CN113243332B

CN113243332B - 一种广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型的制备与应用

Info

Publication number: CN113243332B
Application number: CN202010082845.5A
Authority: CN
Inventors: 魏佑震; 唐文洁
Original assignee: Shanghai East Hospital
Current assignee: Shanghai East Hospital
Priority date: 2020-02-07
Filing date: 2020-02-07
Publication date: 2023-07-28
Anticipated expiration: 2040-02-07
Also published as: WO2021155866A1; CN113243332A

Abstract

本发明涉及一种广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型的制备与应用。具体地，本发明提供了一种广泛脑区神经元树突发育障碍的非人哺乳动物模型的制备方法，包括如下步骤：将非人哺乳动物暴露于低氧条件下30‑40分钟，从而得到广泛脑区神经元树突发育障碍的动物模型，其中，在所述低氧条件下，氧浓度(体积比)从10‑20％降到1‑5％。本发明的动物模型可用于研究广泛脑区神经元树突发育障碍，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。

Description

一种广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型的制备与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型的制备与应用。

背景技术

缺氧/缺血性(H/I)损伤是各年龄段脑功能缺陷的主要原因之一，在临床和实验动物研究中都有广泛的研究，包括病因学、神经发病机制和药理干预。越来越多的研究表明，H/I可能对啮齿动物大脑发育产生不利影响。

目前大多数低氧性脑损伤动物模型有：

1.阻断动脉血管+缺氧法—脑缺血缺氧模型：缺点：麻醉具有神经保护作用；手术本身具有创伤；梗死变异大，不稳定；模型制作麻烦，批量小；成功率低；制作周期长。

2.大脑中动脉闭塞模型：这种模型，常常使用成年鼠，且只是一种脑缺血或脑缺血再灌注损伤模型，没有缺氧的因素；比较适合临床的脑缺血病症，是一种局灶性病变模型。不适合新生儿缺血缺氧性脑病的模拟。

3.夹闭气管法：缺点是：麻醉药物存在对神经的影响；手术本身造成的创伤；技术要求高，周期长；批量小；由于使用的鼠一般日龄较大(太小手术困难)，带来病理变化的一致性不良。

4.建立宫内缺氧模型：缺点：麻醉药物的数据影响；手术本身创伤；手术技术要求高；手术耗材消耗大；周期长，批量小；差异大，均一性差。

因此，本领域迫切需要开发一种新的低氧性脑损伤动物模型，其可以作为研究广泛脑区神经元树突发育障碍的发病机理以及新药筛选的有力工具的动物模型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以作为研究广泛脑区神经元树突发育障碍的发病机理以及新药筛选的有力工具的动物模型。

本发明第一方面提供了一种广泛脑区神经元树突发育障碍的非人哺乳动物模型的制备方法，包括如下步骤：

将非人哺乳动物暴露于低氧条件下30-40分钟，从而得到广泛脑区神经元树突发育障碍的动物模型，

其中，在所述低氧条件下，氧浓度(体积比)从10-20％降到1-5％。

在另一优选例中，所述广泛脑区神经元树突发育障碍包括广泛脑区神经元树突棘发育障碍。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物为新生非人哺乳动物，较佳地，为出生24个小时内的新生非人哺乳动物(比如啮齿动物)或为围出生期的新生非人哺乳动物)比如灵长目动物)。

