Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN113249310B - 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用 - Google Patents

一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113249310B
CN113249310B CN202110550659.4A CN202110550659A CN113249310B CN 113249310 B CN113249310 B CN 113249310B CN 202110550659 A CN202110550659 A CN 202110550659A CN 113249310 B CN113249310 B CN 113249310B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
differentiation
pluripotent stem
myocardial
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110550659.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113249310A (zh
Inventor
张冬卉
李俐
蔡琳
万忠均
汪如香
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei University
Original Assignee
Hubei University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei University filed Critical Hubei University
Priority to CN202110550659.4A priority Critical patent/CN113249310B/zh
Publication of CN113249310A publication Critical patent/CN113249310A/zh
Priority to US18/546,266 priority patent/US20240228968A9/en
Priority to PCT/CN2022/090544 priority patent/WO2022242455A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113249310B publication Critical patent/CN113249310B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0657—Cardiomyocytes; Heart cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用，属于生物医学技术领域。本发明诱导分化所用试剂为化学成分明确的培养基，可获得纯度高、批次间分化效率稳定的心肌细胞。与现有多能干细胞分化的心肌细胞相比，本发明获得的心肌细胞早期增殖能力强，延长培养并构建成心肌微组织后成熟度高，排列结构更整齐，功能性收缩力增强，因此适用于心脏疾病机理研究、药物筛选和细胞治疗等多种应用，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
心脏疾病是全球发病率和死亡率最高的疾病。冠心病、高血压等会导致心肌细胞死亡，心肌出现重构并逐步恶化，最终出现心肌收缩舒张功能障碍，即心力衰竭。心衰病人无法被药物治愈，只能等待供体非常紧缺的心脏移植。近年来随着冠脉搭桥、心脏支架介入治疗等手段开展，以及药物及时干预会延长心梗和心脏慢性病患者生存时间，但心衰发生率却呈逐年上升趋势。心肌细胞自身增殖能力非常低，并且分离成体心肌细胞体外培养困难，给药物筛选和机制研究都造成阻碍。再生医学是心脏疾病研究领域一个非常有潜力的方向，干细胞是其中最重要的工具，利用多能干细胞分化成为心肌细胞，对于心肌细胞药物筛选、细胞治疗以及疾病模型的研究都有重要意义。
人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)是公认有再生医学转化潜力的种子细胞，通过体细胞重编程产生，具有向胚内多种细胞类型分化的能力，并且可以有效避开使用胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)分化存在的伦理争端和免疫排斥风险。通过调节Wnt信号可以诱导iPSCs分化为心肌细胞(Directedcardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulatingWnt/b-catenin signaling under fully defined conditions)，但是不同iPSCs定向分化效率和分化批次不稳定及成熟度不够等问题是制约其应用的重要因素。
