CN113207687B

CN113207687B - 一种铁线莲组织培育快速繁殖方法

Info

Publication number: CN113207687B
Application number: CN202110539292.6A
Authority: CN
Inventors: 孙正海; 杨帆; 李伟; 陶桂祥; 吴田; 王明蓉; 汪琼
Original assignee: Southwest Forestry University
Current assignee: Southwest Forestry University
Priority date: 2021-05-18
Filing date: 2021-05-18
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2041-05-18
Also published as: CN113207687A

Abstract

本发明公开了一种铁线莲组织培育快速繁殖方法，铁线莲(Clematis)作为一种园艺观赏植物和传统中药，历来备受人们喜爱，由于铁线莲品种繁多，各品种在播种、嫁接、扦插、组织培养等繁殖方式上有着明显的不同，本实验所选铁线莲引种自日本，品种为“胭脂扣”，对于其组织培养的相关研究，尚未见有报道。因此，本研究以铁线莲嫩茎为试验材料，利用组织培养技术，对其进行腋芽诱导、增殖培养、生根培养、移栽炼苗等相关方面的研究，建立高效、稳定、重复性好的铁线莲组织培养体系。研究结果可为铁线莲的工厂化生产及推广提供实践指导。

Description

一种铁线莲组织培育快速繁殖方法

技术领域

本发明属于铁线莲繁殖技术领域，具体涉及一种铁线莲组织培育快速繁殖方法。

背景技术

植物组织培养(plant tissue culture)，简称组培，也称植物离体培养，是指在无菌(asepsis)和人工调控(manual control)的环境下，利用适当的培养(medium)，给予适宜的培养条件，对离体的植物器官(organ)、组织(tissue)、细胞(cell)及原生质(protoplast)进行培养，使其再生细胞生长或分化为完整植株的技术。

植物组织培养技术是20世纪初以植物生理学为基础发展起来的一门学科，是结合了植物生理学、遗传学、发育学、植物学、微生物等学科逐步发展形成的生物科学理论，只有对生物细胞的结构、机理、发育过程、细胞遗传物质的本质有了清楚的了解，才能对其进行研究。

该理论最早由德国著名植物学家哈勃兰特(G.Haberlandt)于1902年提出植物细胞具有“全能性”的理论，表示高等植物的器官和组织可以不断分割，直至单个细胞，这种单个细胞是具有潜在的全能性的，即植物细胞具有全能性的。同时大胆地提出“每个体细胞都像胚胎细胞一样，可以经过体外培养成为一个完整的植株，因为植物体的每个细胞都含有该个体的全部遗传信息，都具有形成完整植株的全套基因，因而在适宜的条件下可以诱导生长分化形成完整植株”。之后科学家们作了大量工作。直到20世纪30年代，美国的White用番茄根组织离体培养获得成功，建立了第一个无性繁殖系，也称“克隆”，接着烟草茎形成层的组织培养也获得成功。

之后从20世纪30年代到50年代，科学家们对组织培养进行了不断深入的研究，在以往的基础上发现了对于组培技术两个重要的环节激素调控模式和培养基模式。Kogl于1930年发现了第一种植物激素-吲哚乙酸(indole-3-acetic-acid,IAA)，美国学者White在1937年发现了B维生素和IAA对植物根离体生长的作用，建立了第一个由已知化合物组成的培养基-white培养基；英国学者F.C.Steward和J.Reinert以胡萝卜为例进行试验，首次证实了Haberlandt关于细胞全能性的设想。成为植物组织培养研究历史中的一个重要节点。Miller等发现激动素(Kinetin)促进芽产生的效果比腺嘌呤高出近万倍，于是激动素取代了腺嘌呤，从而建立了激动素与生长素比例控制器官分化模式。

从20世界60年代之后，通过前期的理论基础的建立及研究，组织培养技术已经建立起了相关的理论基础和技术基础，并逐步与实践工作相结合，结合常规育种、在植物遗传改良中发挥了重要的作用。并取得可观的效益额，使植物组织培养你研究进入一个全新的阶段。这之后的1962年，Murashige和Shoog对促进烟草组织培养快速生长培养基成分进行了研究，并发表了目前使用最为广泛的MS培养基，目前植物组织培养技术已经发展成为一个广阔的领域。

