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CN113133488A - 一种制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法 - Google Patents

一种制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法 Download PDF

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CN113133488A CN202010064177.3A CN202010064177A CN113133488A CN 113133488 A CN113133488 A CN 113133488A CN 202010064177 A CN202010064177 A CN 202010064177A CN 113133488 A CN113133488 A CN 113133488A
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陈丹丹
许芮菁
刘敏
丁章贵
王鹏
吴伯阳
杨锐
卢晓慧
高林瑞
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Yunnan Dayi Microbial Technology Co ltd
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Yunnan Dayi Microbial Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法，包括以下步骤：1)提供发酵茶；2)用水对所述发酵茶进行浸提，以得到含有鞣花酸的提取液；3)对所述提取液进行纯化，其中纯化包括用大孔树脂进行分离，并且洗脱所用洗脱溶剂为水和乙醇。本发明从发酵茶中提取分离含鞣花酸的发酵茶提取物，不仅能够获得高含量的鞣花酸，而且还能够获得丰富的发酵茶多酚，并且方法简单、工艺安全，适于工业生产。

Description

一种制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法。
背景技术
鞣花酸是一种苯并吡喃-二酮衍生物，具有四个羟基和两个内酯的亲水基团，以及两个烃环的亲脂基团，结构式如下式I所示。这赋予了鞣花酸接受来自不同底物的电子以及参与抗氧化还原反应的能力。鞣花酸水溶性差，在21℃时水溶性小于1mg/mL。
Figure BDA0002375446420000011
鞣花酸是存在于许多水果、种子和蔬菜中的多酚物质，以游离形式或更复杂分子的形式(鞣花单宁)存在。鞣花单宁在体内生理条件下被水解产生鞣花酸，之后鞣花酸经肠道微生物群逐步代谢，产生不同的尿石素。
鞣花酸的药理活性机制包括抗氧化特性、降低脂质代谢和脂质代谢的能力、改变促炎介质(肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6)、降低核因子-κB活性的同时增加核因子红细胞2相关因子2的表达，这些在其抗动脉粥样硬化、抗炎和神经保护作用中起重要作用。鞣花酸对胰岛素、糖原、磷酸酶、醛糖还原酶、山梨糖醇积累、晚期糖基化终产物形成和抵抗素分泌的影响，可以解释其对代谢综合征和糖尿病的影响。由于鞣花酸影响细胞增殖、细胞凋亡、DNA损伤和血管生成的特定机制，其既是肝脏潜在的保护剂，也是潜在的抗癌剂。此外，鞣花酸能抑制酪氨酸酶活性，阻断黑色素生成，是皮肤科医学公认的可使用的有效美白成分之一。
鞣花酸可以通过植物单宁水解法和化学合成法制备而得。由于过程复杂、副产物多、酶纯度要求高，酶催化没食子酸(酯)氧化聚合法较少使用。目前关于鞣花酸制备的报道多以石榴皮为原料，其中均需使用甲醇等有机溶剂，限制了鞣花酸的应用领域。
发明内容
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法。
具体而言，本发明提供了：
(1)一种制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法，包括以下步骤：
1)提供发酵茶；
2)用水对所述发酵茶进行浸提，以得到含有鞣花酸的提取液；
3)对所述提取液进行纯化，其中纯化包括用大孔树脂进行分离，并且洗脱所用洗脱溶剂为水和乙醇。
