CN113151343A

CN113151343A - 一种酿酒酵母表达长效重组人egf-hsa融合蛋白及其标准品的制备方法

Info

Publication number: CN113151343A
Application number: CN202110354980.5A
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 王梦; 夏兵兵; 刘家炉; 夏洁; 张勇; 蒋敏之
Original assignee: Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Current assignee: Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-04-01
Filing date: 2021-04-01
Publication date: 2021-07-23

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达长效重组人EGF‑HSA融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT‑MFα‑hEGF‑HSA的构建；(2)hEGF‑HSA融合蛋白工程菌的制备、转化；(3)INVSc1/pYES2/CT‑MFα‑hEGF‑HSA工程菌的诱导表达和纯化。同时还提供了一种酿酒酵母表达长效重组人EGF‑HSA融合蛋白标准品的制备方法。本发明利用酿酒酵母表达的长效重组人EGF与HSA融合而成的重组蛋白(hEGF‑HSA)，生产工艺简单、成本低、产物均一。

Description

一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法。

背景技术

人表皮生长因子(human epidermal growth factor，hEGF)自60年代初被发现以来，虽然研究历史不长，但其特殊的生物学效应和潜在的巨大经济效益，决定了它的广泛应用，它的发现于1986年获得诺贝尔生理学和医学奖。众多研究表明，EGF具有促进细胞的增殖和上皮再生的功能，因而被广泛用于促进外科手术伤口及其它创面的愈合、治疗多种角膜相关疾病、促进胃肠道黏膜溃疡愈合以及肿瘤治疗。1974年首次从人尿中提纯出人的表皮生长因子(hEGF)，其结构由53个氨基酸组成，分子量6045道尔顿，分子内有6个半胱氨酸组成的二硫键，EGF无糖基部位，非常稳定，耐热耐酸，广泛存在于体液和多种腺体中，主要由颌下腺、十二指肠合成，在人体的绝大多数体液中均已发现，在乳汁、尿液、精液中的含量特异性地增高，但在血清中的浓度较低。

hEGF广泛存在于人体的绝大多数体液中，但含量不高，传统的提取方法制备EGF造价高昂，达到每克上百万美元的售价，因而难以大量制备，临床应用受到了极大的限制。自80年代以来，利用基因工程技术制备的重组人表皮生长因子(hEGF)问世后随即被用于临床研究，并取得了很大的发展。很多医药企业已经将它们的产品从实验室转向市场，尤其是国外的一些医药公司。例如意大利的Zambon公司开发的一种EGF滴眼剂，可用于各种角膜疾病的治疗，促进角膜上皮的愈合，此制剂以Gentel的商品名在瑞士上市。美国的Chiron、Amgen和日本的住友、武田、日立等公司都在研制具有溃疡治疗作用的EGF，并先后进入了后期临床试验。EGF是一种多功能的生长因子，通过与其受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)结合，在体内体外都对多种组织细胞有诱导生长、迁移，促使分化基因表达的作用，从而发挥维持上皮细胞正常新陈代谢的作用。因此，EGF指标检测也更多的被用于喉癌(孙永柱等，1998)、肺癌(马路，2010；龚成香等，2013)和创新性骨折愈合(王磊孙俊英，2014)等临床诊断。

人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)是人体血液中的主要蛋白，由585个氨基酸构成，是人体循环系统内的含量最多的可溶性蛋白，在血液中的浓度为34～54g/L。HSA由肝脏合成，血清半衰期长，可达19天。HSA在调节血液渗透压、营养和促进伤口愈合等方面发挥重要作用，广泛用于肝硬化腹水、烧伤、休克等临床治疗。此外，HSA具有无免疫原性、人体相容性好、组织分布广和无酶活等特性，使其成为非常理想的重组蛋白融合载体。通过构建融合蛋白技术能够增加重组蛋白的分子量从而延长半衰期，有效的提高重组蛋白的稳定性。