组织培养技术的发展在农业、林业、医学等方面广泛应用，取得了显著的社会效益。在使用组织培养技术对马铃薯、草莓等进行脱毒，可以促进生长，增加产量，用脱毒的方法进行幼苗繁殖、种植可以有效减少病害的发生，并且植物长势明显增强，长势整齐，产量增加；其次利用组织培养技术繁殖周期短、繁殖率高、不受外界环境影响的特点、可在短时间内生产大量苗木，以植物的一个茎、叶、或者芽为基础，利用组织培养可以在一年内完成几万乃至几十万的植株生产，特别是对于一些种子不能繁殖、或某些特定性状的观赏花卉进行快速繁殖，如非洲菊等；其次组织培养技术还可以用于新品种的诱导选育；其次某些植物中含有特定的生物碱、萜类、黄酮类和酚类等生物碱，利用细胞培养的技术可以对天然化合物进行合成提取；其次可用于种质资源的保存，传统的资源保存方法耗资巨大，种植资源流失情况严重，而利用组织培养技术，不仅可以降低成本，减少人力、物力的占用，还可以长期稳定的保存种质资源。

随着人们生活水平的提高，对城市绿化、生活环境要求的逐步提高，而铁线莲属植物是世界著名的观赏植物，栽培品种丰富，春夏秋季皆有开花品种。可以满足园林园艺上的色彩、季候、生态景观等要求。目前铁线莲作为一种新兴的花卉逐渐为人们所喜爱，但市场上提供的铁线莲的品种、数量有限。因此对观赏性较强的铁线莲品种进行快速繁殖研究，从而建立完善的快繁体系，进行工厂化育苗及商业化生产具有重要的价值意义。

发明内容

为了实现铁线莲的组织培育快速繁殖的目的，本发明是通过以下技术方案实现的，一种铁线莲组织培育快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：苗木材料：采集植株高1-1.5m，单瓣，花径在3-4cm，采集时间为5月份，采集生长健壮无病害的当年生嫩茎；

S2：预处理：采集的嫩茎用蒸馏水冲洗表面污垢，用试管刷擦拭表面，剪去多余的茎和枝叶，将清洁修剪后的嫩茎剪成长度为5cm的茎段，装入无菌瓶后放入超净工作台方便后续消毒；

S3：外植体消毒：将S2中处理好的茎段，用75％的乙醇溶液处理0-5s，之后用无菌水冲洗两次，每次持续2min；然后用HgCl₂浸泡3-8min，之后用无菌水冲洗2-3次，每次持续2min；将消毒后的茎段切去两端及叶柄处多余的部分，长度保持在1.5-2cm，每个茎段带有两个腋芽；

S4：增殖培养：以常用的植物培养基为基本培养基质，在培养基中添加分裂素和生长素，将茎段平放于培养基上，先暗培养5d，然后转入光培养30d；

S5：生根培养：选用1/2MS为基本培养基，并在其中加入生长素和活性炭；将S4中增殖培养的嫩茎转移接种至S5培养基中进行生根培养30d；

S6：移栽炼苗：选取S5中已经生根的组培苗，将其放在自然光下生长，在瓶内炼苗达到20d之后，将瓶口打开一半，使瓶内外空气对流持续3-5d；之后用流水将附着于根上的培养基冲洗干净，并用多菌灵进行消毒泡洗5min，然后将消毒后的组培苗移至阴凉环境晾干表面水分；

S7：组培苗移栽：将S6中处理好的组培苗栽入土壤的基质中，放入温室拱棚，湿度保持在75-85％，温度保持在15-20℃；

优选的，所述S4中的培养基选用MS、WPM、White、B5中的一种；分裂素为6-BA、TDZ中的一种，其中6-BA的浓度为0.5-3mg/L，TDZ的浓度为0.01-0.05mg/L；生长素为NAA，浓度为0.00-0.20mg/L；

优选的，所述培养基选用MS；使用6-BA和NAA进行培养，浓度为6-BA 2.0mg/L,NAA0.05mg/L；使用TDZ和NAA进行培养，浓度为TDZ 0.04mg/L，NAA 0.05mg/L；