在另一优选例中，在低氧条件下，加入惰性气体，从而降低氧浓度。

在另一优选例中，所述惰性气体选自下组：氮气、氦气、或其组合。

在另一优选例中，所述广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型具选自下组的一种或多种特征：

(t1)脑形态和脑大小无显著变化；

(t2)动物的全身发育无显著影响；

(t3)动物的体重无显著影响；

(t4)动物一般的生理活动，包括饮食、排泄、呼吸、心率、血压、视听觉、痛温觉、运动能力、反射能力等都没有显著的改变；

(t5)神经元光镜下的结构：神经元的形态、大小、极性、排列、数量、密度、分布没有发生显著变化；

(t6)小胶质细胞在其胞体及其突起的形态、大小、形状、分布、数量、密度等没有显著的变化；

(t7)突触电生理活性显著下降；

(t8)神经元树突和树突棘的棘形态、大小、数量、密度显著下降；

(t9)神经元的树突直径和长度显著下降；

(t10)神经元之间形成的突触的数量、分布、区域等显著减少；

(t11)行为、情绪、认知功能缺陷。

在另一优选例中，所述突触生理活性包括：mEPSCs振幅和频率。

在另一优选例中，所述行为、情绪、认知功能缺陷包括空间学习能力和记忆能力下降、主动探究行为降低、对危险境地的恐惧程度较弱、对明亮区域天然的恐惧心理表现减弱。

本发明第二方面提供了一种本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，将该模型用作研究广泛脑区神经元树突发育障碍的动物模型。

本发明第三方面提供了一种本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，用于筛选或鉴定可减轻或治疗广泛脑区神经元树突发育障碍的物质(治疗剂)。

本发明第四方面提供了一种筛选或鉴定治疗或缓解广泛脑区神经元树突发育障碍的潜在治疗剂的方法，包括以下步骤：

(a)在测试组中，在测试化合物的存在下，将测试化合物施用于本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型，检测测试组中所述动物模型的广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度Q1；并且在不施用所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组中所述动物模型广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度Q2；

(b)将上一步骤所检测的严重程度Q1和严重程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗或缓解广泛脑区神经元树突发育障碍的潜在治疗剂；

其中，如果严重程度Q1显著低于严重程度Q2或如果施用了测试化合物的动物模型中的广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度降低时，则表示所述测试化合物为治疗或缓解广泛脑区神经元树突发育障碍的潜在治疗剂。

在另一优选例中，所述的检测广泛脑区神经元树突发育障碍严重程度包括检测选自下组的一个或多个指标的变化：突触电生理活性；各脑区神经元树突和树突棘的棘形态、大小、数量、分布、密度；神经元的树突直径、长度、数量；各脑区突触及其构成的结构的分布的发育状况；行为、情绪、认知功能。

在另一优选例中，所述的广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度降低表现为：突触电生理活性的下降程度降低；神经元树突棘的棘密度、大小、数量、密度的下降程度降低；神经元的树突直径、长度、数量的降低；各脑区突触及其构成的结构的分布的发育程度降低；和/或行为、情绪、认知功能缺陷程度降低。

在另一优选例中，所述“显著低于”指具有生物学重复的测试组在施用测试化合物后的严重程度Q1低于具有生物学重复的对照组在施用测试化合物后严重程度Q2，且经过t检验其P值小于0.05。

在另一优选例中，所述“显著低于”指严重程度Q1/严重程度Q2之比值≤1/2，较佳地≤1/3，更佳地，≤1/4。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断性和非治疗性的。

在另一优选例中，所述方法包括步骤(c)，将步骤(b)筛选或鉴定的潜在治疗剂施用于本发明第一方面所述方法制备的非人哺乳动物模型，从而测定其对所述动物模型广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度的影响。

本发明第五方面提供了一种非人哺乳动物模型，用本发明第一方面所述方法制备。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本模型动物经受过缺氧打击后，没有引起大体上显著的变化。其中，A：没有发现脑的外形变化；B：没有引起体重的变化。

图2显示了经历过缺氧打击后，模型鼠的神经元电生理活动受到显著的影响。其中，A-C：离体电生理显示缺氧后的脑神经元之间的突触电活性下降；D-F：在体电生理显示缺氧后的海马脑区长时程抑制(LYD)电生理功能变化。

