CN113234752A

CN113234752A - 一种提高小麦植株内源vc含量的方法

Info

Publication number: CN113234752A
Application number: CN202110552456.9A
Authority: CN
Inventors: 张天烨; 羊健; 胡海超; 王紫琼; 陈知青; 钟凯丽; 陈剑平
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2021-05-20
Publication date: 2021-08-10

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，公开了一种提高小麦植株内源VC含量的方法，将从烟草中克隆得到的GDP‑L‑半乳糖磷酸化酶基因构建到表达载体中，然后将得到的重组表达载体转化至小麦幼胚中，筛选阳性植株。本发明的方法转基因效率高，能够提高小麦体内维生素C的合成效率，从而快速得到高VC含量的转基因小麦品种，使小麦更具营养价值。

Description

一种提高小麦植株内源VC含量的方法

技术领域

本发明涉及小麦转基因技术领域，特别涉及一种提高小麦植株内源VC含量的方法。

背景技术

维生素C也称L-抗坏血酸(ASA)，是人体正常生理代谢所必不可少的一种维生素，人体对于维生素C的摄入主要依赖于水果而不是主食。普通小麦，不管是麦芽还是籽粒中的维生素C含量都非常低，无法在作为日常主食的同时为人体提供一定量的维生素C。

维生素C也是植物体内极其重要的抗氧化物质之一，它可以清除植物体内由于各种逆境环境而产生的活性氧，使植物细胞免受氧化胁迫。提高小麦体内的VC含量不仅可以提高小麦的抗氧化能力，更可以提高小麦的VC含量，提高小麦的营养价值。目前对于如何提高小麦植物内源的VC含量的研究非常少，目前还没有已有报道的行之有效的方法。如果使用传统杂交育种的方法培育高VC含量的小麦，不仅困难重重而且周期非常漫长，想要获得稳定的高VC的小麦品种也非常困难。

目前为止，植物中合成维生素C的途径一共有四条，即Smirnoff-Wheeler途径、半乳糖醛酸途径、古洛糖途径和肌醇途径。但最主要的途径还是Smirnoff-Wheeler途径即L-半乳糖途径。在此途径中有关键一步就是将GDP-L-半乳糖催化合成L-半乳糖-1-磷酸。而要完成这一步就需要GDP-L-半乳糖磷酸化酶的磷酸化作用，编码GDP-L-半乳糖磷酸化酶的基因就是GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因，GGP(GDP-L-galactose phosphorylase)。

由于小麦为异源六倍体小麦，基因组非常复杂，利用转基因技术获得纯和的转基因植株也较难，转基因效率也较低，需要大量的工作去获得小麦阳性植株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种周期快，效果好的提高小麦植株内源维生素C含量的技术方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种提高小麦植株内源VC含量的方法，包括以下步骤：将从烟草中克隆得到的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因构建到表达载体中，然后将得到的重组表达载体转化至小麦幼胚中，筛选阳性植株。

本发明中，所述GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因的序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

本发明中，从烟草中克隆GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因的方法包括：提取本氏烟草的总RNA，逆转录得到cDNA，以cDNA为模版设计引物扩增得到GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因。

作为优选的，所述引物为：F:ATGATGCTCAAGATTAAGAGG，R:GACGGGAACCATGGTAGCATG。

本发明中，所述重组表达载体的构建方法包括：将空载质粒双酶切纯化得到线性化载体，所述线性化载体和GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因片段进行连接得到重组质粒。

作为优选的，所述表达载体为pWMB190或pAHC25。

作为一种实施方式，所述转化基因枪介导的小麦遗传转化方法。

作为一种实施方式，所述转化的方法包括：取小麦幼胚愈伤组织在含0.35-0.4M渗透压培养基中预处理4～6h，将重组载体与筛选标记混合后，用基因枪轰击进入预处理的愈伤组织幼胚，继续培养16～18h；将处理后的愈伤组织转移至SD2或改良MS培养基恢复培养两周。

