至少部分(或完全)丧失的突变，或导致生物标志物的功能基因或基因产物无功能，或导致基因表达降低(例如LKB1/STK11mRNA或蛋白质丰度降低)。生物标志物的受影响基因或基因产物的活性和/或水平将大大低于野生型对应物，甚至被消除。
在某些实施例中，失活突变降低了LKB1/STK11的活性，例如，LKB1/STK11的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。在某些实施例中，失活突变降低了LKB1/STK11 mRNA表达或蛋白质表达。
在某些实施例中，LKB1/STK11中的失活突变可以是缺失，插入，取代或上述该突变的任何组合。失活突变可影响例如编码序列，RNA剪接位点，启动子或其他顺式调控元件。在一些实施例中，所述突变是LKB1/STK11所在的染色体19p13的大缺失。这些大的缺失可以跨越整个染色体或染色体的一条臂。在一些实施例中，突变可以较小，例如缺失少于1,000个碱基对。例如，较小的缺失可以靶向LKB1/STK11的一个或仅几个外显子，或者可以是不靶向LKB1/STK11的编码序列的LKB1/STK11的启动子中的缺失。除较大的缺失外，失活突变可以是点突变和小的插入/缺失突变。
如本文所用，“取代”是这样的突变，其在多核苷酸序列中将一个核碱基替换为另一个，或在多肽序列中将一个氨基酸残基替换为另一个。多核苷酸序列的取代可以为：1)将密码子更改为编码不同氨基酸残基的密码子，因此将导致所产生蛋白质的氨基酸序列发生变化(“错义突变”)，或2)更改为可编码相同的氨基酸残基，从而不改变所产生的蛋白质(“同义突变”)；或3)将氨基酸编码密码子更改为单个“终止”密码子，并导致蛋白质不完整(蛋白质不完整通常是无功能的)(“无义突变”)。
如本文所用，“插入”是这样的突变，其中一个或多个额外的核碱基对被插入多核苷酸序列中，或者其中一个或多个氨基酸残基被插入多肽序列。
如本文所用，“缺失”是其中一个或多个核碱基对从多核苷酸序列丢失或缺失，或其中一个或多个氨基酸残基从多肽序列缺失的突变。
在某些实施例中，多核苷酸序列中的插入或缺失可引起移码，其改变密码子的阅读框并导致与原始密码子完全不同的基因翻译产物。这通常会产生截短的蛋白质，从而导致功能丧失。
迄今为止，已经鉴定出LKB1/STK11中的多种突变。例如，在《癌症体细胞突变目录》(COSMIC)数据库中发布的各种癌症样本中已鉴定出超过727种LKB1/STK11突变，该数据库可从以下网站链接获得：(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis？ln＝STK11)。
表1 LKB1/STK11中的突变
Figure BDA0002956500870000251
Figure BDA0002956500870000261
应该理解，本公开不限于任何特定的LKB1/STK11突变。LKB1/STK11的任何失活突变均可用于本公开。在一些实施例中，LKB1/STK11中的失活突变包括但不限于表1中的一个或多个突变。在某些实施例中，LKB1/STK11中的失活突变包括选自表1中列出的突变。
如表1所示，多肽序列中的取代可表示为AnB，其中“n”是指示多肽序列中第n个氨基酸残基的数字，“A”是在野生型多肽序列中第n个残基处的氨基酸残基，“B”是在第n个残基处的突变的氨基酸残基。当突变的残基显示为“*”时，是指导致核苷酸序列中无义密码子的突变，其导致截短的不完整多肽。例如，“S19P”表示第19个氨基酸残基丝氨酸(S)变为脯氨酸(P)；“E33*”表示编码氨基酸残基33(谷氨酸，E)的核苷酸变为终止密码子，并且所得到的多肽被截短。
多肽中的移码由“AnBfs*m”表示，表示阅读框中的移码起始于第n个氨基酸残基，终止于下游的第m个残基，导致蛋白质的过早终止，其中“A”和“B”具有与上述相同的含义。“I35Lfs*127”表示从作为第一个受影响的氨基酸残基的氨基酸残基35(异亮氨酸，I)开始并在下游终止127个残基的移码。
多肽的缺失在缺失位点侧翼的氨基酸残基编号之后用“del”表示。例如，“E98_G155del”表示氨基酸残基98-155被缺失。
多肽序列中的插入可以由插入位点侧翼的氨基酸残基编号之后的“ins”表示，随后是插入的氨基酸残基。
在一些实施例中，失活突变可以是单拷贝或双拷贝突变。因此，即使仅引起单倍体剂量不足，该突变也可能是失活的。因此，失活突变可以具有LKB1/STK11的纯合缺失突变，LKB1/STK11的一个等位基因的缺失突变和另一个等位基因的点突变，或LKB1/STK11的杂合突变。
在某些实施例中，功能性LKB1/STK11的缺陷可以通过在生物学样品中LKB1/STK11的启动子或其他顺式调节元件中存在负性改变(例如，高甲基化)来表明。因此，为了确定生物学样品中功能性LKB1/STK11是否缺乏，本文提供的方法可以包括确定LKB1/STK11的启动子或其他顺式调控元件是否被负向调节，从而导致LKB1/STK11表达的降低。在某些实施例中，本公开的方法包括确定LKB1/STK11的启动子在生物样品中是否被超甲基化，其中启动子中的超甲基化指示功能性LKB1/STK11的缺陷。
在某些实施例中，功能性LKB1/STK11的缺乏可以通过生物样品中的功能性LKB1/STK11的水平显示出来。因此，本文提供的方法可以包括确定生物学样品中的功能性LKB1/STK11的水平相对于参考水平是否降低的步骤，其中LKB1/STK11的水平降低，指示功能性LKB1/STK11的缺乏。在某些实施例中，功能性LKB1/STK11的水平包括功能性LKB1/STK11的基因拷贝数，mRNA表达水平或蛋白质表达水平。在某些实施例中，功能性LKB1/STK11包括野生型LKB1/STK11。
如本文所用，“拷贝数”是指个体基因组中特定基因或特定基因组序列的拷贝数。拷贝数变化(CNV)”或“拷贝数改变(CNA)”是指特定基因或特定DNA序列从一个个体到另一个体的拷贝数的变化。例如，尽管认为基因在每个基因组中以两个拷贝出现，但是发现一些基因或基因组序列以一个，三个或三个以上的拷贝中存在，或者甚至在不同个体中缺失(即0个拷贝)。
在某些实施例中，本公开的方法包括测量LKB1/STK11的表达水平或基因拷贝数变异。不希望受到任何理论的束缚，发现在某些情况下，LKB1/STK11突变可导致LKB1/STK11mRNA或蛋白质表达的减少或丢失，而在另一些情况下，LKB1/STK11启动子的超甲基化也可能导致mRNA或蛋白质水平降低。
在某些实施例中，本公开的方法包括测量LKB1/STK11的生物学活性。测定，监测和调节活性的方法描述于例如美国专利申请US20050026233A1或PCT申请WO2004113562A1。例如，可以通过在允许磷酸化的条件下使样品与底物激酶接触，并通过监测磷酸盐掺入底物激酶中来检测生物样品中的LKB1/STK11活性，其中磷酸盐掺入底物激酶中表示LKB1/STK11具备活性。优选地，底物激酶是或源自AMPK。
在本文提供的某些实施例的方法中，确定步骤还包括在生物学样品中确定p53是否为功能性p53，其中功能性p53的存在指示对MDM2抑制剂反应的可能性。在某些实施例中，功能性p53包含野生型p53。
术语“p53”和“TP53”在本文可互换使用，是肿瘤蛋白p53的缩写。替代名称包括例如抗原NY-CO-13，磷蛋白p53，肿瘤抑制物p53和细胞肿瘤抗原p53。TP53和p53均可指生物标志物p53的蛋白质或DNA或RNA序列。人p53的示例序列可在UniProtKB数据库中获得，登录号为P04637(P53-HUMAN)，在Genbank中，NCBI登录号为AYF55702.1，或AXU92429.1。
p53是一种转录因子，其能够调节许多基因，所述基因调节例如：细胞周期和凋亡。p53蛋白受MDM2控制。通过结合p53，MDM2抑制p53反式激活。此外，作为E3泛素连接酶的MDM2也将p53靶向蛋白体细胞质降解。因此，阻断p53-MDM2相互作用可以减少对p53功能的负面调节，并使p53介导其下游功能。因此，功能性p53的存在对MDM2抑制剂的治疗应答是有益的。用作本文生物标志物的p53可以是p53蛋白以及编码p53蛋白的多核苷酸(例如DNA或RNA)。在某些实施例中，编码p53的基因在本公开中可以称为TP53。在某些实施例中，p53的基因包含SEQ ID NO：3的基因序列。在某些实施例中，p53的蛋白质包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
如本文所用，术语“功能性p53”是指野生型p53和p53的突变体或等位基因变体，其保留了至少约5％，例如至少约10％大约20％，大约30％，大约40％，大约50％，大约60％，大约70％，大约80％，大约90％或更多的野生型p53活性。
在某些实施例中，本文提供的方法还包括在生物学样品中确定功能性p53(例如野生型p53蛋白或TP53基因)的存在与否。在某些实施例中，本公开的方法包括在生物学样品中确定p53是否为野生型(例如野生型p53蛋白或TP53基因)。
在一些实施例中，待与MDM2抑制剂一起施用的受试者在生物样品中具有或进一步确定具有功能性p53(例如野生型p53蛋白或TP53基因)。
在本文提供的方法的某些实施例中，确定步骤进一步包括在生物样品中确定在KRAS中是否存在一种或多种失活突变。
如本文所用，“KRAS”是GTPase KRas的缩写。术语KRAS旨在涵盖KRAS基因以及KRAS基因产物(例如mRNA，蛋白质)。人KRAS的示例序列可在UniProtKB数据库中获得，登录号为P01116(RASK-HUMAN)，在GenBank数据库中，NCBI登录号为AAM12631.1。KRAS蛋白将GTP转换为GDP，以修饰从细胞质到细胞核的转导信号，并且是RAS/MAPK信号通路调节细胞增殖和分化的一部分。当KRAS发生突变时，GTP被维持，RAS/MAPK信号通路持续处于“活跃”状态，从而导致不受控制的细胞增殖。尽管已认识到KRAS突变在癌症恶性肿瘤中的重要性，但在过去的几十年中，持续的努力并未能为KRAS突变癌症开发出获得批准的疗法(Liu P等，ActaPharmaceutica Sinica B(2019)9：871)。KRAS突变已被视为对癌症治疗反应不良的指标，例如在非小细胞肺癌患者中使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗(Massarelli E等人，Clinical Cancer Research(2007)13：2890)。
在本文提供的方法中测量的KRAS可以是KRAS蛋白以及编码KRAS蛋白的多核苷酸(例如DNA或RNA)。在某些实施例中，KRAS的基因包含SEQ ID NO：5的基因序列。在某些实施例中，KRAS的蛋白质包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在一些实施例中，确定步骤还包括在生物样品中确定KRAS中一种或多种突变的存在，其中KRAS中一种或多种突变的存在指示对治疗产生反应的可能性是MDM2抑制剂。
一些实施例中，待与MDM2抑制剂一起施用的受试者，在生物样品中具有或被进一步确定具有KRAS中的一种或多种突变。
本文提供的生物标志物LKB1/STK11，以及在某些实施例中，其他生物标志物例如p53和/或KRAS，旨在涵盖不同形式，包括mRNA，蛋白质以及DNA(例如基因组DNA)。因此，这些生物标志物的水平和/或活性可以用相应生物标志物的RNA(例如mRNA)，蛋白质或DNA(例如基因组DNA)来测量。类似地，生物标志物的突变状态和/或野生型状态也可以用DNA(例如基因组DNA)，RNA(例如mRNA)或蛋白质来测量(例如通过测量由突变基因编码的改变的蛋白质产物)。
可以通过本领域已知的任何方法来测量DNA或RNA水平上的生物标志物(包括本文提供的LKB1/STK11，p53和/或KRAS)的突变状态，例如但不限于扩增测定，杂交测定或测序测定。蛋白质水平的突变状态可以通过本领域已知的任何方法来测量，例如但不限于免疫测定。
DNA或RNA水平的生物标志物(包括本文提供的LKB1/STK11，p53和/或KRAS)的表达水平可以通过本领域已知的任何方法来测量，例如包括但不限于，扩增测定，杂交测定或测序测定。可以通过本领域已知的任何方法，例如但不限于免疫测定，来测量蛋白质水平上的生物标志物(包括本文提供的LKB1/STK11，p53和/或KRAS)的表达水平。
生物标志物的活性水平可以通过本领域已知的合适的功能测定法来测量，例如但不限于通过磷酸化测定法。
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot，WB。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。其方法可以通过本领域技术手册查询。
这些方法在本领域中是众所周知的，并且在下面作为示例性说明进行详细描述。
(A)扩增分析
核酸扩增测定法涉及复制靶核酸(例如DNA或RNA)，从而增加扩增的核酸序列的拷贝数，扩增可以是指数的或线性的。示例性核酸扩增方法包括但不限于使用聚合酶链反应的扩增(“PCR”，参见美国专利4,683,195和4,683,202；PCR方案：方法和应用指南(INNIS等，EDS，1990)。)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，实时定量PCR(QRT-PCR)；定量PCR(例如
Figure BDA0002956500870000311
巢式PCR，连接酶链反应(参见ABRAVAYA，K.等人，NUCLEIC ACIDS RESEARCH，23：675-682，(1995))，分支DNA信号扩增(参见URDEA，MS，ET AL。，AIDS，7(SUPPL 2)：S11-S14，(1993)，可扩增的RNA报告基因，Q-BETA复制(参见LIZARDI ET AL。，BIOTECHNOLOGY(1988)6：1197)，基于转录的扩增(参见，KWOH等，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1989)86：1173-1177)，自返式DNA扩增，链置换激活，循环探针技术，自我维持的序列复制(GUATELLI等，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA，1989：86：1173-1177).NATL.ACAD.SCI.USA(1990)87：1874-1878)，滚环复制(美国专利号5,854,033)，基于等温核酸序列的扩增(NASBA)和基因表达的系列分析(SAGE)。
在一些实施例中，为了测量生物标志物的mRNA水平，在扩增之前将生物标志物的靶RNA逆转录为CDNA。可以使用各种逆转录酶，包括但不限于，MMLV RT，MMLV RT的RNASE H突变体，例如SUPERSCRIPT和SUPERSCRIPT II(LIFE TECHNOLOGIES，GIBCO BRL，GAITHERSBURG，MD)，AMV RT，热稳定逆转录酶来自嗜热栖热菌。例如，可用于将RNA转化为CDNA的一种方法是改编自SUPERSCRIPT II预扩增系统(LIFE TECHNOLOGIES，GIBCO BRL，GAITHERSBURG，MD；目录号18089-011)的方案，如RASHTCHIAN，A.PCR METHODS APPLIC.，4：S83-S91，(1994)所述。