优选的，所述S5中生长素为NAA、IBA中的一种或两种，其中NAA浓度为0.3-1.0mg/L，IBA浓度为0.2-0.8mg/L；活性炭(AC)浓度为0.00-0.50mg/L；

优选的，所述生长素使用NAA+IBA，其中NAA浓度为0.3mg/L，IBA浓度为0.5mg/L，活性炭(AC)浓度为0.3mg/L；

优选的，所述S7中根据日照情况搭盖遮阴网，20d后逐渐开棚通风，每5d喷一次营养液；

优选的，所述S7中的土壤基质为红土、腐殖土、蛭石中的一种或几种按比例搭配；

优选的，所述红土、腐殖土、蛭石按比例搭配为：红土:腐殖土＝1:1，红土:蛭石＝1:1，红土:腐殖土:蛭石＝1:2:2。

本发明的有益效果是：

不同品种之间在组培体系的建立过程中存在着明显的差别，本研究以引种自日本的铁线莲“胭脂扣”作为实验材料，采集当年生嫩茎作为外植体，结合不同类别的外源诱导调节剂和浓度配比，通过探索腋芽启动、增殖培养、生根培养、移栽炼苗等过程的探索，建立“胭脂扣”铁线莲稳定的组培快繁体系，从而为大批量生产提供优质种苗提供技术支撑；

通过本发明的技术对铁线莲组织进行培育，生根率高，根苗强壮，移栽后成活率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明铁线莲组织培育繁殖步骤流程图；

图2是本发明铁线莲组织培育繁殖技术路线图；

图3是MS培养基外植体诱导实物图；

图4是6-BA与NAA增殖培养实物图；

图5是TDZ与NAA增殖培养实物图；

图6是高浓度分裂素下的组培苗实物图；

图7是基部愈伤组织实物图；

图8是1/2MS培养基上培养的生根苗。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

不同消毒处理对成活率、污染率、死亡率的作用效果实验：

实验分为9个处理组，不同的消毒处理之间对于铁线莲的成活率、污染率、死亡率存在着显著的影响，将预处理好的茎段，用75％的乙醇溶液处理0-5s，之后用无菌水冲洗两次，每次持续2min；然后用HgCl₂浸泡3-8min，之后用无菌水冲洗2-3次，每次持续2min；将消毒后的茎段切去两端及叶柄处多余的部分，长度保持在1.5-2cm，每个茎段带有两个腋芽，然后进行正常流程进行培养，结果统计进表1-1

表1-1不同消毒处理之间效果分析

由表1-1得出，从成活率来看处理5的成活率最高为73.84％，是9个处理中成活率最高的一组，多重比较结果显示：处理5与其余各组之间差异显著；处理1的成活率为30.23％，是9个处理中成活率最低的一组，多重比较结果显示：处理1与其余各组差异显著；从污染率来看处理1的污染率最高为62.65％，是9个处理中污染率最高的，多重比较结果显示：处理9与其余各组之间差异显著；处理6的污染率为5.51％、处理7的污染率最低为6.67％、处理9的成活率为7.85％，多重比较结果显示：处理6、7、9之间差异不显著；整体来看9个处理中污染率呈下降趋势；从死亡率来看，处理9的死亡率最高为40.75％，多重比较结果显示：处理9月其余各组之间差异显著，处理2的死亡率为5.16％，是9个处理中死亡率最低的处理、处理1的死亡率为5.87％、处理4的死亡率为4.84％，多重比较结果显示：这三个处理之间差异不显著。

从整体来看伴随着乙醇消毒时间和HgCl2消毒时间的增加，成活率先逐步上升，而后下降；污染率呈逐步下降；死亡率呈逐步上升趋势，可以看出：随着时间的增加，对于污染率的控制效果明显，但是对于成活率来说，过长时间的消毒，使得离体组织的细胞活性受到了损伤，从而使成活率从处理5之后逐步降低，而死亡率从处理5之后逐步升高。