2017年，Yang等首次建立了具有全能性特征的拓展多能干细胞系(ExtendedPluripotent Stem Cells，EPSC)，此细胞系的多能性高于iPSCs，同时具有胚内和胚外组织发育潜能，表现出优秀的异种嵌合能力，并且具备单细胞传代和高增殖率扩增的优势(YangYang等.Cell.2017 6；169(2):243-257)。但此时EPS由ESC转化而来，并且培养时需要滋养层细胞，相对制约其转化应用。2020年Ran等使用小分子化合物诱导条件代替饲养层细胞成功将人ESCs和iPSCs转化为EPSCs，建立了成分明确、简单快速的EPS构建体系，进一步为EPS的转化应用奠定良好基础(Ran Zheng等.bioRxiv.18 Oct 2020)。理论上EPS应该会比iPSCs具有更高的潜能性，但EPS是否可以作为心肌细胞的种子细胞，能否采用成分明确的诱导条件稳定形成高效率分化的心肌细胞，应用于心脏药物开发和心肌再生研究领域是未知的，需要进一步探索。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用。本发明通过小分子分阶段调控WNT信号通路，从而诱导EPS细胞分化为心肌细胞，因此具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供拓展的多潜能干细胞(EPSC)在制备心肌细胞中的应用。
具体的，所述应用包括：将上述拓展的多潜能干细胞诱导分化为心肌细胞。
更具体的，所述诱导分化方法包括：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞。
本发明的第二个方面，提供一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，所述方法包括：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞。
具体的，所述方法包括：采用化学成分明确的培养基条件进行诱导分化，优选的，所述化学成分明确的培养基条件为使用成分明确的血清替代物和生长因子替代血清。
优选的，在小分子分阶段调控前，所述方法还包括将EPSC经mTeSRTM1和/或KnockOutTMDMEM/F-12+B27+FGF2+TGFβ快速过渡转化；进一步优选的，B27细胞培养添加剂中含有胰岛素；培养时间控制为1-4天；
进一步优选的，当拓展性多能干细胞汇合度达到50％以上时即可起始诱导分化形成心肌细胞，优选大于85％，更优选为95％以上。
优选的，所述小分子分阶段调控，具体包括：先添加化学小分子CHIR99021，进行培养；再添加WNT信号通路抑制化学小分子IWR和IWP2，进行培养。
其中，所述CHIR99021的使用浓度控制为5-10μM，优选为7.5μM；使用IWR的浓度范围为2.5-7.5μM，优选为5μM；使用IWP2的浓度范围1-5μM，优选为2.5μM。通过控制加入的化学小分子浓度和时间，从而获得高效分化的心肌细胞。
在小分子分阶段调控时期，使用的细胞培养基包括1640+B27，优选的B27细胞培养添加剂中不含有胰岛素。
优选的，小分子分阶段调控时期培养时间控制为3-7天，优选为4-5天。
本发明的第三个方面，提供上述培养方法获得的心肌细胞。所述心肌细胞为EPSC源心肌细胞，采用上述培养方法获得的心肌细胞，其数量多，且早期繁殖能力强。
本发明的第四个方面，提供上述培养方法和/或上述心肌细胞在如下任意一种或多种中的应用：
a)制备心肌细胞产品用于相关基础研究；
b)药物筛选及心脏相关疾病诊断；
c)心脏相关疾病治疗。
其中，
所述应用a)中，所述相关基础研究包括对心肌细胞结构功能、特性、信号通路以及电生理检测及研究；
所述应用b)中，包括药物安全评价和新药分子研发；
所述应用c)中，所述心脏相关疾病包括心梗；所述治疗方法包括细胞治疗。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
1、上述技术方案通过对EPSC分化不同天数过程中心肌细胞标志物cTNT的检测，首次将EPSC成功分化为高纯度的心肌细胞。
2、上述技术方案通过对EPSC分化的心肌与hiPSC分化的心肌细胞对比，EPSC分化心肌表现为相同底面积下，分化所得心肌细胞数量更多，一般计数大于10Million/9.6cm2。重铺细胞后，EPSC分化心肌早期增殖能力相对较高。
3、随着培养时间延长及构建成心肌微组织后，EPSC分化心肌组织表现更加成熟，排列结构整齐，细胞连接有分布到两端，功能性收缩力增大。
综上，上述技术方案将为干细胞作为产生心肌细胞的种子细胞提供更多选择，促进干细胞向心肌细胞分化在心脏疾病相关领域的应用，在心脏疾病诊断、药物筛选和细胞治疗方面具有广泛的前景，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明分化流程方案及培养不同天数时细胞光镜图。
图2是本发明实施例3中分化不同阶段流式结果和不同阶段的免疫荧光图；其中，A为第5天免疫荧光染色证实分化为中胚层细胞；B为第12天免疫荧光证实此阶段细胞为心肌前体细胞；C为第16-18天，免疫荧光确定分化细胞绝大部分为心肌细胞；D为流式细胞术检测中胚层细胞占比；E为流式细胞术检测心肌前体细胞占比；F为流式细胞术检测心肌细胞标志物cTNT+细胞占比。
图3是本发明实施例3中cTNT阳性率相关结果，表明cTNT阳性率均在80％以上；其中，A为不同批次cTNT阳性分化效率图；B为多批次cTNT阳性分化效率柱状统计图。
图4是本发明实施例4中不同细胞汇合度起始分化后，相同CHIR 7.5的浓度作用下，第16天心肌跳动区域的百分比结果统计及拟合图。
图5是本发明实施例5中EPSC-CM与hiPSC-CM在重铺后，EPS-CM不同阶段的细胞增殖能力更高；其中，A为实际细胞染色图；B为柱状统计图。
图6为本发明实施例6中心肌微组织培养后对心肌细胞标志物α-actinin、cTNI，以及心肌成熟标志物N-Cadherin和RYR2等进行荧光染色结果图。
图7为本发明实施例6中EPSC分化心肌功能性收缩力与hiPSC-CM比较图；其中，A为最大收缩幅度比较图；B为每次收缩间隔时长比较图。
图8为本发明实施例7中EPSC-CM移植到裸大鼠心肌4周后细胞驻留存活情况；其中，A为心脏H&E染色结果及放大图，B为免疫荧光显示驻留的人源心肌细胞肌节完整。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，理论上EPS应该会比iPSCs具有更高的潜能性，但EPS是否可以作为心肌细胞的种子细胞，能否采用成分明确的诱导条件稳定形成高效率分化的心肌细胞，应用于心脏药物开发和心肌再生研究领域是未知的，需要进一步探索。