在某些实施例中，在核酸扩增测定后定量生物标志物的RNA(例如MRNA)的表达水平或DNA的拷贝数变异。例如，可以在琼脂糖凝胶上分离扩增的产物，并用溴化乙锭染色，然后使用标准凝胶电泳方法进行检测和定量。或者，可以用合适的可检测标记物(例如，放射性或荧光核苷酸)整体标记扩增的产物，然后使用X射线胶片或在合适的刺激光谱下实现可视化。
在某些实施例中，在核酸扩增测定期间定量生物标志物的RNA(例如，mRNA)的表达水平或DNA的拷贝数变异，这也称为实时扩增或定量扩增。定量扩增的方法公开于例如美国专利第6,180,349号；和6,033,854；和5,972,602，以及例如在GIBSON等人，GENOMERESEARCH(1996)6：995-1001；DEGRAVES等人，BIOTECHNIQUES(2003)34(1)：106-10、112-5；J.MED.CHEM.SOC。，2003，34：1。DEIMAN B等人，MOL BIOTECHNOL.(2002)20(2)：163-79所述。定量通常基于对可检测信号的监测，所述可检测信号代表扩增(例如PCR)反应循环中模板的拷贝。可通过插入试剂(例如SYBR GREENTM和SYBR GOLDTM)或扩增过程中使用的标记引物或标记探针产生可检测信号。
在某些实施例中，标记的引物或标记的探针包含含有荧光团的可检测标记。在某些实施例中，标记的引物或标记的探针可以进一步包含淬灭剂物质。一个引物或探针中同时存在荧光团和淬灭剂物质(“双标记”)可能有助于提供一种自动猝灭探针，例如TAQMAN(美国专利号5,210,015和5,538,848)或MOLECULAR BEACON探针(美国专利号5,118,801和5,312,728)，或其他无茎或线性信标探针(LIVAK等，1995，PCR METHOD APPL.，4：357-362；TYAGI等，1996，NATURE BIOTECHNOLOGY，14：303-308)；NAZARENKO等，1997，NUCL.ACIDSRES.，25：2516-2521；美国专利号5,866,336和6,117,635)。在完整的引物或探针中，猝灭剂物质和荧光团非常接近，因此当荧光团被辐射激发时，它会通过荧光共振能量转移(FRET)将能量转移到同一探针中的猝灭剂物质，从而完成不发出信号。
在定量扩增测定法(例如实时PCR)中，可以使用本领域已知的方法定量RNA的表达水平(例如MRNA)或生物标志物的DNA的拷贝数变化。例如，在扩增期间，可以在每个PCR循环期间监测和计算荧光信号。可以进一步计算阈值周期或CT值。CT值是荧光与预定值相交的周期。可以使用标准曲线将CT与核酸的初始量或起始细胞数相关。构建标准曲线以关联CT值与所测生物标志物的对数水平之间的差异。
作为质量控制措施，可以测量内部对照生物标志物的表达水平或拷贝数变化。本领域技术人员可以理解，内部对照生物标志物可以固有地存在于样品中，并且其表达水平或拷贝数变化可用于归一化所关注的生物标志物的测量表达水平或拷贝数变化，以抵消生物标志物样品在绝对量中的任何差异。
(B)杂交分析
核酸杂交测定法使用探针与靶核酸杂交，从而允许检测靶核酸。杂交测定的非限制性示例包括：NORTHERN印迹，SOUTHERN印迹，原位杂交，微阵列分析和基于多重杂交的测定。
在某些实施例中，用于杂交测定的探针被可检测地标记。在某些实施例中，用于杂交测定的基于核酸的探针是未标记的。这种未标记的探针可以固定在固体支持物如微阵列上，并且可以与可检测地标记的靶核酸分子杂交。
在某些实施例中，可以通过分离核酸(例如RNA或DNA)，分离核酸(例如通过凝胶电泳)，然后将分离的核酸转移到合适的膜滤器(例如硝酸纤维素滤器)上来进行杂交测定，其中探针与靶核酸杂交并允许检测。参见，例如，《分子克隆：实验室手册》，J.SAMBROOK等人编辑，第二版，冷泉港实验室出版社，1989，第7章。可以检测到探针和靶核酸的杂交或通过本领域已知的方法测定。例如，可以通过将杂交的介质暴露于胶卷进行杂交的放射自显影检测，经由杂交介质曝光的照相胶片的光密度扫描提供了靶核酸水平的准确测量。计算机成像系统也可以用于量化生物标志物的水平。
在一些实施例中，可以在微阵列上进行杂交测定。微阵列提供了一种同时测量大量靶核酸分子水平的方法。靶核酸可以是RNA，DNA，从MRNA逆转录的CDNA或染色体DNA。可以使靶核酸与包含底物的微阵列杂交，所述底物，具有以每平方厘米底物表面多达几百万个探针的密度，排列的多个固定的核酸探针。样品中的RNA或DNA与阵列上的互补探针杂交，然后通过激光扫描进行检测。确定阵列上每个探针的杂交强度，并将其转换为代表RNA或DNA相对水平的定量值。参见美国专利号6,040,138、5,800,992和6,020,135、6,033,860和6,344,316。
使用机械合成方法合成这些阵列的技术在例如美国专利5384261中有所描述。尽管经常采用平面阵列表面，但是该阵列可以被制造在实际上任何形状甚至是曲面的表面上。阵列可以是在珠子，凝胶，聚合物表面，诸如光纤，玻璃纤维或任何其他合适的基底上的肽或核酸，参见美国专利号5,770,358、5,789,162、5,708,153、6,040,193和5,800,992。可以以允许利用全包设备进行诊断或其他操作的方式包装阵列。有用的微阵列也是可商购的，例如，购自Affymetrix的微阵列，购自Nano String Technologies，Panomics的QuantiGene 2.0Multiplex Assay。
在某些实施例中，杂交测定可以是原位杂交测定。原位杂交测定法可用于检测感兴趣的生物标志物(例如LKB1/STK11)位点存在的拷贝数变化(例如增加或扩增)。用于原位杂交测定的探针可以是基因座特异性探针，其与染色体上的特定基因座杂交以检测是否存在特定目的基因座(例如LKB1/STK11)。其他类型的探针也可能有用，例如，染色体计数探针(例如可与感兴趣的染色体中的重复序列区域杂交，以指示整个染色体的存在或不存在)和染色体臂探针(例如可与染色体区域杂交)并指出是否存在特定染色体的臂)。在美国专利No.5,200,300中描述了使用独特序列探针进行原位杂交的方法。美国专利号5,447,841，通过引用并入本文。可以使用荧光显微镜和适用于每种荧光团的滤光片查看探针，或者使用双或三个带通滤波器组来观察多个荧光团。例如，参见美国专利No.授予Bittner等人的美国专利No.5,776,688，其通过引用并入本文。任何合适的显微成像方法都可以用于可视化杂交探针，包括自动数字成像系统。或者，可以使用诸如流式细胞术的技术来检查探针的杂交模式。
(C)测序方法
测序方法允许确定靶核酸的核酸序列，并且还允许对测序的靶核酸进行计数，从而测量靶核酸的表达水平。测序方法的实例包括但不限于RNA测序，焦磷酸测序和高通量测序。
高通量测序涉及合成测序，连接测序和超深度测序(例如Marguiles等人，Nature437(7057)：376-80(2005)中所述)。逐个合成涉及通过在聚合酶扩增中掺入标记的核苷酸或核苷酸类似物来合成靶核酸的互补链。在成功掺入标记核苷酸之后或之后，立即测量标记的信号并记录核苷酸的成分。在重复掺入，检测和鉴定步骤之前，除去掺入核苷酸上的可检测标记。逐合成方法的例子是本领域已知的，并且例如在美国专利No.美国专利号7,056,676 8,802,368和美国专利No.美国专利No.7,169,560，其内容通过引用并入本文。可以使用折返PCR和锚定引物在固体表面(或微阵列或芯片)上进行合成测序。靶核酸片段可通过与锚定的引物杂交而附着于固体表面，并桥接扩增。例如，该技术可以在
Figure BDA0002956500870000351
测序平台中使用。
焦磷酸测序涉及在聚合酶存在下，通过顺序地掺入对应于碱基A，C，G和T(U)的脱氧核苷酸三磷酸，使靶核酸区域与引物杂交并延伸新链。每次掺入碱基都伴随着焦磷酸盐的释放，而焦磷酸的释放则被巯基化酶转化为ATP，从而推动了氧化荧光素的合成和可见光的释放。由于焦磷酸盐的释放与掺入的碱基数等摩尔，因此发出的光与在任一步骤中添加的核苷酸数成正比。重复该过程，直到整个序列被确定。
在某些实施例中，本文所述的突变和/或野生型状态的检测和感兴趣的生物标志物水平的测量是通过全转录组测序或RNA测序(例如RNA-SEQ)进行的。现有技术已经描述了RNA测序的方法(参见WANG Z，GERSTEIN M和SNYDER M，NATURE REVIEW GENETICS(2009)10：57-63；MAHER CA等人，NATURE(2009)458：97-101；KUKURBA K&蒙哥马利SB，《冷泉港议定书》(2015)2015(11)：951-969)。简而言之，将从样品中提取的MRNA反转录为CDNA，然后剪切为片段，选择适当长度范围内的片段，并与测序衔接子连接，然后进行扩增，测序和定位读入参考基因组。
在某些实施例中，使用全外显子组测序(WES)确定生物标志物的CNV。WES涉及使用高通量测序技术对DNA外显子(即蛋白质编码区)进行测序。WES的更多详细信息可以在例如NG SB等人。461(7261)：272-276(2009)NATURE，以及BAO R等人，CANCER INFORM。2014；13(增刊2)：67-82，中找到，将其全部内容并入本文。
(D)免疫分析
免疫分析通常涉及使用特异性结合生物标志物多肽或蛋白质(例如，本文提供的LKB1/STK11，KRAS和/或p53蛋白质)的抗体，以检测或测量靶标多肽或蛋白质的存在或表达水平。此类抗体可以使用本领域已知的方法获得(参见，例如，Huse等人，Science(1989)246：1275-1281；Ward等人，Nature(1989)341：544-546)，或者可以从商业来源得到。免疫测定的例子包括但不限于蛋白质印迹(本发明中也称为：Western-Blot，WB，或Western-印迹法)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，酶免疫测定(EIA)，放射免疫测定(RIA)，夹心测定，竞争测定，免疫荧光染色和成像，免疫组织化学(IHC)和荧光激活细胞分选(FACS)，上述测定方法都为本领域常规试验方法。有关免疫学和免疫测定程序的综述，请参见基础和临床免疫学(Stites&Terr eds。，第7版，1991年)。此外，可以以多种构型中的任一种进行免疫测定，其在酶免疫测定中被广泛综述(Maggio，ed。，1980)。和上文的Harlow&Lane。有关一般免疫测定的综述，另请参见《细胞生物学方法：细胞生物学中的抗体》，第37卷(Asai，ed。1993)。基本和临床免疫学(Stites&Terr编辑，1991年第7版)。
在某些实施例中，抗体被可检测地标记，或者不被标记，但是可以与被可检测地标记的第二分子反应(例如，可检测地标记的第二抗体)。其他检测系统，例如时间分辨荧光，内反射荧光，扩增(例如，聚合酶链反应)和拉曼光谱，也是有用的。
在某些实施例中，抗体可以固定在固体基质上。固定可以通过共价连接或非共价连接(例如包被)进行。固体基质的实例包括多孔和无孔材料，胶乳颗粒，磁性颗粒，微粒，条，珠，膜，微量滴定孔和塑料管。固相材料的选择和可检测地标记抗原或抗体试剂的方法，是根据所需的测定形式性能特征确定的。
(E)活性测定
可以使用生物测定法来测量蛋白质的生物活性。例如，可以通过在允许磷酸化的条件下使样品与底物激酶(例如AMPK)接触，并检测磷酸盐向底物激酶的掺入(其中磷酸盐向底物的掺入)来确定生物样品中的LKB1/STK11活性，其中，磷酸结合到底物激酶中表示LKB1/STK11活性。p53的活性可以通过检测p53的15位氨基酸残基的磷酸化或检测p53的下游靶基因表达水平的变化来测定。由于蛋白质具有发挥多种生物活性的能力，因此对于一种特定的蛋白质可能存在几种可接受的生物测定方法。可在Thompson T等人，JournalBiological Chemistry，279：53015-53022(2004)，美国专利申请US20050026233A1或PCT申请WO2004113562A1中找到用于测量LKB1/STK11或p53活性的示例性功能测定。
IV.预测MDM2抑制剂治疗的反应性或选择利用MDM2抑制剂治疗的患者
在某些实施例中，该方法包括进一步基于在生物样品中发现的功能性LKB1/STK11的缺陷，将受试者鉴定为可能对使用MDM2抑制剂的治疗有反应。
在某些实施例中，在生物样品中LKB1/STK11中一种或多种失活突变的检测表明LKB1/STK11缺乏。在某些实施例中，基于在LKB1/STK11中具有一个或多个失活突变，确定该受试者可能对MDM2抑制剂的治疗有反应。在某些实施例中，一种或多种失活突变选自表1所示的突变。
在某些实施例中，确定受试者LKB1/STK11相对于LKB1/STK11参考水平的表达水平或活性水平，可能基于减少(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的降低)对MDM2抑制剂的治疗作出响应。在某些实施例中，根据LKB1/STK11的拷贝数相对于LKB1/STK11的参考拷贝数的减少(例如，0，1)，被鉴定为可能响应MDM2抑制剂的治疗。
在某些实施例中，可以将LKB1/STK11的表达水平或活性水平或拷贝数标准化为内部对照值或标准曲线。例如，可以将LKB1/STK11的表达水平或活性水平或拷贝数标准化为标准标记的标准水平。该标准标记物的标准水平可以预先设定，同时确定或在从受试者获得样品之后确定。标准标记可以在相同的测定中运行，或者可以是先前测定中已知的标准标记。在通过测序测定(例如RNA测序)确定生物标志物的表达水平或活性水平或拷贝数的情况下，可以将生物标志物的水平标准化为测序的总读数。
LKB1/STK11的术语“参考水平”可以是LKB1/STK11的正常水平或基线水平(例如表达水平，活性水平或拷贝数)，例如，健康细胞或组织样本中的LKB1/STK11水平或一般癌症患者群体或特定目标癌症的癌症患者群体中LKB1/STK11的平均水平。
在某些实施例中，参考水平可以是通常在一种或多种健康细胞或组织样品或一种或多种样品中观察到的LKB1/STK11的典型水平，测量水平或水平范围。控制细胞或组织样本。在某些实施例中，参考水平可以是健康受试者群体中，一般癌症患者群体中或感兴趣的特定癌症的癌症患者群体中的LKB1/STK11的平均水平。例如，可以将LKB1/STK11的经验水平视为代表对照样品或普通癌症样品的代表。在某些实施例中，使用与在生物样品中的LKB1/STK11水平的测量中使用的相同或可比较的测量方法或测定法获得LKB1/STK11的参考水平。
如本文所用，“一般癌症患者群体”是指癌症受试者或患有不同种类的癌症的患者群体。例如，一般癌症患者群体可能是一组至少三种(四种，五种，六种，七种，八种，九种，十种或更多种)癌症患者，其中某些患者患有第一类癌症，患有第二种癌症，有些患有第三种癌症，依此类推。例如，一般癌症患者人群可以是患有各种癌症或多种癌症类型的人群。在某些实施例中，参考水平也可以是被认为代表一般癌症患者群体的经验水平。
