CN113181431B - 形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层及在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层及在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，该方法包括：(1)将基材浸泡于粘附剂中；(2)将步骤(1)获得的基材浸泡于阳离子材料溶液中；(3)将步骤(2)获得的基材浸泡于硫化铜纳米颗粒溶液中；(4)重复步骤(2)和(3)至少两次。该涂层不仅与基材牢固结合、时效持久，而且硫化铜纳米颗粒在近红外光照射下能够被激活而杀灭细菌，达到治疗种植体周围炎的效果，且杀菌效果智能可控、即时性强；硫化铜纳米颗粒能够释放二价铜离子，活化血管内皮生长因子(VEGF)，进而促进种植体周围组织血管、新生骨形成，加强内固定稳定性。

Description

形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层及在基材表面制备抗菌 及骨整合涂层的方法

技术领域

本发明属于骨科生物医学材料技术领域，特别涉及一种形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层及在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法。

背景技术

种植体感染约占医院获得性感染总数的45％，是一个重大的临床挑战。植入物引起的感染主要原因是细菌在其表面的粘附和定植，进而形成生物被膜。一旦种植体表面形成生物膜，最终会由于持续炎症和周围组织坏死导致种植体失败。

由于生物膜内的微生物能够抵抗宿主的免疫攻击，且对抗生素的敏感性较低，因此生物膜的清除在临床上尤其具有挑战性。目前手术切除感染植入物仍被认为是护理的标准，但其明显延长了患者住院时间，大大增加了医疗费用。为了规避手术切除途径不可避免的障碍，各种种植体表面修饰策略已被开发出来，以对抗细菌引起的感染。

种植体表面修饰是对种植体表面进行抗菌改性，以减少细菌黏附、抑制菌斑生物膜形成，从而预防种植术后初期感染。虽然这种策略在抗菌治疗方面取得了显著的成功，但目前设置在种植体表面的抗菌涂层多为传统抗菌剂，而传统抗菌剂相对较长的杀菌时间和潜在的细菌耐药性在很大程度上阻碍了它们在临床实践中的广泛应用；而且目前种植体表面抗菌涂层仍存在结构稳定性、可控性、时效性不理想等缺陷。

近来，光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)由于具有耐细菌、微创、深层组织穿透和即时治疗效果等优点，而在治疗种植体感染中受到了广泛关注。

如公开号为CN111646495A的中国发明专利申请公开了一种双光响应型氧化锌及其制备方法以及具有抗菌成骨性的光敏涂层，该技术先将可溶性锌盐、六亚甲基四胺和水混合进行第一水热反应，然后将反应料液和柠檬酸钠、羟丙基甲基纤维素、光热转换材料以及木质素混合进行第二水热反应，得到水热产物；而后将将所述的水热产物依次进行冷冻干燥和微波辐照，得到双光响应型氧化锌；最后将该双光响应型氧化锌分散于溶剂中，将所得的溶液涂覆于基材表面，干燥后得到具有抗菌成骨性的光敏涂层。

然而该双光响应型氧化锌涂层仅是简单涂覆到钛基材表面，结构稳定性差，时效短，且抗菌性能和骨整合性能仍不理想。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层及在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层不仅结构稳定，而且抗菌性能和骨整合性能均十分优异，时效性长。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将基材浸泡于粘附剂中；

(2)将步骤(1)获得的基材浸泡于阳离子材料溶液中；

(3)将步骤(2)获得的基材浸泡于硫化铜纳米颗粒溶液中；

(4)重复步骤(2)和(3)至少五次。

本发明先将基材浸泡于粘附剂中，以使粘附剂结合到基材表面形成粘附层；而后将带粘附层的基材浸泡于阳离子材料溶液中，阳离子材料也能够紧密粘附到粘附层上；而带负电荷的硫化铜纳米颗粒则通过正负电吸附作用吸附到带正电荷的阳离子材料上，重复步骤(2)和(3)，则阳离子材料和硫化铜纳米颗粒能够层层自组装形成稳定牢固的硫化铜纳米颗粒涂层。

该硫化铜纳米颗粒涂层不仅与基材牢固结合、时效持久，而且硫化铜纳米颗粒为光响应型材料，在近红外光照射下能够被激活而杀灭细菌，达到治疗种植体周围感染的效果，且杀菌效果智能可控、即时性强。不仅如此，硫化铜纳米颗粒能够释放二价铜离子，二价铜离子能够活化血管内皮生长因子(VEGF)，进而促进种植体周围组织血管形成，促进种植体周围的新生骨形成，加强内固定稳定性。

