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CN113249319B - 一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法 - Google Patents

一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基含有：DMEM/F12培养液，1×Glutamax，HEPES缓冲液，抗生素antibiotics，生长因子等；所述分化培养基为含有DMEM/F12，Neurobasal，B27supplement，2‑mercaptoethanol，insulin，Glutamax和MEM‑NEAA。本发明的培养方法是基于物理重力力学膜过滤法对待收集样本进行捕获，最大程度的保证了截留细胞的无损，且未进行任何标记，实现截留细胞的抗原表位的完整性和细胞的活性；该方法基于基质胶支架进行3D培养，能够更好的维持脑脊液三维的生长环境。

Description

一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种脑脊液类器官的培养基及其培养方法。
背景技术
软脑膜转移(leptomeningeal metastasis,LM)是晚期非小细胞肺癌的并发症之一。软脑膜转移的诊断和检测具有挑战性，LM反应的三个基本要素：标准化的神经学检查、脑脊液细胞学或流失细胞术以及放射学评估检查。一项神经肿瘤学反应评估工作组共识建议：所有等级参加临床试验的患者接受脑脊液分析(所有癌症的细胞学检查，血液病的流式细胞术分析)、完全增强的神经轴MRI，以及在计划的脑脊液内治疗的情况下，进行放射性同位素脑脊液血流研究。但是，目前还没有治疗软脑膜转移(LM)的标准指南。但在软脑膜转移治疗的几个关键方面已经取得了实质性的进展，包括改善了基因图谱的特征，建立了临床相关的动物模型，改进了细胞学和基因分型分析的脑脊液液体活检，以及开发了更具中枢神经系统渗透性的治疗药物。
但是从脑瘤患者身上获取组织标本的挑战限制了诊断和分子特征，并阻碍了更好的治疗方法的发展。液体活检收集和分析体液中的肿瘤成分，在原发性和继发性脑肿瘤的治疗中，液体活检将作为肿瘤组织替代物的研究越来越受到人们的关注。中枢神经系统CNS恶性肿瘤研究相关的主要体液包括血液和脑脊液。虽然血液采集可能更直接，但脑脊液提供了许多优势。此外，CNS肿瘤来源的CTCs(脊液循环肿瘤细胞)在外周血中的数量较脑脊液中的数量低得多。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种培养基及其培养方法，是基于基质胶支架进行3D培养，能够更好的维持脑脊液三维的生长环境。
本发明的目的是提供一种脑脊液类器官的培养基。
本发明的另一目的是提供脑脊循环肿瘤细胞的培养方法。
根据本发明的具体实施方式脑脊液类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基含有：DMEM/F12培养液，1×Glutamax， HEPES缓冲液，抗生素antibiotics，生长因子B27 supplement，生长因子EGF，生长因子FGF-10，生长因子IGF1，抗生素primocin，抑制剂SB431542，MEM-NEAA 和Heparin50；
所述分化培养基为含有DMEM/F12，Neurobasal，B27 supplement， 2-mercaptoethanol，insulin，Glutamax和MEM-NEAA。
根据本发明的具体实施方式的培养基，进一步的，所述抗生素antibiotics 包括青霉素和链霉素。
根据本发明的具体实施方式的培养基，进一步的，所述基础培养基为： DMEM/F12培养液中添加1％1×Glutamax，10mM HEPES缓冲液，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5％生长因子B27 supplement，1％生长因子N2 supplement，50ng/ml生长因子EGF，100ng/ml生长因子FGF-10，1μg/ml 生长因子IGF1，0.2％的抗生素primocin，10uM抑制剂SB431542，1％MEM-NEAA 和1ug/ml Heparin50；
所述分化培养基为：由50％DMEM/F12培养液和50％Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5％生长因子N2 supplement，1％生长因子B27supplement，3.5ul/L 2-mercaptoethanol，0.025％insulin， 1％1×Glutamax，0.5％MEM-NEAA和10μM Y-27632。
根据本发明的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；
(3)截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤(2)洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；
(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；
(5)将所述的分化培养基重悬备用；将温和细胞解离试剂和含有15mM HEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿置进行预热；
先向每个预热后的低黏附培养皿中加入重悬后的所述分化培养基；再将解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，混合均匀，于培养箱中进行培养。
进一步的，所述培养方法包括以下步骤：
(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；
(3)截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤(2)洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；
