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CN113237942B - 在微量细胞中检测多种微量元素的方法及应用 - Google Patents

在微量细胞中检测多种微量元素的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法及应用，属于医学检测技术领域。本发明包括检测多种微量元素及其信号动力学分析两部分。通过使用常规单细胞电感耦合等离子体质谱(SC‑ICP‑MS)方法，即用单细胞雾化器将细胞悬液雾化成含单个细胞的小液滴到单细胞雾室中，采用快速分析计算机软件模块实现单细胞水平的元素分析，并用相同的方法检测标准品，制备标准曲线。随后进行特定元素的信号动力学特性分析。本发明可应用在所有体细胞、配子细胞、原核细胞，以及人源癌症细胞，包括但不限于精液、生殖道液、卵泡液、血液、尿液、唾液和大便中可分离的细胞，并测定微量细胞以至单个细胞的多个元素的含量，并用作评估细胞的功能质量的参考参数。

Description

在微量细胞中检测多种微量元素的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法及应用，属于医学检测技术领域。
背景技术
现有技术中，临床上用于人精子质量评价的方法主要针对形态与动力，事实上，离子含量也可以成为评价精子质量的标准，不少研究报道了镉、镍等引起男性生育力减弱，硒可以提高生育力，钙更是精子获能的关键离子(Ingold et al.,2018；Kasperczyk et al.,2015；Li et al.,2012a；Li et al.,2012b；Marzec-Wroblewska et al.,2015；Schmid etal.,2013；Tvrda et al.,2015；Zhao et al.,2017)。因此检测单个精子的离子谱为精子质量评价方法提供了新的角度和方向。另一方面，临床上单个细胞的离子谱分析方法还十分缺乏。因此，建立一种检测单个精子和单个细胞的离子谱的方法为临床上改善精子质量、细胞功能并提供参考值具有重要意义。
现有的元素测定方法“火焰法”技术主要缺点是灵敏度低，检测元素少，时间长。单细胞电感耦合等离子体质谱(SC-ICP-MS)技术的最新进展使我们可以直接在单细胞水平检测单个细胞中的元素含量。SC-ICP-MS技术是使用单细胞雾化器将细胞悬液雾化成含单个细胞的小液滴到单细胞雾室中，通过快速分析计算机软件模块实现单细胞水平的分析。一些研究已经应用SC-ICP-MS来快速、同时地评估单个颗粒和单个哺乳动物细胞中的多种元素组成(Bandura et al.,2009；Cao et al.,2019；Ho and Chan,2010；Meyer et al.,2018；Miyashita et al.,2017；Mueller et al.,2014；Wang et al.,2015)。但大多是红细胞和人源细胞系，对体液中的细胞和精子等非球形细胞尚未见相关检测方法。本发明先使用人精液中的精子为模型，测试了本发明的可行性，进而测试人其它体液中可分离的细胞。本方法可以测定微量细胞以至单个细胞的多个元素的成分含量，并可扩展应用范围至其它细胞,包括所有体细胞、配子细胞、原核细胞，含精液、生殖道液、卵泡液、血液、尿液、唾液和大便中可分离的细胞，也可用作评估细胞的功能质量的参考参数。
参考文献：
Bandura,D.R.,Baranov,V.I.,Ornatsky,O.I.,Antonov,A.,Kinach,R.,Lou,X.,Pavlov,S.,Vorobiev,S.,Dick,J.E.,and Tanner,S.D.(2009).
Mass cytometry:technique for real time single cell multitargetimmunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight massspectrometry.Anal Chem 81,6813-6822.
Cao,Y.,Feng,J.,Tang,L.,Yu,C.,Mo,G.,and Deng,B.(2019).A highlyefficient introduction system for single cell-ICP-MS and its application todetection of copper in single human red blood cells.Talanta 206,120174.