在某些实施例中，参考水平可以是预先设定的。例如，可以基于对照生物学样品(例如来自健康受试者的样品或来自对照癌症患者的样品)的集合中LKB1/STK11水平的测量值来计算或概括参考水平。又例如，参考水平可以基于在健康受试者或一般癌症患者群体中通常观察到的LKB1/STK11水平的统计结果。
在某些实施例中，该方法进一步包括在生物样品中确定功能性p53的存在与否。在某些实施例中，该方法进一步包括在生物学样品中确定p53是否为野生型。在某些实施例中，该方法进一步包括确定p53的表达水平或p53的活性水平。
在某些实施例中，该方法进一步包括在生物样品中确定一种或多种突变KRAS的存在。
V.治疗被确定为对MDM2抑制剂治疗可能有反应的受试者
在某些实施例中，本文提供的方法进一步包括向被鉴定为可能对施用MDM2抑制剂的治疗有反应的受试者施用MDM2抑制剂。在某些实施例中，将MDM2抑制剂以治疗有效量施用于受试者。
另一方面，本公开提供了用MDM2抑制剂治疗患有癌症的受试者的方法，其中已经通过本文提供的任何方法将受试者鉴定为可能对使用MDM2抑制剂的治疗有反应。在某些实施例中，治疗步骤包括对已确定对所述MDM2抑制剂的治疗可能有反应的受试者给予治疗有效量的MDM2抑制剂。
在某些实施例中，确定要与MDM2抑制剂一起施用的受试者的生物样品中具有功能性LKB1/STK11缺陷。
在某些实施例中，要与MDM2抑制剂一起施用的受试者的生物样品中具有或被确定具有功能性p53。
在某些实施例中，待与MDM2抑制剂一起施用的受试者的生物样品中具有或被确定具有KRAS中的一种或多种突变。
在一些实施例中，受试者从免疫治疗复发或对免疫治疗难治。在一些实施例中，免疫疗法为PD-1/PD-L1阻断疗法。在一些实施例中，已确定受试者进一步具有KRAS突变。
VI.诱导铁死亡的方法
在另一方面，本发明还提供诱导需要的受试者铁死亡的方法，包括向受试者施用有效量的本文提供的MDM2抑制剂，并且任选地，MDM2抑制剂具有式(I)化合物或其医药上可接受的盐。
在另一方面，本发明还提供了治疗或改善有需要的受试者中受益于铁死亡的疾病的效果的方法，包括向受试者投与本文提供的有效量的MDM2抑制剂以诱导铁死亡，并且任选地，MDM2抑制剂具有式(I)化合物或其医药上可接受的盐。
在另一方面，本发明还提供了治疗被鉴定为具有铁死亡敏感病症或癌症的受试者的方法，包括向受试者投与本文提供的有效量的MDM2抑制剂以诱导铁死亡，并且任选地，MDM2抑制剂具有式(I)或式(I)的化合物其医药上可接受的盐。
如本文所用，“铁死亡”是指一种依赖于铁的程序性细胞死亡，在遗传和生物化学上不同于其他形式的调节性细胞死亡，如凋亡、坏死和自噬(参见Dixon SJ等人，cell(2012)149:1060-72)。铁死亡的特征是致命的脂质活性氧(lipid ROS)的大量铁依赖性积聚，这是一个自由基从细胞膜脂质中“窃取”电子并促进其被氧氧化的过程，导致细胞损伤。
在某些实施例中，受试者被鉴定为具有能够调节SLC7A11表达的野生型p53或p53变体。不希望受到任何理论的束缚，人们认为MDM2增加了p53的表达，而p53又可以调节SLC7A11的表达。除了野生型p53外，一些p53变体或突变体也可以调节SLC7A11，例如乙酰化缺陷突变体p533KR(参见，例如，L.Jiang等人，《自然》。520(7545)：57–62(2015))，并且这些p53变体或突变体也包含在本发明中。
在一些实施例中，以有效量施用本文提供的MDM2抑制剂以诱导铁死亡。铁死亡可以通过测量脂质ROS来检测。铁死亡的诱导是由脂质ROS的增加决定的。任何合适的检测脂质活性氧的方法都可以用来检测铁死亡。示例性方法使用C11-BODIPYTM581/591，其是荧光脂肪酸类似物，其允许通过间接测量细胞和膜中的ROS产生来量化脂质过氧化。自由基诱导氧化后，其荧光性质由红变绿。通过C11-BODIPYTM581/591测量脂质ROS可按照制造商的说明进行。此外，GSH耗竭、谷氨酸释放、NADPH和胱氨酸摄取测定也可用于铁死亡的测量(XieY，et al.，Cell Death Difference.，(2016)23:369)。
如本文所使用的“铁死亡敏感”的表达意指易受铁死亡诱导的细胞死亡影响或可由铁死亡诱导的细胞死亡治疗的细胞或状况。在某些实施例中，铁死亡敏感病况或癌症的特征在于活性或过度活性脂质ROS产生。所谓“活性脂质ROS产生”，意指相对于对照组(例如，在正常细胞中)，脂质ROS产生的生物途径未被显著抑制或抑制。所谓“过度活性脂质ROS产生”，意指脂质ROS产生途径具有比对照(例如在正常细胞中)更高的活性，例如，由于抑制或抑制该途径中的负调节物或由于基因或蛋白质的表达水平增加或活性增加这不是一个负调节的途径。
本领域已知指示铁死亡敏感性的各种生物标记物。例如，癌细胞中的NADPH水平是许多癌细胞系铁死亡敏感性的生物标记物(参见Shimada et al.，cell Chem Biol.；23(2)：225-235(2016))。铁死亡的敏感性受多种途径和过程调节，例如谷胱甘肽代谢(例如半胱氨酸转运和谷胱甘肽的生物合成)、脂质代谢(例如多不饱和脂肪酸(PUFA)的生物合成和过氧化)、铁代谢(例如铁在细胞中的输入、输出、储存和周转)和其他途径代谢途径(例如，生产辅酶Q10，消除脂质氢过氧化物)。任何合适的基因或蛋白质参与这些途径或过程可能是有用的，以表明铁死亡的敏感性。这些代谢途径和过程在B.R.Stockwell et al.，Cell，171(2)：273-285(2017)中进行了描述，并提供了铁死亡的标记物。
由于铁死亡是一种铁依赖性细胞死亡，不必受理论的约束，对铁死亡的敏感性至少可以部分归因于细胞中可利用的铁含量。铁能产生活性氧(ROS)损伤细胞器。通过摄取、输出或从储存转移到不稳定铁库(LIP)来调节铁可用性的蛋白质或基因可以影响细胞对铁死亡的敏感性。这些蛋白质或基因包括但不限于血红素载体蛋白1、整合素、铁蛋白、铁转运刺激因子(SFT)、铁反应元件结合蛋白(IRP)、TFRC、转铁蛋白和DMT1。例如，TFRC、DMT1和/或转铁蛋白的过度表达或激活突变可指示对铁死亡的敏感性。
另外或者可替代的，调节脂质ROS生成或脂质合成或代谢的蛋白质或基因也可影响细胞对铁死亡的敏感性。这些蛋白质或基因包括但不限于SLC7A11、GPX4、FSP1/AIFM2和SAT1。例如，SLC7A11或GPX4的表达不足或失活突变可指示对铁死亡的敏感性(参见Kim JKM等，PNAS(2019)116:9433))。
在一些实施例中，铁死亡敏感病症或癌症的特征在于具有一个或多个功能性或过度活性基因或基因产物，这些基因或基因产物选自以下组：血红素载体蛋白1、整合素、铁蛋白、铁转运刺激因子(SFT)、铁反应元件结合蛋白(IRP)、转铁蛋白、DMT1，ACSL4、CARS、ALOX、ATP5G3、CHAC1、CS、DPP4、GLS2、LPCAT3、NCOA4、RPL8、SAT1、TFRC和TTC35/EMC2。这些标记物及其与铁死亡的相关性已被详细披露(参见，例如B.R.Stockwell et al.，Cell，171(2)：273-285(2017))。本文所用的“过度活跃”是指癌细胞或癌症患者中的基因或基因产物具有比正常细胞或正常患者中更高的水平或活性在一些实施例中，过度激活的基因或基因产物过度表达或具有激活突变。
在一些实施例中，铁死亡敏感性癌症的特征在于在一个或多个基因或基因产物中具有降低的活性，这些基因或基因产物选自以下组：ZEB2、AKR1C1-3、SLC7A11、SLC3A2、GPX4、CD44v、CBS、CISD1、FANCD2、GCLC/GCLM、GSS、HMGCR、HSPB1/5、NFE2L2和SQS。这些标记物及其与铁死亡的相关性已被详细披露(参见，例如B.R.Stockwell et al.，Cell，171(2)：273-285(2017))。
在一些实施例中，对铁死亡敏感的癌症的特征在于在SLC7A11和/或GPX4中具有降低的水平或活性。在一些实施例中，活性降低的基因或基因产物表达不足或具有失活突变。
本文中关于基因或基因产物(例如蛋白质)使用的术语“表达不足”是指与对照(例如非癌细胞)相比，通常在癌细胞中存在较少量的基因产物。与对照组相比，基因或基因产物的表达不足可能是由于转录水平、转录后处理、翻译、翻译后处理、细胞定位蛋白质稳定性的改变(例如减少)。低表达可以通过检测基因产物(如mRNA或蛋白质)的常规技术来检测。在一些实施例中，表达不足可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更少，或比对照低1倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。
本文中关于基因或基因产物(例如蛋白质)使用的术语“过度表达”是指与对照(例如非癌细胞)相比，通常在癌细胞中存在增加量的基因产物。与对照组相比，基因或基因产物(例如蛋白质)的过度表达可能是由于转录水平、转录后处理、翻译、翻译后处理、细胞定位蛋白质稳定性的改变(例如增加)。过度表达可以通过检测基因产物(如mRNA或蛋白质)的常规技术来检测。在实施例中，与对照相比，过度表达可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，或高1倍、2倍、3倍、4倍或更多。
术语“激活突变”是指导致蛋白质组成性激活和信号通路组成性激活的突变。
此外，一些癌症生物标志物也被确定为对铁死亡敏感的潜在指标。此类癌症生物标记物包括但不限于RAS(例如HRAS和/或KRAS)、NRF2、MRP1(多药耐药蛋白1)。例如，RAS(例如HRAS和/或KRAS)、NRF2和/或MRP1的过度表达或激活突变可指示对铁死亡的敏感性(参见，例如，C.M.Bebber等人，《癌症》(2020)：12，164)。据报道，含有癌基因Ras的癌细胞对铁死亡的诱导更为敏感。(参见Bebber CM等人，《癌症》(2020)12，164，Yang WS等人，《细胞》(2014)156:317-331)。
在一些实施例中，具有高间充质细胞状态的癌症也对铁死亡敏感。如V.S.Viswanathan等人在Nature 547(7664)，453-457(2017)中所揭示，本文所用的高间充质细胞状态以促进多不饱和脂质合成的酶的活性为特征。具有高间充质细胞状态的癌症依赖GPX4生存。在一些实施例中，具有高间充质细胞状态的癌症以一个或多个基因(例如干细胞标记物或间充质标记物)的上调为特征，所述一个或多个基因选自以下组：CD133、CD44、VIM、FN1、ZEB1、TWIST1、SNAI2和CDH2。这些标记已在V.S.Viswanathan et al.，Nature 547(7664)，453-457(2017)和M.J.Hangauer et al.，Nature 551，247-250(2017)中详细披露，其全部并入本文。在不限于任何理论的情况下，相信受试者对铁死亡特别敏感或脆弱，因此可能对本文提供的MDM2抑制剂产生反应。
在一些实施例中，受试者被鉴定为具有能够调节SLC7A11表达的野生型53或p53变体，并且任选地具有生物样品中KRAS中的一个或多个突变。在一些实施例中，个体被鉴定为具有能够调节SLC7A11表达的野生型53或p53变体，并且任选地具有高间充质细胞状态。在一些实施例中，高间充质细胞状态的特征在于从以下组成的组中选择的一个或多个基因的上调：CD133、CD44、VIM、FN1、ZEB1、TWIST1、SNAI2和CDH2。在不限于任何理论的情况下，相信此类受试者对铁死亡特别敏感或易受伤害，因此可能对本文提供的MDM2抑制剂产生反应。
在一些实施例中，对铁死亡敏感的病症可以是可通过诱导受试者铁死亡来治疗的任何病症。例如，合适的条件可能包括消除或阻止不需要的细胞(如癌症)的生长。
在一些实施例中，铁死亡敏感条件或癌症具有RAS(例如KRAS和/或HRAS)过度表达或激活突变的特征。在一些实施例中，对铁死亡敏感的病症或癌症具有功能性p53(例如野生型53)和/或KRAS中的一个或多个突变的特征。
在一些实施例中，对铁死亡敏感的病症或癌症的进一步特征在于功能性LKB1/STK11缺乏。
VII.MDM2抑制剂
本发明中公开的MDM2抑制剂，抑制p53或p53相关蛋白与MDM2或MDM2相关蛋白之间的相互作用。通过抑制MDM2或MDM2相关蛋白对p53或p53相关蛋白的负面影响，本发明的MDM2抑制剂使细胞对细胞凋亡和/或细胞周期停滞的诱导剂敏感。在一个实施例中，本发明的MDM2抑制剂诱导凋亡和/或细胞周期停滞。
MDM2抑制剂的活性可以通过荧光偏振MDM2结合测定，MDM2抑制剂与竞争结合MDM2蛋白的基于p53的肽模拟化合物之间的竞争性结合测定来确定，如美国专利9,745,314B2中所述。
竞争性结合的荧光偏振测量通过滴定目标蛋白与荧光标记探针与未标记竞争物的混合物并证明荧光偏振降低至用自由荧光标记探针观察到的值来进行(Moerke N，Current化学生物学协议，(2009)1：1)。在荧光偏振MDM2结合测定中，重组人His标记的MDM1蛋白(残基1-118)和荧光标记的基于p53的肽称为PMDM6-F(Garcia-Echeverria等人，J.Med.Chem.43：使用3205-3208(2000))，测定带有重组MDM2蛋白的PMDM6-F的Kd值。然后在预先孵育的MDM2蛋白和PMDM6-F肽存在下，用系列稀释的被测MDM2抑制剂进行剂量依赖性竞争性结合实验。使用非线性最小二乘法分析，测量极化值并从图中确定IC50值。
在一些实施例中，MDM2抑制剂具有不大于1μM的IC 50，例如1μM，不大于900nM，800nM，700nM，600nM，500nM，400nM，300nM，200nM，150nM，100nM，90nM，80nM，70nM，60nM，50nM，40nM，30nM，20nM，10nM，9nM，8nM，7nM，6nM，5nM，4nM，3nM，2nM，1nM。如通过荧光偏振MDM2结合测定法所确定的，在抑制MDM2与P53的结合中的作用。
在一些实施例中，MDM2抑制剂选自依沙替林(RG7388)，RG7112(PubChem化合物CID：57406853)，HDM201(PubChem化合物CID：71678098)，KRT-232(也称为AMG232，PubChem化合物CID：58573469)，AMG 232(PubChem化合物CID：58573469)，BI907828(可在NCI词库(版本：19.10d中以代码C156709进行访问)，SAR-405838(也称为MI-77301，PubChem化合物CID：53476877)，MK-8242(也称为SCH 900242，可在NCI词库(版本：19.10d)中以代码C116867访问)，DS3032-b(PubChem化合物CID：9051550)，ALRN-6924(PubChem化合物CID：381833444)和CGM097((PubChem化合物CID：53240420)；或前述任一项的可药用盐。
在一些实施例中，MDM2抑制剂包含由式(I)表示的化合物：
Figure BDA0002956500870000451
或者药学上可接受的盐，其中
Figure BDA0002956500870000452
