CN113311166B - 一种用于绵羊早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于绵羊早期妊娠检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛋白生物标志物为CHI3L1蛋白，其序列号为<210>1；PSMB4蛋白，其序列号为<210>2；LGALS3BP蛋白，其序列号为<210>3。上述蛋白生物标志物应用于绵羊早期妊娠诊断。一种绵羊早期妊娠检测的方法，其特征在于：具体步骤如下：①、采集血样：采集配种后14天的绵羊外周血；②、血样处理：对①步骤的血样进行分离血清或血浆处理：③、试剂盒检测：选用ELISA试剂盒对②步骤处理后的血样进行检测，检测CHI3L1蛋白、PSMB4蛋白及LGALS3BP蛋白的含量。

Description

一种用于绵羊早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于绵羊 早期妊娠检测的方法

技术领域

本发明属于生物技术诊断领域，具体涉及一种用于绵羊早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于绵羊早期妊娠检测的方法。

背景技术

绵羊的妊娠诊断一直以来都受到企业的重视，因为早期妊娠的准确诊断不仅能减少母羊空怀所造成的经济损失，而且便于及时对妊娠母羊进行及时分群，合理的饲养和管理，同时也有利于提高绵羊繁殖效率，促进家畜集约化管理，提高效益。如何通过有效而准确的检测的方法发现未妊娠母羊，缩短胎次间隔以及减少非生产天数(NPD)一直困扰着养羊业。

传统的妊娠检测的方法如试情法、外部观察法、超声波诊断法、阴道检查法等，有着各自的缺陷，检测时间天数较长、症状诊断不明确、受使用者的经验程度影响等，误诊、漏诊均有不同程度的存在。鉴于传统妊娠检测的方法存在的缺陷，我们急需找到一种更为精准简便的早期妊娠检测的方法应用于生产管理。

发明内容

本发明所要解决的问题是找出一种能够检测出绵羊早期妊娠的蛋白标志物及其应用及绵羊早期妊娠检测的方法。

蛋白质作为基因表达的最终产物，直接反映了机体生命的复杂和多变性。对蛋白质进行分析，才能更好地解释细胞活动或其行使功能的过程。生物标志物是指可以明确标识系统、器官等结构或功能的改变的生化指标，如DNA、RNA、蛋白质等都可以作为生物标志物用于研究。现代生物标志物的研发一般分为三个阶段：发现阶段、验证阶段和确认阶段。在发现阶段蛋白质组学的技术方法已经在身故标志物的发现和检测中得到广泛应用。目前较为主流的一种基于串联质谱方法的蛋白质定量技术——TMT(tandem mass tags)，该技术通过对蛋白质酶解后肽段进行标记，利用串联质谱方法，对肽段进行精确鉴定和定量。目前关于绵羊早期妊娠蛋白的研究较少，仍然缺乏准确可靠的蛋白生物标志物用于绵羊早期妊娠诊断，急需开发一些具有早期诊断价值的的绵羊早期妊娠诊断蛋白生物标志物。理想的蛋白生物标志物需在绵羊妊娠早期就能特异且灵敏的从外周血液中检出。目前，尚未公开用于绵羊早期妊娠诊断的蛋白生物标志物。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：

本发明的目的之一在于提供一种用于绵羊早期妊娠检测的蛋白生物标志物。

本发明的目的之二在于提供，通过检测该种蛋白生物标志物在绵羊早期妊娠阶段的表达水平，可以判断绵羊是否妊娠，从而为绵羊早期妊娠检测提供一种新的方法。

本发明的目的之三在于提供一种绵羊早期妊娠检测的方法。

本发明技术方案如下：

本发明提供一种用于绵羊早期妊娠检测的蛋白生物标志物，所述蛋白生物标志物为：CHI3L1，其序列号为<210>1；PSMB4，其序列号为<210>2；LGALS3BP，其序列号为<210>3；上述蛋白生物标志物应用于绵羊早期妊娠诊断。