图3显示了缺氧后的脑光镜下观察，神经元形态、大小、排列、数量、分布、密度没有发现显著的变化(A-J)。

图4显示了缺氧后的脑光镜下观察，小胶质细胞形态、大小、排列、数量、分布、密度没有发现显著的变化(A-F)。

图5显示了缺氧后在早期(生后7天)海马区域的神经元的树突直径、树突棘的大小、数量、密度(B)比较正常鼠(A)显著下降；这种差异在成年时期更为显著(C,D)

图6显示了除去海马之外的其它脑区，比如齿状回(DG)，神经细胞的树突和树突棘也见到了缺氧造成树突直径变细、树突长度缩短、树突棘密度降低的显著变化(A-F)；在CA3区，由神经元树突棘构成的突触所聚集构成的区域体积降低(G-I)。

图7显示了利用体外细胞培养的方式，在低氧环境下培养的神经元，其发出的树突的长度显著下降，第一天就显著(A,B)，第7天差异更大(C,D)。

图8显示了成年以后，新生时期遭遇过缺氧打击的鼠，从逃避潜伏期的变化，反映出其在空间学习能力显著下降(A)；从撤出平台后，大鼠的运动轨迹(C)，反映出其空间记忆能力也同样显著下降(B,D)。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现，将非人哺乳动物暴露于氧浓度(体积比)从10-20％降至1-5％的低氧条件下30-40分钟，可得到广泛脑区神经元树突发育障碍的动物模型，本发明的动物模型是一种有效的广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型，可用于研究广泛脑区神经元树突发育障碍，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。在此基础上完成了本发明。

广泛脑区神经元树突发育障碍

在本发明中，本发明建立了一种相对缓和的缺氧条件(即哺乳动物暴露于浓度变化的氧浓度环境下，比如，氧浓度(体积比)从10-20％降至1-5％的低氧条件下)，造成了显著的神经元树突及其树突棘的发育障碍，这种发育障碍造成的结构性损伤持续存在，造成学习记忆甚至其他认知行为的损害。

动物模型

在本发明中，提供了一种非常有效的广泛脑区神经元树突发育障碍的非人哺乳动物模型。

在本发明中，非人哺乳动物的例子包括(但并不限于)：小鼠、大鼠、兔、猴等，更佳地是大鼠和小鼠。

本发明的动物模型用如下方法制备：

其中，在所述低氧条件下，氧浓度(体积比)从10-20％降至1-5％。

用本发明方法获得的动物模型可育，发育正常。

候选药物或治疗剂

在本发明中，还提供了一种利用本发明的动物模型，筛选治疗广泛脑区神经元树突发育障碍的候选药物或治疗剂的方法。

在本发明中，候选药物或治疗剂是指已知具有某种药理学活性或正在被检测的可能具有某种药理学活性的物质，包括但不限于核酸、蛋白、化学合成的小分子或大分子化合物、细胞等。候选药物或治疗剂的给药方式可以是口服、静脉注射、腹腔注射、皮下注射、椎管给药或直接脑内注射。

本发明的主要优点包括:

1.实验条件简单。

2.制作过程简单。

3.干预处理因素单一。只是给与了缺氧一个条件，没有对动物机体进行手术、给药等。

4.模型均一。个体差异小，新生鼠出生时间容易掌握，出生后几乎没有受到外界干扰。

5.指标明确。形态学、电生理、脑功能变化指标确切，显著、稳定。

6.损伤点聚焦。损伤位点集中在树突棘，明确、聚焦。细胞体、细胞形状、极向、排列、大小、数量、密度等，都不受影响。

7.损伤点功能关键。模型损伤的位点聚集在树突棘，树突棘是脑构成网络的神经元联系的关键节点，是神经元之间彼此影响的传递信号的主要通道，是中枢神经系统网络系统信号传递效率的关键点，是脑功能高低的主要结构基础。