(2)根据(1)所述的方法，其中所述浸提包括用沸水浸泡所述发酵茶30-60分钟。
(3)根据(1)所述的方法，其中所述浸提所用发酵茶与水的质量比为1:(10-20)。
(4)根据(1)所述的方法，其中重复步骤2)1-3次。
(5)根据(1)所述的方法，其中所述纯化包括对步骤2)所得提取液进行过滤和离心，得到上清液，对该上清液进行浓缩，对所得浓缩液进行所述大孔树脂分离。
(6)根据(1)所述的方法，其中所述大孔树脂采用SP700树脂。
(7)根据(1)所述的方法，其中在洗脱时，所述洗脱溶剂的流量为2-8BV，流速为1BV-4BV/小时。
(8)根据(1)所述的方法，其中步骤1)包括对原料茶进行发酵以制得发酵茶，所述原料茶包括晒青毛茶和绿茶初制茶。
(9)根据(1)所述的方法，其中步骤1)包括在30℃-55℃下用黑曲霉对原料茶进行发酵14-20天。
(10)根据(8)或(9)所述的方法，其中在所述发酵之前，将所述原料茶潮水至含水量为茶叶总重的35重量％-65重量％。
本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明首次提出以茶叶为固体发酵原料，从发酵茶中提取分离含鞣花酸的发酵茶提取物。在茶叶发酵过程中，茶叶单宁被转化为鞣花酸，因此发酵茶中富含鞣花酸。本发明还针对发酵茶开发了简单、安全、环保的提取方法，不仅能够有效地从发酵茶中提取鞣花酸，保证提取率，而且提取过程均使用环境友好且安全的试剂，并且方法简单、工艺安全，适于工业生产。
此外，本发明的方法除了能够从发酵茶中获得高含量的鞣花酸以外，还能够获得丰富发酵茶多酚(如普洱茶素401系列(puerins)等)，由此协同增强提取物的生物活性。因此，本发明获得的发酵茶提取物具有良好的抗氧化等生物活性，且水溶性好，可应用于多种用途，如抗氧化、美白等产品的研发。
进一步地，本发明优化了发酵茶工艺，使得能够获得鞣花酸和诸如发酵茶多酚如普洱茶素401系列(puerins)等有益物质含量高的发酵茶，进一步有助于获得含鞣花酸和其他有益物质的发酵茶提取物。
附图说明
图1为鞣花酸标品的HPLC-紫外图谱；
图2为实施例1制备的样品的HPLC-紫外图谱。
图3为实施例1制备的发酵茶提取物和对比例1制备的毛茶提取物的HPLC-MS离子流图谱，其中上图为发酵茶提取物图谱，下图为毛茶提取物图谱。
图4为从图3的图谱中提取的实施例1制备的发酵茶提取物和对比例1制备的毛茶提取物中鞣花酸提取离子流图谱，其中上图为发酵茶提取物图谱，中间图为毛茶提取物图谱，下图为鞣花酸标品图谱。
图5为从图3的图谱中提取的实施例1制备的发酵茶提取物和对比例1制备的毛茶提取物中普洱茶素401系列提取离子流图谱，其中上图为发酵茶提取物图谱，中间图为毛茶提取物图谱，下图为普洱茶素401系列对照品(自制)图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明提供了一种制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法，包括以下步骤：
1)提供发酵茶；
2)用水对所述发酵茶进行浸提，以得到含有鞣花酸的提取液；
3)对所述提取液进行纯化，其中纯化包括用大孔树脂进行分离，并且洗脱所用洗脱溶剂为水和乙醇。
本发明不受理论的束缚，但认为茶叶中的单宁(如木麻黄素(strictinin))在发酵过程中经过湿热作用和微生物作用，可以产生鞣花酸，由此鞣花酸含量显著增加。本发明以微生物发酵茶为原料，制备了含鞣花酸的发酵茶提取物，同时提取物中还含有大量发酵多酚成分，能够协同增强生物活性。
浸提优选用沸水浸泡所述发酵茶，时间优选为30-60分钟，更优选40-60分钟。这样能够保证安全和提取率。
在本发明中，沸水优选是指温度为80℃至100℃的水。
还优选地，浸提所用发酵茶与水的质量比为1:(10-20)，更优选1:(12-16)。当质量比低于1:10时，不能有效提取发酵茶中物质成分，造成原料浪费；当质量比高于1:20时，水含量太高，不利于后期浓缩。
在浸提过程中，优选间歇性搅拌物料。
步骤2)优选重复进行1-3次，从而使发酵茶内含物充分溶出。
优选对步骤2)所得提取液进行过滤和离心。过滤优选采用200-400目滤网，滤除杂质，然后进行离心。离心优选采用蝶式离心机，以1000-1450rpm瞬时离心。
在用大孔树脂处理提取液之前，优选对离心得到的上清液进行浓缩。浓缩优选以反渗透过滤膜进行，可以采用本领域已知的常规方法(如真空减压浓缩)进行浓缩。通过本领域常规已知的方法(如折光率法)测量时，浓缩液质量分数优选为10-15％。