一种绵羊早期妊娠检测的方法，其特征在于：具体步骤如下：

①、采集血样：采集配种后14天的绵羊外周血；

②、血样处理：对①步骤的血样进行分离血清或血浆处理：

③、试剂盒检测：选用ELISA试剂盒对②步骤处理后的血样进行检测，检测CHI3L1蛋白、PSMB4蛋白及LGALS3BP蛋白的含量。

所述ELISA试剂盒是如下的一种：羊几丁质酶3样蛋白1检测试剂盒、羊蛋白酶体B亚基4型检测试剂盒和羊可溶性半乳糖凝集素3结合蛋白检测试剂盒；即：

羊可溶性半乳糖凝集素3结合蛋白检测试剂盒用于检测LGALS3BP蛋白；

羊蛋白酶体B亚基4型检测试剂盒用于检测PSMB4蛋白；

羊几丁质酶3样蛋白1检测试剂盒用于检测CHI3L1蛋白。

收集配种后14天绵羊外周血液样本，在配种后25天进行B超妊娠检测，35天妊娠复检，以区分妊娠组与未妊娠母羊组。分离蛋白，采用TMT技术结合系统的生物信息学分析方法，筛选在妊娠早期差异表达的蛋白，最终获得了3个与绵羊早期妊娠密切相关的外周血液中的蛋白质，即CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP，在配种后14天妊娠与非妊娠绵羊外周血液样本中表达量均存在显著差异并通过ELISA验证，最终证明本发明提供的差异表达蛋白即CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP与绵羊早期妊娠高度相关，能够作为快速进行绵羊早期妊娠诊断的生物标志物，该种蛋白生物标志物具有良好的诊断指标的特性。

所述CHI3L1、PSMB4蛋白在配种后14天妊娠组绵羊外周血液中表达量显著低于非妊娠组，所述LGALS3BP蛋白在配种后14天妊娠组绵羊外周血液中表达量显著高于非妊娠组，进而CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白能够作为绵羊早期妊娠的蛋白生物标志物用于绵羊早期妊娠检测。

进一步的，本发明提供CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白生物标志物中的任意一种在绵羊早期妊娠检测中的应用，在绵羊配种14天后采集外周血样，采用ELISA酶联免疫吸附反应技术检测血液中CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白的表达水平，若检测LGALS3BP显著低表达，CHI3L1、PSMB4显著高表达则该母羊应当及时进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔，进而有效降低母羊非生产天数，提高养羊企业的经济效益。

本发明原理：申请人发现CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白在妊娠早期绵羊外周血液中相对于配种未妊娠母羊表达量显著变化，所以本发明重点分析了早期妊娠绵羊外周血液中CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白的表达情况，首次发现CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白可以单独使用作为快速检测绵羊早期妊娠蛋白分子标志物，并进行应用。

本发明获得的有益效果：

(1)本发明针对绵羊早期妊娠诊断，筛选蛋白质分子，通过收集14天配种后妊娠与未妊娠绵羊外周血液样本，从而对妊娠与未妊娠母羊样本中差异表达的蛋白质进行筛选和检测，获得3个在妊娠与未妊娠差异显著的蛋白质，最终得到与绵羊早期妊娠相关的差异表达蛋白，即：CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白，从而证明3个蛋白质可以用于绵羊早期妊娠检测。

(2)本发明提供蛋白生物标志物CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP中的一种在绵羊早期妊娠检测中的应用，在绵羊配种14天采集外周血液，采用ELISA酶联免疫吸附反应技术检测血液中CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白的表达水平，若检测结果显著低表达，则该母羊应当及时进行下一次人工授精配种，以达到缩短胎次间隔，进而有效降低母羊非生产天数，提高养羊企业的经济效益。

(3)本发明公开的3个蛋白生物标志物中，CHI3L1在配种14天妊娠绵羊与未妊娠绵羊对照组中表达量差异显著；PSMB4在配种14天妊娠绵羊与未妊娠绵羊对照组中表达量差异显著，LGALS3BP在配种14天妊娠绵羊与未妊娠绵羊对照组中表达量差异显著。