(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将200ul所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；
(5)将所述的分化培养基重悬备用；将10mL温和细胞解离试剂和10mL 含有15mMHEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿置进行预热；
先向每个预热后的低黏附培养皿中加入10mL重悬后的所述分化培养基；再将200ul解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，轻轻8字混匀，于37℃， 5％CO2培养箱中进行培养。
本发明的温和细胞解离试剂是兼具蛋白水解酶和胶原酶活性的温和细胞解离试剂，即DMEM高糖，含Collagenase(300U/ml)/Hyaluronidase(100U/ml)。
根据本发明的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(1)中，将细胞捕获滤膜置于1-2mL 75％的乙醇溶液中进行浸洗，重复3 次以上，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润。
优选的，所述细胞捕获滤膜的孔径为8μm。
根据本发明的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(2)中，采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜5次以上，保证残余乙醇彻底去除。
根据本发明的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(3)中，将脑脊液沿模具内壁缓慢加入到PBS中以质量比为1：1的比例进行稀释，采用洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行捕获。本发明采用PBS稀释待过滤样本，防止被过滤样本拥挤造成堵膜，过滤后将截留滤膜进行培养。
根据本发明的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(4)中，所述细胞捕获滤膜置于所述的基础培养基中进行培养时，每3-5 天换一次培养基，培养时间为11-15天。
根据本发明的具体实施方式的脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，进一步的，步骤(5)中，所述预热具体为：将所述低黏附培养皿置于37℃孵箱预热30分钟。
DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。此外，为了增强该培养基的缓冲能力，在DMEM/F12(1：1)中加入15mMHEPES 缓冲液(HEPES是一种Good’s缓冲试剂，中文全称为N-2-羟乙基哌嗪-N'-2- 乙磺酸。它的PH缓冲范围在6.8到8.2区间之内，对细胞没有任何毒性)。
Glutamax添加剂是一种L-谷氨酰胺的替代品，具有更好的稳定性，可改善细胞健康。GlutaMAX添加剂适合于哺乳动物细胞的贴壁和悬浮培养，而且无需适应。
HEPES是一种Good’s缓冲试剂，中文全称为N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸。它的PH缓冲范围在6.8到8.2区间之内。
GlutaMAX添加剂以200mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽形式供货，溶剂为 0.85％NaCl。GlutaMAX添加剂也包括在各种培养基配方中。与L-谷氨酰胺相比，GlutaMAX添加剂可显著减少有毒氨的积累、改善细胞活力和生长情况、在很宽的温度范围内保持稳定、可显著减少有毒氨的积累。
生长因子N2 supplement insulin和Glutamax(L-谷氨酰胺的替代品)采购自Invitrogen；生长因子B27 supplement中无vitamin A，生长因子B27 supplement采购自Gibco；insulin为牛胰岛素，采购自Sigma；生长因子 EGF、生长因子FGF-10和IGF1均采购自Peprotech。其余原料均采购自 Peprotech公司。
Insulin是由胰岛β细胞分泌的一种多肽激素。胰岛素在许多细胞活动中发挥重要作用，如促进糖和氨基酸转运，提高合成代谢降低分解代谢，刺激细胞生长等。
生长因子B27是在神经元细胞培养中所用的添加物，能够维持神经元细胞长期体外培养，因为神经元培养过程中不能使用血清所以用其代替，是专用于培养神经细胞的血清替代物。
表皮生长因子(EGF)是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽。EGF与靶细胞上的EGF受体特异性识别结合后，发生一系列生化反应，最终可促进靶细胞的DNA合成及有丝分裂。
成纤维细胞生长因子-10(FGF-10，也称为KGF-2)是一种肝素结合生长因子，其刺激表达FGF受体的细胞的增殖和活化。FGF-10主要与FGF-7/KGF 相关，在发育过程中表达，并优先在成人肺中表达。
本发明的基础培养基中添加了B27、EGF、FGF细胞生长因子；SB431542 (TGF-β/Smad抑制剂)，用于维持干细胞的自我更新和胚状体的形成，还能够维持多潜能干细胞活性。
抑制剂SB-431542(10μM)是内源性激活素和TGF-β信号传导的选择性抑制剂，但对NIH 3T3细胞中的BMP信号传导没有影响。TRKI，SB-431542，抑制TGF-β诱导的转录，基因表达，细胞凋亡和生长抑制。SB-431542减弱 TGF-β的肿瘤促进作用，包括TGF-β诱导的EMT，细胞运动，迁移和侵袭以及人癌细胞系中血管内皮生长因子的分泌。SB-431542诱导不受TGF-β生长抑制的细胞不依赖锚定的生长，而它可以减少由TGF-β促进生长的细胞的集落形成。SB-431542(0.3μM)抑制MG63细胞中TGF-β诱导的细胞增殖。
MEM-NEAA氨基酸组分如下表1所示：
表1 MEM-NEAA氨基酸组分
Figure BDA0003072852530000061
Figure BDA0003072852530000071