选自包含以下基团的组中，
Figure BDA0002956500870000461
B是C4-7碳环；
R1为H，取代或未取代的C1-4烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，ORa或NRaRb；
n为0、1或2；
R2，R3，R4，R5，R7，R8，R9和R10独立地选自H，F，Cl，CH3和CF3；
R6是
Figure BDA0002956500870000462
Ra是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rb是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rc和Rd是环B的一个碳原子上的取代基，其中
Rc是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；
Rd是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；或
Rc和Rd与它们所连接的碳一起形成4至6元螺环取代基，可选地含有一个氧原子；和
Re是-C(＝O)ORa，-C(＝O)NRaRb或-C(＝O)NHSO2CH3。
一些实施例中，
Figure BDA0002956500870000463
是
Figure BDA0002956500870000464
一些实施例中,B是
Figure BDA0002956500870000465
或
Figure BDA0002956500870000466
在一些实施例中，n为0或1，且R1为H或CH3。
在一些实施例中，
Figure BDA0002956500870000471
是H，CH3或CH2CH3。
在一些实施例中，R2为H。在其他实施例中，R3为卤素，优选为氯。在又一个实施例中，R4为H，R5为H，或R4和R5均为H。
在一些实施例中，R7是卤素，并且更优选是氟。
在一些实施例中，R8，R9和R10各自为H。
在一些实施例中，Ra和Rb分别为H，CH3或CH2CH3。
在一些实施例中，Rc和Rd分别为H，卤素，OH，CH3，CH2CH3或CH2OH。在一些实施例中，Rc和Rd为F和F，H和H，OH和CH3，CH3和CH3，CH3和OH，H和OH，CH2CH3和CH2CH3以及CH2OH和CH2OH。
在一些实施例中，Re为-C(＝O)OH，-C(＝O)NH2或-C(＝O)NHSO2CH3。
在一个实施例中，MDM2抑制剂是选自以下的化合物
Figure BDA0002956500870000472
Figure BDA0002956500870000481
Figure BDA0002956500870000491
或其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，MDM2抑制剂是具有以下结构的化合物
Figure BDA0002956500870000492
或者其药学上可接受的盐。
在一个实施例中，MDM2抑制剂是具有以下结构的化合物(也称为化合物C)
Figure BDA0002956500870000493
或者其药学上可接受的盐。
更多可在本申请中使用的MDM2抑制剂和MDM2抑制剂的合成方法在美国专利号9,745,314中进一步公开，该专利在此引入作为参考。
本文提供的MDM2抑制剂可以盐的形式存在。在此提供的MDM2抑制剂的药学上可接受的盐在本发明的方法中通常是优选的。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指结构式(I)的化合物的盐或两性离子形式。式(I)化合物的盐可以在化合物的最终分离和纯化期间制备，或者通过使化合物与具有合适阳离子的酸反应而分开制备，所述的酸包括但不限于碱金属和碱土金属离子，例如，Na+，K+，Ca2+和Mg2+以及有机阳离子，例如但不限于铵和取代的铵离子，例如NH4+，NHMe3+，NH2Me2+，NHMe3+和NMe4+。一价和二价药学上可接受的阳离子的实例在例如Berge等人(J.Biol.Chem。，1997)中进行了讨论。J.药物Sci.66：1-19(1997)。
结构式(I)的化合物药学上可接受的盐可以是与药学上可接受的酸形成的酸加成盐。可用于形成药学上可接受的盐的酸的实例包括无机酸，例如硝酸，硼酸，盐酸，氢溴酸，硫酸和磷酸，以及有机酸，例如草酸，马来酸，琥珀酸和柠檬酸。本发明化合物的盐的非限制性示例包括但不限于：盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，2-羟基乙磺酸盐，磷酸盐，磷酸氢盐，乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，硫酸氢盐，丁酸盐。樟脑酸酯，樟脑磺酸酯，二葡萄糖酸酯，甘油磷酸酯，半硫酸酯，庚酸酯，己酸，甲酸酯，琥珀酸酯，富马酸酯，马来酸酯，抗坏血酸酯，羟乙磺酸盐，水杨酸酯，甲磺酸盐，甲磺酸三甲苯磺酸盐，萘甲磺酸二磺酸盐，萘磺酸次萘磺酸盐，萘磺酸次磺酸盐，萘磺酸次磺酸盐，萘磺酸次萘酸盐-苯丙酸根，苦味酸根，新戊酸根，丙酸根，三氯乙酸根，三氟乙酸根，磷酸根，谷氨酸根，碳酸氢根，对甲苯磺酸根，十一烷酸根，乳酸根，柠檬酸根，酒石酸根，葡萄糖酸根，甲磺酸根，乙二磺酸根，苯磺酸根和对甲苯磺酸根。另外，存在于本发明化合物中的可用氨基可被甲基，乙基，丙基和丁基氯化物，溴化物和碘化物季铵化；二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸盐；癸基，月桂基，肉豆蔻基和甾基氯化物，溴化物和碘化物；和苄基和苯乙基溴化物。鉴于前述，本文中出现的对本发明化合物的任何提及，旨在包括结构式(I)的化合物及其药学上可接受的盐。
具有一个或多个手性中心的化合物可以各种立体异构形式存在。立体异构体是仅在其空间排列上不同的化合物。立体异构体包括所有非对映异构体，对映异构体和差向异构体形式以及外消旋体及其混合物。
术语“几何异构体”是指具有至少两个取代基的环状化合物，其中两个取代基均在环的同一侧(顺式)或其中取代基均在环的相对侧(反式)。当所公开的化合物通过结构命名或描绘而未指示立体化学时，应理解该名称或结构涵盖一种或多种可能的立体异构体或几何异构体，或所涵盖的立体异构体或几何异构体的混合物。
当通过名称或结构描绘几何异构体时，应理解，命名或描绘的异构体比另一异构体存在更大的程度，即，命名或描绘的几何异构体的纯度更大。纯度按重量计小于50％，例如至少60％，70％，80％，90％，99％或99.9％。几何异构体纯度是通过将混合物中命名或描绘的几何异构体的重量，除以混合物中所有几何异构体的总重量而确定的。
外消旋混合物是指50％的一种对映异构体和50％的相应的对映异构体。当命名或描绘具有一个手性中心的化合物而未指出手性中心的立体化学时，应理解该名称或结构涵盖该化合物的两种可能的对映体形式(例如，对映体纯，对映体富集或外消旋体)。当命名或描绘具有两个或多个手性中心的化合物而未指出手性中心的立体化学时，应理解该名称或结构涵盖所有可能的非对映异构体形式(例如，一种或多种非对映体纯，非对映体富集和等摩尔混合物化合物的非对映异构体(例如外消旋混合物)。
对映异构体和非对映异构体混合物可以通过众所周知的方法拆分为它们的组分对映异构体或立体异构体，例如手性气相色谱法，手性高效液相色谱法，将化合物结晶为手性盐络合物或将其结晶。在手性溶剂中的化合物。对映异构体和非对映异构体也可以通过熟知的不对称合成方法从非对映异构体或对映异构体的中间体，试剂和催化剂获得。
当化合物由表示单个对映异构体的名称或结构指定时，除非另有说明，否则该化合物是至少60％，70％，80％，90％，99％或99.9％的光学纯的(也称为作为“对映体纯”。光学纯度是所述对映异构体混合物中的重量除以两种对映异构体混合物中的总重量。
当所公开的化合物的立体化学由结构命名或描绘，并且所述命名或描绘的结构涵盖不止一个立体异构体(例如，在非对映体对中)时，应理解，所涵盖的立体异构体之一或包括所涵盖的立体异构体的任何混合物。应当进一步理解的是，所命名或描述的立体异构体的立体异构纯度至少为重量的60％，70％，80％，90％，99％或99.9％。在这种情况下，立体异构体纯度是通过名称或结构所涵盖的立体异构体混合物中的总重量，除以所有立体异构体混合物中的总重量而确定的。
在某些实施例中，MDM2抑制剂作为药物组合物施用。药物组合物可以包含MDM2抑制剂或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体或稀释剂。
“药物上可接受的载体”和“药物上可接受的稀释剂”是指有助于受试者配制和/或施用活性剂和/或被受试者吸收的物质，并且可以包括在本发明的成分中而不会对受试者产生严重的毒性影响。药物上可接受的载体和/或稀释剂的非限制性示例包括：水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格液、正常蔗糖、正常葡萄糖、粘合剂、填料、崩解剂、润滑剂、涂料、甜味剂、香料、盐溶液(如林格液)、醇、油、凝胶，碳水化合物，如乳糖、直链淀粉或淀粉、羟甲基纤维素、脂肪酸酯、聚乙烯吡咯烷和色素等。所述载体、稀释剂和/或赋形剂在与所述药物组合物的其他成分相容且对所述药物组合物的接收者无害的意义上是“可接受的”。本领域技术人员将能够通过常规实验确定MDM2抑制剂(例如化合物C)的有效无毒量将用于治疗癌症。例如，MDM2抑制剂(例如，化合物C)的治疗活性量可根据诸如疾病阶段(例如，阶段I与阶段IV)、年龄、性别、医疗并发症(例如，免疫抑制条件或疾病)和受试者体重以及MDM2抑制剂的能力(例如，化合物C)在受试者中引起期望的反应。在某些实施例中，治疗活性量是MDM2抑制剂的安全量，当以本发明的方式使用时，其足以产生与合理的益处/风险比相称的预期治疗反应而不产生不当的副作用(例如毒性、刺激性或过敏反应)。
可以调整剂量方案以提供最佳的治疗响应。例如，可以每天给药几次分剂量或通过连续输注给药，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少剂量。在某些实施例中，如果以单独递送将在治疗上有效的量施用MDM2抑制剂(例如化合物C)，即，施用MDM2抑制剂(例如化合物C)和/或充当治疗性抗癌剂，而不是主要用作改善其他化学疗法或其他癌症治疗副作用的药物。
在某些实施例中，以有效改善或增强对肿瘤的免疫应答的量施用MDM2抑制剂(例如化合物C)。以下提供的剂量可用于MDM2抑制剂(例如化合物C)的任何给药方式，包括局部给药，吸入给药和静脉内给药(例如连续输注)。
在一些实施例中，药物组合物包含化合物C或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，药物组合物为固体剂型。在一些实施例中，固体剂型是胶囊。在一些实施例中，固体剂型是干填充的胶囊。在一些实施例中，固体剂型是干填充的1号明胶胶囊。在一些实施例中，胶囊包含约10-500mg的MDM2抑制剂，例如化合物C。在一些实施例中，药物组合物或胶囊包含硅化的微晶纤维素。
在某些实施例中，以约0.5mg/kg至约10000mg/kg的范围施用MDM2抑制剂(例如化合物C)或其药学上可接受的盐。在某些实施例中，MDM2抑制剂(例如化合物C)或其药学上可接受的盐以约10mg/kg/天(24小时)至约150mg/kg/天(24小时)的剂量施用。在某些实施例中，以约10mg/kg/周至约700mg/kg/周的剂量施用MDM2抑制剂(例如化合物C)或其药学上可接受的盐。在某些实施例中，MDM2抑制剂(例如化合物C)或其药学上可接受的盐每隔一天口服给药(QOD)。
用于治疗的MDM2抑制剂的药物组合物或剂量方案的其他实施例先前已经描述过(参见，例如，美国专利号9,745,314，其全部内容通过引用并入本文)。
VIII.联合治疗
在一些实施例中，还可以将MDM2抑制剂与一种或多种另外的疗法组合给予通过本文提供的任何方法鉴定为可能对使用MDM2抑制剂的治疗有反应的受试者。
在一些实施例中，治疗患有癌症的受试者的方法包括与治疗有效量的MDM2抑制剂联合一种或多种其他疗法一起给予受试者，其中通过检测来自受试者的生物样本，已确定受试者中的LKB1/STK11功能缺乏。
在一些实施例中，一种或多种另外的疗法包括放射疗法，化学疗法，靶向的癌症疗法或使用免疫检查点分子的调节剂的疗法。在一些实施例中，一种或多种另外的疗法包括给予抗PD-1抗体，Bcl-2抑制剂，FAK抑制剂，MEK抑制剂或MET抑制剂。注意，另外的疗法可以包括传统的小的有机化学分子，或者可以是大分子，例如蛋白质，抗体，肽体，DNA，RNA或此类大分子的片段。
在一些实施例中，Bcl-2抑制剂是具有下式的化合物D，或其药学上可接受的盐
Figure BDA0002956500870000541
化合物D：(R)-1-(3-(4-(N-(4-(4-(3-(2-(4-氯苯基)-1-异丙基-5-甲基-4-(甲基磺酰基)-1H-吡咯-3-基)-5-氟苯基)哌嗪-1-基)苯基)-氨磺酰基)-2-(三氟甲基磺酰基)苯氨基)-4-(苯基硫基)丁基)哌啶-4-甲酸。化合物D的合成的方法可参照WO2014/113413A1说明书的记载进行制备。
在一些实施例中，FAK抑制剂是具有下式的化合物E，或其药学上可接受的盐
Figure BDA0002956500870000551
化合物E：(5-氯-N2-(2-异丙氧基-5-甲基-4-(1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-2,4-二胺)，根据WO 2018/044767中描述的生产方法合成，其通过将其引用，整体并入本文并用于所有目的，以及或者类似的方法。
在一些实施例中，MEK抑制剂是曲美替尼，又称为Trametinib。
如本文所用，术语“放射疗法”是指用电离辐射治疗癌症。术语“化学疗法”是指使用特定化学试剂治疗癌症。术语“靶向癌症疗法”是指用与选定的生物分子选择性相互作用的试剂(化合物或大分子)治疗癌症。
如本文所用，“免疫检查点”或“免疫检查点分子”是免疫系统中调节信号的分子。免疫检查点分子可以是共刺激检查点分子，即，调高信号，或抑制性检查点分子，即，调低信号。如本文所用，“免疫检查点分子的调节剂”是能够改变受试者中免疫检查点的活性的试剂。
在一些实施例中，如本文所提供的用于在需要铁死亡的受试者中诱导铁死亡的方法还包括向受试者施用附加疗法。在一些实施例中，如本文所提供的，用于治疗或改善将受益于有需要的受试者的铁死亡的病况的效果的方法，还包括向受试者施用附加治疗。在一些实施例中，如本文所提供的用于治疗被鉴定为具有铁死亡敏感状况或癌症的受试者的方法，还包括向该受试者施用附加治疗。
在一些实施例中，附加治疗包括不诱导铁死亡的抗癌剂。在不受任何理论约束的情况下，相信通过将本文提供的可诱导铁死亡的MDM2抑制剂与不诱导铁死亡的抗癌剂组合，MDM2抑制剂可通过提供杀死癌细胞的不同机制来增强此类抗癌剂的抗癌效果。不诱发铁死亡的此类抗癌剂的实例包括例如DNA损伤剂，例如足叶乙甙和阿霉素。DNA损伤剂被认为不能诱发铁死亡(参见，例如，L.Jiang等人的《自然》。2015年4月2日；520(7545)：57–62.)