本发明的发明人通过反复摸索和试验发现，在进行大孔树脂进行分离时，大孔树脂优选采用对小极性分子有较高选择性的SP700树脂，其可购自日本三菱公司。
在洗脱时，洗脱溶剂的流量优选为2-8BV，流速优选为1-4BV/小时。洗脱所用乙醇优选为食品级乙醇，例如体积分数为30％-70％的乙醇水溶液。
在一个优选的实施方案中，将浓缩液用SP700树脂分离，然后用先3BV纯水以2-3BV/小时的流速洗脱，后用6BV 50％乙醇水溶液以2BV/小时的流速洗脱。
所得洗脱液优选通过减压浓缩去除乙醇，干燥后得到含鞣花酸的发酵茶提取物。
为保证鞣花酸及多酚类成分的活性，本发明优选采用真空冷冻干燥技术对经大孔树脂分离的洗脱液进行干燥。本发明对真空冷冻干燥的方法没有特别的限制，可使用公知的方法。
在本发明的方法中，优选利用本发明摸索的发酵方法和条件提供发酵茶。原料茶可以使用未经发酵的茶叶，优选为晒青毛茶和绿茶初制茶。
优选将原料茶进行潮水，优选潮水至含水量为茶叶总重的35重量％-65重量％，更优选40-50重量％。
在发酵之前，通常将已潮水的茶叶灭菌，通常在115-121℃下进行灭菌15-30分钟。
本发明采用普洱茶渥堆优势微生物进行发酵，优选用黑曲霉(Aspergillusniger)在30℃-55℃下对原料茶进行发酵14-20天，更优选在37-45℃下发酵15-18天。
在本发明的方法中，所用的黑曲霉可以得自市售途径，优选分离自普洱茶，例如可以使用已于2016年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏的保藏编号为CGMCC NO.12763的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。优选地，可以以大于或等于105个的孢子量接种所述黑曲霉菌种，例如以105数量级的孢子量接种。
发酵完成后，优选将茶叶晾干至含水量低于茶叶总重的12重量％，然后再进行鞣花酸的提取。
在一个具体的实施方案中，将原料茶叶称重置于发酵罐中，按照上述条件进行潮水、灭菌，冷却后接入普洱茶渥堆优势菌种培养，发酵结束后晾干，得到富含鞣花酸的微生物发酵茶。
在本发明中，可以用HPLC测定发酵茶或提取物中的鞣花酸含量。样品可以用甲醇稀释以进行前处理，经有机相滤膜过滤，滤液用HPLC进行检测分析。
在一个具体的实施方案中，HPLC检测的方法如下：当样品为微生物发酵茶时，将茶叶粉碎后用水浸提，料液质量比为1:7.5，超声(30000-40000HZ)30分钟，离心取上清液，重复提取2次，合并上清液，用水定容至50ml。取1mL加入甲醇定容至10mL。样品为微生物发酵茶提取物时，称取0.1g，用水溶解至100ml，取1-5ml用甲醇定容至10ml。过0.45μl有机膜，待测。
HPLC检测可使用如下条件：
HPLC为Waters e2695，色谱柱Agilent ZORBAX SB-C184.6*250mm,5μm)，流动相0.2％磷酸水-乙腈(85:15)，等度洗脱，流速1ml/分钟，检测时间25分钟，柱温35℃，检测波长254nm。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为对本发明的保护范围的限制。
例子
除非特别说明，否则以下例子中所用常规流程、操作、材料和条件不再赘述。
以下例子中所用SP700大孔树脂柱在使用前，用3BV 2％氢氧化钠溶液淋洗柱子，后用水冲至pH＝7，再用3BV的2％盐酸溶液淋洗小柱，之后用水冲至pH＝7，然后用无水乙醇完全置换柱内残留水并用无水乙醇浸泡柱子24小时。样品上柱前，用水完全置换乙醇。
实施例1
(1)茶叶固态发酵
称取200kg晒青毛茶置于发酵罐中，潮水至含水量为茶叶总重的50％，115℃蒸汽灭菌30分钟，冷却后接入普洱茶渥堆优势菌株黑曲霉，在37℃下发酵15天，发酵结束后晾干至含水量低于12％。经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为2.8mg/g茶叶的微生物发酵茶。
(2)含鞣花酸的发酵茶提取物的制备
称取30kg微生物发酵茶置于提取罐，加入450L沸水浸泡提取30分钟，间歇性搅拌，200目粗滤，1200rpm瞬时蝶式离心，重复提取一次，两次滤液混合。提取液采用反渗透膜进行浓缩，经HPLC检测(方法如上文所述)，获得鞣花酸含量为1‰(w/v)的浓缩液，浓缩液质量分数为10％。