作为优选，上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法还包括步骤(5)：

(5)将步骤(4)获得的基材浸泡于还原态氧化石墨烯溶液中，获得形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层。

还原态氧化石墨烯会通过静电吸附作用结合到硫化铜纳米颗粒涂层上，二者之间牢固结合、时效持久。

还原态氧化石墨烯也是光响应型材料，在近红外光照射下也能够被激活而杀灭细菌，从而与硫化铜纳米颗粒协同达到治疗种植体周围感染的效果，且杀菌效果智能可控、即时性强。不仅如此还原态氧化石墨烯能够招募骨髓间充质干细胞使其大量聚集在种植体周围，而骨髓间充质干细胞能够进一步分化为成骨细胞，从而与硫化铜纳米颗粒共同实现种植体的血管化及骨整合，进一步加强内固定稳定性。

作为优选，在上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法中，步骤(5)中，所述的还原态氧化石墨烯为聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯。聚多巴胺修饰不仅能够将氧化石墨烯还原成还原态氧化石墨烯，降低石墨烯的毒性，提高石墨烯的生物相容性，而且连接到还原态氧化石墨烯上的聚多巴胺还能强粘附硫化铜纳米颗粒涂层表面的阳离子材料，使还原态氧化石墨烯牢固结合到硫化铜纳米颗粒涂层表面。

作为优选，在上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法中，步骤(1)中，所述的粘附剂为多巴胺。多巴胺能够在基材表面自发沉淀一层聚多巴胺涂层，该聚多巴胺涂层不仅与基材之间、与阳离子材料之间均具有十分牢固的结合力，而且聚多巴胺涂层对阳离子材料具有强力的吸附作用(类似于贻贝的吸附效果)，能够将后续的硫化铜纳米颗粒涂层和还原态氧化石墨烯层牢牢地吸附在基材表面。

作为优选，在上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法中，步骤(2)中，所述的阳离子材料为壳聚糖或脂质体。

作为优选，在上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法中，步骤(3)中，以牛血清白蛋白、人血清白蛋白或鸡卵清蛋白为模板，原位合成所述的硫化铜纳米颗粒。利用蛋白作为生物模板来合成硫化铜纳米颗粒时，反应条件温和、简便，全程无有机溶剂参与，是一种绿色合成方法。

作为优选，在上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法中，步骤(4)中，重复步骤(2)和(3)至少八次。即硫化铜纳米颗粒涂层中硫化铜纳米颗粒层有至少八层，硫化铜纳米颗粒层的层数越多，则抗菌及骨整合性能越强。

作为优选，在上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法中，步骤(1)中，先对基材作阳极氧化处理，使基材表面形成纳米管状结构；而后再将基材浸泡于粘附剂中。纳米管状结构能够增加基材的表面积，进一步增强基材与粘附层之间的结合力。

作为优选，上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法包括以下步骤：

(1)将基材洗净、晾干后浸入电解液中，于15-25V下阳极氧化45-90min后超声洗涤基材以除去电解液；而后将基材置于聚多巴胺溶液中，于37℃下浸泡10-15h；

(2)将步骤(1)获得的基材置入壳聚糖溶液中，于37℃下浸泡15-60min；

(3)将步骤(2)获得的基材置于硫化铜纳米颗粒溶液浸泡15-60min；

所述的硫化铜纳米颗粒溶液的制备方法为：将牛血清白蛋白溶解于双蒸水中，获得白蛋白溶液；在磁搅拌下向所述的白蛋白溶液中加入二价铜离子盐，获得蓝色混合物，二价铜离子与牛血清白蛋白的质量比为(32-625)：1；迅速向该蓝色混合物中加入碱，获得紫色混合物，碱与二价铜离子的摩尔比为(5-2)：1；向该紫色混合物中加入硫化钠溶液，获得砖红色混合物，二价铜离子与硫化钠的摩尔比为(1-2)：1；将该砖红色混合物置于90℃下反应15-60min，将反应物透析、过滤，获得硫化铜纳米颗粒溶液；