在一些实施例中，附加疗法包括铁死亡诱导剂。如本文所用，“铁死亡诱导剂”系指可直接诱导细胞中的铁死亡或增加细胞对铁死亡的敏感性的剂。在不受任何理论约束的情况下，相信本文提供的MDM2抑制剂和额外的铁死亡诱导剂的组合可以提供添加剂或协同的铁死亡活性。铁死亡诱导剂可作用于参与铁死亡调节的多种因素，例如，(i)RSL3和/或抑制GPX4的其他化合物，(ii)erastin(例如，和/或抑制氨基酸转运系统xc-的其他化合物)，以及(iii)抑制γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽产生的丁硫氨酸亚砜胺(BSO)。铁死亡诱导剂的实例包括RSL3、奥特瑞他明、青蒿琥酯、丁硫氨酸亚砜肟、BAY87-2243、细胞色素酶、DP17伊拉斯汀、FIN56、兰帕立松、哌嗪偶联伊拉斯汀、咪唑酮伊拉斯汀、他汀类、柳氮磺胺吡啶、索拉非尼和魏菲灵A(Bebber CM et al，Cancers(2020)12、164、Xie Y et al，CellDeath Different.，(2016)23:369)。
在一些实施例中，铁死亡诱导剂为仑伐替尼(Lenvatinib)，他汀类药物为阿伐他汀(Atorvastatin)，或阿托伐他汀。
IX.癌症种类
在某些实施例中，所述受试者患有癌症。在某些实施例中，受试者被诊断出患有癌症或患有癌症的状况。在某些实施例中，受试者是癌症患者。
在某些实施例中，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在各种实施例中，所述癌症选自白血病，淋巴瘤，黑素瘤，癌和肉瘤。在某些实施例中，所述癌症选自肾上腺皮质癌，晚期癌症，肛门癌，再生障碍性贫血，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，成人的脑/CNS肿瘤，脑/CNS肿瘤。儿童，乳腺癌，男性乳腺癌，儿童癌症，未知原发性癌症，卡斯曼病，子宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，尤因家族肿瘤，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠道间质瘤(GIST)，妊娠滋养细胞疾病，头颈癌，霍奇金病，卡波济肉瘤，肾癌，成人喉和下咽癌，白血病-成人急性淋巴细胞(ALL)，白血病-急性髓系(AML)，白细胞贫血症—慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，白血病—慢性髓样性白血病(CML)，白血病—儿童慢性粒细胞性白血病(CMML)，儿童白血病，肝癌，肺癌—非小细胞肺癌小细胞，肺类癌，皮肤淋巴瘤，恶性间皮瘤，多发性骨髓瘤，骨髓增生异常综合症，鼻腔和鼻旁窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，非霍奇金淋巴瘤，儿童非霍奇金淋巴瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，肉瘤-成人软组织癌，皮肤癌-基底和鳞状细胞，皮肤癌-黑色素瘤，小肠癌，胃癌，睾丸癌，胸腺癌，甲状腺癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，沃尔登斯特罗姆巨球蛋白血症和威尔姆斯肿瘤。在一个实施例中，所述癌症选自黑素瘤，霍奇金淋巴瘤，肺癌，肾癌，膀胱癌，头颈癌，默克尔细胞癌，尿路上皮癌，微卫星不稳定性高或错配修复的实体瘤。缺陷，肉瘤，结肠癌，前列腺癌，绒癌，乳腺癌，视网膜母细胞瘤，胃癌，急性髓细胞性白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤和白血病。
在某些实施例中，癌症选自胃癌(例如胃癌)，胆管癌，肺癌，黑素瘤，乳腺癌(例如浸润性乳腺癌)，结肠癌，卵巢癌，前列腺癌，肝癌癌症(例如肝细胞癌)，膀胱癌，胰腺癌，肾癌，食道癌，头颈癌，甲状腺癌，皮肤鳞状细胞癌，胶质母细胞瘤。神经母细胞瘤，膀胱癌，子宫癌，黑色素瘤，骨肉瘤，淋巴瘤(例如壁炉细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤)，白血病(例如T细胞淋巴细胞性白血病，慢性淋巴细胞性白血病或急性髓性白血病)，多发性骨髓瘤，排卵障碍，大肠癌，肺腺癌，子宫癌肉瘤，肺鳞状细胞癌，宫颈癌，食道癌，肉瘤，生色团，肾细胞癌(RCC)，透明细胞RCC，乳头状RCC，葡萄膜黑色素瘤，睾丸生殖细胞瘤，低重度神经胶质瘤(LGG)，间皮瘤，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)，胸腺瘤和腺样囊性癌(ACC)。
在一些实施例中，癌症选自小细胞肺癌和非小细胞肺癌(例如肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肺大细胞癌)。
在某些实施例中，癌症是局部晚期或转移性实体瘤或淋巴瘤。在某些实施例中，受试者经历治疗并显示疾病进展。本文所称“有治疗经验”是指受试者已接受过抗癌治疗。疾病进展的特征是对先前治疗的反应性降低，例如肿瘤大小增加、肿瘤细胞数量增加或肿瘤生长。
在一些实施例中，癌症是一种对铁死亡敏感的癌症，包括肺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、急性髓系白血病、肝细胞癌、横纹肌肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、卵巢癌、脑癌或乳腺癌癌症。
在一些实施例中，对铁死亡敏感的癌症可以具有高间充质细胞状态。在一些实施例中，高间充质细胞状态的特征在于从以下组中选择的一个或多个基因的上调：CD133、CD44、VIM、FN1、ZEB1、TWIST1、SNAI2和CDH2。
在一个实施例中，如本文所述的MDM2抑制剂(例如化合物C)的施用导致一个或多个减少肿瘤大小、重量或体积、增加进展时间、抑制肿瘤生长和/或延长患有癌症的受试者的生存时间。
X.检测试剂盒
在另一方面，本发明还提供了一种用于预测MDM2抑制剂治疗反应性的试剂盒，其包括一种或多种用于检测LKB1/STK11功能性缺陷的试剂。在一些实施例中，试剂盒包括用于检测LKB1/STK11中存在一个或多个失活突变、测量LKB1/STK11的表达或活性水平、测量LKB1/STK11的拷贝数或确定LKB1/STK11的启动子甲基化状态的试剂。在一些实施例中，试剂盒还包括一种或多种试剂，用于检测是否存在功能性P53(例如野生型P53)。在一些实施例中，试剂盒还包括一种或多种试剂，用于检测KRAS中是否存在一种或多种突变。
在一些实施例中，用于预测对MDM2抑制剂治疗的反应性的试剂盒包含用于检测脂质ROS产生功能的一种或多种试剂。
在一些实施例中，试剂盒还包括一种或多种试剂，用于检测基因或基因产物中的过度表达或激活突变，所述基因或基因产物选自：血红素载体蛋白1、整合素、铁蛋白、铁转运刺激因子(SFT)、铁响应元件结合蛋白(IRP)，转铁蛋白、DMT1、ACSL4、CARS、ALOXS、ATP5G3、CHAC1、CS、DPP4、GLS2、LPCAT3、NCOA4、RPL8、SAT1、TFRC和TTC35/EMC2。
在一些实施例中，试剂盒还包括一种或多种试剂，用于检测基因或基因产物中的表达不足或失活突变，所述基因或基因产物选自以下组：ZEB2、AKR1C1-3、SLC7A11、SLC3A2、GPX4、CD44V、CBS、CISD1、FANCD2、GCLC/GCLM、GSS、HMGCR、HSPB1/5、NFE2L2和SQS。
在一些实施例中，试剂盒还包括一种或多种试剂，用于检测从以下组中选择的基因或基因产物的上调：CD133、CD44、VIM、FN1、ZEB1、TWIST1、SNAI2和CDH2。
在一些实施例中，试剂盒还包括一种或多种试剂，用于检测RAS(例如KRAS和/或HRAS)、TFRC或MRP1的过度表达或激活突变。
可以在RNA水平、DNA水平和/或蛋白质水平进行测量或检测。可以使用合适的试剂来检测靶RNA、靶DNA或靶蛋白。在某些实施例中，检测试剂包含可与所关注基因的多核苷酸(例如，LKB1/STK11、p53或KRAS)杂交的引物或探针。在某些实施例中，检测试剂包含可特异性结合到所需蛋白质(例如，LKB1/STK11、p53或KRAS)的抗体。在一些实施例中，引物、探针和/或抗体可被或不可被检测地标记。在某些实施例中，试剂盒可进一步包含用于执行本文所述方法的其他试剂。在此类应用中，试剂盒可包括以下任何或全部：合适的缓冲液、用于分离核酸的试剂、用于扩增核酸的试剂(例如聚合酶、dNTP混合物)、用于杂交核酸的试剂、用于核酸测序的试剂，用于定量核酸的试剂(例如嵌入剂、检测探针)、用于分离蛋白质的试剂和用于检测蛋白质的试剂(例如二级抗体)。通常，在本文所提供的任何方法中有用的试剂包含在载体或分隔容器中。载体可以是容器或支撑物，例如袋子、盒子、管子、架子的形式，并且任选地被分隔。
如本文所用，术语“引物”是指由于靶多核苷酸序列内至少一部分序列与引物的序列具有互补性，而可与靶多核苷酸序列特异性杂交的寡聚核苷酸。引物的长度可以至少为8个核苷酸，通常为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与靶序列正确杂交，引物可与靶多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的序列互补性。可用作引物的寡核苷酸可以根据首先由BEAUCAGE和CARUTHERS，TETRAHEDRONLETTS描述的固相亚磷酰胺三酯方法化学合成。(1981)22：1859-1862，使用自动合成仪，如NEEDHAM-VAN DEVANTER等，NUCLEIC ACIDS RES。(1984)12：6159-6168。
引物可用于核酸扩增反应，其中引物被延伸以产生多核苷酸的新链。引物可以由技术人员使用本领域已知的常识容易地设计，使得它们可以与本文提供的至少一种生物标记物的靶核苷酸序列的核苷酸序列特异性退火。通常，将引物的3'核苷酸设计成与靶序列在相应的核苷酸位置互补，以通过聚合酶提供最佳的引物延伸。
如本文所用，术语“探针”是指由于靶多核苷酸序列内的序列的至少一部分的序列与探针具有互补性，而可与靶多核苷酸序列特异性杂交的寡核苷酸或其类似物。示例性探针可以是例如DNA探针，RNA探针或蛋白质核酸(PNA)探针。探针的长度可以为至少8个核苷酸，通常为8至70个核苷酸，通常为18至26个核苷酸。为了与靶序列正确杂交，探针可与靶多核苷酸序列的杂交部分具有至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的序列互补性。探针也可以根据如上所述的固相亚磷酰胺三酯方法化学合成。DNA和RNA探针的制备方法及其与靶核苷酸序列杂交的条件，在《分子克隆：实验室手册》，J.SAMBROOK等，第2版中有描述。冷泉港实验室出版社，1989年，第10和11章。
如本文所用，术语“抗体”是指可以与靶蛋白抗原特异性结合的免疫球蛋白或其抗原结合片段。可以通过从噬菌体或类似载体中的重组抗体文库中选择抗体来鉴定和制备抗体，以及通过对动物(例如兔或小鼠)进行免疫来制备多克隆和单克隆抗体(参见例如HUSE等，SCIENCE(1989)246：1275-1281；WARD等人，NATURE(1989)341：544-546)。
在某些实施例中，本文提供的引物或探针包含可与SEQ ID NO：1、3或5的序列中的一部分杂交的多核苷酸序列。在某些实施例中，本文提供的引物或探针包含具有以下特征的多核苷酸序列：与SEQ ID N.1、3或5序列中的一部分至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或100％互补。在某些实施例中，本文提供的抗体包含能够与具有SEQ ID NO：2、4或6的序列的蛋白质或多肽内的表位特异性结合的抗原结合区。
在某些实施例中，本文提供的引物，探针和抗体被可检测地标记。适用于标记引物，探针和抗体的可检测标记的例子包括，例如，生色团，放射性同位素，荧光团，化学发光部分，颗粒(可见或荧光)，核酸，配体或催化剂，例如酶。
放射性同位素的非限制性示例包括：123I，124I，125I，131I，35S，3H，111IN，112IN，14C，64CU，67CU，86Y，88Y，90Y，177LU，211AT，186RE，188RE，153SM，212BI和32P。
荧光团的非限制性示例包括：A啶，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，BODIPY，级联蓝，CY2，CY3，CY5，CY7，EDANS，曙红，赤藓红，荧光素，6-FAM，TET，JOC，HEX，俄勒冈绿色，若丹明，RHODOL GREEN，塔姆拉。ROX和TEXAS RED TM(MOLECULAR PROBES，INC.，俄勒冈州尤金)。
酶的实例包括但不限于碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，辣根过氧化物酶，Β-半乳糖苷酶和核糖核酸酶。
配体的非限制性示例包括：生物素，抗生物素蛋白，抗体或抗原。
应该理解的是，可检测的标记物不必产生可检测的信号，例如，在一些实施例中，它可以与可检测的伴侣反应或与一种或多种其他化合物反应以产生可检测的信号。例如，可检测标记可以是能够用作标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如，二级标记的抗体)。再例如，由于其催化色原，荧光或发光底物的催化活性，酶是可检测的标记，其导致可检测信号的产生。
在某些实施例中，本文提供的可检测地标记的引物，探针或抗体可以进一步包含淬灭剂物质。猝灭剂物质是指当与荧光物质足够接近地存在时，由于例如荧光共振能量转移(FRET)的结果，可以猝灭由荧光物质发出的荧光的物质。