浓缩液上SP700柱分离，先用3BV纯水以2-3BV/小时流速洗脱，后用6BV 50％乙醇水溶液以2BV/小时流速洗脱。洗脱液减压浓缩去除乙醇，冷冻干燥，经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为4％(W鞣花酸/W提取物)的发酵茶提取物。HPLC检测图谱如图1和图2所示，图1为鞣花酸标品的HPLC-紫外图谱，其中鞣花酸标品购自上海源叶生物科技有限公司，图2为实施例1制备的样品的HPLC-紫外图谱。图1和图2中最右侧的峰为鞣花酸峰。
实施例2
(1)茶叶固态发酵
称取200kg晒青毛茶置于发酵罐中，潮水至含水量为茶叶总重的35％，115℃蒸汽灭菌30分钟，冷却后接入普洱茶渥堆优势菌株黑曲霉，在30℃下发酵14天，发酵结束后晾干至含水量低于12％重量。经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为1.97mg/g茶叶的微生物发酵茶。
(2)含鞣花酸的发酵茶提取物的制备
称取30kg微生物发酵茶置于提取罐，加入300L沸水浸泡提取60分钟，间歇性搅拌，200目粗滤，1200rpm瞬时蝶式离心，重复提取一次，两次滤液混合。提取液采用反渗透膜进行浓缩，经HPLC检测(方法如上文所述)，获得鞣花酸含量为0.6‰(w/v)的浓缩液，浓缩液质量分数为10％。
浓缩液上SP700柱分离，先用3BV纯水以2-3BV/小时流速洗脱，后用6BV 50％乙醇水溶液以2BV/小时流速洗脱。洗脱液减压浓缩去除乙醇，冷冻干燥，经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为2.6％(W鞣花酸/W提取物)的发酵茶提取物。
实施例3
(1)茶叶固态发酵
称取200kg晒青毛茶置于发酵罐中，潮水至含水量为茶叶总重的65％，115℃蒸汽灭菌30分钟，冷却后接入普洱茶渥堆优势菌株黑曲霉，在30℃下发酵20天，发酵结束后晾干至含水量低于12％重量。经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为1.02mg/g茶叶的微生物发酵茶。
(2)含鞣花酸的发酵茶提取物的制备
称取30kg微生物发酵茶置于提取罐，加入600L沸水浸泡提取30分钟，间歇性搅拌，200目粗滤，1400rpm瞬时蝶式离心，重复提取一次，两次滤液混合。提取液采用反渗透膜进行浓缩，经HPLC检测(方法如上文所述)，获得鞣花酸含量为0.3‰(w/v)的浓缩液，浓缩液质量分数为10％。
浓缩液上SP700柱分离，先用3BV纯水以2-3BV/小时流速洗脱，后用6BV 50％乙醇水溶液以2BV/小时流速洗脱。洗脱液减压浓缩去除乙醇，冷冻干燥，经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为1.5％(W鞣花酸/W提取物)的发酵茶提取物。
实施例4
如实施例1所述发酵及提取浓缩，获得鞣花酸含量为1‰(w/v)的浓缩液，浓缩液质量分数为10％。
浓缩液上HP20柱分离，先用3BV纯水以2-3BV/小时流速洗脱，后用6BV 50％乙醇水溶液以2BV/小时流速洗脱。洗脱液减压浓缩去除乙醇，冷冻干燥，经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为2.4％(W鞣花酸/W提取物)的发酵茶提取物。
对比例1
采用鞣花酸含量为0.95mg/g的晒青毛茶为原料，制备含鞣花酸的毛茶提取物。称取30kg毛茶叶置于提取罐，加入450L沸水浸泡提取30分钟，间歇性搅拌，200目粗滤，1200rpm瞬时蝶式离心，重复提取一次，两次滤液混合。提取液采用反渗透膜进行浓缩，经HPLC检测(方法如上文所述)，获得鞣花酸含量为0.2‰(w/v)的浓缩液，浓缩液质量分数为10％。
浓缩液上SP700柱分离，先用3BV纯水以2-3BV/小时流速洗脱，后用6BV 50％乙醇水溶液以2BV/小时流速洗脱。洗脱液减压浓缩去除乙醇，冷冻干燥，经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为0.95％(W鞣花酸/W提取物)的茶提取物。
对比例2
如实施例1所述条件发酵，发酵28天，发酵结束后晾干至含水量低于12％。经HPLC检测(方法如上文所述)，得到鞣花酸含量为0.63mg/g茶叶的微生物发酵茶。
如实施例1所述条件提取浓缩，获得鞣花酸含量为0.1‰(w/v)的浓缩液，浓缩液质量分数为10％。