作为一种实施方式，所述筛选的方法包括：将小麦幼胚愈伤组织转移至1/2MS含有0.8-1mg/L NAA与0.8-1mg/L KT的分化筛选培养基中，待愈伤组织分化出小苗后转移置1/2MS无激素的生长筛选培养基上,经过数次筛选后得到的小苗转移到1/2MS含有0.15-0.2mg/L IAA和0.4-0.5mg/L多效唑的培养基上进行壮苗处理，移栽鉴定。

作为一种实施方式，本发明所述筛选剂为双丙氨膦或草甘膦，所述筛选剂的浓度随筛选次数的增加逐渐增大。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种提高小麦植株内源VC含量的方法，将从烟草中克隆得到的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因构建到表达载体中，然后将重组表达载体转化至小麦幼胚中，筛选阳性植株。GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因从烟草cDNA上进行克隆后，将其转至小麦中，经表达后可翻译成GDP-L-半乳糖磷酸化酶，进而提高小麦体内维生素C的合成效率，从而增加小麦整体的维生素C含量。本发明的方法转基因效率高，能够快速得到高VC含量的转基因小麦品种，使小麦更具营养价值。

本发明将同一生长期阳性转基因小麦植株和普通小麦植株的叶、茎秆、籽粒进行收集，并通过高效液相色谱法(HPLC)进行维生素C含量的测定，结果表明，不管是在叶片、茎秆还是籽粒中，转GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因阳性小麦的VC含量相比较于未转基因的野生型小麦都有显著提高，阳性转基因小麦叶片、茎秆和籽粒中的VC含量相较于普通小麦中分别提高2.8倍、1.9倍和1.5倍。

附图说明

图1：克隆烟草中的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因；

图2：转基因小麦RT-PCR检测鉴定结果；

图3：转基因小麦植株与野生植株在叶片、茎秆及籽粒中的VC含量对比。

具体实施方式

本发明提供一种提高小麦植株内源VC含量的方法，将从烟草中克隆得到的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因构建到表达载体中，然后将得到的重组表达载体转化至小麦幼胚中，筛选阳性植株。得到的阳性转基因小麦植株与普通野生型小麦植株相比，其叶、茎秆和籽粒中的VC含量均显著提高。本发明的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因为从烟草中克隆得到，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。本发明对烟草的种类没有特殊限制，在本发明具体实施例中，GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因为从本氏烟草中克隆得到，瞬时表达该基因可以提高烟草中的VC含量。作为一种实施例，从烟草中克隆GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因的方法包括：提取本氏烟草的总RNA，逆转录得到cDNA，以cDNA为模版设计引物扩增得到GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因。作为一个实施例，本发明总RNA的提取方法采用Trizol法。本发明对逆转录的方式没有特别限定，采用本领域已知方法或试剂盒进行RNA的逆转录。本发明对扩增的方式没有特别限定，采用本领域已知的扩增方法进行。作为一个实施例，所述扩增的引物为：F:ATGATGCTCAAGATTAAGAGG，R:GACGGGAACCATGGTAGCATG。PCR扩增程序为：95℃、5min；95℃、30s；58℃、30s；72℃、1min；72℃、10min。

本发明将GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因构建到表达载体中，得到重组表达载体。根据GDP-L-半乳糖磷酸化酶的基因序列，设计序列的引物，并在引物的前后端分别加同源臂序列，通过同源重组连接的方式构建至表达载体上。作为一个实施例，正反向引物分别是F:CGACTCTAGAGGATCCATGATGCTCAAGATTAAGAGG；R:GAGCTCTCTAGACTAGTGACGGGAACCATGGTAGCATG。所述重组表达载体的构建方法包括：将空载质粒双酶切纯化得到线性化载体，所述线性化载体和GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因片段粘性末端进行连接得到重组质粒。作为一个实施例，本发明的表达载体可以为pWMB190或pAHC25。作为一个实施例，双酶切位点为BamH1和Spe1。