Primocin可以保护原代细胞免受微生物污染的抗生素,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用。
Y-27632是一种选择性的ROCK1(p160ROCK)抑制剂，Ki为140nM，比对其他激酶包括PKC，cAMP依赖性蛋白激酶，MLCK和PAK的作用强200多倍。Y-27632 处理，阻断Rho调节的肌动球蛋白的激活，也阻断LPA刺激的MM1细胞入侵活性，这种作用存在浓度依赖性。10μM Y-27632处理在无血清悬浮(SFEB) 培养基中的人类胚胎干细胞(hES)，显著减少分离诱导的凋亡，提高克隆效率(从1％提高到27％),转基因后促进亚克隆,且使SFEB培养的hES细胞存活及分化成Bf1+皮质和基底端脑祖细胞。
发明人对可用于诊断和监测软脑膜和脑实质转移的脊液循环肿瘤细胞 (CTCs)进行分子生物学鉴定及体外类器官培养诱导，在此基础上利用该模型预测治疗脑膜转移药物的有效性。数据研究表明，这种体外屏障液CSF-CTCs主要表现为CK18/19阳性，且多以CTCscluster形式存在；同时CSF-CTCs诱导类器官模型可以用于评估化合物通过CNS的通透性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)该方法基于物理重力力学膜过滤法对待收集样本进行捕获，最大程度的保证了截留细胞的无损，且未进行任何标记，实现截留细胞的抗原表位的完整性和细胞的活性；
(2)该方法基于基质胶支架进行3D培养，能够更好的维持脑脊液三维的生长环境。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为根据本发明的具体实施例3的细胞第2天、第6天、第10天、第 15天的培养状态对比图。
图2显示根据本发明的试验例的免疫荧光联合荧光原位杂交检测鉴定结果，其中，DAPI是核染色，CEP8是8号染色体探针FISH，CD45白细胞染色， CK18/19肿瘤细胞角蛋白染色。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
在一些较为具体的实施方案中，一种脑脊循环肿瘤细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基含有：DMEM/F12培养液， 1×Glutamax，HEPES缓冲液，抗生素antibiotics，生长因子B27 supplement，生长因子N2 supplement，生长因子EGF，生长因子FGF-10，生长因子IGF1，抗生素primocin，抑制剂SB431542，MEM-NEAA和Heparin50；
所述分化培养基为含有DMEM/F12，Neurobasal，B27 supplement， 2-mercaptoethanol，insulin，Glutamax和MEM-NEAA。
进一步的，所述抗生素antibiotics包括青霉素和链霉素。
脑脊循环肿瘤细胞的培养方法包括以下步骤：
(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；
(3)截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤(2)洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；
(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；
(5)将所述的分化培养基重悬备用；将温和细胞解离试剂和含有15mM HEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿置进行预热；
先向每个预热后的低黏附培养皿中加入重悬后的所述分化培养基；再将解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，混合均匀，于培养箱中进行培养。
在一些更为具体的实施案例之中，具体如下：
实施例1
本实施例提供了一种脑脊循环肿瘤细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基为：DMEM/F12培养液中添加1％1× Glutamax，10mM HEPES缓冲液，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5％生长因子B27 supplement，1％生长因子N2supplement，50ng/ml生长因子EGF， 100ng/ml生长因子FGF-10，1μg/ml生长因子IGF1，0.2％的抗生素primocin， 10uM抑制剂SB431542，1％MEM-NEAA和1ug/ml Heparin50；
所述分化培养基为：由50％DMEM/F12培养液和50％Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5％生长因子N2 supplement，1％生长因子B27supplement，3.5ul/L 2-mercaptoethanol，0.025％insulin， 1％1×Glutamax，0.5％MEM-NEAA和10μM Y-27632。
上述脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，细胞捕获滤膜的孔径为8μm，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；
(3)截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤(2)洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；
(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；
(5)将所述的分化培养基重悬备用；将温和细胞解离试剂和含有15mM HEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿置进行预热；
先向每个预热后的低黏附培养皿中加入重悬后的所述分化培养基；再将解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，混合均匀，于培养箱中进行培养。