(4)本发明公开的3个蛋白生物标志物中，CHI3L1在配种14天妊娠绵羊与未妊娠绵羊的ROC曲线下面积(AUC)为0.992，并且呈现出0.001水平的显著性(p＝0.001＜0.05)；PSMB4在配种14天妊娠绵羊与未妊娠绵羊的ROC曲线下面积(AUC)为0.976，并且呈现出0.001水平的显著性(p＝0.001<0.05)；LGALS3BP在配种14天妊娠绵羊与未妊娠绵羊的ROC曲线下面积(AUC)为0.844，并且呈现出0.017水平的显著性(p＝0.017<0.05)，这意味着3个蛋白生物标志物均可单独用于绵羊早期妊娠检测，且具有较高的早期妊娠检测价值。

本发明为绵羊早期妊娠检测提供了新的蛋白生物标志物CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP，为绵羊早期妊娠检测提供了新的方向。

附图说明

图1为TMT检测的差异蛋白表达的ELISA验证图。

图2为CHI3L1蛋白在配种后14天血液中表达情况的ROC曲线分析。

图3为PSMB4蛋白在配种后14天血液中表达情况的ROC曲线分析。

图4为LGALS3BP蛋白在配种后14天血液中表达情况的ROC曲线分析。

图5为PSMB4-CHI3L1蛋白在配种后14天血液中表达情况的ROC曲线分析。

图6为PSMB4-LGALS3BP蛋白在配种后14天血液中表达情况的ROC曲线分析。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：TMT技术筛选配种后第14天妊娠与非妊娠绵羊外周血液中差异蛋白

本实施例采集了配种后第14天妊娠与非妊娠的绵羊血液，分离蛋白，采用TMT技术及生物信息学方法分析筛选在妊娠早期差异表达的蛋白，具体步骤如下：

1.检测样本

选取正常哈萨克绵羊8头随机分为对照组和试验组。按照常规生产流程查情配种，试验组母羊输入正常的精液，对照组母羊输入死精(正常精液高温煮沸，并在显微镜下观察确保精子死亡)。在配种后第14天采集妊娠母羊和对照组母羊血液，分离血浆，立即置于干冰中冷冻保存，并尽快运回实验室并置于超低温冰箱保存备用。

2.总蛋白提取和定量

样品从-80℃取出，4℃，12000g离心10分钟，去除细胞碎片，上清液转移至新的离心管，用ProteoMiner^TMProtein Enrichment Small-Capacity Kit(Bio-rad)说明书去除高丰度蛋白。取5μL蛋白样品，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。

3.SDS-PAGE电泳

(1)样品准备：根据蛋白浓度测定结果，每个样品取等量蛋白到离心管中，加入5μL4×Loading buffer，再加入2％SDS使体积为20μL；

(2)上样：依次上样1μL预染蛋白marker和20μL蛋白样品，样品相邻的空白孔上样20μL 1×Loading buffer封闭；

(3)电泳：浓缩胶15mA/gel置蛋白浓缩为一条线，约15min；分离胶35mA至dye电泳到胶底部；

(4)染色和脱色：胶取出后于考马斯亮蓝R-250染液中室温染色2h，然后加入脱色液，脱色至背景无色、条带清晰。

4.TMT定量蛋白组测序筛选差异蛋白

(1)胰蛋白酶酶切

各样品蛋白取等量进行酶解，加入适量标准蛋白，用裂解液将体积调整至一致。加入1倍体积的预冷丙酮，涡旋混匀后再加入4倍体积的预冷丙酮，-20℃沉淀2h。4500g，离心5min，弃上清，用预冷的丙酮洗涤沉淀2次。晾干沉淀后加入终浓度200mM的TEAB，超声打散沉淀，以1:50的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解过夜。加入二硫苏糖醇(DTT)使其终浓度为5mM，56℃还原30min。之后加入碘乙酰胺(IAA)使其终浓度为11mM，室温避光孵育15min。

(2)TMT标记

胰酶酶解的肽段用StrataX C18(Phenomenex)除盐后真空冷冻干燥。以0.5M TEAB溶解肽段，根据TMT试剂盒操作说明标记肽段。简单的操作如下：标记试剂解冻后用乙腈溶解，与肽段混合后室温孵育2h，标记后的肽段混合后除盐，真空冷冻干燥。样本标记信息：