8.树突棘损伤机制清晰。缺氧造成了神经元代谢紊乱，影响到能量供应，导致树突棘的发育障碍，树突棘的发育畸形终生存在，并伴随脑功能的低下。

9.成功率高。模型稳定，100％成功。

10.可以批量生产。同时制作比较大量的同质模型，便于开展大规模的实验。

11.可以作为研究广泛脑区神经元树突发育障碍症的发病机理和新药筛选的有力工具。

12.本发明动物模型表型稳定。

13.用本发明方法获得的动物模型可育，机体一般结构发育正常。

14.本发明的动物模型可以用来研究TSH在早期大脑神经元树突棘发育中的作用和机制。

15.本发明的动物模型可用来探索研究、开发、验证潜在的药物或手段、方法干预TSH损伤，阻断树突棘发育损伤；改善树突棘的发育障碍。

16.本发明的动物模型可用来研究树突棘发育障碍病理条件下，神经系统运行的功能性变化及其运行机制。

17.本发明的动物模型作为一种智力障碍的神经系统模式参考，进行其他神经系统病理模式(比如老年痴呆)下的学习记忆研究对比参照。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料均为市售产品。

制作过程

1.怀孕的母鼠被关在一个动物房间里，有12小时的光照和12小时的黑暗周期，它们可以自由获取食物和水，直到它们分娩。

2.在出生并由母亲喂养6小时后，这些新生鼠被随机分为两组。

3.在TSH处理中，新生鼠首先被放置在低氧室中，氧气浓度为15％，在30℃条件下，30分钟内逐渐被N2调节到3％。此后，氧浓度维持在3％，新生鼠在箱内再呆5分钟。因此，总的缺氧损伤持续了35分钟。对于正常氧处理组，新生鼠被放入箱内35分钟，正常氧浓度为21％。

4.缺氧过程结束后，所有的新生鼠，被送回笼子，与母鼠同处。

所需制备条件

1.一台氧控细胞培养箱，或者专用的动物饲育箱

2.如果没有专用设备，可以使用一台普通细胞培养箱，外加一个能控制氧气浓度的密闭盒子。

检测指标结果

1.成活率高：TSH处理后，50只新生鼠的脑大体形态及体重均恢复正常，全部成活。

2.缺氧全身反应明显：在低氧处理结束时，新生鼠的全身颜色比正常对照组更暗，并且在低氧处理结束后很快恢复。

3.脑形态不变：研究人员还对分别在5天和7天内接受TSH和常氧处理的幼鼠的大脑进行了仔细的比较。低氧处理组和正常氧处理组在脑形态和脑大小上没有明显差异(图1A)。

4.体重不变：低氧处理的新生鼠和正常氧处理的新生鼠体重(n＝8,p>0.05)的生长速度相似(图1B)。这些观察结果表明，TSH对动物全身发育的影响不显著。

5.突触电生理活性下降：为了探索是否TSH对神经功能的影响,利用膜片箝记录自发的突触活动，海马切片TSH(n＝27个神经元)和normoxia治疗大鼠神经元(n＝31),即谷氨酸受体介导微型兴奋性突触后电流(mEPSCs)记录在CA1神经元。TSH处理大鼠mEPSCs振幅(pA)为15.18±0.43(pA)，与对照组(p<0.001)的17.70±0.28(pA)相比，差异有统计学意义(图2A和图2B)。TSH处理的大鼠mEPSCs频率为3.98±0.55(Hz)，与对照组的6.35±0.49(Hz)相比，也显著降低(图2A和2C)(p<0.01)。此外，体内海马CA1突触活动记录显示，TSH损伤(n＝23个神经元)动物神经元放电率为8.74±0.63(spike/s)，明显高于正常运动对照组(n＝25个神经元)的5.06±0.45(spike/s)，p<0.001(图2D)。由于TSH大鼠海马CA1中mEPSCs的振幅和频率均显著降低，我们怀疑基础突触传递的减少是否也会影响海马脑片的突触可塑性。TSH处理组海马CA1区细胞外长期电位(LTP)与正常对照组相同(图2E)。然而，缺氧显著抑制了长期抑郁(LTD)(图2F)。这些结果表明，TSH损伤后神经元突触活动中断。