(4)重复步骤(2)和(3)至少十次；

(5)将步骤(4)获得的基材置入还原态氧化石墨烯溶液中，于37℃下浸泡20-30h；

所述的还原态氧化石墨烯溶液的制备方法为：先将氧化石墨烯粉末置于Tris-HCl溶液中超声分散，而后加入盐酸多巴胺，于冰浴及超声条件下反应，获得反应混合物，氧化石墨烯与盐酸多巴胺的质量比为(2-1)：1；将反应混合物置于室温下搅拌10-20h后过滤，获得聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯；将聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯洗净、分散，并置于纯水中透析、干燥，将干燥后的聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯分散于双蒸水中，获得所述的还原态氧化石墨烯溶液。

本发明还提供了一种形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层，该涂层即采用上述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法制备而成。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明中，不仅阳离子材料和硫化铜纳米颗粒能够层层自组装形成稳定牢固的硫化铜纳米颗粒涂层，而且硫化铜纳米颗粒涂层还能够通过粘附层与基材牢固结合，不仅结构稳定、时效持久，而且硫化铜纳米颗粒为光响应型材料，在近红外光照射下能够被激活而杀灭细菌，达到治疗种植体周围感染的效果，且杀菌效果智能可控、即时性强。不仅如此，硫化铜纳米颗粒能够释放二价铜离子，二价铜离子能够活化血管内皮生长因子(VEGF)，进而促进种植体周围组织血管形成，促进种植体周围的新生骨形成，加强内固定稳定性。

(2)本发明中，抗菌及骨整合涂层还包括设置在硫化铜纳米颗粒涂层外的还原态氧化石墨烯层，还原态氧化石墨烯会通过静电吸附作用结合到硫化铜纳米颗粒涂层上，二者之间也能够牢固结合，尤其是当还原态氧化石墨烯上修饰有聚多巴胺时，聚多巴胺的强粘附作用还能够进一步增强二者之间的结合力。还原态氧化石墨烯也是光响应型材料，在近红外光照射下也能够被激活而杀灭细菌，从而与硫化铜纳米颗粒协同达到治疗种植体周围感染的效果，且杀菌效果智能可控、即时性强。不仅如此还原态氧化石墨烯能够招募骨髓间充质干细胞使其大量聚集在种植体周围，而骨髓间充质干细胞能够进一步分化为成骨细胞，从而与硫化铜纳米颗粒共同实现种植体的血管化及骨整合，进一步加强内固定稳定性。

附图说明

图1为本发明形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层的结构示意图；

其中，a表示基材，b表示二氧化钛纳米管状层，c表示硫化铜纳米颗粒涂层，d表示还原态氧化石墨烯层；n＝10表示硫化铜纳米颗粒涂层的层数为10层，下同；

图2为采用扫描电镜观察本发明形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层获得的表面形貌图；

图3为本发明形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层EDS分析结果图；

图4为本发明形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层XPS分析结果图；

图中，Binding energy(ev)表示结合能(电子伏特)，Intensify(a.u.)表示强度(任意单位)，下同；

图5为材料表面于体外细菌培养后洗脱液检测结果图；

其中，实验组①表示具有本发明抗菌及骨整合涂层的钛片(或钛棒)材料，空白对照组表示未作任何表面修饰的钛片(或钛棒)材料；下同；

图6为材料表面于体外细菌培养后洗脱液中细菌计数结果图；

其中，TNT表示未作任何表面修饰的钛片(或钛棒)材料，Cus@BSA/rGO-PDA表示具有本发明抗菌及骨整合涂层的钛片(或钛棒)材料，Without NIR表示无近红外光照射，NIR表示近红外光照射，Number of bacteria(*10³)表示细菌数量(*10³)；下同；

图7为带菌材料植入体内后的抗菌性能检测结果图；

图8为带菌材料植入体内后再次取出洗脱液中细菌计数结果图；

图9为材料体内促进骨整合的micro CT结果图；

图10为本发明实施例2形成于基材表面的硫化铜纳米颗粒涂层的结构示意图；

图11为采用扫描电镜观察实施例2形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层获得的表面形貌图；

图12为本发明实施例2形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层XPS分析结果图；

图13为材料表面于体外细菌培养后洗脱液检测结果图；

其中，实验组①表示具有抗菌及骨整合涂层的钛片(或钛棒)材料；实验组②表示具有硫化铜纳米颗粒涂层的钛片(或钛棒)材料；下同；

图14为材料表面于体外细菌培养后洗脱液中细菌计数结果图；

其中，CUS@BSA表示具有硫化铜纳米颗粒涂层的钛片(或钛棒)材料，Cus@BSA/rGO-PDA表示具有本发明抗菌及骨整合涂层的钛片(或钛棒)材料，Without NIR表示无近红外光照射，NIR表示近红外光照射，Number of bacteria(*10³)表示细菌数量(*10³)；下同；