P1

P2

P3

P4

NP1

NP2

NP3

NP4

127N

127C

128N

128C

129N

129C

130N

130C

(3)HPLC分级

肽段用高pH反相HPLC分级，色谱柱为Agilent 300Extend C18(5μm粒径，4.6mm内径，250mm长)。操作如下：肽段分级梯度为8％-32％乙腈、pH9，60min时间分离60个组分，随后肽段合并为14个组分，合并后的组分经真空冷冻干燥后进行后续操作。

(4)液相色谱-质谱串联分析

肽段用液相色谱流动相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系统进行分离。流动相A为含0.1％甲酸和2％乙腈的水溶液；流动相B为含0.1％甲酸和90％乙腈的水溶液。液相梯度设置：0-38min，8％～23％B；38-52min，23％～35％B；52-56min，35％～80％B；56-60min，80％B，流速维持在600.00nL/min。肽段经由超高效液相系统分离后被注入NSI离子源中进行电离然后进QE+1质谱进行分析。离子源电压设置为2.2kV，肽段母离子及其二级碎片都使用高分辨的Orbitrap进行检测和分析。一级质谱扫描范围设置为400-1500m/z，扫描分辨率设置为70000.00；二级质谱扫描范围则固定起点为100m/z，二级扫描分辨率设置为35000.00。数据采集模式使用数据依赖型扫描(DDA)程序，即在一级扫描后选择信号强度最高的前20.00肽段母离子依次进入HCD碰撞池使用30％的碎裂能量进行碎裂，同样依次进行二级质谱分析。为了提高质谱的有效利用率，自动增益控制(AGC)设置为5E4，信号阈值设置为3.8E4ions/s，最大注入时间设置为50ms，串联质谱扫描的动态排除时间设置为30s秒避免母离子的重复扫描。

(5)数据库搜索

二级质谱数据使用Maxquant1.5.2.8进行检索。检索参数设置：数据库为Ovis_aries_9940(23111条序列)，添加了反库以计算随机匹配造成的假阳性率(FDR)，并且在数据库中加入了常见的污染库，用于消除鉴定结果中污染蛋白的影响；酶切方式设置为Trypsin/P；漏切位点数设为2；肽段最小长度设置为7个氨基酸残基；肽段最大修饰数设为5；First search和Main search的一级母离子质量误差容忍度分别设为10.0ppm和5ppm，二级碎片离子的质量误差容忍度为0.02Da。将半胱氨酸烷基化Carbamidomethyl(C)设置为固定修饰，可变修饰为['Acetyl(Protein N-term)','Oxidation(M)','Deamidation(NQ)']。定量方法设置为TMT-10plex，蛋白鉴定、PSM鉴定的FDR都设置为1％。

(6)生物信息学分析方法

①功能注释分析：蛋白在Gene Ontology(GO)可进行3个方面分类注释：生化过程，细胞定位，分子功能。GO的注释信息主要来自于UniProt-GOA数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库用来分析蛋白通路。首先使用KEGG在线工具KAAS进行KEGG数据库的蛋白质功能注释，然后使用KEGG的在线工具KEGG mapper绘制注释蛋白的代谢通路。

②功能富集：利用双尾Fisher检验对鉴定的GO和KEGG通路以及结构域富集的差异蛋白检测。用FDR和P<0.05的多重假设检验校正。

③差异蛋白的富集分析和富集聚类：富集分析和富集聚类被用来探索不同蛋白质在参与的通路(比如KEGG通路)中潜在关系。我们首先通过分析所有蛋白质的p值对蛋白质功能富集，然后过滤掉低富集度的蛋白质。过滤的p值矩阵用x＝-log10(P-value)表示，再由x值对每个功能类别做z变换，z值用于单方聚类分析(欧几里得距离，平均距离聚类)。用R语言中pheatmap包对差异蛋白进行聚类分析。

5.差异蛋白互作网络分析

将差异蛋白用STRING(https://string-db.org/cgi/input.pl)在线软件进行互作网络分析，STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)是一个专门研究、收集针对己知者预测蛋白相互作用的数据库。将羊的蛋白质比对到STRING数据库中对应物种的蛋白上，获得表达该蛋白的基因登录号进行STRING分析。