6.神经元形态及光镜下结构不变：TSH不会引起大脑神经细胞结构变化。我们检测了TSH损伤后海马神经元数量是否发生了改变。尼氏小染色显示(图3，A-J)。海马CA1神经元密度TSH和正常大鼠在P5,P7,P21和P90的观察,如表1所示。这些观察结果支持在TSH损伤后海马CA1在不同发育年龄没有发生明显的细胞丢失或整体结构改变。

表1

7.小胶质细胞没有被激活。TSH不诱发脑激活小胶质。观察海马CA1小胶质细胞在的形态、数量、分布、密度等，与正常(图4，A,B,C)相比，缺氧大鼠的海马小胶质细胞表明没有明显激活(图4，D,E,F)。

8.TSH导致海马神经元树突棘密度下降。TSH处理后第7天和第90天分别检测海马CA1神经元树突、树突棘和脑区DG中颗粒细胞的结构细节。正常大鼠神经元树突棘沿树突成簇状分布,缺氧后动物的树突棘TSH显著下降,稀疏分布,只有少量沿着树突分布(图5)。生后第7天，海马CA1神经元的顶树突的树突棘密度是每10um,8.5±4.0，与正常对照组15.1±2.9/10m比较，差异显著of,<0.001(图5A,B)。TSH损伤后3个月，树突棘密度的降低为14.0±3.9/10um，而正常运动组动物的棘密度为23.7±4.6/10um(<0.05)(图5C,D)。

9.神经元的树突直径下降。除树突棘密度外，在TSH处理或常氧处理后第7天和90天，我们还对海马CA1的神经元树突，尤其是次级分支进行了检测。在P7时，TSH组动物的树突平均直径与正常对照组大体相同。然而，经TSH处理的动物的神经元树突二级分枝的直径在统计学上要比常氧对照组的小。在低氧和常氧处理后90天也观察到类似的结果(图5和表2)。

表2

10.SH导致DG和CA3区域异常发育。海马齿状回的观察进一步证实了海马CA1中树突棘密度降低和树突二级分支变细(图6A、6B、6C)。在P90时，TSH处理后动物的DG颗粒细胞树突棘密度为7.03±0.53/10um，低于正常氧对照组的14.8±0.60/10um,p<0.0001(图6D)。TSH组树突长度较对照组明显缩短。TSH处理后90天，动物齿状回颗粒细胞的树突直径为0.893±0.064m，明显大于正常对照组的0.628±0.046m,p<0.05(图6E)。TSH处理后90d动物海马DG内分子层(IML)颗粒细胞的树突状收缩长度为15.35±1.75m，显著高于常氧对照组7.04±1.02m,p<0.001(图6F)。最后，在90天龄时对动物进行Timm染色的大脑切片显示，与对照组相比，TSH组海马CA3区域的Timm阳性颗粒明显减少(图6G和6H)。TSH损伤组海马CA3平均透明层宽度为117.3±4.63um，与正常对照组146.0±5.82um相比显著降低，p<0.005(图6I)。

11.低氧神经细胞培养神经元树突生长受损。利用细胞培养的方法进行体外实验，进一步验证缺氧对神经元树突的生长发育的影响。实验结果显示，在低氧(5％O2)条件下连续培养7天，从第一天开始，就观察到低氧条件下的神经元树突生长缓慢，突起变短，分支减少(图7A,B)；并一直持续存在，在观察期的第7天，比较常氧状态下的神经元形态(图7C)，缺氧的神经元树突长度和密度都显著降低(图7D)。