对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，这些方法本身变异性较大。因此，标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。而天然EGF虽然广泛存在于人体的绝大多数体液中，但含量不高。传统的提取方法制备EGF造价高昂，达到每克上百万美元的售价，因而难以大量制备，临床应用受到了极大的限制。目前运用基因重组技术表达外源性EGF的工程菌有大肠杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、酿酒酵母和毕赤酵母。T.Oka等在大肠杆菌中分泌表达EGF，上清液中EGF浓度仅为1.026mg/L；H.Yamagata等在短芽孢杆菌表达EGF，其表达量约为260mg/L；汪洋等采用多拷贝筛选在毕赤酵母中表达pEGF，其上清中pEGF浓度为82mg/L；而D.N.Lee等在毕赤酵母中表达pEGF，其pEGF表达量达870mg/L；Q.C.K.Cheung等在乳酸杆菌中表达pEGF，其上清中pEGF表达量约为500μg/L。J.C.Pascall等在酿酒酵母中表达了少量的pEGF的融合蛋白，且未进一步研究融合蛋白的生物学活性。此外，虽然EGF能在毕赤酵母中高效诱导表达，但毕赤酵母诱导表达需要甲醇诱导，在生产应用中还需进一步加工脱毒处理；而Q.C.K.Cheung等在有益菌乳酸杆菌中诱导表达pEGF，但表达量过低(500μg/L)，对于大规模发酵生产意义不大。当前，尚未见将EGF基因在有益菌酿酒酵母中分泌表达的报道。

发明内容

为克服背景技术中的技术问题，本发明利用酿酒酵母表达的长效重组人EGF与HSA融合而成的重组蛋白(hEGF-HSA)，生产工艺简单、成本低、产物均一，建立了一种经济、高效、稳定表达的高浓度、高活性的长效重组人EGF标准品蛋白，为建立长效重组人EGF蛋白质量标准提供依据。

一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，包含以下步骤：

(1)酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的构建，具体包括：

人表皮生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pMD19-T-hEGF-HSA；

对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-hEGF-HSA进行双酶切，并分别切胶回收hEGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA；

(2)hEGF-HSA融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：

酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；

将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA；

(3)INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA工程菌的诱导表达和纯化，具体包括：

将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA，通过培养、诱导表达，再依次经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化，即得本发明酿酒酵母表达重组人EGF-HSA融合蛋白。

进一步的，步骤(1)中，人表皮生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pMD19-T-hEGF-HSA，具体步骤为：

根据pYES2/CT-MFα载体的性质(图1)和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计了重组人EGF-HSA基因序列和重组人EGF-HSA的氨基酸序列，重组人EGF-HSA基因序列如序列表1所示，重组人EGF-HSA的氨基酸序列如序列表2所示；

将序列以hEGF-HSA顺序插入pMD19-T Simple Vector，其5’端接NotⅠ酶切位点，3’端接XbaⅠ酶切位点，由此得到质粒pMD19-T-hEGF-HSA。

进一步的，步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-hEGF-HSA进行双酶切，并分别切胶回收hEGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA，具体步骤为：

用内切酶Not I和内切酶Xba I分别对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-hEGF-HSA进行双酶切；

在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收hEGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接；

将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄青霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物hEGF-HSA-F：5'-GAAATTACCACGTTTACCGCTCTGA-3'；反向引物hEGF-HSA-R：5'-TAGATTAGTGATGGTGATGGTGATG-3')及双酶切(NotⅠ和XbaⅠ)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA。

进一步的，步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：

YPD培养基：蛋白胨20g，酵母提取物10g，葡萄糖20g(制备固体培养基时另加20g琼脂粉)，溶于800ml水中，定容到1L，121℃高压灭菌20min；

SC-U选择培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸(制备SC-U选择性平板培养基时另加20g琼脂粉)，加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；