图15为带菌材料植入体内后的抗菌性能检测结果图；

图16为带菌材料植入体内后再次取出洗脱液中细菌计数结果图；

图17为材料体内促进骨整合的micro CT结果图；

其中，New Bone表示材料植入后在材料周围形成的新生骨。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1

本实施例一种在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，包括以下步骤：

(1)将基材浸泡于粘附剂中；

本实施例分别选用边长为8mm、厚为0.5mm的方形钛片以及长为1cm、直径为0.5mm的钛棒作为基材，先用#400、#800、#1000SiC砂纸逐级打磨抛光，然后用溶剂丙酮、无水乙醇和双蒸水依次超声清洗20min，晾干备用；

而后将洗净的钛片(或钛棒)和铂箔作为正负电极，浸入含有0.27M NH₄F的甘油/水(v/v＝1:1)混合电解质中，将电压调至20V，对钛片(或钛棒)进行阳极氧化60min以在钛片(或钛棒)表面形成二氧化钛纳米管状层，处理后的钛片(或钛棒)用蒸馏水超声洗涤2min，以去除电解液残留，备用；

将经阳极氧化处理的钛片(或钛棒)置于2mg/ml的聚多巴胺溶液(100mg的聚多巴胺溶解在50ml的10mM、pH为8.5的Tris缓冲液中)中浸泡12h以在钛片(或钛棒)表面形成聚多巴胺涂层；反应完成后用去离子水清洗钛片(或钛棒)，以去除未结合的多巴胺分子；

(2)将步骤(1)获得的基材浸泡于阳离子材料溶液中；

具体地，将步骤(1)获得的钛片(或钛棒)置于壳聚糖溶液中，在37℃下反应1h，通过聚多巴胺涂层的吸附能力吸附壳聚糖分子，然后用去离子水去除未结合的壳聚糖分子；

(3)将步骤(2)获得的基材浸泡于含硫化铜纳米颗粒的溶液中；

具体地，将步骤(2)获得的钛片(或钛棒)浸泡于硫化铜纳米颗粒溶液中反应1h，通过静电吸附作用结合硫化铜纳米颗粒，然后用去离子水清洗去除未结合的硫化铜纳米颗粒；

其中，硫化铜纳米颗粒溶液的制备方法为：将250mg牛血清白蛋白溶解于7.5mlddH₂O中，获得白蛋白溶液；在磁搅拌下向该白蛋白溶液中加入1ml 0.2M的Cu(NO3)₂溶液，得到蓝色混合物；迅速向该蓝色混合物中加入0.5mL 1M NaOH后，混合物变为紫色；再向该紫色混合物中加入2ml 0.2M Na₂S溶液，溶液颜色立即变为砖红色；继续在90℃下反应0.5h，颜色变为深绿色，表示生成了CuS@BSA纳米颗粒，进而透析，过滤得到CuS@BSA纳米颗粒溶液；

(4)重复步骤(2)和(3)10次；

具体地，将钛片(或钛棒)在壳聚糖溶液和硫化铜纳米颗粒溶液中按顺序浸泡，每次泡完用PBS缓冲液浸泡，清洗，重复10个循环；由于壳聚糖带正电荷，硫化铜纳米颗粒带负电荷，因此壳聚糖和硫化铜纳米颗粒能够通过层层自组装技术在钛片(或钛棒)上修饰形成硫化铜纳米颗粒涂层；

(5)将步骤(4)获得的基材浸泡于还原态氧化石墨烯溶液中，由此在基材表面获得所述的抗菌及骨整合表面涂层；

将步骤(4)获得的钛片(或钛棒)置入还原态氧化石墨烯溶液中在37℃下浸泡反应24h以形成还原态氧化石墨烯层，反应完成后将钛片(或钛棒)取出、晾干，即得形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层；