淬灭剂物质的非限定性示例包括Tamra，Dabcyl或Black Hole Quencher(BHQ，Biosearch Technologies)，DDQ(Eurogentec)，爱荷华州Black FQ(Integrated DNATechnologies)，QSY-7(Molecular Probes)，和Eclipse淬灭剂(Epoch Biosciences)。
引物和探针可以通过切口平移法或随机引物法标记为高比活。有用的探针标记技术描述于文献中(Fan，Y-S，Molecular cytogenetics：protocols and applications，Humana Press，Totowa，N.J.xiv，411(2002))。
另外，试剂盒可包括指导材料，该指导材料包含用于实施本文提供的方法的指导(即方案)。尽管指导材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。
在某些实施例中，试剂盒可进一步包括存储在计算机可读介质上的计算机程序产品。当计算机程序产品由计算机执行时，其基于在生物样品中发现的功能性LKB1/STK11不足，执行确定对象是否可能对使用MDM2抑制剂治疗的步骤。本发明考虑了能够存储这种计算机可执行指令并将其传达给最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘，磁带，盒带，芯片)，光学介质(例如CD ROM)等。此类媒体可能包括提供此类指导材料的互联网站点的地址。
还可以使用载波信号对计算机程序进行编码和发送，该载波信号适于经由符合包括因特网的各种协议的有线、光学和/或无线网络进行传输。这样，可以使用利用这样的程序编码的数据信号来创建根据本发明的实施例的计算机可读介质。可以将用程序代码编码的计算机可读介质与兼容设备打包在一起，或者与其他设备分开提供(例如，通过Internet下载)。任何此类计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品(例如，硬盘驱动器，CD或整个计算机系统)上或内部，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。
在一些实施例中，本公开提供了连接在固体支持物的寡核苷酸探针，所述固体支持物诸如阵列载玻片或芯片，例如，如在Eds.，Bowtell和Sambrook DNA Microarrays：AMolecular Cloning Manual(2003)港口实验室出版社。这样的装置结构在本领域中是众所周知的，例如，如美国专利和专利公开第5,837,832号美国专利；和PCT申请WO95/11995；美国专利第5807522号；美国专利号7,157,229、7,083,975、6,444,175、6,375,903、6,315,958、6,295,153和5,143,854、2007/0037274、2007/0140906、2004/0126757、2004/0110212、2004/0110211、2003/0143550、2003/0003032和2002/0041420。在以下参考文献中也对核酸阵列进行了综述：Biotechnol Annu Rev(2002)8：85-101；Sosnowski等。精神科遗传学(2002)12(4)：181-92；Heller，Annu Rev Biomed Eng(2002)4：129-53；Hell，Annu RevBiomed Eng(2002)4：129-53。Kolchinsky et al。，Hum。Mutat(2002)19(4)：343-60；和McGail等人，Adv Biochem Eng Biotechnol(2002)77：21-42。提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，并且不应将其解释为限制本发明的范围。下文全部或部分描述的所有具体组成，材料和方法均落入本发明的范围内。这些特定的组成，材料和方法无意于限制本发明，而仅仅是为了说明落入本发明范围内的特定实施例。本领域技术人员可以开发等同的组合物，材料和方法，而无需行使发明的能力并且不脱离本发明的范围。可以理解的是，可以在本文描述的过程中做出许多变化，同时仍然保持在本发明的范围内。发明人的意图是，这样的变化包括在本发明的范围内。
实施例
尽管我们已经描述了本发明的多个实施例，但是显然可以改变我们的基本实施例，以提供利用本公开的化合物和方法的其他实施例。因此，可以理解，本公开的范围将由所附权利要求书而不是由已经通过示例表示的特定实施例来定义。
贯穿本申请引用的所有参考文献(包括参考文献，已发布的专利，已公开的专利申请和共同待决的专利申请)的内容在此明确地全文引入作为参考。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均与本领域普通技术人员通常已知的含义一致。
实施例1癌症中的LKB1/STK11突变
已经在各种肿瘤中，例如恶性黑素瘤(Guldberg，P.等人，(1999)18：1777)，乳腺癌(Stephens P.等人，Nature(2005)37：590)，肺癌(Shah U.等人，Cancer Res(2008)68：3562)和胰腺癌(Goggins，M.等人，(1999)10：增刊4)，鉴定了LKB1/SKT11中的突变。特别是，已提出LKB1/SKT11与肺腺癌患者对免疫检查点抑制剂治疗的耐药性有关，尤其是当KRAS中也存在突变时(Skoulidis F等人，J Clin Oncol.2017；35(suppl_15_abstr 9016))。还发现具有转移性NSCLC特征的LKB1/SKT11突变的患者不太可能从一线化疗中受益(Shire N等人，IASLC 2019世界肺癌大会，2019年9月7日至10日；西班牙巴塞罗那，摘要OA07.02)。
使用TCGA数据集下NIH基因组数据共享的数据(John N等人癌症基因组图谱泛癌分析项目)分析了各种癌症中的LKB1/SKT11突变Nat Genet.2013年10月；45(10)：1113–1120。doi：10.1038/ng.2764)。
图1A中显示的数据证明LKB1/SKT11突变(包括拷贝数变异(CNA))在肺腺癌中最常见，发生率高达14％。此外，肺腺癌中的LKB1/SKT11突变可能伴有TP53突变，频率为36％(图1B)。换句话说，具有LKB1/SKT11突变和TP53野生型的患者约占肺腺癌人口的8.7％。
实施例2 MDM2抑制剂与MDM2蛋白的结合亲和力检测
本实验利用重组人His标记的MDM2蛋白(残基1-118)和荧光标记的p53肽，通过基于荧光偏振(FP)的结合试验测定化合物C与MDM2蛋白的结合亲和力。
荧光探针的设计基于先前报道的，基于高亲和力的p53的拟肽化合物PMDM6-F(García-Echeverría等，J。Med。Chem。43：3205-3208(2000))。由饱和曲线确定带有重组MDM2蛋白的PMDM6-F的Kd值。将MDM2蛋白在Dynex 96孔黑色圆底板中连续两次稀释，并以1nM的浓度添加PMDM6-F肽。该测定在以下缓冲液中进行：100mM磷酸钾，pH 7.5；100μg/mL牛丙种球蛋白；在孵育3小时后，使用ULTRA READER(Tecan U.S.Inc。，Research TrianglePark，NC)测量0.02％的叠氮化钠，0.01％的Triton X-100)和极化值。通过将mP值拟合在具有非线性回归的S形剂量响应曲线(可变斜率)中，获得IC50值，并将其确定为1.40nM±0.25。使用等式计算Kd值：Kd值＝IC50-L0/2。L0/2是游离配体(PMDM6-F)的浓度。由于PMDM6-F的最终浓度为1nM，因此L0/2为0.5nM。
用化合物C在DMSO中的系列稀释液进行剂量依赖性竞争性结合实验。将包含5μL样品化合物C，预温育的MDM2蛋白(10nm)和PMDM6-F肽(1nm)的分析缓冲液(100mM磷酸钾，pH值7.5；100μg/mL牛丙种球蛋白；0.02％叠氮化钠，0.01％Triton X-100)加入Dynex 96孔黑色圆形底板中，以产生125μL的最终体积。对于每个测定，对照包括MDM2蛋白和PMDM6-F(相当于0％抑制)，单独的PMDM6-F肽(相当于100％抑制)。孵育3小时后测量极化值。使用非线性最小二乘法从图上确定IC 50值，即结合肽的50％被置换时的化合物C浓度。使用GRAPHPADPRISM软件(GraphPad Software，Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)进行曲线拟合。
化合物C的IC50值确定为3.8nM。
实施例3化合物C预测性生物标志物的研究
该研究旨在评估化合物C作为单一药剂在NSCLC细胞系中的抗增殖活性。
实验方法：利用Cell Titer-Glo发光细胞生存力测定试剂盒(Promega，Cat。#G7571)，定量检测化合物C的抗增殖作用。
简要地，收集处于对数生长期的细胞，离心，计数并稀释至所需浓度。将包含8000个细胞的90μL细胞悬浮液接种到不透明的96孔板(8000个细胞/孔)的每个孔中，并孵育过夜。引入仅包含培养基(100μL/孔)的3个孔以获得背景发光信号(对照孔)，测试的细胞系如表2所示。
将化合物C(10μM)以1∶3的比例连续稀释以获得5-7个系列浓度。将10μL/孔的稀释的化合物C溶液添加到96孔板中，同时将10μL/孔的培养基添加到对照孔中。将板在5％CO 2培养箱中于37℃温育72小时。每天在倒置显微镜下观察细胞生长。
在处理结束时，从培养箱中取出96孔板并平衡至室温30分钟，然后向每个孔中添加30μLCellTiter-
Figure BDA0002956500870000651
试剂(避光)。将溶液在每个孔中充分混合以产生细胞裂解，并将96孔板在室温下再保持10分钟以稳定发光信号。然后使用Biotek synergy H1酶标仪检测发光信号。使用以下等式，根据对照重复样本(空白)的平均发光(LN)值计算细胞生存力(％)：
细胞存活率(％)＝(试验细胞荧光信号值-阴性对照细胞荧光信号值)/(对照细胞荧光信号值-阴性对照细胞荧光信号值)×100％
使用Graphpad Prism 6.0软件(Golden软件，Golden，Colorado，USA)绘制细胞增殖(例如：活力)曲线。
这些细胞系的LKB1/SKT11，KRAS和TP53的遗传状态可从COSMIC数据库获得。
实验结果：
如下表2和图2所示，MDM2抑制剂化合物C在具有推定的LKB1/SKT11失活突变，和具有推定的功能性TP53的所有细胞中，显示出抗癌活性。在具有推定的LKB1/SKT11失活突变的细胞中，KRAS发生了共突变。
表2
Figure BDA0002956500870000661
实施例4化合物C联合治疗方案与脂质ROS水平升高的关系
实验方法：培养并制备A549、NCI-H460、NCI-H292、NCI-H1944、NCI-H1666、DV90和MOLM-13细胞，以上细胞株都来源于ATCC，以便用实施例2中所述的化合物C进行处理。对不同浓度的化合物C和所示的溶媒对照品(DMSO)进行了测试。在指定的时间采集细胞进行分析。
BODIPY法检测脂质ROSTM 581/591C11试剂盒(Invitrogen，目录号D3861)，符合制造商的说明。对于bodipy581/591c11染色，监测来自非氧化C11(PE通道)和氧化C11(FITC通道)的信号。计算每个样品FITC的MFI与PE的MFI之比。western-blot法(也称作蛋白质印迹法，western印迹法或WB)检测SCL7A11、p53、p21在大鼠肾组织中的表达水平。简单地说，用化合物C处理后，收集细胞并用预冷PBS洗涤。使用RIPA裂解(Beyotime Biotechnology，Cat。#P0013B)，含1％PMSF(Yeasen Biotechnology，目录号：20104ES08)和1％蛋白酶抑制剂。使用BCA蛋白质分析试剂盒(Beyotime Biotechnology，Cat.#P0012)测量蛋白质浓度。细胞裂解液(20-50μg)经4-20％SDS-PAGE分离蛋白。将分离的蛋白质转移到PVDF膜上(Millipore，Cat。#IPVH00010)。室温下用1％BSA缓冲液封闭PVDF膜1小时，然后用一抗SLC7A11(abcam，Cat)孵育。ab37185)，抗p53(CST，Cat。#2524S)或抗p21(CST，Cat。#2947S)在4℃摇床上用1％BSA TBST稀释过夜。将膜在1xTBST中洗涤10分钟3次。然后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二级抗体(Yeasen，Cat)在室温下孵育PVDF膜1小时。#33101ES60；耶森，Cat。#33201ES60)，按照供应商的指示编制。将膜在1x TBST中洗涤10分钟，再次洗涤3次。在PVDF膜上施加HRP基片。用ECL超敏试剂检测信号。
结果表明，用化合物C处理以剂量和/或时间依赖性方式增加脂质ROS水平(图3A-3E)。化合物C对脂质ROS水平的影响在具有LKB1/SKT11突变的A549和NCI-H460细胞中更为显著(图3A、3B)。化合物C的治疗也增加了p53和p21的表达(p21的存在是p53活性的一个指标)，并抑制了SCL7A11的表达(图3F-3H)。这些结果提示化合物C能促进人癌细胞的铁死亡。
实施例5 LKB1/STK11突变PDX模型对化合物C治疗的反应
该研究的目的是评估MDM2抑制剂化合物C在LKB1/SKT11肺癌PDX模型中的抗肿瘤活性。
将一组BALB/c裸鼠(雌性，6-8W，18-20g)在右胁侧皮下接种LKB1/SKT11突变体和TP53野生型A549肺癌细胞(5×106)。基质胶用于肿瘤发展。独立的一组小鼠接种了H460(ATCC)肺癌细胞。当肿瘤达到合适的平均大小时开始治疗。根据表3所示的实验设计，将带有A549肺癌细胞的小鼠和带有H460肺癌细胞的小鼠都施用媒介物或化合物C。治疗后，收集新鲜的肿瘤组织进行药效学研究，并收集血清样品进行药代动力学分析。
表3.