有鉴于此，本发明采用分化效率高的化学成分明确的方法，即通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞。
本发明研究发现，若直接将原有hiPSC分化心肌的方案应用于EPS细胞分化，即采用1640+B27混合WNT信号通路调控小分子的分化流程，使用不同细胞汇合度起始分化均无法获得心肌细胞；并且在此方案基础上增加ACTIVIN A，BMP4等起始分化，也无法获得高效分化的心肌细胞。
为此，本发明在心肌细胞分化流程上的改进有：(1)EPSC的多能性经mTeSRTM1快速过渡转化1-4天，细胞汇合度达到85％以上后，再换1640+B27基础培养基和WNT信号通路调节小分子；(2)分化过程中抑制Wnt信号时同时使用IWR和IWP2两种小分子。(3)进一步的，鉴于mTeSRTM1中成分高达近100种,我们采用KnockOutTMDMEM/F-12+B27(+Insulin)+FGF2(100ng/ml)+TGFβ(2ug/ml)也能达到快速转化和进一步分化的效果。
本发明的一个具体实施方式中，提供一种心肌细胞获取的方法，所述方法按下述流程进行：
1)将EPS细胞培养在EPS专用培养基中，经TriplE消化后以4-5*104/cm2比例进行传代并采用前述过渡培养基培养1-4天。
2)细胞长至95％开始分化，细胞培养基换成1640+B27(-Insulin)，添加7.5μM的GSK3β抑制剂化学小分子CHIR99021，维持培养2天。
3)撤掉CHIR培养1天。
4)添加WNT信号通路抑制化学小分子5μM IWR和2.5μM IWP2，培养2天。
5)撤掉培养基中的IWR和IWP2。
6)在心肌细胞分化第10-12天显微镜下可见跳动的心肌细胞。
7)第16天对分化的心肌进行消化和重铺或构建微组织，流式细胞术检测分化细胞cTNT阳性百分比。8)检测心肌细胞增殖。在重铺后的第3天，7天对细胞Edu标记24h，24h后免疫荧光染色α-actinin定位至心肌细胞，统计心肌细胞增殖百分比。
9)通过免疫荧光染色和收缩功能检测确定心肌组织成熟度。组织培养至14天后，免疫荧光染色α-actinin、CTNI、N-Cadherin、DAPI，观察两种心肌微组织的排列和结构。同时，用1.5HZ电刺激，录制微组织收缩视频，用Image J插件分析两组收缩力大小。
本发明方法获得的EPSC源心肌细胞，可应用于：(1)进行心肌细胞结构功能、特性、信号通路以及电生理检测；(2)应用于药物安全评价和新药分子研发；(3)高效获得分化成熟的心肌细胞，可通过细胞注射或者结合组织工程，应用于心梗等相关心脏疾病治疗。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。
实施例1
EPSC细胞培养和传代
EPSC细胞培养基：包含1:1混合的KnockOutTMDMEM/F-12和NeurobasalTMMedium,含有1％B27(-Vitamin A),0.5％N2，5％血清替代物,1％谷氨酸盐,1％非必需氨基酸,1％双抗,0.1mMβ-巯基乙醇，10ng/mL recombinant human LIF,1μM CHIR99021,2μM(S)-(+)-Dimethindene maleate,2μM Minocycline hydrochloride,1μM IWR-endo-1,2μM Y-27632。
采用EPSC细胞培养基和3倍Matrigel包被培养板对EPS细胞进行培养，并以单细胞传代的方式、使用TriplE消化液每3天传一次代，每次消化时间3-4分钟，根据细胞转化过程中的生长和增殖状态，以1：2至1：8传代，每次传代时将细胞尽量吹散至单细胞状态。连续培养10-15代后，即可见具有EPSC克隆的形态，表现为：克隆立体，紧密，明亮、有光泽，呈隆起圆球状，核质比高，经Q-PCR检测部分多能性基因表达显著提升。
实施例2
EPSC细胞向心肌细胞分化
第0天，EPSC经TriplE消化后，提供密度为4-5*104/cm2的细胞，用EPSC培养基重悬，做分化使用时，无需吹成单细胞状态。培养板或皿使用1倍Matrigel包被即可，即每1μlMatrigel用100μl预冷的DMEM/F-12培养基稀释混匀。
第1天，更换为mTeSRTM1培养基，或KnockOutTMDMEM/F-12培养基，含1％B27(+Insulin)，100ng/ml FGF2和2ug/ml TGFβ。细胞体积开始增大，克隆朝四周伸展，每天换液，待细胞汇合度长至95％以上，克隆间有明显的边界线。过渡培养时间约2天。
第3天，培养基换为1640+B27(-Insulin)，添加GSK3β抑制剂化学小分子CHIR99021诱导，浓度7.5μM，维持2天。
第4天，撤掉CHIR99021，换成1640+B27(-Insulin)。
第5-6天，添加WNT信号通路抑制化学小分子5μM IWR和2.5μM IWP2。
第7天撤掉化学小分子，换1640+B27(-Insulin)，之后每两天更换一次培养基。
第10-12天，显微镜下可见大面积跳动的心肌细胞。EPS的具体分化流程图以及分化不同时间的细胞光镜结果见附图1。
实施例3
流式细胞术和免疫荧光技术检测EPS分化为心肌细胞的过程中心肌前体及心肌细胞阳性比例。