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发明内容
本发明的目的是为解决如何测定微量细胞以至单个细胞的多个元素的含量，以及如何评估细胞的功能质量的技术问题。
为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法，包括以下步骤：
步骤1：取得体细胞离心去上清液，用稀释液稀释至检测浓度在3x106/ml以下,上机检测；
步骤2：检测方法是使用常规单细胞ICP-MS即SC-ICP-MS方法，用单细胞雾化器将细胞悬液雾化成含单个细胞的小液滴到单细胞雾室中，通过快速分析计算机软件模块实现单细胞水平的多种微量元素的分析；
步骤3：用与步骤2相同的方法检测标准品，制备标准曲线；
步骤4：评估特定细胞的特异元素的SC-ICP-MS信号动力学的特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积等细胞独特性的元素特性信号特征；
步骤5：评估细胞的功能质量。
本发明提供一种评估细胞功能质量的方法，采用评估特定细胞的特异元素的SC-ICP-MS信号动力学的特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积等细胞独特性的元素特性信号特征。
本发明提供一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法在评估人精子细胞中的应用。
本发明提供一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法在评估多种形态和类型的细胞中的应用，包括所有不限种属的体细胞、配子细胞、原核细胞、以及含精液、生殖道液、卵泡液、血液、尿液、唾液和大便中可分离的细胞。
本发明提供一种评估细胞功能质量的方法在评估人精子细胞中的应用。
本发明提供一种评估细胞功能质量的方法在评估多种形态和类型的细胞中的应用，包括所有不限种属的体细胞、配子细胞、原核细胞、以及含精液、生殖道液、卵泡液、血液、尿液、唾液和大便中可分离的细胞。
本发明提供一种在人精子细胞中检测多种微量元素的方法；包括以下步骤：
步骤1：样本准备：将新鲜的人精液按常规方法液化后离心，分离精浆与精子，用4％PFA将精子重悬固定十五分钟，再把固定液清洗后，可直接使用或放于4度保存备用；
步骤2：用稀释液稀释至检测浓度在3x106/ml以下；
步骤3：上机检测：安装特定的单细胞雾化器和雾室后，首先用调谐液(2％v/v硝酸中含有10μg/L的Li、Be、Mg、Fe、In、Ce、Pb和U)对ICP-MS仪器进行调谐以确定适宜的仪器检测参数，然后用金颗粒标准品确定单细胞传输效率，一般在40％-60％范围；配制不同浓度18种待测元素的标准溶液绘制校准曲线，所有浓度标准溶液均在超纯水中配制；为了消除多原子干扰，获得高信噪比，在动态反应池模式下，以氨气为反应气体，分别测定了单细胞中的K、Ca、Cr和Fe；以氧气为反应气体，分别测定了单细胞中的As和Se，并以氧化反应产物AsO和SeO为分析物种进行检测；其他元素在标准模式下测定；样本在50μs的驻留时间下采集50s，所检测的18个元素消耗的总样本体积约为400μL；
步骤4：评估特定细胞的特异元素的SC-ICP-MS信号动力学的特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积等细胞独特性的元素特性信号特征；
步骤5：评估细胞的功能质量。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
基于特定细胞的特定元素SC-ICP-MS信号动力学的特征，可以解决通过单细胞离子谱学多边分析结果，从而推断细胞功能及其在临床应用的技术问题。本发明能广泛应用在特定细胞的质量检测，包括但不限于以下细胞及其相关的功能：如精子功能与不孕不育以及后代健康参考参数、卵细胞功能与不孕不育参考参数、颗粒细胞功能与不孕不育参考参数、血液白细胞功能与生理健康状态以及病理诊断参考参数、尿液可分离的细胞与生理健康状态以及病理诊断参考参数、大便中可分离的细胞(含体细胞以及原核细胞)与生理健康状态以及病理诊断参考参数、唾液可分离的细胞与生理健康状态以及病理诊断参考参数等。
附图说明
图1为不同样本中单个人精子中多个元素的定量分析。
图2为在单个人精子中必需微量元素含量比较高的样本范例。
图3为在单个人精子中有毒元素含量比较高的样本范例。
图4在单个人精子中其它元素含量比较高的样本范例。
图5为人精子的独特元素特性信号特征。
图6为必需宏量元素(钙和镁)在不同类型细胞中的信号特征。
图7为必需微量元素在人精子的信号特征，包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)、钴(Co)、硒(Se)等。
图8为必需微量元素在小鼠附睾上皮DC2细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)、钴(Co)、硒(Se)等。
图9为必需微量元素在人胎儿肾293T细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)、硒(Se)等。