6.检测结果

利用T检验分析妊妊娠与未妊娠两组样本间蛋白表达的差异，筛选条件为显著性检验值P<0.05和两组样本定量比值FC>1.20或FC<0.83。在本次测序结果中，通过GO和KEGG富集分析，以及差异蛋白互作网络分析，共筛选到与绵羊妊娠早期相关的差异蛋白3个，分别是CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP。

本实施例通过收集配种后14天妊娠与未妊娠绵羊外周血液样本，从而对妊娠与未妊娠绵羊外周血液样本中差异表达的蛋白进行筛选和检测，共获得3个妊娠早期与胚胎附植相关的差异表达蛋白——CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP。

7.ELISA对TMT检测结果的验证

为进一步验证TMT检测的蛋白表达结果，我们使用ELISA技术对上述样本中7个差异表达蛋白的表达情况进行验证。

羊几丁质酶-3样蛋白-1(CHI3L1)、羊蛋白酶体B亚基4型(PSMB4)和羊可溶性半乳糖凝集素3(LGALS3BP)的ELISA试剂盒购于上海恒远生物科技有限公司。ELISA酶联免疫吸附剂测定试验按照试剂盒说明书进行操作，具体操作流程如下：

①标准品的稀释：试剂盒提供原倍标准品一只，按照下表在小试管中进行稀释。

5号标准品	150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
		4号标准品	150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
3号标准品	150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
		2号标准品	150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
1号标准品	150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

②加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

③温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

④配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

⑦温育：操作同③。

⑧洗涤：操作同⑤。

⑨显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

⑩终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

ELISA结果及数据分析

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

使用SPSS 21.0软件分析妊娠与非妊娠组中差异蛋白表达量。数据表示为平均值+标准误，并且通过t检验或方差分析测试样品之间的差异。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

如图1所示，结果表明7个差异蛋白在配种后14天妊娠与未妊娠绵羊外周血液中的表达与TMT检测结果一致。

实施例2：ELISA在配种后14天妊娠与未妊娠外周血液中差异蛋白表达情况的大群验证为进一步验证TMT检测的蛋白表达结果，我们使用ELISA技术对与绵羊妊娠早期相关的4个蛋白的表达情况进行了大群验证。

羊几丁质酶-3样蛋白-1(CHI3L1)、羊蛋白酶体B亚基4型(PSMB4)和羊可溶性半乳糖凝集素3(LGALS3BP)的ELISA试剂盒购于上海恒远生物科技有限公司。

1.样本信息采集

在配种后第14天采集绵羊血液样本30例，分离血清，立即置于干冰中冷冻保存，并尽快运回实验室并置于超低温冰箱保存备用。

2.样本信息确认

血液样本采集后，在配种后第25天时对所有配种绵羊进行B超孕检，随后在配种后第35天时对所有配种绵羊再次进行B超复检，确定所有配种母羊的妊娠状态，分为妊娠与非妊娠组，对所有样品均进行试验检测。样本信息检测结果为妊娠25例，未妊娠5例。

3.ELISA酶联免疫吸附剂测定试验按照试剂盒说明书进行操作，具体操作流程如下：

①标准品的稀释：试剂盒提供原倍标准品一只，按照下表在小试管中进行稀释。

5号标准品	150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
		4号标准品	150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
3号标准品	150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
		2号标准品	150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
1号标准品	150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

②加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

③温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

④配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

⑦温育：操作同③。

⑧洗涤：操作同⑤。

⑨显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

⑩终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

4.ELISA结果及数据分析

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

5.3种蛋白生物标志物的ROC曲线及曲线下面积AUC数据分析

ROC曲线是以1-特异性即误报率为X轴，以特异性(敏感度)作为Y轴而建立的折线图。本领域中，ROC曲线以下的面积值代表着预测的准确率情况，我们称其为AUC值。显然，AUC值越大，以为着预测准确率越高，反之则说明预测准确率越低。AUC值介于0到1之间，关于AUC值的判断说明如下：