Figure BDA0002956500870000681
注：“PO”表示口服，“QD”表示每日一次，“D”表示剂量。
在从Crowbio和Wuxi Biologics获得的另外的LKB1/SKT11突变体和TP53野生型肺癌PDX模型中，进一步评估了化合物C的治疗效果。
可以预期，化合物C在LKB1/SKT11突变体和TP53野生型肺癌PDX模型中，发挥有效的抗增殖活性。
实施例6化合物C对STK11突变体A549和NCI-H460细胞凋亡的诱导作用
方法：采用annexinv-PI(碘化丙啶)染色试剂盒检测细胞凋亡。简单地说，在处理后24或48小时收获细胞并用PBS洗涤。然后用Annexin-V和PI对细胞进行染色，并按照制造商的说明用Attune-NxT流式细胞仪进行分析。通过分析每个实验条件下的20000个细胞获得凋亡数据。数据用FlowJo软件进行分析。
STK11突变体A549和NCI-H460细胞系来源于ATCC。
结果：如图4和图5所示，化合物C对STK11突变体A549和NCI-H460细胞株经48小时处理后显著诱导凋亡。
实施例7 STK11在A549细胞中的过度表达降低了其对化合物C的敏感性
方法：用流式细胞仪Attune-NxT流式细胞仪检测Western印迹法、CTG法、流式细胞仪法和脂质ROS。
CTG(CELL TITER-GLO)发光法，此法可快速灵敏的检测活细胞数量，利用CellTiter-Glo化学发光细胞活性检测试剂盒(Promega)进行检测。
图6C简介了详细方法：对于凋亡分析，将STK11缺失或过度表达的肺癌细胞系，单独用化合物C处理48小时，然后使用膜联蛋白V/异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)进行流式细胞术分析；Annexin V-FITC-PI)凋亡检测试剂盒(BD Biosciences Cat)。简言之，细胞用冷PBS洗涤一次，并在冰上与膜联蛋白V-FITC-PI在结合缓冲液中孵育30分钟。然后使用FlowJo软件在Attune NxT流式细胞仪(Life Technologies，Thermo Fisher，Carlsbad，CA USA)上分析细胞。结果以膜联蛋白V+细胞百分比表示。实验在两个独立的实验中进行，一式三份。
图6d详细方法：将细胞接种到24孔板中并培养过夜。在指定时间内用化合物C处理细胞，通过胰蛋白酶消化收获细胞，并在200μL RPMI-1640中再悬浮，其中含有5μM C11-BODIPY 581/591(Invitrogen，Cat#D3861，用于脂质过氧化检测)或10μM CM-H2DCFDA(Beyotime，Cat#S0033，用于ROS检测)。细胞在37℃的培养箱中培养30分钟。脂质过氧化或活性氧的评估使用流式细胞仪调音NxT流式细胞仪。每孔至少分析30000个单细胞
如图6-8所示，在图6A中，WB(western blot蛋白质印迹法)证实A549-STK11过度表达。
如图6b所示，A549细胞中STK11的过度表达降低了化合物C的敏感性。如图6C所示，当STK11在A549细胞中过度表达时，化合物C诱导的细胞凋亡减少，如图6d所示，使用流式细胞仪Attune NxT流式细胞仪评估脂质ROS。STK11过表达对A549细胞脂质ROS无明显影响。
A549,NCI-H460细胞系来源于ATCC。
实施例8化合物C+Trametinib对STK11和KRAS共突变NSCLC细胞株的协同抗增殖作用
实验方法：A549,NCI-H460，NCI-H2122细胞系来源于ATCC，Trametinib(又称为：曲美替尼)来源于selleck。
表4
细胞系 STK11 KRAS TP53状态
A549 p.Q37* p.G12S 野生型
NCI-H2122 p.G279fs p.G12C Q16L,C176F
NCI-H460 p.Q37* p.Q61H 野生型
结果：如表4和图9-11所示与单一药物相比，联合治疗显示出较低的细胞活力。化合物C+trametinib联合应用72h后，对A549、NCI-H460、NCI-H2122STK11和KRAS共突变的NSCLC细胞的活性抑制作用增强。
实施例9化合物C+D(APG-1252M1)对STK11和KRAS共突变NSCLC细胞株的协同抗增殖作用
实验方法：细胞活力CTG测定。
结果：如表5和图12-14所示，联合治疗的细胞活力低于单药。
化合物C和化合物D在联合治疗72小时后增强了A549、NCI-H1944、NCI-H2122STK11和KRAS共突变NSCLC细胞的细胞活力抑制。
表5
Figure BDA0002956500870000701
Figure BDA0002956500870000711
实施例10化合物C单药对STK11mut-LUAD-PDX模型的抗肿瘤作用
实验方法：STK11mut-LUAD-PDX模型来源于Crownbio。
结果：如图15所示，化合物C单剂对LU5209 STK11mut LUAD PDX有抗肿瘤活性，第26天T/C(％)值为54％。
实施例11化合物C等药物联合治疗TP53wt、STK11mut LU5209肺PDX模型
实验方法：TP53wt，STK11mut LU5209 lung PDX模型来源于crownbio。
表6
Figure BDA0002956500870000712
Figure BDA0002956500870000721
实验结果：
如表6和图16所示，化合物C单剂抗肿瘤活性较小，阿伐他汀(也称为：Atorvastain，或阿托伐他汀，来源于selleck)单剂无抗肿瘤活性，伦伐替尼(也称为：Lenvatinib，来源于selleck)单剂抗肿瘤活性显著。化合物C+阿托伐他汀联合治疗具有协同抗肿瘤作用。化合物C加Lenvatinib联合治疗可增强抗肿瘤作用。
如表所示，化合物C与阿托伐他汀联合用药组第42天的T/C(％)值为41.32％，单药组为74.04％或92.86％，协同作用得分为1.66，显示协同作用。化合物C和伦伐他汀联合组第42天T/C(％)值为26.21％，单药组为74.04％和35.43％，协同作用评分为1.
化合物C联合阿托伐他汀对s.C.LU5209 STK11mut LUAD PDX具有协同抗肿瘤作用。
化合物C与lenvastain的联合应用在s.C.LU5209 STK11mut LUAD PDX中获得增强的抗肿瘤作用。
实施例12化合物C单药或联合化合物E(2449)治疗皮下移植A549模型肺癌
方法：A549细胞系来自于ATCC。
表7
Figure BDA0002956500870000731
结果：如表7和图18所示，化合物C和化合物E的单药抗肿瘤活性较小。化合物C加化合物E联合治疗可增强抗肿瘤作用。
如表所示，化合物C和化合物E联合组在第53天的T/C(％)值为43.85％，而单药组为78.91％或71.66％，协同作用得分为1.29，显示二者具有协同作用。
结论：化合物C与化合物E联合应用对s.C.A549肺癌具有协同抗肿瘤作用。
实施例13化合物C和RSL3/阿伐他汀联合治疗TP53wt,KRAS mut,STK11mut A549 A549皮下移植模型肺癌
实验方法：A549来源于ATCC，动物模型来源于Crownbio。RSL3 100mg/kg瘤内注射，每周两次(又称为BIW)。阿托伐他汀100mg/kg，PO，每周三次(又称为TIW)。
表8
Figure BDA0002956500870000741
如图20所示，化合物C单剂显示抗肿瘤活性，RSL3(来源于selleck)和阿伐他汀单剂显示轻微抗肿瘤活性。化合物C加RSL3或阿托伐他汀联合治疗具有协同抗肿瘤作用。
如表所示，化合物C和RSL3联合组在第63天的T/C(％)值为26.85％，而单药组为38.20％或77.37％，协同作用得分为1.10，表明协同作用。化合物C和阿伐他汀联合用药组在第63天的T/C(％)值为25.05％，单药组为38.20％和75.76％，协同作用得分为1.16，显示两者协同作用。
结论：化合物C+RSL3或阿伐他汀联合治疗皮下移植A549模型中的肺癌具有协同抗肿瘤作用。
序列表
<110> 苏州亚盛药业有限公司
亚盛医药集团（香港）有限公司
<120> MDM2抑制剂的治疗方法和生物标志物
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1302
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggaggtgg tggacccgca gcagctgggc atgttcacgg agggcgagct gatgtcggtg 60
ggtatggaca cgttcatcca ccgcatcgac tccaccgagg tcatctacca gccgcgccgc 120
aagcgggcca agctcatcgg caagtacctg atgggggacc tgctggggga aggctcttac 180
ggcaaggtga aggaggtgct ggactcggag acgctgtgca ggagggccgt caagatcctc 240
aagaagaaga agttgcgaag gatccccaac ggggaggcca acgtgaagaa ggaaattcaa 300
ctactgagga ggttacggca caaaaatgtc atccagctgg tggatgtgtt atacaacgaa 360
gagaagcaga aaatgtatat ggtgatggag tactgcgtgt gtggcatgca ggaaatgctg 420
gacagcgtgc cggagaagcg tttcccagtg tgccaggccc acgggtactt ctgtcagctg 480
attgacggcc tggagtacct gcatagccag ggcattgtgc acaaggacat caagccgggg 540
aacctgctgc tcaccaccgg tggcaccctc aaaatctccg acctgggcgt ggccgaggca 600
ctgcacccgt tcgcggcgga cgacacctgc cggaccagcc agggctcccc ggctttccag 660
ccgcccgaga ttgccaacgg cctggacacc ttctccggct tcaaggtgga catctggtcg 720
gctggggtca ccctctacaa catcaccacg ggtctgtacc ccttcgaagg ggacaacatc 780
tacaagttgt ttgagaacat cgggaagggg agctacgcca tcccgggcga ctgtggcccc 840
ccgctctctg acctgctgaa agggatgctt gagtacgaac cggccaagag gttctccatc 900
cggcagatcc ggcagcacag ctggttccgg aagaaacatc ctccggctga agcaccagtg 960
cccatcccac cgagcccaga caccaaggac cggtggcgca gcatgactgt ggtgccgtac 1020
ttggaggacc tgcacggcgc ggacgaggac gaggacctct tcgacatcga ggatgacatc 1080
atctacactc aggacttcac ggtgcccgga caggtcccag aagaggaggc cagtcacaat 1140
ggacagcgcc ggggcctccc caaggccgtg tgtatgaacg gcacagaggc ggcgcagctg 1200
agcaccaaat ccagggcgga gggccgggcc cccaaccctg cccgcaaggc ctgctccgcc 1260
agcagcaaga tccgccggct gtcggcctgc aagcagcagt ga 1302
<210> 2
<211> 433
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Glu Val Val Asp Pro Gln Gln Leu Gly Met Phe Thr Glu Gly Glu
1 5 10 15
Leu Met Ser Val Gly Met Asp Thr Phe Ile His Arg Ile Asp Ser Thr
20 25 30
Glu Val Ile Tyr Gln Pro Arg Arg Lys Arg Ala Lys Leu Ile Gly Lys
35 40 45
Tyr Leu Met Gly Asp Leu Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Gly Lys Val Lys
50 55 60
Glu Val Leu Asp Ser Glu Thr Leu Cys Arg Arg Ala Val Lys Ile Leu
65 70 75 80
Lys Lys Lys Lys Leu Arg Arg Ile Pro Asn Gly Glu Ala Asn Val Lys
85 90 95
Lys Glu Ile Gln Leu Leu Arg Arg Leu Arg His Lys Asn Val Ile Gln
100 105 110
Leu Val Asp Val Leu Tyr Asn Glu Glu Lys Gln Lys Met Tyr Met Val
115 120 125
Met Glu Tyr Cys Val Cys Gly Met Gln Glu Met Leu Asp Ser Val Pro
130 135 140
Glu Lys Arg Phe Pro Val Cys Gln Ala His Gly Tyr Phe Cys Gln Leu
145 150 155 160
Ile Asp Gly Leu Glu Tyr Leu His Ser Gln Gly Ile Val His Lys Asp
165 170 175
Ile Lys Pro Gly Asn Leu Leu Leu Thr Thr Gly Gly Thr Leu Lys Ile
180 185 190
Ser Asp Leu Gly Val Ala Glu Ala Leu His Pro Phe Ala Ala Asp Asp
195 200 205
Thr Cys Arg Thr Ser Gln Gly Ser Pro Ala Phe Gln Pro Pro Glu Ile
210 215 220
Ala Asn Gly Leu Asp Thr Phe Ser Gly Phe Lys Val Asp Ile Trp Ser
225 230 235 240
Ala Gly Val Thr Leu Tyr Asn Ile Thr Thr Gly Leu Tyr Pro Phe Glu
245 250 255
Gly Asp Asn Ile Tyr Lys Leu Phe Glu Asn Ile Gly Lys Gly Ser Tyr
260 265 270
Ala Ile Pro Gly Asp Cys Gly Pro Pro Leu Ser Asp Leu Leu Lys Gly
275 280 285
Met Leu Glu Tyr Glu Pro Ala Lys Arg Phe Ser Ile Arg Gln Ile Arg
290 295 300
Gln His Ser Trp Phe Arg Lys Lys His Pro Pro Ala Glu Ala Pro Val
305 310 315 320
Pro Ile Pro Pro Ser Pro Asp Thr Lys Asp Arg Trp Arg Ser Met Thr
325 330 335
Val Val Pro Tyr Leu Glu Asp Leu His Gly Ala Asp Glu Asp Glu Asp
340 345 350
Leu Phe Asp Ile Glu Asp Asp Ile Ile Tyr Thr Gln Asp Phe Thr Val
355 360 365
Pro Gly Gln Val Pro Glu Glu Glu Ala Ser His Asn Gly Gln Arg Arg
370 375 380
Gly Leu Pro Lys Ala Val Cys Met Asn Gly Thr Glu Ala Ala Gln Leu
385 390 395 400
Ser Thr Lys Ser Arg Ala Glu Gly Arg Ala Pro Asn Pro Ala Arg Lys
405 410 415
Ala Cys Ser Ala Ser Ser Lys Ile Arg Arg Leu Ser Ala Cys Lys Gln
420 425 430
Gln
<210> 3
<211> 1026
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 60
gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 120
gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 180
gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccccgtgg cccctgcacc agcagctcct 240
acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 300
aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 360
tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 420
tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 480
gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 540
cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 600
ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 660
gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 720
tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 780
agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcgtg tttgtgcctg tcctgggaga 840
gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 900
ccagggagca ctaagcgagc actgcccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 960
aaaccactgg atggagaata tttcaccctt caggaccaga ccagctttca aaaagaaaat 1020
tgttaa 1026
<210> 4
<211> 341
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln
1 5 10 15
Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu
20 25 30
Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp
35 40 45
Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro
50 55 60
Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser
85 90 95
Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly
100 105 110
Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro
115 120 125
Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys Pro Val Gln
130 135 140
Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys
165 170 175
Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln
180 185 190