SC-U诱导培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，加去离子水800ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液和100ml过滤除菌的20％半乳糖溶液，混匀，4℃保存备用。

进一步的，步骤(2)中，获得阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的具体步骤为：

采用电转化法将pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA转化酿酒酵母INVSc1感受态细胞：

将10μl pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中，冰浴5min，擦干电击杯外壁；

将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击，迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板；

30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；

在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的酿酒酵母转化子，菌液PCR(正向引物：hEGF-HSA-F；反向引物：hEGF-HSA-R)筛选INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA阳性克隆子。

进一步的，步骤(3)中，

含有INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的工程菌的诱导表达，具体步骤为：

挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜，测定其OD_600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4；

4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种至100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清液经离心并通过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。

进一步的，步骤(3)中，金属离子亲和层析的步骤为：

取离心并过0.22μm滤膜过滤后的过滤液，使用GE Healthcare公司ChelatingSepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni²⁺螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积；

在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min；

再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定。再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过金属离子亲和层析后的重组人EGF-HSA蛋白原液。

进一步的，步骤(3)中，阴离子交换层析的步骤为：

采用DEAE阴离子交换层析，将金属离子亲和层析纯化后收集的蛋白原液置换到Binding BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.5)中后，上样通过用Binding BufferⅡ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集hEGF-HSA融合蛋白峰；

再用Elution BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，pH8.5)洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白，即为本发明获得的纯化后的重组人EGF-HSA融合蛋白。

一种重组人EGF-HSA融合蛋白标准品的制备方法，包括以下步骤：

取经过经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化后的重组人EGF-HSA融合蛋白溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mmol/L磷酸缓冲液稀释后，加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥，干燥后即为重组人EGF-HSA融合蛋白标准品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用酿酒酵母分泌表达的长效重组人表皮生长因子与HSA融合而成的重组蛋白(hEGF-HSA)，提高了重组蛋白的稳定性。酿酒酵母分泌表达系统为真核表达系统，能够高水平表达蛋白质分泌到培养基中，产品生产工艺简单、成本低、产物均一、无免疫原性。

本发明同时制备了检测标准品，以hEGF国际标准品为标准进行协作标定，冻干hEGF标准品经外观、无菌、水分检测均符合规定，在-20、4、25和37℃保持24个月生物活性稳定。

附图说明：

图1质粒pYES2/CT-MFα图谱；

图2SDS-PAGE鉴定纯化后重组人EGF-HSA蛋白

图3Western Blot鉴定纯化后重组人EGF-HSA蛋白

序列表说明：

序列表1本发明重组人EGF-HSA的核苷酸序列

序列表2本发明重组人EGF-HSA的氨基酸序列

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

具体实施方式：

实施例1：酿酒酵母分泌表达载体pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的构建

1.1人表皮生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得：

通过GenBank查询获得以下相关基因和氨基酸序列，本次试验将利用目的基因表达的氨基酸序列优化基因序列，再进行人工合成两段基因来构建表达载体。根据pYES2/CT-MFα载体的性质(图1)和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计重组人EGF-HSA基因序列和重组人EGF-HSA的氨基酸序列，重组人EGF-HSA基因序列如序列表1所示，重组人EGF-HSA的氨基酸序列如序列表2所示。

序列表1中，GCGGCCGC为NotⅠ酶切位点，TCTAGA为Xba I酶切位点；ATG为起始密码子，TAA为终止密码子；GCAGAGGCGGCGGCTAAGGAAGCTGCAGCCAAAGCC为连接hEGF和HSA序列的Linker所对应的碱基序列；CATCACCATCACCATCAC为6×His标签序列。

1.2 pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA表达载体的构建

用内切酶NotI和内切酶Xba I分别对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-hEGF-HSA进行双酶切。

酶切反应体系为：

在37℃金属浴酶切反应3h，酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并分别切胶回收hEGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接。