图10为必需微量元素在人宫颈癌Hela细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、锰(Mn)、铬(Cr)等。
图11为必需微量元素在人胃癌SNU-1细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)等。
图12为毒性元素在不同类型细胞的的信号特征。其中A)为人精子；B)为小鼠附睾上皮DC2细胞；C)为人胎儿肾293T细胞；D)为人宫颈癌Hela细胞；E)为人胃癌SNU-1细胞。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：本发明提供一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法，包括以下步骤：
步骤1：取得体细胞离心去上清液，用稀释液稀释至检测浓度在3x106/ml以下,上机检测；
步骤2：检测方法是使用常规单细胞ICP-MS即SC-ICP-MS方法，用单细胞雾化器将细胞悬液雾化成含单个细胞的小液滴到单细胞雾室中，通过快速分析计算机软件模块实现单细胞水平的多种微量元素的分析；
步骤3：用与步骤2相同的方法检测标准品，制备标准曲线；
步骤4：评估特定细胞的特异元素的SC-ICP-MS信号动力学的特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积等细胞独特性的元素特性信号特征；
步骤5：评估细胞的功能质量。
本发明提供一种评估细胞功能质量的方法，采用评估特定细胞的特异元素的SC-ICP-MS信号动力学的特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积等细胞独特性的元素特性信号特征。
本发明提供一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法在评估人精子细胞中的应用。
本发明提供一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法在评估多种形态和类型的细胞中的应用，包括所有不限种属的体细胞、配子细胞、原核细胞、以及含精液、生殖道液、卵泡液、血液、尿液、唾液和大便中可分离的细胞。
本发明提供一种评估细胞功能质量的方法在评估人精子细胞中的应用。
本发明提供一种评估细胞功能质量的方法在评估多种形态和类型的细胞中的应用，包括所有不限种属的体细胞、配子细胞、原核细胞、以及含精液、生殖道液、卵泡液、血液、尿液、唾液和大便中可分离的细胞。
实施例1
如图1-图5所示，一种在微量细胞中检测多种微量元素的方法在评估人精子细胞中的应用。
步骤1：样本准备：将新鲜的人精液按常规方法液化后离心，分离精浆与精子，用4％PFA将精子重悬固定十五分钟，再把固定液清洗后，可直接使用或放于4度保存备用。
步骤2：用稀释液稀释至检测浓度在3x106/ml以下。
步骤3：上机检测：安装特定的单细胞雾化器和雾室后首先用调谐液(2％v/v硝酸中含有10μg/L的Li、Be、Mg、Fe、In、Ce、Pb和U)对ICP-MS仪器进行调谐以确定适宜的仪器检测参数，然后用金颗粒标准品(如50nm金颗粒)确定单细胞传输效率，一般在40％-60％范围。配制不同浓度待测元素(如Na、K、Ca、Mg、Zn、Fe、Cu、Se、Co、Cr、Cd、Mn、As、Hg、Pb、Ag、Al、Ni等)的标准溶液绘制校准曲线，其中Hg的标准浓度依次为0.5ppb、1ppb、2ppb；Ca的标准浓度依次为50ppb、100ppb、200ppb，其余元素的标准浓度依次为5ppb、10ppb、20ppb，所有浓度标准溶液均在超纯水中配制。为了消除多原子干扰，获得高信噪比，在动态反应池(DRC)模式下，以氨气为反应气体，分别测定了单细胞中的K、Ca、Cr和Fe；以氧气为反应气体，分别测定了单细胞中的As和Se，并以氧化反应产物AsO和SeO为分析物种进行检测。其他元素在标准模式下测定。样本在50μs的驻留时间下采集50s，所检测的18个元素消耗的总样本体积约为400μL。SC-ICP-MS的常规工作条件如下表所示：
实施例1-5
因为临床上单个精子的离子谱分析方法还十分缺乏，而精子中的离子含量也是影响精子质量重要因素，因此，建立一种检测单个精子的离子谱的方法为临床上改善精子质量、细胞功能并提供参考值具有重要意义。另外，单个精子不同元素的驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积等细胞独特性的元素特性信号特征具有可区分性。这些信号动力学的特征具有重要的生物学意义、相关病理学意义和临床应用前景。
如图1所示：图中为不同样本中单个人精子中多个元素的定量分析。通过使用本发明的检测方法，不同样本中多个元素的差异可以检测。多个元素的检测最低灵敏范围可以达到单个细胞在百亿亿分之一克(ag)的浓度(如图1所示)。
如图2所示：图为在单个人精子中必需微量元素含量比较高的样本范例。本发明的检测方法可以检测到必需微量元素含量在不同样本中的差异。这些发现可以作为标准并可以对这些元素缺陷的人群进行元素补充的建议。