按上述方法，在EPS细胞分化的第5天，采用brachyury免疫荧光染色证实EPS细胞分化为中胚层细胞(附图2A)。在EPS分化的第12天，采用心肌前体细胞标志物Isl1和NKX2.5进行免疫荧光染色，证实此阶段细胞为心肌前体细胞(附图2B)。在EPS分化第16天，采用心肌细胞标志物α-actinin和成纤维细胞标志物Vimentin共染确定分化细胞绝大部分为心肌细胞(附图2C)；进一步通过消化分化第5天细胞后，流式细胞术检测中胚层标志物Brachyury，发现此细胞群体Brachyury阳性率为98.8％；(附图2D)消化分化第12天细胞后，流式细胞术检测心肌及前体细胞标志物，发现此细胞群体Isl1阳性率为93.5％，NKX2.5阳性率为90％(附图2E)；消化第16天细胞,心肌细胞标志物cTNT+细胞占比高达96.6％(附图2F)。通过对8批次EPS分化为心肌细胞的cTNT阳性率统计，我们发现EPS的心肌分化效率每次都在80％以上，平均分化效率为88％(附图3)，此结果表明本分化体系分化效率高且稳定。
实施例4
将EPSC及hiPSC细胞消化后,按照1*104/cm2、2*104/cm2、4*104/cm2、6*104/cm2、8*104/cm2不同密度将细胞接种到24孔板，每组3个平行，EPSC用EPS培养基重悬1天后，用mTeSRTM1培养基转化培养2天。hiPSC直接使用mTeSRTM1重悬和培养至第3天。拍照统计EPSC以及hiPSC每孔细胞覆盖面积占总孔面积比，记为起始分化汇合度。紧接着，CHIR99021诱导起始分化，浓度7.5μM。第16天，录制视频统计两组干细胞分化心肌跳动区域所占整孔面积百分比。统计结果显示，hiPSC起始汇合度70-85％时，心肌分化效率最高，跳动区域可达到100％，当分化密度不在最适密度下，分化效率显著下降。而EPSC起始分化汇合度达80％以上时，心肌跳动区域均可达到100％，显示出EPSC具有更宽的分化潜力且分化效果较好。
实施例5
EPSC分化心肌细胞与原始诱导性多能干细胞hiPSC系分化心肌细胞功能的比较。
待EPSC诱导心肌分化至16天后，使用胶原酶Ⅰ和Tripsin-EDTA消化成单细胞，重铺至coverslip或confocal皿上，使用1640+B27与无糖DMEM+4μM Lactate成1:1的重铺后培养基，在第3天，7天对细胞使用Brdu标记24h，在重铺后的第4天，8天固定细胞后，免疫荧光染色α-actinin进行心肌细胞定位，并统计心肌细胞增殖百分比。结果显示，在心肌细胞重铺后3-4天和7-8天时间点，EPS-CM的增值率都显著高于hiPSC-CM(附图5)。并且对相同孔板面积分化的心肌细胞进行消化后，EPSC分化心肌数量平均为1-1.2*106/cm2，而hiPSC分化心肌数量平均仅为0.3-0.5*106/cm2。
实施例6
因重铺的单层细胞有个体差异，功能检测的均一性远不如组织稳定。为了测试EPSC与hiPSC分化心肌在功能上的区别，两组在加1640培养基分化14天后，消化成单细胞，随后构建成本实验室自制的条形心肌微组织，每个组织条用0.4*106个细胞，混以Matrigel，thrombin，Fibrinogen，一般在组织构建第3-5天，肉眼可见跳动的心肌微组织。组织培养至14天后，通过心肌细胞标志物α-actinin、cTNI，以及心肌成熟标志物N-Cadherin和RYR2免疫荧光染色，发现EPS分化的心肌细胞排列结构整齐，N-Cadherin细胞连接分布到两端,RYR2染色结构清晰(附图6)。同时，录制微组织收缩视频，用Image J插件Myociter v1.3分析两组收缩力大小。结果显示，EPSC分化心肌功能性收缩力明显高于hiPSC分化心肌(附图7)，具体表现为最大收缩幅度显著高于hiPSC-CM(附图7A)，而收缩频率更高(附图7B)；在促收缩剂ISO刺激下差异更明显。综合以上结果，我们认为EPSC分化心肌细胞的成熟度比hiPSC-CM更高。
实施例7
8周龄裸大鼠麻醉后开胸，向左室前壁区心肌肌肉层多点注射EPS-CM，逐层关胸待大鼠苏醒。大鼠饲养四周后取心脏病理检测，H&E染色可见心肌组织中大量EPSC-CM驻留和存活(附图8A)，进一步免疫荧光染色证实驻留细胞为人源心肌细胞且肌节结构完整(附图8B)。以上结果表明将EPS-CM进行细胞移植能够在心肌中有效存活，可应用于心肌疾病的细胞治疗。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (11)

1.拓展的多潜能干细胞在制备心肌细胞中的应用，其特征在于，所述应用：将拓展的多潜能干细胞诱导分化为心肌细胞；
所述诱导分化：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞；
所述小分子分阶段调控，具体包括：先添加化学小分子CHIR99021，进行培养；再添加WNT信号通路抑制化学小分子IWR和IWP2，进行培养。
2.一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法，其特征在于，所述方法：通过小分子分阶段调控WNT信号通路，诱导EPS细胞分化为心肌细胞；
所述小分子分阶段调控，具体包括：先添加化学小分子CHIR99021，进行培养；再添加WNT信号通路抑制化学小分子IWR和IWP2，进行培养。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在小分子分阶段调控前，所述方法还包括将EPSC经mTeSRTM1和/或KnockOutTMDMEM/F-12+B27+FGF2+TGFβ快速过渡转化。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，B27细胞培养添加剂中含有胰岛素；培养时间控制为1-4天。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，当拓展性多能干细胞汇合度达到50％以上时即可起始诱导分化形成心肌细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，当拓展性多能干细胞汇合度达到85％以上时即可起始诱导分化形成心肌细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当拓展性多能干细胞汇合度达到95％以上时即可起始诱导分化形成心肌细胞。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CHIR99021的使用浓度控制为5-10μM；使用IWR的浓度范围为2.5-7.5μM；使用IWP2的浓度范围1-5μM；