连接反应体系为：

反应条件为16℃、14h，按常规方法(氯化钙法)将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄青霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR(正向引物hEGF-HSA-F：5'-GGCCGCAATGAACTCTGATTCTGAA-3'；反向引物hEGF-HSA-R：5'-GGTGATGGTGATGTAACCCTAAAGC-3')及双酶切(NotⅠ和XbaⅠ)鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA。

实施例2：hEGF-HSA融合蛋白工程菌的制备、转化

2.1酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制

SC-U培养基：6.70g酵母无氮浸出物，0.15g复合氨基酸，(若制SC-U选择性平板培养基，另加20g琼脂粉)加去离子水900ml，121℃高压灭菌20min，冷却至50℃时加入100ml过滤除菌的20％葡萄糖溶液，混匀，4℃保存备用；

2.2 pYES2/CT-MFα-hFLG-HSA转化酿酒酵母

采用电转化法将pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞。

将10μl pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，PIC选项，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的酿酒酵母转化子，菌液PCR(正向引物：hEGF-HSA-F；反向引物：hEGF-HSA-R)筛选INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA阳性克隆子。

实施例3：INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA工程菌的诱导表达、检定和纯化

3.1工程菌的诱导表达、检定

挑取INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30℃、220rpm震荡培养过夜。测定其OD_600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4。4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清经0.22μm滤膜过滤。

诱导表达得到的上清蛋白液经SDS-PAGE电泳可观察到72.6kDa左右有明显的特异性条带出现(图2，其中，泳道M：Marker；泳道1：含有空载质粒酿酒酵母菌株的诱导上清；泳道2，诱导上清)，使用兔抗hEGF多克隆抗体(Anti-FGF1 antibody，ab207321)经WesternBlot鉴定含有pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA质粒的酿酒酵母菌株的诱导表达上清液均可观察到72.6kDa左右特异性条带(图3，其中，泳道M：Marker；泳道1：空载质粒酿酒酵母菌株产物；泳道2：hEGF-HSA蛋白)，由此可见本发明制备的含人表皮生长因子的真核表达载pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的酿酒酵母工程菌经半乳糖诱导能产生72.6kDa左右的重组人表皮生长因子和血清白蛋白的融合蛋白。

3.2重组人EGF-HAS融合蛋白的纯化

3.2.1金属离子亲和层析

离心收集培养液上清，用0.22μm滤膜过滤用以上样。使用GE Healthcar e公司Chelating Sepharose TM Fast Flow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni²⁺螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min。再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定。再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到金属离子亲和层析洗脱后的hEGF-HSA蛋白原液。

3.2.2阴离子交换层析

DEAE阴离子交换层析：将金属离子亲和层析洗脱后的hEGF-HSA蛋白原液置换到Binding BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.5)中后，上样通过用Binding BufferⅡ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集hEGF-HSA融合蛋白峰。再用Elution BufferⅡ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，pH8.5)洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白，即得本发明获得的酿酒酵母表达重组人EGF-HSA融合蛋白。

实施例4：hEGF-HSA促细胞生长效果检测

4.1试剂配制

4.1.1完全培养液：量取小牛血清100ml，加培养液定容至1L；

4.1.2维持培养液：量取小牛血清4ml，加培养液定容至1L；

4.1.3消化液：称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g、胰蛋白酶2.5g，加纯化水溶解并定容至至1L，0.22μm滤膜过滤除菌。

4.1.4噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末0.1g，加PBS 20ml使溶解，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。

4.2供试品制备

取100μl供试品于900μl完全培养液中进行10倍稀释，重复操作直至稀释1000倍。取1000倍稀释液在96孔细胞培养板中，从1:4开始依次做4倍递增梯度稀释(具体操作步骤为首先于96孔细胞培养板中加入150μl完全培养液，取50μl 1000倍稀释的供试品溶液加入96孔板中第1列，吹打稀释；充分稀释后于第1列孔中抽取50μl于第2列孔，吹打稀释；充分稀释后于第2列孔中抽取50μl于第3列孔，吹打稀释。重复上述操作，直至第10列)，共做10个稀释度(1-10孔)，每个稀释度同时设置一个复孔。