作为一个实施例，本发明用基因枪介导的方法进行小麦遗传转化。所述转化的方法包括：取小麦幼胚愈伤组织在含0.35-0.4M渗透压培养基中预处理4～6h，将重组载体与筛选标记混合后，用基因枪轰击进入预处理的愈伤组织幼胚，继续培养16～18h；将处理后的愈伤组织转移至SD2或改良MS培养基恢复培养两周。本发明中优选的筛选标记为含有含有草铵膦或抗双丙氨膦的抗性基因，与重组表达载体共转至小麦幼胚愈伤组织中，在含有筛选剂的环境下进行筛选，得到阳性表达转基因小麦。作为一个实施例，筛选标记为pAHC20空载质粒。

作为一个实施例，小麦幼胚愈伤组织的培养方式为：将授粉后11～15天的未成熟种子进行采集，经无菌消毒后取出幼胚，接种于MS培养基，置于24～26℃黑暗培养。黑暗培养7～8天后挑选长势较好的幼胚愈伤组织，进行基因枪转化。

作为一个实施例，所述筛选的方法包括：将小麦幼胚愈伤组织转移至1/2MS含有0.8-1mg/L NAA与0.8-1mg/L KT的分化筛选培养基中，待愈伤组织分化出小苗后转移置1/2MS无激素的生长筛选培养基上,经过数次筛选后得到的小苗转移到1/2MS含有0.15-0.2mg/L IAA和0.4-0.5mg/L多效唑的培养基上进行壮苗处理，移栽鉴定。其中筛选剂为双丙氨膦或草甘膦，筛选剂的浓度随筛选次数的增加逐渐增大。如从2～3ppm上升至4～5ppm。筛选过程中选择合适的温湿度和光照环境，以提高转基因植株的成活率。

将筛选得到的阳性转基因植株进行RT-PCR检测鉴定及VC含量的测定。得到的转基因小麦植株中不管是在叶片、茎秆还是籽粒中，VC含量相比较于未转基因的野生型小麦都有显著提高。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明若无特别说明，所使用的参考方法及相应分子生物学基本操作都未本领域的常规已知方法。所使用的试剂均可商业购买。

实施例1：

GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因的提取

利用Trizol法提取出本氏烟草的总RNA，随后用First Strand cDNA SynthesisKit ReverTra Ace(TOYOBO)逆转录试剂盒对提取的总RNA进行逆转录。将RNA的量定至1ug/20ul，反应体系如下：

随机引物	1ul
		总RNA	x ul(1ug)
RNase Free H<sub>2</sub>O	11-x ul

65℃，5分钟后，立即置于冰上。

第一步RNA溶液	12ul
		5×RT Buffer	4ul
dNTP Mixture	2ul
		RNase Inhibitor	1ul
ReverTra Ace	1ul

反应程序为：30℃、10min；42℃、20min；99℃、5min；4℃、5min。反应完成后瞬间离心，得到逆转录完成的本氏烟草cDNA。

逆转录完成的用来扩增GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因。根据本氏烟草的cDNA设计引物：

F:ATGATGCTCAAGATTAAGAGG；

R:GACGGGAACCATGGTAGCATG。

用KOD FX(TOYOBO)高保真酶从逆转录好的cDNA中亚克隆烟草维生素C合成的关键基因GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因。

PCR程序为：95℃、5min；95℃、30s；58℃、30s；72℃、1min；72℃、10min。

克隆结果见图1。

实施例2：

重组表达载体的构建

将实施例1克隆到的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因用下述引物以及KOD FX酶进行PCR扩增，得到GDP-L-半乳糖磷酸化酶扩增片段。

F:CGACTCTAGAGGATCCATGATGCTCAAGATTAAGAGG；

R:GAGCTCTCTAGACTAGT GACGGGAACCATGGTAGCATG。

将Pwmb190空载质粒用BamH1(上游)和spe1(下游)双酶切并纯化得到线性化载体。

利用南京诺维赞公司的ClonExpress II One Step Cloning Kit对线性化载体和上述扩增片段进行连接得到重组质粒pWMB190-GGP。体系程序如下：