AUC＜0.5：不符合实际情况，预测诊断比随机性猜测差，实际情况中不应该出现；

AUC＝0.5：说明完全无预测诊断价值，预测准确率和猜测效果一样；

0.5＜AUC＜0.7：预测诊断价值很低，此种情况相对较常见；

0.7≤AUC＜0.9：具有一定的预测诊断价值，对于实际诊断有较大的实用性；

AUC≥0.9：说明预测诊断价值高，此种情况较好；

AUC＝1，是完美预测没有瑕疵，绝大多数情况下，不存在完美的预测诊断。

根据ELISA试验结果，分别进行ROC曲线分析，并计算其AUC面积及置信度，3个指标的ROC曲线分析结合二元逻辑回归操作，如图2至图6，表1。

表1ROC曲线结果汇总

从上表可知，针对表达时期和蛋白对应的妊娠结局构造ROC曲线，用于判断它们对于妊娠结局的诊断价值，根据以上结果，我们以AUC值＞0.8且P值＜0.05作为阈值来筛选可以作为生物标志物的蛋白及其表达时期：

14天-CHI3L1对应的AUC值为0.992，并且呈现出0.001水平的显著性(p＝0.001<0.05)意味着14天-CHI3L1对于用于妊娠检测的价值非常高；

14天-PSMB4对应的AUC值为0.976，并且呈现出0.001水平的显著性(p＝0.001<0.05)意味着14天-PSMB4用于妊娠检测的价值非常高；

14天-LGALS3BP对应的AUC值为0.884，并且呈现出0.017水平的显著性(p＝0.017<0.05)意味着14天-LGALS3BP用于妊娠检测的价值非常高；

14天-PSMB4-CHI3L1对应的AUC值为1.000，并且呈现出0.001水平的显著性(p＝0.001<0.05)意味着14天-PSMB4、14天-CHI3L1联合用于妊娠检测的价值非常高；

14天-PSMB4-LGALS3BP对应的AUC值为0.976，并且呈现出0.001水平的显著性(p＝0.001<0.05)意味着14天-PSMB4、14天-LGALS3BP联合用于妊娠检测的价值非常高。

根据上述结果，对3个蛋白生物标志物检测与B超诊断结果进一步分析如下：

表2三种蛋白生物标志物检测结果与B超诊断结果

注释：CHI3L1，PSMB4为下调蛋白，大于最佳阈值判断为未妊娠，小于最佳阈值判断为妊娠；LGALS3BP为上调蛋白，大于最佳阈值判断为妊娠，小于最佳阈值判断为非妊娠。

表3三种蛋白生物标志物检测结果分析

由表中可以看出CHI3L1、PSMB4、PSMB4-CHI3L1、PSMB4-LGALS3BP的真阳性率(妊娠母羊检测为妊娠状态)有较高的准确性，分别为96％、100％、100％及96％，LGALS3BP为68％；CHI3L1、LGALS3BP、PSMB4-CHI3L1、PSMB4-LGALS3BP在判断假阳性率(未妊娠母羊检测为妊娠状态)为0，PSMB4为25％；真阴性率(未妊娠母羊检测为妊娠状态)CHI3L1、PSMB4、LGALS3BP、PSMB4-CHI3L1及PSMB4-LGALS3BP分别为100％、80％、100％、100％和100％；而假阴性率(未妊娠母羊检测为妊娠状态)CHI3L1为4％、PSMB4为0、LGALS3BP为32％、PSMB4-CHI3L1为0、PSMB4-LGALS3BP为0。CHI3L1、PSMB4、LGALS3BP、PSMB4-CHI3L1、PSMB4-LGALS3BP在检测母羊妊娠状态的准确率分别为96.67％、96.67％、73.33％、100％、96.67％。

综上所述，本发明提供的配种后14天妊娠与未妊娠绵羊外周血液中差异蛋白CHI3L1、PSMB4、LGALS3BP、PSMB4-CHI3L1联合及PSMB4-LGALS3BP联合适合作为羊早期妊娠检测生物标志物，且准确性与特异性较好。