如图3所示：图为在单个人精子中有毒元素含量比较高的样本范例。这些有毒元素含量比较高的样本人群可以做临床排毒治疗。
如图4所示：图为在单个人精子中其它元素含量比较高的样本范例。具有临床意义。
如图5所示：图为人精子的独特元素特性信号特征。图示是以单个人精子细胞中的铁和铜元素在同一样本的SC-ICP-MS信号动力学特征为例，表明细胞特异性的信号特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值，以及峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积等细胞独特性的元素特性信号的特征。
实施例6-12
因为不同细胞不但含有不同元素的含量，特定元素在不同细胞中也有独特的ICP-MS信号，并且可以识别其在不同细胞的特异性质。例如在培养的小鼠附睾上皮DC2细胞、人胎儿肾293T细胞、人宫颈癌Hela细胞、人胃癌SNU-1细胞的不同元素的SC-ICP-MS信号相关特征的时间和常数都具有可辨别性。这些信号动力学的特征具有生物学意义、相关病理学意义和临床应用前景。
如图6所示：为必需宏量元素(钙和镁)在不同类型细胞中的信号特征。
如图7所示：为必需微量元素在人精子的信号特征，包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)、钴(Co)、硒(Se)等。
如图8所示：为必需微量元素在小鼠附睾上皮DC2细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)、钴(Co)、硒(Se)等。
如图9所示：为必需微量元素在人胎儿肾293T细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)、硒(Se)等。
如图10所示：为必需微量元素在人宫颈癌Hela细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、锰(Mn)、铬(Cr)等。
如图11所示：为必需微量元素在人胃癌SNU-1细胞的信号特征,包括锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、铬(Cr)等。
如图12所示：为毒性元素在不同类型细胞的信号特征。其中A)为人精子；B)为小鼠附睾上皮DC2细胞；C)为人胎儿肾293T细胞；D)为人宫颈癌Hela细胞；E)为人胃癌SNU-1细胞。这些毒性元素的信号值及其动力学特征具有生物毒理学意义及病理学意义，并可在临床诊断中应用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种通过在微量细胞中检测多种宏量与微量元素用于评估细胞功能质量的方法，其特征在于：包括取得体细胞离心去上清液，用稀释液稀释至检测浓度在3x106/ml以下,上机检测；使用单细胞电感耦合等离子质谱SC-ICP-MS方法，对单细胞水平的多种元素进行分析；采用评估特定细胞的特异元素的SC-ICP-MS单个信号动力学的特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积细胞独特性的元素特性信号特征评估细胞的功能质量。
2.如权利要求1所述的方法在评估活的或是去活的人精子细胞中的应用。
3.如权利要求1所述的方法在评估多种形态和类型的细胞中的应用，包括所有不限种属、不限生理状况的体细胞、配子细胞、原核细胞、以及含精液、生殖道液、卵泡液、血液、尿液、唾液和大便中可分离的细胞。
4.一种通过在人精子细胞中检测多种微量元素用于评估人精子细胞功能质量的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：样本准备：将新鲜的或是获能前或是获能后的人精液按常规方法液化后离心，分离精浆与精子，用4％PFA将精子重悬固定十五分钟，再把固定液清洗后，可直接使用或放于4摄氏度保存备用；
步骤2：用稀释液稀释至检测浓度在3x106/ml以下；
步骤3：上机检测：安装特定的单细胞雾化器和雾室后，首先用调谐液，调谐液为2％v/v硝酸中含有10μg/L的Li、Be、Mg、Fe、In、Ce、Pb和U，对ICP-MS仪器进行调谐以确定仪器检测参数，然后用金颗粒标准品确定单细胞传输效率，传输效率在40％-60％范围；配制不同浓度待测元素的标准溶液绘制校准曲线，所有浓度标准溶液均在超纯水中配制；为了消除多原子干扰，获得高信噪比，在动态反应池模式下，以氨气为反应气体，分别测定了单细胞中的K、Ca、Cr和Fe；以氧气为反应气体，分别测定了单细胞中的As和Se，并以氧化反应产物AsO和SeO为分析物种进行检测；其他元素在标准模式下测定；样本在50μs的驻留时间下采集50s，所检测的18个元素消耗的总样本体积约为400μL；
步骤4：评估特定细胞的特异元素的SC-ICP-MS单个信号动力学的特征，包括驻留时间、单信号的峰值时间及其与驻留时间比值、峰值前动力常数与面积和峰值后动力常数与面积细胞独特性的元素特性信号特征；
步骤5：评估细胞的功能质量。
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