37℃，30min。

质粒测序成功后备用。

实施例3：

基因枪介导的小麦遗传转化

将含有GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因序列的pWMB190-GGP载体转化进入小麦幼胚中，其简要步骤如下：

(1)将授粉后11～15天的未成熟种子进行采集(盾片直径约1cm，种子正好发白带点绿色，胚芽部稍稍成型略微突起)，经10％的NaClO溶液无菌消毒后取出幼胚，接种于MS培养基，置于24～26℃黑暗培养；

(2)经黑暗培养7～8天后挑选涨势较好的幼胚愈伤组织，将其固定在含0.4M渗透压培养基的培养皿中心，在直径约2.5cm的圆内放置大约30～40个幼胚，渗透压预处理4～6h；

(3)将pWMB190-GGP重组质粒与pAHC20空载质粒一起混合后，将金粉包裹混合质粒，制备微粒子弹；

(4)用PDS 1000/He基因枪(BIA-RAD公司)将金粉包裹的质粒轰击进入经过渗透压预处理的愈伤组织幼胚，轰击条件：Psi 1100，Hg 27.5。经轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上培养16～18h；

(4)将处理后愈伤组织转移置SD2或改良MS培养基进行恢复培养两周；

(5)恢复培养后的愈伤组织转移至1/2MS含有1mg/L NAA与1mg/L KT的分化筛选培养基中，筛选剂PPT(草铵膦，Phosphinothricin)的浓度为2～3ppm，24～26℃光照培养；

(6)待愈伤组织分化出小苗后转移置1/2MS无激素的生长筛选培养基上,筛选剂PPT的浓度为4～5ppm，24～26℃光照培养；

(7)经过2～3次筛选后得到的小苗转移到1/2MS(附加0.2mg/L的IAA和0.5mg/L的多效唑)的培养基上进行壮苗处理，待苗长至7～8cm高且根系较发达后将其进行移栽；

(8)将移栽后的组培苗置于低温高湿的培养箱中，温度控制在15-17摄氏度，湿度80％培养一周，以提高移栽成活率，还苗后将其移到温室培养；

(9)T₀代转化植株长大后采集叶片保存于-80℃，并提取其中一些叶片的DNA与RNA保存-80℃，作后续的分子检测用；

(10)通过Trizol法提取出转基因小麦的总RNA，随后进行普通RT-PCR检测鉴定的方式(引物为：F：AACAGGCTCTAGGGGAGGTC；R：CAGGAGAACCTTCAGTGGCA)，确定转基因阳性植株(图2)。

实施例4：

阳性植株中的VC含量测定

将同一生长期阳性小麦植株和普通小麦植株的叶、茎秆、籽粒进行收集，并通过高效液相色谱法(HPLC)进行维生素C含量的测定以及比较。

如表1和图3所示，不管是在叶片，茎秆还是籽粒中，转NbGGP2基因阳性小麦的VC含量相比较于未转基因的野生型小麦都有显著提高。阳性转基因小麦叶片、茎秆和籽粒中的VC含量相较于普通小麦中分别提高2.8倍、1.9倍和1.5倍。

表1 小麦不同部位中的VC含量测定结果

VC含量(μg/g)	叶片	茎秆	籽粒
				阳性转基因小麦	12.97±0.93	6.15±0.03	1.59±0.058
普通小麦	3.42±0.33	2.85±0.026	0.64±0.023

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种提高小麦植株内源VC含量的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1311