4.3促细胞生长活性测定

包括以下步骤：

(1)将小鼠胚胎成纤维细胞(BALB/C 3T3)用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0×10⁵～5.0×10⁵个细胞，传代后24-36h用于生物学活性测定；

(2)弃去步骤(1)培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1ml含5.0×10⁴～8.0×10⁴个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养；

(3)步骤(2)中完全培养液培养24h后，换成维持培养液，置37℃、5％二氧化碳培养24h；

(4)待步骤(3)培养24h后，将制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100μl，置37℃、5％二氧化碳培养64-72h；

(5)采用MTT比色法检测结果：每孔加入MTT溶液20μl，于37℃、5％二氧化碳培养5h。

以上操作均在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100μl,混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。

4.4试验结果

采用MTT法检测hEGF-HSA对BALB/C 3T3细胞的促细胞生长效果，生物学活性为5.7×10⁵IU/ml。

实施例5：hEGF-HSA标准品的制备和检测

5.1、hEGF-HSA标准品的制备

将重组hEGF-HSA纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mm ol/L磷酸缓冲液稀释后加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥。

5.2hEGF-HSA标准品的检测

蛋白质含量测定：对上述纯化后的hEGF-HSA标准品用Bradford法检测蛋白浓度，其蛋白含量为2.0mg/ml。

SDS-PAGE进行纯度鉴定：对hEGF-HSA标准品进行SDS-PAGE鉴定纯度，其纯度为98％，相对分子量72.6kD。

HPLC纯度鉴定：hEGF-HSA标准品经μRPC C18 ST 4.6/100反相层析柱进行分析，通过计算峰面积得出主峰面积占总面积的99.00％。

N-端氨基酸序列测定：

(a)SDS-PAGE电泳：将hEGF-HSA蛋白样品SDS-PAGE电泳，上样前先将配置好的聚丙烯酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50V恒压空跑30min；

(b)转膜：将蛋白电转到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，电转缓冲液用CAPS缓冲液；

(c)丽春红染色：将PVDF膜放到丽春红染液中染色30min，用水洗去背景颜色；

(d)将目的条带剪下放于Eppendorf管中，-20℃保存，用Edman降解法进行N端氨基酸测序；

(e)N-端二十个氨基酸序列为E A E A Y V E F P R A A A M N S D S E C，说明纯化后的目的蛋白就是hEGF-HSA。

综上，本发明利用酿酒酵母表达的长效重组人EGF与HSA融合而成的重组蛋白(hEGF-HSA)，克服了现有技术中，采用大肠杆菌、乳酸杆菌、短芽孢杆菌及毕赤酵母表达系统容易形成包涵体、获得的蛋白生物学活性较低的缺陷，生产工艺简单、成本低、产物均一；同时，提供了一种重要的重组人EGF-HSA标准品，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，起着非常重要的作用。本发明制备的长效重组人EGF-HSA融合蛋白，具有更好的均一性、稳定性和更好的回收率，可显著降低生产成本。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司

<120> 一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白及其标准品的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2079

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggccgcaa tgaactctga ttctgaatgt ccattgtctc atgatggtta ctgtttgcac 60