His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp
195 200 205
Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu
210 215 220
Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser
225 230 235 240
Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr
245 250 255
Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val
260 265 270
Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn
275 280 285
Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr
290 295 300
Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys
305 310 315 320
Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Asp Gln Thr Ser Phe
325 330 335
Gln Lys Glu Asn Cys
340
<210> 5
<211> 570
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atgactgaat ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgacg 60
atacagctaa ttcagaatca ttttgtggac gaatatgatc caacaataga ggattcctac 120
aggaagcaag tagtaattga tggagaaacc tgtctcttgg atattctcga cacagcaggt 180
caagaggagt acagtgcaat gagggaccag tacatgagga ctggggaggg ctttctttgt 240
gtatttgcca taaataatac taaatcattt gaagatattc accattatag agaacaaatt 300
aaaagagtta aggactctga agatgtacct atggtcctag taggaaataa atgtgatttg 360
ccttctagaa cagtagacac aaaacaggct caggacttag caagaagtta tggaattcct 420
tttattgaaa catcagcaaa gacaagacag agagtggagg atgcttttta tacattggtg 480
agagagatcc gacaatacag attgaaaaaa atcagcaaag aagaaaagac tcctggctgt 540
gtgaaaatta aaaaatgcat tataatgtaa 570
<210> 6
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys
165 170 175
Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met
180 185

Claims (63)

1.一种识别癌症受试者对MDM2抑制剂治疗可能有反应的方法，所述方法包括：
a)提供受试者的生物样本；
b)确定生物样品中是否存在功能性LKB1/STK11缺陷；以及
c)根据生物样本中发现的功能性LKB1/STK11缺陷，确定受试者对MDM2抑制剂治疗可能有反应。
2.如请求项1之方法，其中该方法进一步包含：
d)将治疗有效量的MDM2抑制剂施用于经鉴定可能对MDM2抑制剂治疗有反应的受试者。
3.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括：
a)从受试者的生物学样品中确定功能性LKB1/STK11是否不足；和
b)基于所述生物样品中发现的功能性LKB1/STK11的缺乏，向所述受试者施用治疗有效量的MDM2抑制剂。
4.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的MDM2抑制剂，其中已经确定在来自所述受试者的生物样品中功能性LKB1/STK11缺乏。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测定包括检测生物样品中LKB1/STK11中存在的一个或多个失活突变，其中LKB1/STK11中存在的一个或多个失活突变指示LKB1/STK11中功能性的缺陷。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述LKB1/STK11中的一个或多个失活突变包括缺失、插入、替换或其任何组合，所述缺失、插入、替换或其任何组合降低LKB1/STK11的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述LKB1/STK11中的一个或多个失活突变包含从表1中所列的突变组中选择的突变。
8.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的方法，其中所述确定包括确定所述生物样品中LKB1/STK11的水平是否相对于参考水平降低，其中所述降低的LKB1/STK11水平指示LKB1/STK11中功能性的缺陷。
9.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的方法，其中所述确定包括确定所述生物样品中LKB1/STK11的启动子是否高甲基化，其中所述高甲基化的LKB1/STK11启动子指示功能性LKB1/STK11的缺陷。
10.根据权利要求1-3和5-9中任一权利要求所述的方法，其中所述确定进一步包括：
在生物样品中测定功能性p53(例如野生型p53)的存在或不存在，其中功能性p53(例如野生型p53)的存在指示对MDM2抑制剂的治疗有反应的可能性。
11.如请求项4之方法，其中将施用MDM2抑制剂之受试者在生物样本中具有或进一步确定具有功能性p53(例如野生型53)。
12.如请求项4或11之方法，其中将施用MDM2抑制剂之受试者因免疫疗法或化学疗法而复发或难治。
13.如请求项4、11或12之方法，其中该免疫疗法系PD-1/PD-L1阻断疗法。
14.根据权利要求1-3和5-10中任一权利要求所述的方法，其中所述确定进一步包括：在生物样品中测定KRAS中一个或多个突变的存在，其中KRAS中一个或多个突变的存在指示对MDM2抑制剂的治疗有反应的可能性。
15.如请求项4及11-13中任一项之方法，其中将施用MDM2抑制剂之受试者在该生物样本中具有或进一步确定具有一个或多个KRA突变。
16.根据上述任一权利要求所述的方法，其中i)功能性LKB1/STK11的缺陷，ii)功能性p53的存在或不存在，和/或iii)KRAS中的一个或多个突变，通过扩增分析、杂交分析、测序分析或免疫分析来测量。
17.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述生物样品包含癌细胞或非癌细胞。
18.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述癌症为实体瘤或血液恶性肿瘤。
19.如前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述癌症为胃癌(例如胃癌)、胆管癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌(例如浸润性乳腺癌)、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、膀胱癌、胰腺癌、肾癌，食道癌、头颈癌、甲状腺癌、皮肤鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤。神经母细胞瘤、膀胱癌、子宫癌、黑色素瘤、骨肉瘤、淋巴瘤(如mantel细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)、白血病(如T细胞前淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或急性髓系白血病)、多发性骨髓瘤、子宫癌、结直肠癌、肺腺癌、，子宫癌肉瘤、肺鳞状细胞癌、宫颈癌、食管癌、肉瘤、嫌色症、肾细胞癌(RCC)、透明细胞癌、乳头状RCC、葡萄膜黑色素瘤、睾丸生殖细胞瘤、低度胶质瘤(LGG)、间皮瘤、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、胸腺瘤或腺样囊性癌(ACC)。
20.如请求项19之方法，其中该癌症选自小细胞肺癌及非小细胞肺癌(例如肺腺癌、肺鳞状细胞癌或肺大细胞癌)。
21.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述MDM2抑制剂在抑制MDM2与p53的结合方面具有不大于1μM(例如，不大于500nM、400nM、300nM、200nM、150nM、100nM、50nM、20nM、10nM或5nM)的IC50，如通过荧光偏振结合测定所述MDM2抑制剂。
22.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其特征在于，所授MDM2抑制剂为(I)表示的化合物：
Figure FDA0002956500860000031
或者药学上可接受的盐，其中
Figure FDA0002956500860000032
选自包含以下基团的组中，
Figure FDA0002956500860000041
B是C4-7碳环；
R1为H，取代或未取代的C1-4烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，ORa或NRaRb；
n为0、1或2；
R2，R3，R4，R5，R7，R8，R9和R10独立地选自H，F，Cl，CH3和CF3；
R6是
Figure FDA0002956500860000042
Ra是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rb是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rc和Rd是环B的一个碳原子上的取代基，其中
Rc是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；
Rd是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；要么
Rc和Rd与它们所连接的碳一起形成4至6元螺环取代基，可选地含有一个氧原子；和
Re是-C(＝O)ORa，-C(＝O)NRaRb或-C(＝O)NHSO2CH3。
23.如权利要求22所述的方法，其中
Figure FDA0002956500860000043
是
Figure FDA0002956500860000044
B是
Figure FDA0002956500860000045
和
Rc和Rd是F和F,H和H,OH和CH3,OH和H,CH3和CH3,CH3和OH,H和OH,CH2CH3和CH2CH3,或CH2OH和CH2OH。
24.如权利要求22和23所述的方法，其中
Figure FDA0002956500860000051
是H,CH3,或CH2CH3。
25.如权利要求22-24任一项所述的方法，其中R2是H；R3是卤素；R4和R5是H。
26.如权利要求22-25任一项所述的方法，其中R7是氟；每个R8,R9,和R10是H；Re是—C(＝O)OH,—C(＝O)NH2,或—C(＝O)NHSO2CH3。
27.如权利要求20所述的方法，其中MDM2抑制剂选自：
Figure FDA0002956500860000052
Figure FDA0002956500860000061
Figure FDA0002956500860000071
或其药学上可接受的盐。
28.如权利要求22所述的方法，其中所述MDM2抑制剂是
Figure FDA0002956500860000072
其药学上可接受的盐。
29.根据权利要求1-21中任一权利要求所述的方法，其中所述MDM2抑制剂选自以下组：伊达沙努特林、RG7112、HDM201、KRT-232、AMG 232、BI907828、SAR-405838、MK-8242、DS3032-b、ALRN-6924和CGM097；或前述任一药物上可接受的盐。
30.根据权利要求2-29中任一权利要求所述的方法，其中所述方法还包括进一步施用有效量的一种或多种附加疗法。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述一种或多种附加疗法包括放疗、化疗、靶向癌症疗法或具有免疫检查点分子的调节剂的疗法。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种附加疗法包括施用抗PD-1抗体、Bcl-2抑制剂、FAK抑制剂、MEK抑制剂或MET抑制剂。
33.一种用于预测癌症受试者对MDM2抑制剂治疗的反应性的试剂盒，包括
a)一种或多种用于检测功能性LKB1/STK11缺陷的试剂。
34.如权利要求第33项之试剂盒，其进一步包含：
b)一种或多种试剂，用于检测是否存在功能性p53(例如野生型p53)。
35.如权利要求项第33或34之试剂盒，其进一步包含：
c)一种或多种试剂，用于检测KRAS中的一种或多种突变。
36.一种在需要的受试者中诱导铁死亡的方法，包括向该受试者投与有效量的MDM2抑制剂。
37.一种治疗或改善需要铁死亡的受试者中受益于铁死亡的疾患的效果的方法，包括向受试者施用有效量的MDM2抑制剂以诱导铁死亡。
38.一种治疗被鉴定为具有铁死亡敏感疾患或癌症的受试者的方法，包括向该受试者投与有效量的MDM2抑制剂以诱导铁死亡。
39.如权利要求36-38任一项所述的方法，其中MDM2抑制剂包含式(I)所述化合物或其药学上可接受的盐，其中
Figure FDA0002956500860000081
选自包含以下基团的组中，
Figure FDA0002956500860000091
B是C4-7碳环；
R1为H，取代或未取代的C1-4烷基，取代或未取代的环烷基，取代或未取代的杂环烷基，ORa或NRaRb；
n为0、1或2；
R2，R3，R4，R5，R7，R8，R9和R10独立地选自H，F，Cl，CH3和CF3；
R6是
Figure FDA0002956500860000092
Ra是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rb是氢或取代或未取代的C1-4烷基；
Rc和Rd是环B的一个碳原子上的取代基，其中
Rc是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；
Rd是H，C1-3烷基，C1-3亚烷基-ORa，ORa或卤素；要么
Rc和Rd与它们所连接的碳一起形成4至6元螺环取代基，可选地含有一个氧原子；和
Re是-C(＝O)ORa，-C(＝O)NRaRb或-C(＝O)NHSO2CH3。
40.如权利要求39所述的方法，其中
Figure FDA0002956500860000093
是
Figure FDA0002956500860000094
B是
Figure FDA0002956500860000095
和
Rc和Rd是F和F,H和H,OH和CH3,OH和H,CH3和CH3,CH3和OH,H和OH,CH2CH3和CH2CH3,或CH2OH和CH2OH。
41.如权利要求39和40所述的方法，其中
Figure FDA0002956500860000101
是H,CH3,或CH2CH3。
42.如权利要求39-41任一项所述的方法，其中R2是H；R3是卤素；R4和R5是H。
43.如权利要求39-42任一项所述的方法，其中R7是氟；每个R8,R9,和R10是H；Re是—C(＝O)OH,—C(＝O)NH2,或—C(＝O)NHSO2CH3。
44.如权利要求39所述的方法，其中MDM2抑制剂选自：
Figure FDA0002956500860000102
Figure FDA0002956500860000111
Figure FDA0002956500860000121
或其药学上可接受的盐。
45.如权利要求36-44中任一项之方法，其中铁死亡之诱导系藉由脂质活性氧(ROS)之增加来确定。
46.根据权利要求36-45所述的方法，其中所述受试者被鉴定为具有能够调节SLC7A11表达的野生型p53或p53变体。
47.根据权利要求38-46中任一权利要求所述的方法，其中所述铁死亡敏感疾患或癌症的特征在于活性或过度活性脂质ROS产生。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述铁死亡敏感病症或癌症的特征在于具有一个或多个功能性或过度活性基因或基因产物，所述基因或基因产物选自：血红素载体蛋白1、整合素、铁蛋白、铁转运刺激因子(SFT)、铁反应元件结合蛋白(IRP)、转铁蛋白，DMT1、ACSL4、CARS、ALOX、ATP5G3、CHAC1、CS、DPP4、GLS2、LPCAT3、NCOA4、RPL8、SAT1、TFRC和TTC35/EMC2。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述过度活性基因或基因产物过度表达或具有激活突变。
50.根据权利要求47-49中任一权利要求所述的方法，其中所述铁死亡敏感病症或癌症的特征在于，在一个或多个基因或基因产物中具有降低的活性，所述一个或多个基因或基因产物选自以下组：ZEB2、AKR1C1-3、SLC7A11、SLC3A2、GPX4、CD44v、CBS、CISD1、FANCD2、GCLC/GCLM、GSS、HMGCR、HSPB1/5、NFE2L2和SQS。
51.根据权利要求47-50中任一权利要求所述的方法，其中所述对铁死亡敏感的癌症的特征在于在SLC7A11和/或GPX4中具有降低的活性。
52.如权利要求第50或51之方法，其中具有降低活性之基因或基因产物表达不足或具有失活突变。
53.根据权利要求38-52中任一权利要求所述的方法，其中所述铁死亡敏感病况或癌症以高间充质细胞状态为特征。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述高间充质细胞状态的特征在于从以下组中选择的一个或多个基因的上调：CD133、CD44、VIM、FN1、ZEB1、TWIST1、SNAI2和CDH2。
55.根据权利要求38-54中任一权利要求所述的方法，其中所述铁死亡敏感疾患或癌症的特征在于：RAS(例如KRAS和/或HRAS)、TFRC或MRP1的过度表达或激活突变。
56.根据权利要求38-55中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者进一步被鉴定为具有功能性p53(例如野生型53)和/或KRAS中的一个或多个突变。
57.根据权利要求38-56中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者被鉴定为具有功能性LKB1/STK11缺陷。
58.根据权利要求38-57中任一权利要求所述的方法，其中所述铁死亡敏感病况或癌症包括肺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、急性髓系白血病、肝细胞癌、横纹肌肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肾细胞癌、前列腺癌、黑色素瘤、纤维肉瘤、卵巢癌，脑癌或乳腺癌。
59.根据权利要求36-58中任一权利要求所述的方法，还包括向所述受试者施用附加疗法。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述附加治疗包括放疗、化疗、靶向癌症治疗(例如，使用Bcl-2抑制剂、FAK抑制剂、MEK抑制剂或MET抑制剂的治疗)、使用免疫检查点分子的调节剂的治疗(例如，抗PD-1抗体)。
61.根据权利要求59所述的方法，其中所述附加疗法包含不诱导铁死亡的抗癌剂。
62.根据权利要求59所述的方法，其中，所述另外的疗法包括铁死亡诱导剂。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述铁死亡诱导剂包含RSL3、阿替瑞他明、青蒿琥酯、丁硫氨酸亚砜肟、BAY 87-2243、细胞色素酶、DP17伊拉斯汀、FIN56、兰帕立松、哌嗪偶联伊拉斯汀、咪唑酮伊拉斯汀、他汀类、柳氮磺胺吡啶、索拉非尼或魏菲灵A。
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