实施例2
本实施例提供了一种脑脊循环肿瘤细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基为：DMEM/F12培养液中添加1％1× Glutamax，10mM HEPES缓冲液，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5％生长因子B27 supplement，1％生长因子N2supplement，50ng/ml生长因子EGF， 100ng/ml生长因子FGF-10，1μg/ml生长因子IGF1，0.2％的抗生素primocin， 10uM抑制剂SB431542，1％MEM-NEAA和1ug/ml Heparin50；
所述分化培养基为：由50％DMEM/F12培养液和50％Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5％生长因子N2 supplement，1％生长因子B27supplement，3.5ul/L 2-mercaptoethanol，0.025％insulin， 1％1×Glutamax，0.5％MEM-NEAA和10μM Y-27632。
脑脊循环肿瘤细胞的培养方法包括以下步骤：
(1)将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；
(3)截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤(2)洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；
(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将200ul所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；
(5)将所述的分化培养基重悬备用；将10mL温和细胞解离试剂和10mL 含有15mMHEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿置进行预热；
先向每个预热后的低黏附培养皿中加入10mL重悬后的所述分化培养基；再将200ul解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，轻轻8字混匀，于37℃， 5％CO2培养箱中进行培养。
实施例3
本实施例提供了一种脑脊循环肿瘤细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和分化培养基，所述基础培养基为：DMEM/F12培养液中添加1％1× Glutamax，10mM HEPES缓冲液，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5％生长因子B27 supplement，1％生长因子N2supplement，50ng/ml生长因子EGF， 100ng/ml生长因子FGF-10，1μg/ml生长因子IGF1，0.2％的抗生素primocin， 10uM抑制剂SB431542，1％MEM-NEAA和1ug/ml Heparin50；
所述分化培养基为：由50％DMEM/F12培养液和50％Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5％生长因子N2 supplement，1％生长因子B27supplement，3.5ul/L 2-mercaptoethanol，0.025％insulin，1％1×Glutamax，0.5％MEM-NEAA和10μM Y-27632。
脑脊循环肿瘤细胞的培养方法包括以下步骤：
(1)将孔径为8μm的细胞捕获滤膜置于1-2mL 75％的乙醇溶液中进行浸洗，重复3次，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
(2)采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜5次，保证残余乙醇彻底去除；
(3)截留细胞富集：将脑脊液沿模具内壁缓慢加入到PBS中以质量比为1： 1的比例进行稀释，采用洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行捕获，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；
(4)无菌镊子夹取步骤(3)的所述细胞捕获滤膜，置于所述的基础培养基中进行培养，每3-5天换一次培养基，培养15天，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将200ul所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；
(5)将所述的分化培养基重悬备用；将10mL温和细胞解离试剂和10mL 含有15mMHEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将所述低黏附培养皿置于37℃孵箱预热30分钟；
先向每个预热后的低黏附培养皿中加入10mL重悬后的所述分化培养基；再将200ul解冻后的Matrigel和步骤(4)得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，轻轻8字混匀，于37℃， 5％CO2培养箱中进行培养，根据脑脊循环肿瘤细胞(可用于培养脑脊液类器官) 生长状况，培养基每3-4天更新一次。脑脊循环肿瘤细胞培养第2天、第6天、第10天、第15天培养状态如图1所示。PatientA为采用基础培养基培养第2 天、第6天、第10天、第15天培养状态；PatientB为采用分化培养基培养第 2天、第6天、第10天、第15天培养状态。
其中，温和细胞解离试剂是兼具蛋白水解酶和胶原酶活性的温和细胞解离试剂，即DMEM高糖，含Collagenase(300U/ml)/Hyaluronidase(100U/ml)。
本发明的基础培养基中添加了B27、EGF、FGF细胞生长因子；SB431542 (TGF-β/Smad抑制剂)，用于维持干细胞的自我更新和胚状体的形成，还能够维持多潜能干细胞活性。
MEM-NEAA氨基酸组分如下表1所示：