在小分子分阶段调控时期，使用的细胞培养基包括1640+B27。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述CHIR99021的使用浓度控制为7.5μM；使用IWR的浓度为5μM；使用IWP2的浓度为2.5μM；
在小分子分阶段调控时期，B27细胞培养添加剂中不含有胰岛素。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，小分子分阶段调控时期培养时间控制为3-7天。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，小分子分阶段调控时期培养时间控制为4-5天。
CN202110550659.4A 2021-05-17 2021-05-17 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用 Active CN113249310B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110550659.4A CN113249310B (zh) 2021-05-17 2021-05-17 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
US18/546,266 US20240228968A9 (en) 2021-05-17 2022-04-29 Method for induced differentiation of extended pluripotent stem cell into cardiomyocyte and use thereof
PCT/CN2022/090544 WO2022242455A1 (zh) 2021-05-17 2022-04-29 一种扩展多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110550659.4A CN113249310B (zh) 2021-05-17 2021-05-17 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113249310A CN113249310A (zh) 2021-08-13
CN113249310B true CN113249310B (zh) 2022-10-11

Family

ID=77182947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110550659.4A Active CN113249310B (zh) 2021-05-17 2021-05-17 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20240228968A9 (zh)
CN (1) CN113249310B (zh)
WO (1) WO2022242455A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2976283C (en) 2015-02-17 2022-04-26 University Health Network Methods for making and using sinoatrial node-like pacemaker cardiomyocytes and ventricular-like cardiomyocytes
CN113249310B (zh) * 2021-05-17 2022-10-11 湖北大学 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
CN116942798A (zh) * 2023-08-01 2023-10-27 湖北大学 重组人il-37蛋白在提高人心肌组织功能中的应用
CN117132577B (zh) * 2023-09-07 2024-02-23 湖北大学 非侵入式检测心肌组织张力和振动的方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293730A (zh) * 2014-09-23 2015-01-21 云南中科灵长类生物医学重点实验室 多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法
CN106244527A (zh) * 2016-08-29 2016-12-21 广东依浦赛生物科技有限公司 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法
CN106244526A (zh) * 2016-08-23 2016-12-21 北京赛贝生物技术有限公司 心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法
CN106661553A (zh) * 2014-05-06 2017-05-10 豪夫迈·罗氏有限公司 用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法