综上所述，结合成活率、污染率、死亡率选择成活率较高的处理5最为铁线莲外植体消毒的最佳方案，即处理5：75％的乙醇中浸泡3s，HgCl2中浸泡5min。

由表1-2不同因子水平的极差分析，我们可以看出在成活率方面极差分析表明：A因子的平均值(K1-K3)的变化为134.49-162.92逐步增大，可以看出随着A因子水平值的增高，对于成活率的影响也逐步增大，B因子的平均值(K1-K3)的变化为126.75-161.20逐步增大，可以看出随着B因子水平值的增高，对于成活率的影响也逐步增大。

而在污染率方面极差分析表明：A因子的平均值(K1-K3)的变化为94.35-25.05，可以看出随着A因子水平值的增高，对于污染率的影响也逐步减小，B因子的平均值(K1-K3)的变化为121.06-29.82，可以看出随着B因子水平值的增高，对于污染率的影响逐步减小。

在死亡率方面A因子的平均值(K1-K3)的变化为24.34-95.67，可以看出随着A因子水平值的增高，对于死亡率的影响也逐步增大，B因子的水平平均值(K1-K3)的变化为38.39-64.63，可以看出随着B因子值的增高，对于污染率的影响逐步增大。

表1-2不同因子水平的极差分析

试验通过对不同因子水平的极差分析，从表1-3可以看出不同因子(A、B)对铁线莲外植体存活的污染率、存活率、死亡率有着不同程度的影响，可以看出在存活率方面，A因素的极差值(R值)为15.28，B因素的极差值(R值)为20.51，这表明B因素对于成活率的影响程度高于A因素；在污染率方面，因素A的极差值(R值)为23.1，B因素的极差值(R值)为30.41，这表明在污染率方面B因素的影响程度高于A因素；在死亡率方面，因素A的极差值(R值)为23.78，B因素的极差值(R值)为8.78，这表明B因素对于污染率的影响程度高于A因素。

同时通过对各因素极差值的分析，得出优处理，其中成活率的优处理为A3B3(乙醇5s+HgCl28min)，这表明在乙醇和HgCl2消毒时间在水平时，可以有效的进行消毒；污染率的优处理为A3B3(乙醇5s+HgCl28min)，这说明乙醇和HgCl2消毒时间的延长有助于降低污染率，可以将污染率控制在一个合理的数值内，死亡率的优处理为A1B1(乙醇0s+HgCl23min)，这表明乙醇和HgCl2结合的消毒时间较小时，可以减少对接种材料组织损害；但是外植体的消毒不能单一的从某一个指标去考虑其结果，必须结合各方面的因素去考虑。综上所述，从成活率、污染率、死亡率三方面去考虑最佳的消毒处理，最终的外植体消毒最佳处理为：75％乙醇3s+0.1％HgCl25min。

1-3不同因子水平的极差分析

实施例2

不同培养基对腋芽的诱导效果实验：

试验以常用的MS、WPM、White、B5四种培养基为基本培养基质，将经过消毒处理后的嫩茎接种于附加有1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA四种培养基上，茎段长度保持在1.5cm左右，每个茎段带有2个腋芽，平放于培养基上，先暗培养5d，然后转入光培养阶段，实验共4个处理组，每处理组15瓶，每瓶接种2个，每处理组重复3次。30d后统计外植体腋芽诱导率，统计平均苗高以及萌芽率如表2-1所示

表2-1不同基质中外植体诱导结果

从表2-1实验结果来看，不同的培养基上的萌芽率、苗均高、萌芽长势存在着明显的差异，四种培养基上的萌芽率分别为84.32％、46.61％、31.67％、35.67％，多重比较结果显示：处理1、处理2与各组之间均差异显著，处理3与处理4之间差异不显著。从苗均高来看，多重比较结果显示：处理1苗高为2.53cm，处理2苗高为1.86cm，处理1与处理2之间差异不显著，处理3苗高为0.90cm，处理4苗高为1.08cm，处理3与处理4之间差异显著。从萌芽长势来看，MS培养基上的外植体萌芽较快，叶片舒张较好，叶色鲜绿；WPM、B5培养基上萌芽短而细小、叶尖或茎段部分呈淡黄色；White培养基上的萌芽茎节短小，叶色失率，长势差。综上所述：选择MS培养基为铁线莲组织培养的最佳培养基。