gatggtgttt gtatgtacat tgaggctttg gataagtatg cttgtaattg tgttgttggt 120

tacattggtg aaagatgtca atacagagat ttgaagtggt gggagttgag acatcaccat 180

caccatcacg cagaggcgga ggctaaggaa gctgcagcca aagccatgaa gtgggttacg 240

tttatctccc tattatttct gttctcatcc gcctactcca gaggtgtttt caggagagat 300

gctcacaaat ctgaggttgc tcatagattc aaggatttgg gtgaagaaaa ctttaaggcc 360

ttagtgttaa tagctttcgc acaatacctg caacagtgtc cttttgaaga ccatgtcaaa 420

ttagttaatg aagtcaccga atttgctaag acgtgcgttg ctgatgagtc tgccgaaaat 480

tgtgacaaat cactgcatac attgttcggt gataagctat gtaccgttgc aactcttaga 540

gaaacgtacg gagagatggc ggactgttgt gctaaacaag aacctgaaag aaatgaatgt 600

tttttgcaac acaaagatga taatccaaac ttgccaagat tggtaagacc agaagttgac 660

gttatgtgta ccgcttttca tgataatgaa gaaacatttt tgaaaaagta tctttatgaa 720

atagcaagga ggcatcctta cttctacgct ccagagttat tattttttgc aaaaagatat 780

aaggcagctt ttactgaatg ttgtcaggct gcggataaag ccgcatgtct gttacccaaa 840

ttggatgaat tgagagacga gggcaaagct agtagtgcca aacaaagatt aaaatgcgct 900

tcattacaaa aatttggaga aagagcgttt aaggcttggg ccgtagcaag attgtctcag 960

agattcccga aagccgaatt tgcagaagtg agtaaactgg tcacagattt gacgaaagtt 1020

cacacagaat gttgtcacgg agatttattg gaatgcgctg acgatagggc tgacttagct 1080

aaatacatat gcgagaatca agattccata tcatcaaaat tgaaagaatg ttgtgagaaa 1140

ccattattag aaaaatccca ctgtatagct gaagttgaga acgtagaaat gcccgcggat 1200

ttaccctccc ttgcggctga cttcgttgag tcaaaggatg tttgcaagaa ttacgcggag 1260

gccaaggatg tttttcttgg catgttttta tatgagtatg ccagacgtca tccggattat 1320

tctgtagttc tactgttaag gcttgccaag acatacgaaa ctaccttaga aaaatgttgt 1380

gcggctgccg atccacatga atgttacgca aaagtttttg atgaattcaa gccgcttgtc 1440

gaggagccac aaaatttaat taaacaaaac tgtgaattat ttgaacaatt aggtgaatat 1500

aaattccaaa acgcattatt ggtcagatat acaaaaaaag tacctcaggt ttccacacca 1560

actttagtgg aagtgtcacg taacctaggc aaggttggta gtaagtgctg taaacaccca 1620

gaagctaaga gaatgccatg cgctgaagat tatctatcag tcgtacttaa tcaactgtgt 1680

gtcctacacg agaagactcc tgtcagtgac agagtgacaa aatgttgcac cgagagctta 1740

gttaatagaa gaccgtgttt ttcagcgctg gaagttgatg aaacctatgt tccaaaggag 1800

ttcaatgcag aaacattcac cttccatgct gatatatgta ctcttagtga aaaagaaagg 1860

cagatcaaaa aacaaactgc cctggtcgaa ttagtcaaac ataaacctaa agcaacgaag 1920

gaacagttga aggccgtaat ggatgatttc gcagctttcg ttgaaaaatg ttgcaaggct 1980

gatgacaaag agacatgttt tgctgaagag ggaaaaaaat tggtggcagc ttctcaagcc 2040

gctttagggt tacatcacca tcaccatcac taatctaga 2079

<210> 2

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu

1 5 10 15

His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys

20 25 30

Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu

35 40 45

Lys Trp Trp Glu Leu Arg His His His His His His Ala Glu Ala Ala

50 55 60

Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser

65 70 75 80

Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg

85 90 95

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

100 105 110

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

115 120 125

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

130 135 140

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

145 150 155 160

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

165 170 175

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

180 185 190

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

195 200 205

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

210 215 220

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

225 230 235 240

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

245 250 255

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

260 265 270

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

275 280 285

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

290 295 300

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

305 310 315 320

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

325 330 335

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

340 345 350

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

355 360 365

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

370 375 380