CN106987555A (zh) * 2016-01-20 2017-07-28 中国科学院上海生命科学研究院 高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合物
CN108060125A (zh) * 2018-02-07 2018-05-22 苏州大学 促进多能干细胞分化为心肌细胞成熟的方法
CN108359636A (zh) * 2018-02-07 2018-08-03 苏州大学 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法
CN110564677A (zh) * 2019-08-09 2019-12-13 杭州标模生物科技有限公司 诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用
CN111187750A (zh) * 2020-01-17 2020-05-22 复旦大学附属中山医院 生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法与应用
CN111718895A (zh) * 2020-07-01 2020-09-29 湖北大学 一种人工心肌组织纤维化模型、制备方法、制备装置及其应用
CN111868078A (zh) * 2018-03-16 2020-10-30 斯坦福大学托管董事会 使用wnt激动剂和生物活性脂质用于生成和扩增心肌细胞的试剂和方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8951798B2 (en) * 2011-10-13 2015-02-10 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
DK3047019T3 (da) * 2013-09-20 2019-08-26 Georg August Univ Goettingen Stiftung Oeffentlichen Rechts Univsmedizin Fremgangsmåde til at lede differentiering af pluripotente stamceller til funktionel hjertemuskel
JP6780870B2 (ja) * 2015-08-13 2020-11-04 北昊干細胞与再生医学研究院有限公司Ｂｅｉｈａｏ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 誘導された拡張された多能性幹細胞、作製方法および使用方法
CN113249310B (zh) * 2021-05-17 2022-10-11 湖北大学 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106661553A (zh) * 2014-05-06 2017-05-10 豪夫迈·罗氏有限公司 用于使多能干细胞分化为心肌细胞的方法
CN104293730A (zh) * 2014-09-23 2015-01-21 云南中科灵长类生物医学重点实验室 多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法
CN106987555A (zh) * 2016-01-20 2017-07-28 中国科学院上海生命科学研究院 高效诱导人多能干细胞向心肌细胞分化的小分子化合物组合物
CN106244526A (zh) * 2016-08-23 2016-12-21 北京赛贝生物技术有限公司 心肌分化试剂盒及心肌细胞的培养方法
CN106244527A (zh) * 2016-08-29 2016-12-21 广东依浦赛生物科技有限公司 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法
CN108060125A (zh) * 2018-02-07 2018-05-22 苏州大学 促进多能干细胞分化为心肌细胞成熟的方法
CN108359636A (zh) * 2018-02-07 2018-08-03 苏州大学 一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法
CN111868078A (zh) * 2018-03-16 2020-10-30 斯坦福大学托管董事会 使用wnt激动剂和生物活性脂质用于生成和扩增心肌细胞的试剂和方法
CN110564677A (zh) * 2019-08-09 2019-12-13 杭州标模生物科技有限公司 诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用
CN111187750A (zh) * 2020-01-17 2020-05-22 复旦大学附属中山医院 生物胺诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的方法与应用
CN111718895A (zh) * 2020-07-01 2020-09-29 湖北大学 一种人工心肌组织纤维化模型、制备方法、制备装置及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Aconitine-induced cardiac arrhythmia in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes;FENG ZHANG等;《EXPERIMENTAL AND THERAPEUTIC MEDICINE》;20180822;第16卷;3497-3503 *