试验通过对不同培养基质对外植体诱导效果的方差分析，表2-2结果表明：不同培养基质对成活率的影响差异显著(P＝0.003<0.05)；不同培养基质在苗高方面差异显著(P＝0.043<0.05)。

表2-2不同培养基质上外植体诱导的方差分析

实施例3

6-BA+NAA对铁线莲增殖培养的影响实验

在培养基中分别添加不同浓度的6-BA分裂素和NAA生长素，将茎段平放于培养基上，先暗培养5d，然后转入光培养30d；实验共设9个处理组，每个处理组2瓶，每瓶接种4株，每组重复3次，30d后统计增殖系数和幼苗长势统计进表3-1

表3-1 6-BA与NAA处理对铁线莲增殖培养的影响

从表3-1来看，不同浓度的6-BA和NAA结合对铁线莲的增殖培养有着显著影响，多重比较结果显示：处理1-5的增殖系数在0.64-0.74之间，多重比较结果显示：这五个处理之间差异不显著，处理6-10的增殖系数在1.67-1.65之间，多重比较结果显示：这五个处理之间同样差异不显著；处理11-15的增殖系数在3.06-3.74之间，多重比较结果显示：这五个处理之间同样差异不显著；处理16-20的增殖系数在4.13-4.14之间，多重比较结果显示：这五个处理之间同样差异不显著；处理21-25的增殖系数在3.95-3.36之间，多重比较结果显示：这五个处理之间同样差异不显著；这表明各处理之间随着6-BA浓度的增加，表现为同一6-BA浓度水平下的各处理之间差异不显著；同时在这25处理中，增殖系数呈现一个先上升后下降的趋势，其中处理17的增殖系数最高为4.28，同时也观察到在NAA浓度为0.0mg/L时，处理1、6、11、16、21幼苗虽然没有愈伤形成，但生长缓慢，苗高较矮；随着NAA浓度的增加，苗高也出逐步增长，但随着NAA浓度的过量会伴随着绿色愈伤的形成，过量的愈伤会影响幼苗的正常生长，通过试验发现将NAA浓度保持在0.05mg/L时处于一个合理的水平。

综合增殖系数及幼苗长势，选择处理17作为最佳增殖培养方案，即：MS+2.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA。

实施例4

TDZ+NAA对铁线莲增殖培养的影响实验

在培养基中分别添加不同浓度的TDZ分裂素和NAA生长素，将茎段平放于培养基上，先暗培养5d，然后转入光培养30d；实验共设9个处理组，每个处理组2瓶，每瓶接种4株，每组重复3次，30d后统计增殖系数和幼苗长势统计进表4-1

表4-1 TDZ与NAA处理对铁线莲增殖培养的影响

结合表4-1来看，处理17的增殖系数最高为4.84，多重比较结果显示：处理11、处理12、处理13、处理14、处理15、处理16、处理17、处理18、处理19、处理20这10个处理之间差异不显著；处理1的增殖系数最小为1.65，多重比较结果显示：处理1、处理2、处理3、处理4、处理5这5个处理之间差异不显著，从长势来看处理1、处理6、处理11、处理16、处理21，这五个处理中没有愈伤形成，这可能是NAA浓度为0.0mg/L的原因，其余各处理愈伤随着NAA浓度的增加明显增多，说明NAA对于愈伤的形成有着明显的影响；从长势来看，幼苗叶片会出现黄花现象，多表现为叶片和叶尖干枯。从表中可以看出TDZ对于铁线莲增殖培养的影响比较明显，随着TDZ浓度的生高，增殖系数从1.65逐步提高到处理17的4.84，然后逐步降低到3.31，可以看出过高的TDZ反而会移至增殖培养的效果，当TDZ浓度在0.05mg/L以上时，幼苗会出现玻璃化现象，表现为茎部通透明亮，泛黄，影响后期的增殖效果。