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

385 390 395 400

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

405 410 415

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

420 425 430

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

435 440 445

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

450 455 460

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

465 470 475 480

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

485 490 495

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

500 505 510

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

515 520 525

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

530 535 540

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

545 550 555 560

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

565 570 575

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

580 585 590

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

595 600 605

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

610 615 620

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

625 630 635 640

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

645 650 655

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

660 665 670

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu His His His His His His

675 680 685

Claims

1.一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-hEGF-HSA进行双酶切，并分别切胶回收hEGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体片段，然后用T4 DNA连接酶进行连接，经含氨苄青霉素的LB平板培养基筛选获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA；

(2)hEGF-HSA融合蛋白工程菌的制备、转化，具体包括：

酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制；

将步骤(1)获得的pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞，通过培养基的培养及PCR扩增、筛选，获得阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA；

将步骤(2)获得的阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA，通过培养、诱导表达，再依次经过金属离子亲和层析和阴离子交换层析纯化，即得本发明所需酿酒酵母表达重组人EGF-HSA融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，人表皮生长因子和人血清白蛋白因子的人工优化和获得，以获得质粒pMD19-T-hEGF-HSA，具体步骤为：

根据pYES2/CT-MFα载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计了重组人EGF-HSA基因序列和重组人EGF-HSA的氨基酸序列，重组人EGF-HSA基因序列如序列表1所示，重组人EGF-HSA的氨基酸序列如序列表2所示；

3.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对质粒pYES2/CT-MFα及质粒pMD19-T-hEGF-HSA进行双酶切，并分别切胶回收hEGF-HSA基因片段和pYES2/CT-MFα载体，然后用T4 DNA连接酶进行连接，获得阳性克隆pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA，具体步骤为：

将重组质粒转化至大肠杆菌(DH5ɑ)，在含氨苄青霉素的LB平板培养基上挑取阳性克隆，经菌液PCR及双酶切鉴定，选取阳性克隆pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA。

4.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，酿酒酵母表达体系常用溶液及培养基的配制，具体方法为：

5.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，获得阳性克隆子INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的具体步骤为：

采用电转化法将pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞：

30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆；

在SC-U选择培养基(含氨苄)生长的为含有pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA的酿酒酵母转化子，菌液PCR筛选INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA阳性克隆子。

6.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，

INVSc1/pYES2/CT-MFα-hEGF-HSA工程菌的诱导表达，具体步骤为：

4℃、1500g离心5min，收集菌体，用1～2ml的SC-U诱导培养基悬浮菌体，重新接种到100ml的SC-U诱导培养基中，置于30℃震荡培养96h后，4℃、15000g离心5min，收集菌体和上清，诱导表达的上清液经离心并通过0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。

7.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，金属离子亲和层析的步骤为：

再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD_280nm稳定，再以含500mM咪唑PBS缓冲液过层析柱，洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白，即得到经过金属离子亲和层析后的重组人EGF-HSA蛋白原液。

8.根据权利要求1所述的一种酿酒酵母表达长效重组人EGF-HSA融合蛋白制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，阴离子交换层析的步骤为：

将金属离子亲和层析纯化后收集的蛋白原液置换到Binding Buffer Ⅱ中后，上样通过用Binding Buffer Ⅱ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集hEGF-HSA融合蛋白峰；

再用Elution Buffer Ⅱ洗脱，洗去杂蛋白并收集洗脱峰对应的蛋白，即为本发明获得的纯化后的重组人EGF-HSA融合蛋白。

9.一种重组人EGF-HSA融合蛋白标准品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取权利要求1-8任一项制备方法制得的重组人EGF-HSA融合蛋白溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mmol/L磷酸缓冲液稀释后，加入终浓度为10％甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥，干燥后即为重组人EGF-HSA融合蛋白标准品。