<212> DNA

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 1

atgatgctca agattaagag ggttcctaca cttgtttcca acttccaaaa agaagaggct 60

gaagaaactc ttgctcgtgg tgctggctgt ggccgcaatt gcctccgata ctgctgcctt 120

ccagggtcaa agctgccgct gtatgcttcc aagaatttga gaaagggcaa gtctgttgcc 180

gatgaaacca aggaacctcc tgttgacttc ttggaatccc tccttcttgg ggaatgggag 240

gatcgtcagc agaaaggtct ctttcgctat gatgtcactg cttgcgaaac caaggttatt 300

cctggagaat atggtttcat tgctcaactg aatgagggaa ggcacctcaa gaagaggcca 360

actgagtttc gcgttgataa ggtgctgcag ccttttgatg gaagcaagtt caacttcacc 420

aaagttggtc aggaggagtt gctctttcag tttgaagcaa gtgaggacaa cgatgtccaa 480

ttctttccaa atgcgcccat tgatgccgag aaatctccaa gtgttgttgc catcaatgtc 540

agtcccattg agtacggaca cgtgcttttg atccctaagg tccttgaatg ccttccccag 600

aggatcgaca gggacagctt attgcttgca ctgcaaatgg ctgccgaagc agcaaaccca 660

tacttccgat tgggttataa cagcttgggt gcatttgcta ctatcaacca tcttcacttt 720

caggcttatt acctggctgt gccattcccc atggagaagg cccccactcg gaagattacc 780

tttgctgatg ctggggtgaa gatatctgag atgctgaatt atccagttcg aggccttgtc 840

tttgagggtg gaaatacttt ggaggatttg gccaatgttg tctctggttc ctgcgttttc 900

ctgcaagaga ataacattcc ctacaatgtt ctaatctctg attcggcaaa aagggtattc 960

cttctcccac agtgctatgc agagaaacag gctctagggg aggtcagctc tgaactgctt 1020

gacactcaag tcaatcctgc agtttgggag attagtggac acatggtctt gaagaggaag 1080

gaggattacg agggtgcaac cgaggcaaat gcttggaggc ttctcgctga ggtctcactt 1140

tctgaagcga ggttccaaga agtgacggct ctcatctttg aagccattga ttgcagtgtt 1200

gaggagaatg agaatgccac tgaaggttct cctgagaagc cagatgttgc acctcagcct 1260

atggaggaaa ttgatgctct caacacccat gctaccatgg ttcccgtcta g 1311

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgatgctca agattaagag g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gacgggaacc atggtagcat g 21

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cgactctaga ggatccatga tgctcaagat taagagg 37

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gagctctcta gactagtgac gggaaccatg gtagcatg 38

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aacaggctct aggggaggtc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

caggagaacc ttcagtggca 20

Claims

1.一种提高小麦植株内源VC含量的方法，其特征在于：将从烟草中克隆得到的GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因构建到表达载体中，然后将得到的重组表达载体转化至小麦幼胚中，筛选阳性植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因的序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述从烟草中克隆GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因的方法包括：提取本氏烟草的总RNA，逆转录得到cDNA，以cDNA为模版设计引物扩增得到GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述引物为：F:ATGATGCTCAAGATTAAGAGG，R:GACGGGAACCATGGTAGCATG。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体的构建方法包括：将空载质粒双酶切纯化得到线性化载体，所述线性化载体和GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因片段进行连接得到重组质粒。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表达载体为pWMB190或pAHC25。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转化为基因枪介导的小麦遗传转化方法。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：所述转化的方法包括：取小麦幼胚愈伤组织在含0.35-0.4M渗透压培养基中预处理4～6h，将重组载体与筛选标记混合后，用基因枪轰击进入预处理的愈伤组织幼胚，继续培养16～18h；将处理后的愈伤组织转移至SD2或改良MS培养基恢复培养两周。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述筛选的方法包括：将小麦幼胚愈伤组织转移至1/2MS含有0.8-1mg/L NAA与0.8-1mg/L KT的分化筛选培养基中，待愈伤组织分化出小苗后转移置1/2MS无激素的生长筛选培养基上,经过数次筛选后得到的小苗转移到1/2MS含有0.15-0.2mg/L IAA和0.4-0.5mg/L多效唑的培养基上进行壮苗处理，移栽鉴定。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述筛选剂为双丙氨膦或草甘膦，所述筛选剂的浓度随筛选次数的增加逐渐增大。