其中，该还原态氧化石墨烯溶液的制备方法为：

将氧化石墨烯粉末(100mg)分散在200mL 10mM Tris-HCl溶液(pH 8.5)中，超声作用5h，获得还原态氧化石墨烯溶液(rGO)；然后向该还原态氧化石墨烯溶液中加入50mg盐酸多巴胺，冰浴超声分散15min；而后将反应混合物在室温下600rpm搅拌12h，过滤，获得聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯(PDA-rGO)；将PDA-rGO洗净、分散，并置于纯水中透析72h，将获得的黑色粉末采用冻干法干燥，而后分散于去离子水中，即获得上述还原态氧化石墨烯溶液。

该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层的结构如图1所示，图中，a表示基材，b表示二氧化钛纳米管状层，c表示硫化铜纳米颗粒涂层，d表示还原态氧化石墨烯层。

对该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层进行扫描电镜观察，其表面形貌如图2所示，EDS分析结果如图3所示，XPS分析结果如图4所示。

由图3和图4可以看出，钛片(或钛棒)表面已修饰有硫化铜纳米颗粒和还原态氧化石墨烯。

为验证该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层在体外的光响应抗菌性能，将本实施例制备的具有该抗菌及骨整合涂层的钛片(或钛棒)作为实验组①，将未作任何表面修饰的钛片(或钛棒)作为空白对照组，实验组①和空白对照组分别设置两个；将100μl的金黄色葡萄球菌的菌悬液(10⁶CFU ml^-1)，分别接种到实验组①和空白对照组的样品上，其中一个实验组①和一个空白对照组的样品在接种后先采用808nm NIR辐照10min，而后37℃孵育3h，另一实验组①和另一空白对照组的样品在接种后不予NIR辐照，直接37℃孵育3h。孵育结束后，将用等量生理盐水冲洗各样品，并应用平板法对各样品的杀菌能力进行了评价，检测结果见图5和图6。

由图5和图6可见，与空白对照组相比，实验组①在近红外光照射后杀菌能力提高了40倍。

进一步地，为验证该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层在体内的光响应抗菌性能，将本实施例制备的具有该抗菌及骨整合涂层的钛棒作为实验组①，将未作任何表面修饰的钛棒作为空白对照组，将上述的钛棒浸泡在金黄色葡萄球菌的菌液中过夜，使其在钛棒表面形成一层菌膜。然后将SD大鼠随机分为四组，即：空白对照组，实验组①，空白对照组+近红外光组，实验组①+近红外光组；沿各组SD大鼠的胫骨外侧纵向切开10mm长的切口，然后在胫骨平台侧正中垂直于胫骨长轴钻一个圆柱形孔(直径1.6mm)，用生理盐水清洗骨腔后，向骨腔内植入钛棒，并仔细缝合伤口。

其中，空白对照组SD大鼠植入空白对照组钛棒(即含菌膜的未作任何表面修饰的钛棒)，实验组①SD大鼠植入实验组①的钛棒(即含菌膜的具有表面修饰的钛棒)，空白对照组+近红外光组SD大鼠则植入空白对照组钛棒，并在植入后的3天内每天予以1w的808nm近红外光照射10min，实验组①+近红外光组SD大鼠则植入实验组①的钛棒，并在植入后的3天内每天予以1w的808nm近红外光照射10min。1周后将各组植入物取出，用等量的生理盐水冲洗掉表面的细菌，并观察植入物的抗菌结果见图7和图8。

由图7和图8可见，具有抗菌及骨整合涂层的钛棒在植入SD大鼠体内并予以近红外光照射后，其在体内的杀菌能力高达99.9％，大鼠组织上未见明显的炎症反应，钛棒冲洗液呈清澈透明状。

为验证该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层的骨整合性能，将SD大鼠随机分成两组，即实验组①和空白对照组；将所有SD大鼠麻醉后，沿股骨外侧纵向切开15mm长切口使膝关节脱位，膝关节屈曲时，在股骨髁中心平行于股骨长轴处钻一个圆柱形孔(直径1.6mm)，用生理盐水清洗骨腔后，向实验组①SD大鼠的骨腔内植入本实施例制备的具有该抗菌及骨整合涂层的钛棒，向空白对照组SD大鼠的骨腔内植入未作任何表面修饰的钛棒，然后仔细闭合伤口。2个月后将大鼠安乐死，收获股骨标本，通过micro-CT检测成骨效果，结果见图9。