表1 MEM-NEAA氨基酸组分
氨基酸 浓度(mg/l)
Glycine 750
L-Alanine 890
L-Asparagine 1320
L-Aspartic acid 1330
L-Glutamic Acid 1470
L-Proline 1150
L-Serine 1050
试验例
将CSF-CTCs诱导类器官采用本发明的培养方法进行培养18天后，取滤膜原位诱导的培养物进行免疫荧光联合荧光原位杂交进行检测鉴定，具体操作如下：
(1)4％PFA固定：小心取出培养物并移至载玻片上，立即滴加200μL 4％PFA固定液固定5min，吸净液体。
(2)洗涤：1×PBS洗涤膜片三次，3min/次。
(3)细胞透化：取200μL含0.01％Triton X100的1×PBS试剂至固定好的样本上，处理5min。
(4)洗涤：1×PBS洗涤膜片三次，3min/次。
(5)老化：将载玻片放入提前37℃预热的2xSSC中处理10min。
(5)脱水：依次于75％、85％、无水乙醇中处理2min，室温晾干。
以下步骤均避光
(7)杂交：取10μLCEP8探针加至膜片中间，中性树胶封片(注意避免气泡)。杂交条件：变性：76℃5min；杂交：37℃2～16h。
(8)洗涤：杂交结束后，小心撕去封片胶，将载玻片移至提前43℃预热的甲酰胺工作液中，弃盖玻片，处理15min，5min轻摇一次；移至2xSSC中处理5min，重复1次。取出载玻片，1×PBS洗涤两次。
(9)抗体孵育：将抗体工作液(取20μL CD45抗体和20μL CK18、19 抗体至160μL2％BSA中，混匀)加至标本区，37℃孵育1h。
(10)洗涤：1×PBS洗涤膜片三次，3min/次。
(11)DAPI染色：取150μL DAPI染色液于膜片上，孵育10min。
(12)封片：取10μL封片剂封片。
免疫荧光联合荧光原位杂交检测鉴定结果如图2所示，其中，DAPI是核染色，CEP8是8号染色体探针FISH，CD45白细胞染色，CK18/19肿瘤细胞角蛋白染色。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种脑脊循环肿瘤细胞的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
（1）将细胞捕获滤膜置于无水乙醇溶液中进行浸洗，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润；
（2）采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜，保证残余乙醇彻底去除；
（3）截留细胞富集：将脑脊液加入到PBS中进行稀释，采用步骤（2）洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行过滤，然后采用HBSS缓冲液对所述细胞捕获滤膜进行多次洗涤，至膜上无可见残留物；
（4）无菌镊子夹取步骤（3）的所述细胞捕获滤膜，置于基础培养基中进行培养，形成脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液；将所述脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液进行离心，弃上清液，得到重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液，所述基础培养基为：DMEM/F12培养液中添加1% 1×Glutamax，10 mM HEPES缓冲液，100U/ml 青霉素，0.1mg/ml链霉素，1.5% 生长因子B27 supplement，1% 生长因子N2 supplement，50ng/ml生长因子EGF，100 ng/ml生长因子FGF-10， 1μg/ml生长因子IGF1， 0.2%的抗生素primocin，10 uM抑制剂SB431542，1%MEM-NEAA和1ug/ml Heparin50；
（5）将分化培养基重悬备用；将温和细胞解离试剂和含有15 mM HEPES的DMEM/F-12置于冰上备用；冰上解冻Matrigel备用；将低黏附培养皿进行预热；所述分化培养基为：由50%DMEM/F12培养液和50% Neurobasal培养基组成混合培养基，在所述混合培养基中添加0.5%生长因子N2 supplement，1%生长因子B27 supplement，3.5ul/L 2-mercaptoethanol，0.025% insulin，1% 1×Glutamax，0.5% MEM-NEAA和10 µM Y-27632；
（6）先向每个预热后的低黏附培养皿中加入重悬后的所述分化培养基；再将解冻后的Matrigel和步骤（4）得到的所述重悬脑脊液循环肿瘤细胞体外增殖培养混合液加入到所述低黏附培养皿中，混合均匀，于培养箱中进行培养。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，将细胞捕获滤膜置于1-2mL 75%的乙醇溶液中进行浸洗，重复3次以上，确保所述细胞捕获滤膜完全浸润。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述细胞捕获滤膜的孔径为8μm。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（2）中，采用1×PBS完全浸润并洗涤所述细胞捕获滤膜5次以上，保证残余乙醇彻底去除。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（3）中，将脑脊液沿模具内壁缓慢加入到PBS中以质量比为1：1的比例进行稀释，采用洗涤过的所述细胞捕获滤膜对稀释后的所述脑脊液进行捕获。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（4）中，所述细胞捕获滤膜置于所述的基础培养基中进行培养时，每3-5天换一次培养基，培养时间为11-15天。
7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（5）中，所述预热具体为：将所述低黏附培养皿置于37℃孵箱预热30分钟。
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