12.TSH会导致长期的认知功能缺陷。对3个月大的TSH和常氧处理后的大鼠进行Morris水迷宫实验。在为期4.5天的空间导航训练中，对照组和缺氧组的大鼠在前6次训练中都表现出了相似的改善，并且所有的动物在找到平台方面的潜伏期都有所缩短。然而，从第7、8和9个训练结果，TSH损伤和正常缺氧处理的动物之间存在显著差异。TSH组大鼠的潜伏期分别是21.6±3.71,16.6±1.79,20.4±3.86，显著长于对照组的12.1±1.72,7.99±1.03,8.07±0.96,分别(p<0.05)(图8A)。在9次训练试验后，所有大鼠在没有MWM平台的情况下进行空间探索测试。游泳的痕迹用数字记录下来了。TSH的平台网站穿越次数，第5日，9.43±1.29次和2.00±1.15，正常鼠的穿越次数分别是16.75±2.18，6.29±2.36，差异显著(p<0.05,图8B)。此外，TSH组动物在平台所在象限游泳距离为26475±2412mm，与对照组35862±3371mm相比，p<0.05(图8C和8D)。这些结果有力地表明，新生大鼠TSH损伤会导致大脑发育障碍，导致大脑功能缺陷，包括空间学习和记忆。

讨论

TSH围产期新生儿的动物模型研究。大脑是对缺氧最敏感的器官之一，长时间缺氧会导致昏迷、癫痫、认知障碍和其他神经功能障碍，甚至脑死亡。新生儿缺氧损伤通常被认为由于脐带绕颈、头盆不衬、出生嵌顿、子宫供血不良、新生儿窒息所致。围产期缺氧缺血性脑损伤造成急性婴儿和儿童较高的死亡率和慢性神经发病率，常常后遗症状。本发明首次发现TSH导致显著的病理变化包括中枢神经系统神经元的树突变细、短缩、树突棘密度降低、突触构造减少、突触电生理功能下降；此外，在患有TSH的动物中观察到认知功能受损。本发明的数据清楚地表明，TSH可以在新生期乃至成年期引起显著的神经突触和树突状毒性。因此，本发明提供了一个有用的动物模型，可以用于研究亚致死缺氧对早期大脑发育的作用和机制，并探索潜在的干预药物或方法。

本发明的研究表明，新生大鼠出生6小时后，单独给予短暂亚致死缺氧35分钟，这与之前用于缺氧/缺血研究的动物模型不同。在目前的研究中使用出生6个小时的动物,这比以往许多缺氧/缺血研究,使用动物大约有一个星期日龄，更接近临床情况(脐带绕颈、出生嵌顿、子宫畸形等)，出生后的时间越短，动物生后的个体变异系数越小，动物个体间神经系统的均一性越好。一个单因素的梯度缺氧供应，是目前研究与以往的动物模型使用颈动脉闭塞和缺氧(两个因素)的第二个差异。最后，TSH损伤组未见明显的神经病理改变，无神经元丢失，无神经胶质激活，但观察到持久的脑功能缺陷，是一种比较适宜于模拟临床更为常见的中轻度缺血缺氧性脑病的模型。由于其缺氧严重程度较轻，病情难以确诊，缺乏适当的护理或治疗，最终导致严重的脑发育功能障碍。因此，本研究为瞬态亚致死缺氧单独损伤的临床实践提供了一个重要的动物模型和有用的数据。