由图9可见，实验组①的钛棒周围相较于空白对照组的钛棒周围形成更多更致密的新生骨，实验组①的新生骨增量是空白对照组的2.5倍。

实施例2

本实施例一种在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，与实施例1基本相同，不同之处仅在于不包括步骤(5)。

该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层的结构如图10所示，图中，a表示基材，b表示二氧化钛纳米管状层，c表示硫化铜纳米颗粒涂层。

对该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层进行扫描电镜观察，其表面形貌如图11所示，XPS分析结果如图12所示。

由图11和图12可以看出，钛片(或钛棒)表面已修饰有硫化铜纳米颗粒。

将实施例1制备的具有抗菌及骨整合涂层的钛片(或钛棒)作为实验组①，将实施例2制备的具有硫化铜纳米颗粒涂层的钛片(或钛棒)作为实验组②，采用与实施例1记载相同的方法对该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层的体外光响应抗菌性能、体内光响应抗菌性能和骨整合性能进行检测。

如图13和图14所示，实验组①与实验组②的体外杀菌效果相似，提示硫化铜纳米颗粒为主要的杀菌物质。

如图15和图16所示，实验组①与实验组②的体内抗菌性能均十分明显，各大鼠组织上均未见明显的炎症反应，钛棒冲洗液均呈清澈透明状；但实验组①的体内抗菌效果更强，说明实验组①中，硫化铜纳米颗粒与还原态氧化石墨烯之间具有协同抗菌作用。

如图17所示，实验组①的钛棒周围相较于实验组②的钛棒周围形成了更多更致密的新生骨，实验组①的新生骨增量约为空白对照组的0.8倍。

实施例3

本实施例一种在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，与实施例1基本相同，不同之处仅在于：步骤(4)中，重复步骤(2)和步骤(3)5或8或12次。

以未作任何表面修饰的钛片(或钛棒)作为对照，分别对具有不同组装层数的硫化铜纳米颗粒涂层的钛片(或钛棒)进行抗菌性能和骨整合性能的测试，测试结果如表1所示。

表1

由表1可见，随硫化铜纳米颗粒层的层数增加，抗菌及骨整合涂层的抗菌性能和骨整合性能均不断提升。

对比例1

本对比例一种在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，包括以下步骤：

(1)将基材浸泡于粘附剂中；

本实施例分别选用边长为8mm、厚为0.5mm的方形钛片以及长为1cm、直径为0.5mm的钛棒作为基材，先用#400、#800、#1000SiC砂纸逐级打磨抛光，然后用溶剂丙酮、无水乙醇和双蒸水依次超声清洗20min，晾干备用；

而后将洗净的钛片(或钛棒)和铂箔作为正负电极，浸入含有0.27M NH₄F的甘油/水(v/v＝1:1)混合电解质中，将电压调至20V，对钛片(或钛棒)进行阳极氧化60min以在钛片(或钛棒)表面形成二氧化钛纳米管状层，处理后的钛片(或钛棒)用蒸馏水超声洗涤2min，以去除电解液残留，备用；

将经阳极氧化处理的钛片(或钛棒)置于2mg/ml的聚多巴胺溶液(100mg的聚多巴胺溶解在50ml的10mM、pH为8.5的Tris缓冲液中)中浸泡12h以在钛片(或钛棒)表面形成聚多巴胺涂层；反应完成后用去离子水清洗钛片(或钛棒)，以去除未结合的多巴胺分子；

(2)将步骤(1)获得的基材浸泡于阳离子材料溶液中；

具体地，将步骤(1)获得的钛片(或钛棒)置于壳聚糖溶液中，在37℃下反应1h，通过聚多巴胺涂层的吸附能力吸附壳聚糖分子，然后用去离子水去除未结合的壳聚糖分子；

(3)将步骤(2)获得的基材浸泡于还原态氧化石墨烯溶液中，由此在基材表面获得所述的抗菌及骨整合表面涂层；

将步骤(2)获得的钛片(或钛棒)置入还原态氧化石墨烯溶液中在37℃下浸泡反应24h以形成还原态氧化石墨烯层，反应完成后将钛片(或钛棒)取出、晾干，即得形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层；