如实施例1所述条件分离、洗脱、浓缩、干燥，得到鞣花酸含量为0.43％(W鞣花酸/W提取物)的发酵茶提取物。
总结上例子可知，发酵水分过低或过高，发酵时间过长或过短，提取料液比越低，浸泡时间越短，越不利于鞣花酸的富集。但提取料液比过高、浸泡时间过长，富集效率无显著变化，且能耗和时间成本显著增加，不利于工业生产。且需选择合适的树脂，才能获得更高鞣花酸含量的发酵茶提取物。
实验例
将实施例1获得的发酵茶提取物和对比例1获得的毛茶提取物分别进行HPLC-MS，分析其中所含的物质。方法如下：
采用岛津LC-30AD高效液相色谱-AB sciex 5600质谱联用仪。
高效液相色谱的检测参数包括：色谱柱采用Megres C18柱，粒径5μm，柱长4.6×250mm，柱温40℃；流动相A为含2mM乙酸铵的0.1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件为：0～3分钟，流动相B保持10％，3～6分钟，流动相B升至30％，6～12分钟，流动相B保持30％，12～25分钟，流动相B升至100％，25～21分钟，流动相B降至10％；流动相的流速为1mL/分钟，进样量为10μL。
质谱的分析参数包括：采用负离子模式，离子喷雾电压为-4500V，去簇电压为-80V，碰撞能量为-35eV，离子源温度为600℃，吹扫气气压为40psi，雾化器气压为55psi，辅助气气压为55psi，离子扫描范围为100～2000AMU。
实施例1制备的发酵茶提取物和对比例1制备的毛茶提取物的HPLC-MS离子流图谱见图3，图中茶多酚峰谱信息见表1。
表1
Figure BDA0002375446420000101
Figure BDA0002375446420000111
通过用鞣花酸标品图谱和自制普洱茶素401系列对照品(采用常规方法制备，故不赘述)图谱进行对比分析，发现发酵茶提取物较毛茶提取物更富含鞣花酸(见图4，图4是在图3基础上，采用软件提取出鞣花酸300.9989的离子流图)，且酯型儿茶素大量被转化，此外含有非酯型儿茶素和独特发酵茶多酚普洱茶素401系列等(见图5，图5是在图3基础上，采用软件提取出普洱茶素401系列物质400.13的离子流图)，具有良好的抗氧化等生物活性，且水溶性好，加工工艺安全，可应用于抗氧化、美白等产品的研发。

Claims (10)

1.一种制备含鞣花酸的发酵茶提取物的方法，包括以下步骤：
1)提供发酵茶；
2)用水对所述发酵茶进行浸提，以得到含有鞣花酸的提取液；
3)对所述提取液进行纯化，其中纯化包括用大孔树脂进行分离，并且洗脱所用洗脱溶剂为水和乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述浸提包括用沸水浸泡所述发酵茶30-60分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述浸提所用发酵茶与水的质量比为1:(10-20)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中重复步骤2)1-3次。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括对步骤2)所得提取液进行过滤和离心，得到上清液，对该上清液进行浓缩，对所得浓缩液进行所述大孔树脂分离。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述大孔树脂采用SP700树脂。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在洗脱时，所述洗脱溶剂的流量为2-8BV，流速为1BV-4BV/小时。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)包括对原料茶进行发酵以制得发酵茶，所述原料茶包括晒青毛茶和绿茶初制茶。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)包括在30℃-55℃下用黑曲霉对原料茶进行发酵14-20天。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中在所述发酵之前，将所述原料茶潮水至含水量为茶叶总重的35重量％-65重量％。
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