综合增殖系数及幼苗长势，选择处理17作为最佳增殖培养方案，即：MS+TDZ0.04mg/L+0.05mg/L NAA。

实施例5

不同生长素对生根培养的影响对比实验

选用1/2MS为基本培养基，并在其中加入生长素和活性炭(AC)；将S4中增殖培养的嫩茎转移接种至S5培养基中进行生根培养30d；生长素为NAA、IBA中的一种或两种，其中NAA浓度为0.3-1.0mg/L，IBA浓度为0.2-0.8mg/L；活性炭(AC)浓度为0.00-0.50mg/L；实验共设9个处理组，每个处理组2瓶，每瓶接种4株，每组重复3次，30d后统计生根率和生根情况统计进表5-1

表5-1不同生长素对生根的影响

由表5-1可以看出，处理4的生根率最高为39.24％，多重比较结果显示：处理4与其余处理之间差异显著；当IBA浓度在0.8mg/L时，处理3、处理7、处理8、处理9的生根率均为0.00％，可以看出在这一水平下IBA和NAA配比均不能促进生根，从生根情况来看，铁线莲的生根效果整体偏低，其中处理5、处理6在根基不出现愈伤，这对于后期的移栽炼苗是不利的；

综上所述，选择处理组4作为生根的最佳方案，1/2MS培养基中添加0.5mg/L IBA和0.3mg/L NAA，生根率为39.24％。

实施例6

不同栽培基质对移栽炼苗效果的对比实验

选取已经生根的组培苗，将其放在自然光下生长，在瓶内炼苗达到20d之后，将瓶口打开一半，使瓶内外空气对流持续3-5d；之后用流水将附着于根上的培养基冲洗干净，并用多菌灵进行消毒泡洗5min，然后将消毒后的组培苗移至阴凉环境晾干表面水分；将处理好的组培苗栽入土壤的基质中，放入温室拱棚，湿度保持在75-85％，温度保持在15-20℃；根据日照情况搭盖遮阴网，20d后逐渐开棚通风，每5d喷一次营养液；实验共设计6组不同的栽培基质，并在30d后统计成活率和生长情况如表6-1

表6-1不同基质中移栽效果比较

从表6-1来看，多重比较结果显示：不同的移栽基质中成活率之间存在着显著差异，处理6的成活率最高为58.12％，与其余各组成活率之间差异显著，处理2的成活率为12.35％，处理3的成活率为6.54％，多重比较结果显示：二者之间差异不显著；处理1、处理4、处理5的成活率为0.00％，多重比较结果显示：三者之间差异不显著。综上所述，应选择处理6最为移栽炼苗基质，即红土：腐殖土：蛭石＝1:2:2，成活率在58.12％。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims

1.一种铁线莲组织培育快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3：外植体消毒：将S2中处理好的茎段，用75%的乙醇溶液处理0-5s，之后用无菌水冲洗两次，每次持续2min；然后用HgCl₂浸泡3-8min，之后用无菌水冲洗2-3次，每次持续2min；将消毒后的茎段切去两端及叶柄处多余的部分，长度保持在1.5-2cm，每个茎段带有两个腋芽；

S4：增殖培养：以MS为基本培养基，使用6-BA和NAA进行培养，浓度为6-BA 2.0mg/L，NAA0.05mg/L；或以MS为基本培养基，使用TDZ和NAA进行培养，浓度为TDZ 0.04mg/L，NAA0.05mg/L；将茎段平放于培养基上，先暗培养5d，然后转入光培养30d；

S5：生根培养：选用1/2MS为基本培养基，并在其中加入NAA、IBA和活性炭，其中NAA浓度为0.3mg/L，IBA浓度为0.5mg/L，活性炭浓度为0.3mg/L；将S4中增殖培养的嫩茎转移接种至S5培养基中进行生根培养30d；

S7：组培苗移栽：将S6中处理好的组培苗栽入土壤基质中，放入温室拱棚，湿度保持在75-85%，温度保持在15-20℃；

所述S7中的土壤基质为红土:腐殖土:蛭石=1:2:2。

2.根据权利要求1所述一种铁线莲组织培育快速繁殖方法，其特征在于，所述S7中根据日照情况搭盖遮阴网，20d后逐渐开棚通风，每5d喷一次营养液。