其中，该还原态氧化石墨烯溶液的制备方法为：

将氧化石墨烯粉末(100mg)分散在200mL 10mM Tris-HCl溶液(pH 8.5)中，超声作用5h，获得还原态氧化石墨烯溶液(rGO)；然后向该还原态氧化石墨烯溶液中加入50mg盐酸多巴胺，冰浴超声分散15min；而后将反应混合物在室温下600rpm搅拌12h，过滤，获得聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯(PDA-rGO)；将PDA-rGO洗净、分散，并置于纯水中透析72h，将获得的黑色粉末采用冻干法干燥，而后分散于去离子水中，即获得上述还原态氧化石墨烯溶液。

该形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层的结构包括依次形成于基材表面的二氧化钛纳米管状层和还原态氧化石墨烯层。

以未作任何表面修饰的钛片(或钛棒)作空白对照，根据实施例1中记载的相同方法，比较具有抗菌及骨整合涂层的钛片(或钛棒)、具有硫化铜纳米颗粒涂层的钛片(或钛棒)和本对比例具有还原态氧化石墨烯层的钛片(或钛棒)的骨整合性能。

经测试，本对比例具有还原态氧化石墨烯层的钛片(或钛棒)的骨增量是空白对照组的1.5倍。表明，在抗菌及骨整合涂层中，还原态氧化石墨烯是主要的促成骨物质，且还原态氧化石墨烯与硫化铜纳米颗粒具有协同促成骨作用。

Claims (9)

1.一种在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将基材浸泡于粘附剂中；

(2)将步骤(1)获得的基材浸泡于阳离子材料溶液中；

(3)将步骤(2)获得的基材浸泡于硫化铜纳米颗粒溶液中；

(4)重复步骤(2)和(3)至少五次；

步骤(3)中，以牛血清白蛋白、人血清白蛋白或鸡卵清蛋白为模板，原位合成所述的硫化铜纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，还包括步骤(5)：

(5)将步骤(4)获得的基材浸泡于还原态氧化石墨烯溶液中，获得形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层。

3.如权利要求2所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的还原态氧化石墨烯为聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯。

4.如权利要求1所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的粘附剂为多巴胺。

5.如权利要求1所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的阳离子材料为壳聚糖或脂质体。

6.如权利要求1所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，步骤(4)中，重复步骤(2)和(3)至少八次。

7.如权利要求1所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，步骤(1)中，先对基材作阳极氧化处理，使基材表面形成纳米管状结构；而后再将基材浸泡于粘附剂中。

8.如权利要求1-7中任意一项所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将基材洗净、晾干后浸入电解液中，于15-25V下阳极氧化45-90min后超声洗涤基材以除去电解液；而后将基材置于聚多巴胺溶液中，于37℃下浸泡10-15h；

(2)将步骤(1)获得的基材置入壳聚糖溶液中，于37℃下浸泡15-60min；

(3)将步骤(2)获得的基材置于硫化铜纳米颗粒溶液浸泡15-60min；

所述的硫化铜纳米颗粒溶液的制备方法为：将牛血清白蛋白溶解于双蒸水中，获得白蛋白溶液；在磁搅拌下向所述的白蛋白溶液中加入二价铜离子盐，获得蓝色混合物，二价铜离子与牛血清白蛋白的质量比为(32-625)：1；迅速向该蓝色混合物中加入碱，获得紫色混合物，碱与二价铜离子的摩尔比为(5-2)：1；向该紫色混合物中加入硫化钠溶液，获得砖红色混合物，二价铜离子与硫化钠的摩尔比为(1-2)：1；将该砖红色混合物置于90℃下反应15-60min，将反应物透析、过滤，获得硫化铜纳米颗粒溶液；

(4)重复步骤(2)和(3)至少十次；

(5)将步骤(4)获得的基材置入还原态氧化石墨烯溶液中，于37℃下浸泡20-30h；

所述的还原态氧化石墨烯溶液的制备方法为：先将氧化石墨烯粉末置于Tris-HCl溶液中超声分散，而后加入盐酸多巴胺，于冰浴及超声条件下反应，获得反应混合物，氧化石墨烯与盐酸多巴胺的质量比为(2-1)：1；将反应混合物置于室温下搅拌10-20h后过滤，获得聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯；将聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯洗净、分散，并置于纯水中透析、干燥，将干燥后的聚多巴胺修饰的还原态氧化石墨烯分散于双蒸水中，获得所述的还原态氧化石墨烯溶液。

9.一种形成于基材表面的抗菌及骨整合涂层，其特征在于，采用如权利要求1-8中任意一项所述的在基材表面制备抗菌及骨整合涂层的方法制备而成。

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