TSH阻断神经元的自发突触活动。在非常早期的早产儿和动物中发现了脑电图(EEG)的背景活动。在本研究中，与正常对照组相比，TSH导致海马CA1神经元mEPSCs的振幅和频率下降。TSH对神经元树突发育有负面影响。在本发明中，与对照组相比，经TSH处理后，动物的神经元树突直径明显减小。5％氧处理后原代培养海马神经元的树突总长度也明显低于正常对照组。这些结果表明，TSH的损伤诱导了树突毒性，影响了神经元树突的生长发育。缺氧引起的能量供应不足可能影响包括肌动蛋白和微管在内的细胞骨架动力学。肌动蛋白和MT是常规树突生长发育的关键，它们是许多控制神经元树突生长的分子途径的靶标。在大脑发育过程中，肌动蛋白和MT细胞骨架的结构都会发生变化，从而产生神经元突起。本发明还发现，TSH损伤降低了树突棘的密度和发育。这些神经元上超过95％的兴奋性突触发生在树突棘上，每个棘头通常连接构成一个突触。树突棘的形成和可塑性对大脑功能非常重要。树突棘的发育由氧传感器PHD2控制，以肌动蛋白交联剂Filamin-A为目标，调节突触密度和网络范围内的神经元活动。树突棘相关Rap特异性GDP酶激活蛋白(SPAR)是一种突触后蛋白，与突触后密度(PSD)-95形成复合物，其与N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDARs)，都参与调节树突棘的形态发生。

树突棘的结构和动态反映了突触的强度，在不同的脑部疾病中，包括神经退行性疾病和精神疾病，突触的强度通常受到严重影响。树突棘可以经历几种类型的转变，从生长到崩溃，从伸长到缩短，它们经历这种动态形态活动的时间跨度非常短。树突棘数目和形态的变化不仅发生在兴奋性中毒等病理条件下，也发生在正常的中枢神经系统发育、激素波动和生理环境下神经活动的反应过程中。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种广泛脑区神经元树突发育障碍的非人哺乳动物模型的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

其中，在所述低氧条件下，氧浓度体积比从10-20％降到1-5%，所述广泛脑区神经元树突发育障碍动物模型具有选自下组的多种特征：

突触电生理活性显著下降；

神经元树突和树突棘的棘形态、大小、数量、密度显著下降；

神经元的树突直径和长度显著下降；

神经元之间形成的突触的数量、分布、区域显著减少，所述广泛脑区神经元树突发育障碍包括广泛脑区神经元树突棘发育障碍。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物包括小鼠、大鼠、兔和/或猴。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为新生非人哺乳动物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为出生24个小时内的新生非人哺乳动物或为围出生期的新生非人哺乳动物。

6.一种权利要求1所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，将该模型用作研究广泛脑区神经元树突发育障碍的动物模型，所述广泛脑区神经元树突发育障碍包括广泛脑区神经元树突棘发育障碍。

7.一种权利要求1所述方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，用于筛选或鉴定可减轻或治疗广泛脑区神经元树突发育障碍的物质，所述广泛脑区神经元树突发育障碍包括广泛脑区神经元树突棘发育障碍。

8.一种筛选或鉴定治疗或缓解广泛脑区神经元树突发育障碍的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) 在测试组中，在测试化合物的存在下，将测试化合物施用于权利要求1所述方法制备的非人哺乳动物模型，检测测试组中所述动物模型的广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度Q1；并且在不施用所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组中所述动物模型广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度Q2；

(b) 将上一步骤所检测的严重程度Q1和严重程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗或缓解广泛脑区神经元树突发育障碍的潜在治疗剂；

其中，如果严重程度Q1显著低于严重程度Q2或如果施用了测试化合物的动物模型中的广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度降低时，则表示所述测试化合物为治疗或缓解广泛脑区神经元树突发育障碍的潜在治疗剂，所述广泛脑区神经元树突发育障碍包括广泛脑区神经元树突棘发育障碍。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的检测广泛脑区神经元树突发育障碍严重程度包括检测选自下组的多个指标的变化：突触电生理活性；各脑区神经元树突和树突棘的棘形态、大小、数量、分布、密度；神经元的树突直径、长度、数量；各脑区突触及其构成的结构的分布的发育状况。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的广泛脑区神经元树突发育障碍的严重程度降低表现为：突触电生理活性的下降程度降低；神经元树突棘的棘密度、大小、数量、密度的下降程度降低；神经元的树突直径、长度、数量的降低；和各脑区突触及其构成的结构的分布的发育程度降低。