实施例3：蛋白生物标志物在绵羊早期妊娠诊断中的应用

本实施例提供了一种蛋白生物标志物在绵羊早期妊娠诊断中的应用。通过检测蛋白生物标志物的表达水平，判断绵羊是否妊娠，本例以ELISA酶联吸附反应为例进行检测，ELISA试剂盒购于上海恒远生物科技有限公司。

1.血液样本的类型和采集

血清：将收集与血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内与2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.ELISA酶联免疫吸附剂测定试验按照试剂盒说明书进行操作，具体操作流程如下：

①标准品的稀释：试剂盒提供原倍标准品一只，按照下表在小试管中进行稀释。

5号标准品	150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
		4号标准品	150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
3号标准品	150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
		2号标准品	150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
1号标准品	150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

②加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上标准孔准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

③温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

④配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。

⑤洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

⑥加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

⑦温育：操作同③。

⑧洗涤：操作同⑤。

⑨显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

⑩终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

3.结果计算：

以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

4.根据蛋白浓度进行妊娠诊断

CHI3L1蛋白检测最佳阈值点蛋白浓度为302.54ng/ml；PSMB4蛋白检测最佳阈值点蛋白浓度为2956.06ng/ml；LGALS3BP蛋白检测最佳阈值点蛋白浓度为111.02ng/ml；PSMB4-CHI3L1蛋白检测最佳阈值点蛋白浓度为-0.66ng/ml；PSMB4-LGALS3BP蛋白检测最佳阈值点蛋白浓度为302.54ng/ml。

LGALS3BP及PSMB4-LGALS3BP，大于最佳阈值判断为妊娠，小于最佳阈值判断为未妊娠；CHI3L1、PSMB4及PSMB4-CHI3L1，小于最佳阈值判断为妊娠，大于最佳阈值判断为未妊娠。

优选的，本实施例提供CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白生物标志物中的任意一种在绵羊早期妊娠诊断试中的应用，在绵羊配种14天后采集外周血样，采用ELISA酶联免疫吸附反应技术检测血液中CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白的表达水平，若能检测LGALS3BP显著低表达，检测CHI3L1、PSMB4显著低表达则该母羊应当及时进行下一次配种，以达到缩短胎次间隔，进而提高绵羊繁殖效率，提高养羊企业的经济效益。

综上所述，CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白在绵羊外周血液中，采用ELISA方法在妊娠14天与未妊娠绵羊外周血液样本中进一步验证得出，CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白在妊娠14天与未妊娠绵羊外周血液中存在显著差异，因此将CHI3L1、PSMB4及LGALS3BP蛋白中的任意一种或联合应用到快速检测绵羊早期妊娠诊断技术领域时，可以作为检测绵羊早期妊娠的蛋白分子标志物，该种蛋白分子标志物具有良好的检测指标的特性，与现有的激素测定和超声波诊断等方法相比，本申请具有较好的特异性和灵敏性，能在配种后14天检测确定绵羊是否妊娠。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经对本发明作了详尽的描述，但其不得解释为对本发明自身的限制。在本发明的基础上，可对其在形式上和细节上作出一些修改或改进。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

<110> 石河子大学

<120>一种用于绵羊早期妊娠诊断的蛋白生物标志物及其用于绵羊早期妊娠检测的方法

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 453

<212> 氨基酸序列

<213> 羊

<220>

<221> CHI3L1

<223>

<400>

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V

<210> 2

<211> 264

<212> 蛋白质序列

<213> 羊

<220>

<221> PSMB4

<223>

<400>MEALLESRSGLWAGGPAPGQFYRIPPTPGSSVDPASALYGAPITRTQNPMVTGTSVLGLK

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<210> 3

<211> 536

<212> 氨基酸序列

<213> 羊

<220>

<221> LGALS3BP

<223>

<400> GVKDGDMRLADGGSANEGRVEIYYSGQWGTVCENMWDLTDASVVCRALGFRNATEALGGA

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Claims (1)

1.一种蛋白生物标志物在制备用于绵羊早期妊娠诊断产品中的应用，其特征在于：所述蛋白生物标志物包括如下蛋白中的一种或者多种组合；CHI3L1蛋白，其序列号为<210>1；PSMB4蛋白，其序列号为<210>2；LGALS3BP蛋白，其序列号为<210>3。

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