Establishment of bovine expanded potential stem cells;Lixia Zhao等;《PNAS》;20210408;第118卷(第15期);e2018505118 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022242455A1 (zh) 2022-11-24
US20240228968A9 (en) 2024-07-11
CN113249310A (zh) 2021-08-13
US20240132848A1 (en) 2024-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113249310B (zh) 一种拓展性多能干细胞诱导分化为心肌细胞的方法及应用
CA2718032C (en) Method for generating primate cardiovascular progenitor cells for clinical use from primate embryonic stem cells or embryonic-like state cells, and their applications
EP1649012B1 (en) Method for the isolation and expansion of cardiac stem cells from biopsy
JP5312804B2 (ja) 幹細胞及び胎児由来の心筋細胞及び予定心筋細胞の精製方法
JP6832049B2 (ja) 心臓神経堤細胞、及びその使用方法
US20050214939A1 (en) Direct differentiation method for making cardiomyocytes from human emberyonic stem cells
WO2022110654A1 (en) Generation of neural progenitor cells from embryonic stem cells or induced pluripotent stem cells
Fukuda Progress in myocardial regeneration and cell transplantation
CN113337458A (zh) 一种提高多能干细胞定向诱导心肌细胞产量及纯度的方法
US9969978B2 (en) Method for producing cardiomyocytes from human or mouse embryonic stem cells in a medium consisting of a serum-free medium and N2 supplement
CN116769695A (zh) 从畸胎瘤、类器官和拟胚体中产生人细胞和组织的培养基和方法
US20120308530A1 (en) Materials Composition and Methods to Control Neural Progenitor and Stem Cell Attachment, Proliferation and Guide Cell Differentiation
IL178006A (en) Method for making high purity cardiomyocyte preparations suitable for regenerative medicine
CN110564673A (zh) 一种干细胞培养液及其应用
WO2024174996A1 (zh) 一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元的试剂盒及其应用
US20050281791A1 (en) Method for inducing cardiac myocytes in embryonic stem (ES) cells by induction with precardiac endoderm and mesoderm
Aghami et al. ESC cardiac differentiation and applications
CN114958718A (zh) 一种诱导高foxa2表达的细胞的方法
Fu et al. Tumorigenesis of nuclear transfer-derived embryonic stem cells is reduced through differentiation and enrichment following transplantation in the infarcted rat heart
Guddati Derivation of cardiomyocytes from embryonic stem cells and development of techniques to study cardiac lineage
EP2450432A1 (en) Materials composition and methods to control neural progenitor and stem cell attachment, proliferation and guide cell differentiation
Gepstein Embryonic Stem Cells for Myocardial Repair
Fatima et al. In Vitro Differentiation and Expansion of Vascular Endothelial Cells Derived from Mouse Embryonic Stem Cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant