CN113138276A - 用于检测HBcAg的方法及抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)检测领域。具体而言,本发明提供了采用双抗体夹心法检测HBcAg的方法,以及用于上述检测的抗体及试剂盒。本发明还提供了能够用于组织或细胞样品的HBcAg免疫学检测的单克隆抗体。
Description
技术领域
本发明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)检测领域。具体 而言,本发明提供了采用双抗体夹心法检测HBcAg的方法,以及用于上述 检测的抗体及试剂盒。本发明还提供了能够用于组织或细胞样品的HBcAg 免疫学检测的单克隆抗体。
背景技术
乙型肝炎病毒感染,尤其是慢性HBV感染是全球最为重要的公共卫 生问题之一(Dienstag JL.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med 2008 Oct 2;359(14):1486-1500)。
目前,HBV血清标志物(常规如:HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb, HBcAb即俗称“两对半”检测)广泛作为现症HBV感染和既往HBV感染 的常规检测标准。但是,高的变异率再加上HBV携带者庞大基数导致常规 的“两对半”检测的假阴性高发。并且,普通“两对半”检测无法从量上反映 病毒复制性和传染性大小,常出现可怀疑难解释的结果,也无法从“两对半”指标直接确定检测个体并未感染HBV。
HBV DNA是HBV复制的直接指标,其斑点杂交检测(或PCR检测) 是乙型肝炎患者和HBV携带者感染与传染性判断的金标准。PCR检测与 斑点杂交检测均可作为HBV感染和传染性的直接指标,但是不适合大规 模普查和常规使用。
在所有可能与HBV DNA高度相关的血清标志抗原(HBV PreS1、 HBcAg、HBxAg、DNAP、HBV PreS2等)中:HBcAg一直被认为是与HBV DNA直接相关的抗原,检测在HBcAg在复制型病毒定量和HBsAg阴性的 HBV感染者与HBV患者中特有诊断意义。目前市面上没有开发特异性的HBcAg检测试剂,已报道或者有研发的HBcAg免疫诊断试剂通常采取检 测前对样品进行前处理(裂解病毒、破膜并灭火HBcAb)或采用迂回检测 HBcAg-HBcAb免疫复合物的方式进行,前者操作复杂程序繁琐,不易被 临床客户接受,也不适合用于大规模献血员筛查及流行病学调查,后者则 因为检测方法的特殊性,难以达到理想的特异性和灵敏度。2006年有报道 的专利“一种联合检测乙型肝炎病毒前S1抗原和核心抗原的方法及诊断试剂盒”中提到的HBcAg的检测试剂方法是采用sAg的抗体捕获病毒颗粒后 进行破膜、裂解病毒检测核内的cAg,但是灵敏度不够。
开发一种简单、准确而又高灵敏度的HBcAg发光检测试剂在HBV患 者抗病毒疗效及病程预后方面都有迫切的现实意义。
发明内容
本发明人经过大量的实验研究,出乎意料地发现了特别适用于HBcAg 双抗体夹心法检测的结合特定表位的抗体对。在此基础上,本发明人开发 了新的HBcAg定量检测试剂盒以及检测方法。该检测方法的灵敏度能够 达到与DNA相当水平,且可以实现快速、高通量检测,具备重大临床应用 价值。
试剂盒
因此,在第一方面,本发明提供了一种试剂盒,其包含:
(i)第一抗体,编码第一抗体的分离的核酸分子,包含所述分离的核酸 分子的载体,或者表达所述第一抗体的重组细胞;其中,所述第一抗体其 选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位的抗体 或其抗原结合片段;和,
(ii)第二抗体,编码第二抗体的分离的核酸分子,包含所述分离的核酸 分子的载体,或者表达所述第二抗体的重组细胞;其中,所述第二抗体选 自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-154位中所包含的表位的抗体或 其抗原结合片段。
在本文中,表述“HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位”或类 似表述是指,所述表位存在于HBcAg蛋白的第150-183位氨基酸之内或与 之重叠。换言之,所述能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位中所包 含的表位的抗体或其抗原结合片段是能够特异性结合HBcAg蛋白的第 150-183位氨基酸或其片段的抗体或其抗原结合片段。
在某些示例性实施方案中,HBcAg蛋白具有如SEQ ID NO:17所示的 序列。
在某些实施方案中,所述第二抗体选自能够特异性结合HBcAg蛋白 的第141-152位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中,所述第一抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段:
(i)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含下述3个互补决定区(CDR) 的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:3的HCDR1、序列为SEQ ID NO:4的HCDR2、以及序列为SEQ ID NO:5的HCDR3;和/或,包含下 述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:6的LCDR1、序列为SEQ ID NO:7的LCDR2、以及序列为SEQ ID NO:8 的LCDR3;或者,
(ii)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含SEQ ID NO:1所示的重链 可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH);和/或,包含SEQ ID NO: 2所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL);优选地, 所述重链可变区中含有的3个CDR,和/或所述轻链可变区中含有的3个 CDR,由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义;或者,
(iii)抗体或其抗原结合片段,所述抗体是杂交瘤细胞株18B2-2所产生 的单克隆抗体,其中,杂交瘤细胞株18B2-2保藏于中国典型培养物保藏中 心(CCTCC),且具有保藏号CCTCC NO.C2019303。
在某些实施方案中,所述第一抗体包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:1所示的序列;(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个 氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的 置换、缺失或添加)的序列;或(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序 列同一性的序列;
和/或,
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:(iv)SEQ ID NO:2所示的序列;(v)与SEQ ID NO:2所示的序列相比具有一个或几个 氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的 置换、缺失或添加)的序列;或(vi)与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序 列同一性的序列。
在某些实施方案中,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中,所述第一抗体包含:具有如SEQ ID NO:1所示 的序列的VH和具有如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
在某些实施方案中,所述第二抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段:
(i)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含下述3个互补决定区(CDR) 的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:11的HCDR1、序列为SEQ ID NO:12的HCDR2、以及序列为SEQ IDNO:13的HCDR3;和/或,包含 下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL):序列为SEQ IDNO: 14的LCDR1、序列为SEQ ID NO:15的LCDR2、以及序列为SEQ ID NO: 16的LCDR3;或者,
(ii)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含SEQ ID NO:9所示的重链 可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH);和/或,包含SEQ ID NO: 10所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL);优选地, 所述重链可变区中含有的3个CDR,和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR,由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义;或者,
(iii)抗体或其抗原结合片段,所述抗体是杂交瘤细胞株2A7所产生的 单克隆抗体,其中,杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC),且具有保藏号CCTCCNO.C2019302。
在某些实施方案中,所述第二抗体包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:9所示的序列;(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个 氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的 置换、缺失或添加)的序列;或(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序 列同一性的序列;
和/或,
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:(iv)SEQ ID NO:10所示的序列;(v)与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几 个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸 的置换、缺失或添加)的序列;或(vi)与SEQ ID NO:10所示的序列具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100% 的序列同一性的序列。
在某些实施方案中,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中,所述第二抗体包含:具有如SEQ ID NO:9所示 的序列的VH和具有如SEQ ID NO:10所示的序列的VL。
在某些实施方案中,所述第一抗体和/或第二抗体包含重链恒定区(CH) 和轻链恒定区(CL)。
在某些实施方案中,所述第一抗体和/或第二抗体包含小鼠重链恒定区 和小鼠轻链恒定区。
在某些实施方案中,所述第一抗体和/或第二抗体是IgG、IgM、IgE、 IgD或IgA抗体。在某些实施方案中,所述第一抗体和/或第二抗体是IgG 抗体。
在某些实施方案中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、 二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)。
在某些实施方案中,所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在一些实施方案中,所述第二抗体带有可检测标记。
在另一些实施方案中,所述试剂盒还包括能够特异性结合所述第二抗 体的第三抗体,所述第三抗体带有可检测标记。
在本文中,所述可检测标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物 化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是, 此类标记能够适用于免疫学检测(例如,酶联免疫测定法、放射免疫测定 法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知 的,包括但不限于,酶(例如,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷 酶、脲酶、葡萄糖氧化酶,等)、放射性核素(例如,3H、125I、35S、14C 或32P)、荧光染料(例如,异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸 四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子 点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、化学发光物质(如吖啶酯类化合物)、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和 素)的生物素。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例 如,放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测,荧光标记物可使用光 检测器检测,以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通 过酶对底物的作用产生的反应产物来检测。测热标记物通过简单可视化着 色标记物来检测。化学发光物质(如吖啶酯类化合物)一般通过给发光物 质提供激发液和/或催化剂来检测发射的光。生物素一般通过给生物素提供 上述标记物修饰的亲和素(例如,链霉亲和素)及检测与生物素连接的亲 和素所携带的标记物来检测。在某些实施方案中,可通过不同长度的接头 将如上所述的可检测标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段,以降低 潜在的位阻。
在某些实施方案中,所述可检测标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或 碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物 素。
在某些实施方案中,所述试剂盒可以进一步包含用于使相应可检测标 记被检测到的试剂。例如,当所述可检测标记为酶时,所述试剂盒还可以 包含相应酶的显色底物,例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、 四甲基联苯胺(TMB)、ABTS或鲁米诺类化合物,或用于碱性磷酸酶的 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)或AMPPD。例如当所述可检测标记为化学发光 试剂(例如吖啶酯类化合物)时,所述试剂盒还可以包含用于化学发光的 预激发液和/或激发液。
在某些实施方案中,所述试剂盒进一步包含固相载体。在某些实施方 案中,所述固相载体包括由聚合物材料(例如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙 酰胺或纤维素)制成或包被的凹孔平板、试管、珠粒(例如乳胶颗粒)或 薄膜(例如硝酸纤维素膜),或由功能基团(例如氨基、羧基、生物素或 亲和素)预包被的磁珠。在某些实施方案中,所述固相载体选自磁珠或微 量滴定板(例如微孔板或酶标板)。
在某些实施方案中,所述试剂盒还包含用于将所述第一抗体包被于所 述固相载体上的包被试剂,例如包被缓冲液(例如,碳酸盐缓冲液、磷酸 盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或硼酸盐缓冲液)。将蛋白或多肽包被于固相 载体上的方法是本领域熟知的,例如物理吸附、通过氨基化或羧基化表面 实现的共价偶联或通过亲和素-生物素系统、聚赖氨酸预包被表面、蛋白A 或蛋白G预包被表面实现的介导结合。
在某些实施方案中,所述第一抗体包被在固相载体的表面。
在某些实施方案中,所述试剂盒在单独的容器中或在单个容器单元的 分开的隔室中至少包含上述固相载体,以及上述第一抗体。
在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含:第一抗体,和带有可检 测标记的第二抗体。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含:包被于 固相载体表面的第一抗体,和带有可检测标记的第二抗体。在某些示例性 实施方案中,所述试剂盒包含:一种或多种第一抗体,和带有可检测标记 的第二抗体。在某些示例性实施方案中,所述试剂盒包含:包被于固相载 体表面的一种或多种第一抗体,和带有可检测标记的第二抗体。在某些实 施方案中,所述多种第一抗体识别HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的 不同表位。
在某些实施方案中,所述试剂盒进一步包含用于裂解HBV病毒颗粒 的裂解剂。在本文中,用于裂解HBV病毒颗粒的裂解剂是指能够裂解Dane 颗粒(即,破坏病毒包膜)以暴露HBcAg抗原的任何试剂。这类试剂是本 领域技术人员已知的,例如表面活性剂,例如NP40,LDS或SDS。
在某些实施方案中,所述裂解剂包含LDS或SDS。在某些实施方案 中,所述试剂盒进一步包含中和剂,所述中和剂包含CHAPS。在某些实施 方案中,所述裂解剂包含20%LDS或20%SDS。在某些实施方案中,所述 裂解剂包含20%LDS或20%SDS以及余量的水。在某些实施方案中,所 述中和剂包含10%CHAPS。在某些实施方案中,所述中和剂包含 10%CHAPS、20mM PBS。在某些实施方案中,所述中和剂包含10%CHAPS、 20mM PBS以及余量的水。
在某些实施方案中,所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或 装置:标准品(例如,含有不同已知量的HBcAg的系列样品);阳性对照 样品(例如,含有已知量的HBcAg的样品);阴性对照样品(例如,不含 有HBcAg的样品);用于裂解HBV病毒的裂解剂(以及任选地中和剂); 和,用于收集或贮存待测样品的装置(例如采血装置)。
抗体的制备
第一方面所述的第一抗体和第二抗体可以本领域已知的各种方法来制 备,例如通过基因工程重组技术来获得。例如,通过化学合成或PCR扩增 获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插 入表达载体内,然后转染宿主细胞。然后,在特定条件下培养转染后的宿 主细胞,并表达本发明的抗体。
第一方面所述的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参 见Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外,这些抗原结合片段也可以直 接由重组宿主细胞产生(reviewed in Hudson,Curr.Opin.Immunol.11: 548-557(1999);Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如, Fab’片段可以直接从宿主细胞中获得;可以将Fab’片段化学偶联形成 F(ab’)2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外,Fv、 Fab或F(ab’)2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本 领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此,在第二方面,本发明提供了一种试剂盒,其包含:
(i)第一抗体,编码第一抗体的分离的核酸分子,包含所述分离的核酸 分子的载体,或者表达所述第一抗体的重组细胞;其中,所述第一抗体如 第一方面中定义;和,
(ii)第二抗体,编码第二抗体的分离的核酸分子,包含所述分离的核酸 分子的载体,或者表达所述第二抗体的重组细胞;其中,所述第二抗体如 第一方面中定义。
在某些实施方案中,所述载体是克隆载体或表达载体。在某些实施方 案中,所述载体是例如质粒,粘粒,噬菌体等。
在某些实施方案中,表达所述第一抗体的重组细胞是包含编码所述第 一抗体的分离的核酸分子或包含所述分离的核酸分子的载体的宿主细胞; 表达所述第二抗体的重组细胞是包含编码所述第二抗体的分离的核酸分子 或包含所述分离的核酸分子的载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限 于,原核细胞例如大肠杆菌细胞,以及真核细胞例如酵母细胞,昆虫细胞, 植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞,例如小鼠细胞、人细胞等)。在 某些实施方案中,本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞,例如CHO(例如 CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)。
在某些实施方案中,表达所述第一抗体的重组细胞是杂交瘤细胞株 18B2-2,其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号 CCTCC NO.C2019303;和,表达所述第二抗体的重组细胞是杂交瘤细胞 株2A7,其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号 CCTCC NO.C2019302。
检测方法及用途
在第三方面,本发明提供了一种检测HBcAg蛋白在样品中的存在或 其水平的方法,其包括以下步骤:
(1)将所述样品与第一抗体接触,以形成抗体-抗原复合物,所述第一 抗体如第一方面中所定义;
(2)使所述抗体-抗原复合物与第二抗体接触,以形成抗体-抗原-抗体 复合物,所述第二抗体如第一方面中所定义;和
(3)测定所述抗体-抗原-抗体复合物的量。
所述方法可以用于诊断目的,或者非诊断目的。在某些实施方案中, 本发明的方法用于非诊断目的。在此类实施方案中,由于待测的样品已知 含有HBcAg,也即在施用本发明的方法进行检测前,该样品的同一主体已 具备诊断结果;因此,本发明的方法对于该样品的诊断步骤而言并无任何 帮助。由此可见,本发明的方法的直接目的并不在于获得该样品的同一主 体的诊断结果,而是在于对该已知诊断信息的样品进行进一步的精确定量 检测。
在一些实施方案中,所述第二抗体带有可检测标记。在某些实施方案 中,步骤(3)中所述的测定包括以下步骤:(3a)检测可检测标记的量;(3b) 将步骤(3a)所获得的可检测标记的量与表示HBcAg已知量与所述可检测标 记的量的关系的标准曲线比较,并获得HBcAg的含量。在某些实施方案 中,步骤(3)中所述的测定包括以下步骤:(3a)检测可检测标记的量(例如 发光值);(3b)将步骤(3a)所获得的可检测标记的量(例如发光值)与Cutoff值比较,当所述比值小于1时,认为该样品为阴性,当所述比值大于等 于1时,认为该样品为HBcAg阳性。在某些实施方案中,当所述可检测标 记为吖啶酯类化合物时,所述Cutoff值为9000。
在另一些实施方案中,所述第二抗体不带有可检测标记。在类实施方 案中,步骤(3)中所述的测定包括使用带有可检测标记的第三抗体来检测所 述抗体-抗原-抗体复合物。在某些实施方案中,所述第三抗体能够特异性结 合所述第二抗体(例如,能够特异性结合所述第二抗体的恒定区)。在某 些实施方案中,步骤(3)中所述的测定可以包括以下步骤:(3a)使所述抗体 -抗原-抗体复合物与带有可检测标记的第三抗体接触;(3b)检测可检测标 记的量;(3c)将步骤(3b)所获得的可检测标记的量与表示HBcAg已知量与 所述可检测标记的量的关系的标准曲线比较,并获得HBcAg的含量。在某 些实施方案中,步骤(3)中所述的测定包括以下步骤:(3a)使所述抗体-抗原 -抗体复合物与带有可检测标记的第三抗体接触;(3b)检测可检测标记的量 (例如发光值);(3c)将步骤(3b)所获得的可检测标记的量(例如发光值) 与Cut off值比较,当所述比值小于1时,认为该样品为阴性,当所述比值 大于等于1时,认为该样品为HBcAg阳性。在某些实施方案中,当所述可 检测标记为吖啶酯类化合物时,所述Cut off值为9000。
在某些实施方案中,所述可检测标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或 碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物 素。
在某些实施方案中,在步骤(3)中,所述测定选自酶免疫测定法或化学 发光免疫分析法。
在某些实施方案中,在步骤(1)之前,所述方法还包括处理所述样品的 步骤,所述处理包括:将裂解剂与所述样品混合以裂解病毒。在某些实施 方案中,所述处理还包括使用中和剂终止所述裂解反应。
在某些实施方案中,所述裂解剂、中和剂如第一方面中定义。
在某些实施方案中,所述第一抗体包被于固相载体的表面。在某些实 施方案中,所述固相载体选自磁珠或微量滴定板(例如微孔板或酶标板)。
在某些实施方案中,在步骤(2)和/或步骤(3)之前还包括洗涤步骤。所述 洗涤步骤可以去除未参与反应的物质。
在某些实施方案中,所述样品选自全血、血浆和血清。
在另一方面,本发明还涉及第一方面所述的试剂盒在制备用于检测 HBcAg蛋白在样品中的存在或其水平的检测试剂盒中的用途。
在某些实施方案中,所述试剂盒通过第三方面所述的方法来检测 HBcAg蛋白在样品中的存在或其水平。
2A7单抗及其用途
目前在组织或细胞样品的HBcAg免疫学检测(例如免疫组化或免疫 荧光)中所采用的抗HBcAg抗体为多克隆抗体,多克隆抗体可以提高检测 的灵敏度,但往往具有背景较高而特异性较低、并且应用其进行的免疫组 化结果不易标准化等缺点。然而,目前尚无抗HBcAg单克隆抗体用于组织 或细胞样品的HBcAg免疫学检测的报道。
本发明人出乎意料地发现了适用于组织或细胞样品的HBcAg免疫学 检测的单克隆抗体,基于该单克隆抗体的检测效果能够达到与商业化多克 隆抗体相当的水平,这是显著的、意料不到的且非常有利的技术效果。
因此,在第四方面,本发明还提供了一种能够特异性结合HBcAg的单 克隆抗体或其抗原结合片段,其中,
(i)所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:包含下述3个互补决定区 (CDR)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:11的HCDR1、序列 为SEQ ID NO:12的HCDR2、以及序列为SEQ ID NO:13的HCDR3; 和/或,包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:14的LCDR1、序列为SEQ ID NO:15的LCDR2、以及序列 为SEQ ID NO:16的LCDR3;或者,
(ii)所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:包含SEQ ID NO:9所示 的重链可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH);和/或,包含SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL); 优选地,所述重链可变区中含有的3个CDR,和/或所述轻链可变区中含 有的3个CDR,由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义;或者,
(iii)所述单克隆抗体是杂交瘤细胞株2A7所产生的单克隆抗体,其中, 杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏 号CCTCC NO.C2019302。
在某些实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:9所示的序列;(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个 氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的 置换、缺失或添加)的序列;或(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少 80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序 列同一性的序列;
和/或,
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:(iv)SEQ ID NO:10所示的序列;(v)与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几 个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸 的置换、缺失或添加)的序列;或(vi)与SEQ ID NO:10所示的序列具有 至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至 少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100% 的序列同一性的序列。
在某些实施方案中,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:具有如 SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:10所示的序列的 VL。
在某些实施方案中,所述单克隆抗体包含重链恒定区(CH)和轻链恒 定区(CL)。在某些实施方案中,所述单克隆抗体是IgG、IgM、IgE、IgD 或IgA抗体。
在某些实施方案中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、 二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb)。在某些实 施方案中,所述单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在另一方面,本发明还涉及第四方面所述的单克隆抗体或其抗原结合 片段在制备用于检测样品中的HBcAg的试剂中的用途。
在某些实施方案中,所述样品是组织样品(例如组织切片)或细胞样品。
在某些实施方案中,所述检测是免疫学检测。在某些实施方案中,所 述免疫学检测选自免疫组织化学Immunohistochemistry(IHC)、免疫细胞 化学Immunocytochemistry(ICC)、免疫荧光Immunofluorescence(IF)和 Western Blot。
在一个实施方案中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的 标记。
在另一个实施方案中,所述用于检测样品中的HBcAg的试剂还包含 带有可检测的标记的二级抗体。
在某些实施方案中,所述二级抗体对所述单克隆抗体或其抗原结合片 段所包含的恒定区所来自的物种(例如小鼠)的抗体是特异的。
在某些实施方案中,所述二级抗体是抗-免疫球蛋白抗体,例如抗IgG 抗体。
在某些实施方案中,所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶 或碱性磷酸酶)、荧光染料或生物素。
在某些示例性实施方案中,当所述免疫学检测选自免疫组织化学(IHC)、 免疫细胞化学(ICC)、或Western Blot时,所述可检测的标记选自酶。
在某些示例性实施方案中,当所述免疫学检测选自免疫荧光(IF)时,所 述可检测的标记选自荧光染料。
术语定义
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有 本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的病毒学、生物化 学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时, 为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的,术语“HBcAg”是指,乙型肝炎病毒(HBV)的 核心抗原,也称为核衣壳蛋白,其是本领域技术人员公知的(参见,例如 NCBI GENBANK数据库登录号:GU357842.1)。HBcAg蛋白包含位于其 N端的参与VLP组装的装配区,以及位于其C端的富含精氨酸的结构域 (Arginine Rich Domain,ARD)。
如本文中所使用的,当提及HBcAg的氨基酸序列时,其使用SEQ ID NO:17所示的序列来进行描述。例如,表述“HBcAg的第150-183位氨基 酸残基”是指,SEQ ID NO:17所示的多肽的第150-183位氨基酸残基。然 而,本领域技术人员理解,在HBcAg的氨基酸序列中,可天然产生或人工 引入突变或变异(包括但不限于,置换,缺失和/或添加,例如不同基因型或基因亚型的HBcAg),而不影响其生物学功能。因此,在本发明中,术 语“HBcAg”应包括所有此类序列,包括例如SEQ ID NO:17所示的序列以 及其天然或人工的变体。并且,当描述HBcAg的序列片段时,其不仅包括 SEQ ID NO:17的序列片段,还包括其天然或人工变体中的相应序列片段。 例如,表述“HBcAg的第150-183位氨基酸残基”包括,SEQ ID NO:17的 第150-183位氨基酸残基,以及其变体(天然或人工)中的相应片段。根 据本发明,表述“相应序列片段”或“相应片段”是指,当对序列进行最优比 对时,即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时,进行比较的序列中 位于等同位置的片段。
如本文中所使用的,术语“Dane颗粒”又称为大球形颗粒,是指完整 的具有传染性的乙肝病毒颗粒,具有双层衣壳结构。HBcAg通常存在于 Dane颗粒的核心。因此为检测HBcAg,通常需要先裂解Dane颗粒外壳, 以使HBcAg暴露游离。
如本文中所使用的,术语“特异性结合”是指,两分子(即结合分子与 靶分子)之间的非随机的结合反应,如抗体和其所针对的抗原之间的反应。 两分子之间的结合亲和力可用KD值描述。KD值是指由kd(特定的结合分 子-靶分子相互作用的解离速率;亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分 子相互作用的缔合速率;亦称为kon)之比得到的解离常数,或者指表示 为摩尔浓度(M)的kd/ka。KD值越小,两分子结合越紧密,亲和力越高。 在某些实施方式中,特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗 体)是指,抗体以小于大约10-5M,例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、 10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。KD值可通过本领域熟 知的方法确定,例如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定。
如本文中所使用的,术语“免疫学检测”是指,利用抗原-抗体之间的 特异性相互作用/结合亲和力来进行的测定,其一般可用于检测特定抗原或 者抗体在样品中的存在或水平。此类免疫学检测是本领域技术人员公知的, 包括但不限于,酶免疫测定法(EIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、 放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定法(FIA)、Western印迹法、免 疫比浊法、表面等离子共振法等。关于免疫学检测的详细描述,可参见例 如,Fundamental Immunology,Ch.7Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press, N.Y.(1989)。
如本文中所使用的,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具 有一条轻链(LC)和一条重链(HC))组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分 类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并 且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重 链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链 还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和 重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。 各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构 域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效 应子功能,如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL 区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较 保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR 和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合部 位。氨基酸在各区域或结构域的分配可遵循Kabat,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md. (1987and 1991)),或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917; Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的,术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区 中负责抗原结合的氨基酸残基。在重链和轻链的可变区中各含有三个CDR, 命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知 的各种编号系统进行定义,例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;Chothia等人(1989) Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat. Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的抗体,本领域技术人员将 容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且,不同编号系统之间的对应关 系是本领域技术人员熟知的(例如,可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat. Immunol.27:55-77,2003)。
在本发明中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR可根据本 领域已知的各种编号系统确定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗 原结合片段含有的CDR优选地通过Kabat、Chothia或IMGT编号系统确 定。在某些实施方案中,本发明的抗体或其抗原结合片段含有的CDR优选 地通过Kabat编号系统确定。
如本文中所使用的,术语“构架区(framework region)”或“FR” 残基是指,抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残 基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如,其包括, 重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体,例 如,IgG(例如,IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE 或IgM抗体。
如本文中所使用的,术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体 的片段的多肽,其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力,和/ 或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合,其也被称为“抗原结合部分”。 通常参见,Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版,Raven Press,N.Y.(1989),其以其全文通过引用合并入本文,用于所有目的。可通 过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合 片段。抗原结合片段的非限制性实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、 互补决定区(CDR)片段、scFv、双抗体(diabody)、单域抗体(single domain antibody)、嵌合抗体、线性抗体(linear antibody)、纳米抗体(技术来 自Domantis)和这样的多肽,其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的 抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005;Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的,术语“全长抗体”意指,由两条“全长重链”和 两条“全长轻链”组成的抗体。其中,“全长重链”是指这样的多肽链, 其在N端到C端的方向上由重链可变区(VH)、重链恒定区CH1结构域、 铰链区(HR)、重链恒定区CH2结构域、重链恒定区CH3结构域组成; 并且,当所述全长抗体为IgE同种型时,任选地还包括重链恒定区CH4结 构域。优选地,“全长重链”是在N端到C端方向上由VH、CH1、HR、 CH2和CH3组成的多肽链。“全长轻链”是在N端到C端方向上由轻链 可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。两对全长抗体链通过在CL 和CH1之间的二硫键和两条全长重链的HR之间的二硫键连接在一起。本 发明的全长抗体可以来自单一物种,例如人;也可以是嵌合抗体或人源化 抗体。本发明的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合部 位,这两个抗原结合部位特异性识别/结合相同的抗原。
如本文中所使用的,术语“Fd”意指由VH和CH1结构域组成的抗体 片段;术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人, Nature 341:544 546(1989));术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和 CH1结构域组成的抗体片段;术语“F(ab’)2片段”意指包含通过铰链区上 的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段;术语“Fab’片段”意指还原连 接F(ab’)2片段中两个重链片段的二硫键后所获片段,由一条完整的轻链和 重链的Fd片段(由VH和CH1结构域组成)组成。
如本文中所使用的,术语“Fv”意指由抗体的单臂的VL和VH结构 域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是,能形成完整的抗原结合位点的 最小抗体片段。一般认为,六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而, 即便是一个可变区(例如Fd片段,其仅仅含有三个对抗原特异的CDR) 也能够识别并结合抗原,尽管其亲和力可能低于完整的结合位点。
如本文中所使用的,术语“Fc”意指,由抗体的第一重链的第二、第 三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。 抗体的Fc片段具有多种不同的功能,但不参与抗原的结合。
如本文中所使用的,术语“scFv”是指,包含VL和VH结构域的单 个多肽链,其中所述VL和VH通过接头(linker)相连(参见,例如,Bird 等人,Science 242:423-426(1988);Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988);和Pluckthun,ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Roseburg和Moore编,Springer-Verlag,纽约, 第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构:NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的 GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头,但也可使用其变体(Holliger等人(1993),Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人 (1995),Protein Eng.8:725-731,Choi等人(2001),Eur.J.Immunol.31:94- 106,Hu等人(1996),Cancer Res.56:3055-3061,Kipriyanov等人(1999), J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001),Cancer Immunol.描述。在 一些情况下,scFv的VH与VL之间还可以存在二硫键。
如本文中所使用的,术语“双抗体”意指,其VH和VL结构域在单 个多肽链上表达,但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域 之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗 原结合部位(参见,例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993),和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
如本文中所使用的,术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)” 具有本领域技术人员通常理解的含义,其是指由单个单体可变抗体结构域 (例如单个重链可变区)所组成的抗体片段,其保持特异性结合全长抗体 所结合的相同抗原的能力。单域抗体也称为纳米抗体(nanobody)。
上述各个抗体片段均保持了特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的 能力,和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如,重组DNA技术或酶促 或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的抗体)获得抗体的抗原 结合片段(例如,上述抗体片段),并且以与用于完整抗体的方式相同的 方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中,除非上下文明确指出,否则当提及术语“抗体”时,其不 仅包括完整抗体,而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的,术语“嵌合抗体(Chimeric antibody)”是指, 这样的抗体,其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特 定物种或属于某一特定抗体类或亚类),且轻链或/和重链的另一部分源自 另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或 亚类),但无论如何,其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P4,816,567 to Cabilly et al.;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:68516855 (1984))。例如,术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体), 其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体),而抗体的 重链和轻链可变区来自第二抗体(例如人抗体)。
如本文中所使用的,术语“人源化抗体”是指,经基因工程改造的非 人源抗体,其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常 而言,人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体), 全部或部分的非CDR区(例如,可变区FR和/或恒定区)来自于人源免 疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质,包括但不限于,抗原特异性、亲和性、反应性等。供体抗体可以是有预期性 质(例如,抗原特异性、亲和性、反应性等)的小鼠、大鼠、兔或非人灵 长类动物(例如,食蟹猴)抗体。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以根据上述制备的鼠单克隆抗体的 序列进行制备。编码重链和轻链的DNA可以从目标鼠杂交瘤中获得,并且 使用标准分子生物学技术进行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白 序列。
为制备嵌合抗体,可使用本领域已知的方法将鼠免疫球蛋白可变区连 接至人免疫球蛋白恒定区。例如,将编码VH的DNA可操作的连接至编码 重链恒定区的另一DNA分子以获得全长重链基因。人重链恒定区基因的 序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242),包含这些区的 DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区,但是通常优选为IgG1或IgG4 恒定区。例如,将编码VL的DNA可操作的连接至编码轻链恒定区CL的 另一DNA分子以获得全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定 区基因的序列是本领域已知的(参见例如Kabat,E.A.等人(1991) Sequencesof Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Healthand Human Services,NIH Publication No.91- 3242),包含这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定 区可以是κ或λ恒定区,但通常优选为κ恒定区。
为制备人源化抗体,可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区插入人 源框架序列(参见Winter的美国专利No.5,225,539;Queen等人的美国专 利Nos.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370;以及Lo,Benny,K.C., editor,in Antibody Engineering:Methods and Protocols,volume 248, Humana Press,New Jersey,2004)。
如本文中所使用的,术语“载体(vector)”是指,可将多聚核苷酸插入 其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表 达时,载体称为表达载体。载体可以通过转化,转导或者转染导入宿主细 胞,使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术 人员公知的,包括但不限于:质粒;噬菌粒;柯斯质粒;人工染色体,例 如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体 (PAC);噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动 物病毒包括但不限于,逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、 疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空 泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件,包括但不限于, 启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外, 载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞, 其包括但不限于,如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞,如酵母细胞或曲霉 菌等的真菌细胞,如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞,或者如纤维原细 胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK 293 细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的,术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸 之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱 基或氨基酸单体亚单元占据时(例如,两个DNA分子的每一个中的某个位 置都被腺嘌呤占据,或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据), 那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由 这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。 例如,如果两个序列的10个位置中有6个匹配,那么这两个序列具有60% 的同一性。例如,DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50%的同一性(总 共6个位置中有3个位置匹配)。通常,在将两个序列比对以产生最大同一 性时进行比较。这样的比对可通过使用,例如,可通过计算机程序例如Align 程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E. Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.,4:11-17(1988))的算法,使用 PAM120权重残基表(weightresidue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口 罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外,可使用已整合入 GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和 Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和 1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一 性。
如本文中所使用的,术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包 含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如,可通过本领域 内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨 基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换,例如 用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、 电荷、化学性质,包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已 在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有 碱性侧链(例如,赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷 氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、 苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如,苏 氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、 组氨酸)的氨基酸。因此,优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替 代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参 见,例如,Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人 Protein Eng.12(10):879-884(1999);和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如, Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds., Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其以引用的方式并入本文 中。在本发明中,术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使 用。并且在本发明中,氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来 表示。例如,丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的,术语“受试者”包括但不限于各种动物,特别是哺 乳动物,例如人。
有益效果
本发明提供了一种基于特定抗体的HBcAg检测试剂盒以及基于该试 剂盒的建立的双抗体夹心法。与现有技术相比,本发明的技术方案能够达 到与DNA相当水平的检测灵敏度,且可以实现快速、高通量检测,具备重 大临床应用价值。
此外,本发明还提供了一种抗HBcAg单克隆抗体,其能够用于免疫组 化、免疫荧光等多种组织或细胞样品的免疫学检测领域,且能够达到与商 业化多克隆抗体类似的检测效果,因此具有广阔的应用前景。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本 领域技术人员将理解,下列附图和实施例仅用于说明本发明,而不是对本 发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述,本发明的 各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了包含不同长度的HBV抗原的真核表达质粒示意图。
图2分别显示了2A7作为一抗对不同长度的HBV抗原的western blot 分析结果。
图3显示了本发明的酶免检测法对不同样本中HBcAg的检测结果。
图4显示了本发明的化学发光检测法与PCR检测结果的相关性。
图5显示了2A7作为HBcAg免疫荧光检测抗体对细胞样品的免疫荧 光检测结果。
图6显示了2A7作为HBcAg免疫组化检测抗体对组织切片的免疫组 化检测结果。
序列信息
本申请涉及的序列的信息描述于下面的表中。
关于生物材料保藏的说明
本发明涉及下列生物材料:
1)分类命名:杂交瘤细胞株18B2-2;保藏号:CCTCC NO.C2019303; 保藏时间:2019年11月28日;保藏单位:中国典型培养物保藏中心 (CCTCC);保藏地址:中国,武汉,武汉大学。
2)分类命名:杂交瘤细胞株2A7;保藏号:CCTCC NO.C2019302; 保藏时间:2019年11月28日;保藏单位:中国典型培养物保藏中心 (CCTCC);保藏地址:中国,武汉,武汉大学。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述 本发明。
除非特别指明,本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法, 基本上参照J.Sambrook等人,分子克隆:实验室手册,第2版,冷泉港 实验室出版社,1989,以及F.M.Ausubel等人,精编分子生物学实验指南, 第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1995中所述的方法进行;限制性内切 酶的使用依照产品制造商推荐的条件。实施例中未注明来源的试剂均是本 领域的常规试剂或市售可得的试剂。本领域技术人员知晓,实施例以举例 方式描述本发明,且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1:c183抗原的制备
1.1合成构建C183克隆(其序列如SEQ ID NO:17所示),利用大肠 杆菌表达体系,制备C183B抗原。
1.2纯化C183抗原
收集菌液打超声破碎,将破碎液12000rpm,10℃离心10min,留取上 清。而后65℃水浴20min,留取上清。
样品对1×PB7.4透析。准备中压DEAE-FF层析(GE介质)
收集穿透峰溶液(目的蛋白)。而后过Capto Core700分子筛纯化。 收集第一个样品峰即可。
实施例2:anti-HBcAg小鼠单克隆抗体的制备
2.1小鼠免疫
2.1.1免疫原的准备:免疫原为大肠杆菌重组表达的HBcAg(C183抗 原)蛋白。取重组抗原稀释至0.4mg/mL,与弗氏佐剂等体积混合,使其成 油包水状乳剂(判断混合液是否乳化完全的方法:可将一小滴混合液滴在 清水的液面上,若混合液凝聚不散,则可认为已基本上混匀)。初次免疫 使用弗氏完全佐剂,后续加强免疫使用弗氏不完全佐剂,并且融合前72h 的最后一次加强免疫不加佐剂。
2.1.2小鼠的基础免疫:使用上述免疫原对6-8周龄BALB/c雌鼠进行 皮下多点注射免疫,注射剂量为500μL/只/次,每次免疫前采集200μL 眼球静脉血以备滴度测定。每隔2周加强免疫一次。用间接ELISA测定血 清滴度,当小鼠血清滴度达到平台期后,小鼠停止免疫并休息两个月后进 行融合。
2.1.3融合前72小时的免疫加强(Final boost):小鼠脾脏细胞与小鼠 骨髓瘤细胞融合前72h进行脾脏免疫加强,此次加强的免疫原不含佐剂, 取100μl 0.5mg/mL的重组蛋白进行注射。其中脾脏免疫前,需先用乙醚 麻醉小鼠,剖开腹腔外皮取出脾脏,沿脾脏纵向注射100μL抗原,迅速 手术缝合腹皮切口。
2.2融合杂交瘤的制备与筛选
融合前72h加强免疫后,取小鼠脾脏制成细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0进行细胞融合,以获得杂交瘤细胞。在此之前先制备饲养细胞。在杂 交瘤细胞的培养过程中,融合后的大量骨髓瘤细胞和脾细胞在1640-HAT 培养液中相继死亡,单个细胞或少数分散的细胞不易存活,必须加入其他 细胞方能使之生存,这种被加入的活细胞称为饲养细胞。本实验室使用小 鼠腹腔巨噬细胞或13天龄的小鼠胸腺细胞作为饲养细胞。
2.2.1小鼠巨噬细胞的制备:分如下步骤进行:(i)将一只6周龄左右 的BALB/c小鼠引颈处死,自来水冲洗,浸泡于75%乙醇溶液中5min; 放入超净工作台,使小鼠腹部朝上;用镊子提起小鼠腹部皮肤,剪一小口, 用大镊子向上下方向撕拉开皮肤,充分暴露腹部。(ii)用无菌眼科镊子提 起腹膜,然后用5mL注射器向腹腔内注入适量培养液,用另一无菌眼科 镊子轻微提动小鼠四肢,最后利用注射器吸出培养液于离心管中。(iii)将 腹腔细胞液溶解于HAT培养液或HT培养液中,使成浓度为2×105/mL的 巨噬饲养细胞。(iv)加入96孔细胞培养板,每孔0.1mL,置培养箱培养; 也可直接与融合细胞混合后添加到96孔细胞培养板中。
2.2.2小鼠胸腺细胞的制备:分如下步骤进行(i)将一只13天龄左右 的BALB/c小鼠引颈处死,自来水冲洗,浸泡于75%乙醇溶液中5min; 放入超净工作台,使小鼠腹部朝上;(ii)用镊子提起小鼠腹部皮肤,将腹 部和胸部的外皮剪开。(iii)用另一把干净的剪刀剪开胸腔,用镊子取出乳 白色的胸腺,经研磨后通过200目细胞筛,得到胸腺饲养细胞液。
2.2.3小鼠骨髓瘤细胞的制备:分如下步骤进行。(i)小鼠骨髓瘤细胞 株Sp2/0-Ag14(Sp2/0)易培养,融合率高,是目前最理想的融合细胞,但 Sp2/0杂交瘤细胞系对培养条件的变化比NS-1敏感,过度稀释(密度低于 3×105/mL)和pH碱性(pH高于7.3)时生长不良。(ii)选择对数生长 期的细胞进行融合。(iii)融合前从培养瓶移出骨髓瘤细胞于离心管,用 RPMI-1640培养液洗3次(1000rpm×5min)。用RPMI-1640培养液重 悬细胞,计数。(iv)一般融合前5天开始复苏小鼠骨髓瘤细胞,每次融合 约需6瓶35cm2 Sp2/0细胞。
2.2.4免疫脾细胞的制备:分如下步骤进行。(i)取待融合的BALB/C 小鼠,摘除眼球放血致小鼠死亡,收集的血液制成抗血清,可作抗体检测 的阳性对照。自来水冲洗,浸泡于75%乙醇溶液中5min,随即放入超净 台内小鼠解剖板上,右侧卧位。(ii)无菌手术打开腹腔取出脾脏,用剪刀 剪成小块放于200目细胞筛网上,再用研磨棒(注射器内芯)挤压研磨, 同时用吹管滴加RPMI-1640培养液。(iii)补加适量RPMI-1640培养液, 静置3-5min,取上2/3部分悬液移入50mL塑料离心管中。上述过程反复 2-3次。(iv)用RPMI-1640培养液洗细胞3次(1000rpm×10min)。 (v)用RPMI-1640培养液重悬细胞,计数。
2.2.5使用PEG促融剂融合制备杂交瘤:分如下步骤进行。(1)融合 前先将1mL的PEG-1500和10mL的RPMI-1640无血清培养基和200 mL完全培养基预温至37℃。(ii)将制备的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于 50mL离心管内(1×108脾细胞+1×107骨髓瘤细胞,约10:1),离心1500 rpm×8min,离心后,轻轻弹击管底,使细胞疏松成糊状。(iii)1mL吸 管吸取0.8mL(按1×108脾细胞+0.8mL PEG)加入离心管内,边加边 轻轻搅拌,PEG平均在60s内加完,随即加入10mL预温至37℃的RPMI- 1640完全培养液,搅拌要温和。最后补加RPMI-1640培养液至40mL,离 心1000rpm×5min。(iv)弃上清液,取少量HT培养液将细胞小心吹散, 将细胞移入准备好的HT培养液中,加入96孔细胞培养板,每孔0.1mL, 放入CO2孵育箱中培养。(v)12h后,配置适量的HAT完全培养基,每 个孔中滴加0.1mL;5天后,用HT完全培养基给孔中的细胞上清进行 50-100%的换液;大约9-14天后,吸取上清检测。
2.2.6杂交瘤的筛选:间接ELISA筛选,包被重组抗原100ng/mL,每 孔包被0.1mL,加入细胞上清50uL检测,并挑选出阳性克隆孔。
2.2.7杂交瘤细胞的克隆化:采用有限稀释法,先把细胞按一定浓度进 行梯度稀释,然后接种到96孔细胞培养板的每个孔中,尽可能使孔内只有 一个细胞生长。杂交瘤单克隆阳性细胞株一般需要重复克隆2-3次,直到100%阳性后确认为稳定克隆株。
2.3单抗腹水的生产
取BALB/c小鼠2-3只,经腹腔注入0.5mL液体石蜡油。1周后,将 对数生长期的杂交瘤细胞以1000rpm离心5min,弃上清液。杂交瘤细 胞用无血清培养液悬浮,并将细胞数调至(1-2)×106/mL,每只小鼠腹腔 注射0.5mL。7-10d后,小鼠腹部明显膨大后,引颈处死小鼠,自来水冲 洗,浸洗,浸泡于75%乙醇中5min,使小鼠腹部朝上用注射针头固定四 肢于小鼠解剖台板。用镊子提起小鼠腹部皮肤,剪一小口,然后从两边向 小鼠背部方向剪开,用大镊子向上下方向撕开皮肤,充分暴露腹部。用无 菌眼科镊子提取腹膜,将腹膜中央处剪一小口,然后用1mL吸管通过小口 吸出腹腔内全部腹水。收集的腹水可以混合,置离心管离心,3000rpm, 20min。离心后收集上清。
2.4单抗腹水的纯化
经硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化(购自美国GE公司),获得 纯化的单克隆抗体。
通过上述方法共获得一下单克隆抗体:1B11、2A7、6E1、14C6、18B2- 2、14C7、5H4、1F9。其中,所获得的杂交瘤细胞株2A7和18B2-2在中国 典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了如上文中所描述的保藏。
实施例3:anti-HBcAg小鼠单克隆抗体的体外表位鉴定
3.1多肽合成
以HBV序列GenBank ID:CAA59669.1作为参考序列,合成31条多 肽(委托上海生工生物科技有限公司合成)。这31条多肽(s1-s31)一起 覆盖了HBcAg的全长183个氨基酸。S1-S31的多肽信息如下表1所示, HBcAg的全长氨基酸序列如GenBank:GU357842.1所示。
表1:S1-S31的多肽信息
3.2Anti-HBcAg小鼠单克隆抗体与多肽的S1-S31的反应性分析
3.2.1反应板的制备
将多肽用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液,终 浓度为50mM,pH值为9.6)稀释,终浓度为5μg/mL;在96孔酶标板每 孔中加入100μL的包被液,2~8℃包被16~24小时后再37℃包被2小 时;用PBST洗涤液(20mM PB7.4,150mM NaCl,0.1%Tween20)洗 涤1次;然后每孔加入200μL的封闭液(含有20%小牛血清及1%酪蛋白 的pH值为7.4的20mMNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液),放入37℃封 闭2小时;弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
3.2.2Anti-HBcAg小鼠单克隆抗体的ELISA检测
取2.1中获得的Anti-HBcAg小鼠单克隆抗体以含20%新生牛血清的 PBS溶液稀释至1μg/mL,进行定性ELISA检测。
样品反应:取36种已包被多肽的酶标板,每孔加入100μL已稀释的 样品,置于37℃温箱反应30分钟。
酶标记物反应:完成样品反应步骤后,将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mMNaCl,0.1%Tween20)洗涤5遍,每孔加入100μL HRP 标记的羊抗鼠IgG(GAM)反应液,置于37℃温箱反应30分钟。
显色反应:完成酶标记物反应步骤后,将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4,150mMNaCl,0.1%Tween20)洗涤5遍,每孔加入TMB显色剂 (购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL,置于37℃温箱反应15 分钟。
终止反应及读值测量:完成显色反应步骤后,在反应完的酶标板中每 孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL,并于酶标仪 上检测各孔的OD450/630值。
Anti-HBcAg小鼠单克隆抗体与36种多肽的反应性判定:根据反应后 的读值进行判定。若检测值/本底值大于5,则判定为阳性。
3.2.3Anti-HBcAg小鼠单克隆抗体的识别性质分析
结果如表2所示。所获得的Anti-HBcAg小鼠单克隆抗体的识别类型 可分为5组(根据其识别性质),分别为:sA、sB、sC、sD、sE,其中sA 组抗体识别的多肽为S29/S30,其中2A7、14C6、14C7属于sA组;sB组 抗体识别的多肽为S31,其中1F9、18B2-2属于sB组中;sC组抗体识别 的多肽为S1;sD组抗体识别的多肽为s26、s27;和sE组抗体识别的多肽 为s15、s16。
表2:单抗多肽识别性质分析
分组 | 单抗名称 | 单抗亚型 | 识别的多肽 |
sA | HBc-2A7 | IgG2B | S29/S30 |
sA | HBc-14C6 | IgG1 | S29/S30 |
sC | HBc-5H4 | IgG1 | S1 |
sA | HBc-14C7 | IgG1 | S29/S30 |
sB | HBc-18B2-2 | IgG1 | S31 |
sD | HBc-1B11 | IgG1 | S26/S27 |
sE | HBc-6E1 | IgG2A | S15/S16 |
sB | HBc-1F9 | IgG2B | S31 |
表3:2A7/18B2-2具体表位的反应情况
抗体2A7、18B2-2与相应表位的具体检测结果如表3所示,2A7的表 位在141-152aa,18B2-2的表位在150-183aa。
实施例4:体内的表位鉴定
4.1真核质粒构建方法
我们将HBV基因的HBcAg序列及其N端-29至-1共222个氨基酸段 的序列分别构建到真核表达载体(EHRP载体,获得自厦门大学国家传染 病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心)CMV启动子下游,其结构示意图如 图1所示,其中C149至C183是HBcAg序列(从+1位置开始)分别从C 端进行截短至数字对应的氨基酸位置,pca-C183为-29至183段,pcb-C183 为-20至183段,pcc-C183为-10至183段。
4.2真核表达以及western blot评估
293β5细胞铺6孔板,待12h贴壁后细胞密度达到80-90%左右进行转 染,使用lipo3000转染试剂将构建好的真核表达质粒分别转染293β5细胞, 并于转染后12h更换培养基(DMEM+10%Gibco FBS),继续培养48h后 弃细胞上清,并用PBS洗涤一次细胞,每孔添加300μL细胞裂解液,4℃ 静置1h裂解,收集裂解液于1.5ml EP管中,12000rpm 4℃离心10min, 收集上清至干净的1.5ml EP管中,并对裂解样品进行western blot分析 (二抗为羊抗鼠-HRP,来源于proteintec公司)。
4.3结果分析
利用体内真核构建的不同长度的抗原评估单抗,结果如图2所示, 结果验证了2A7-21识别位点为141-152aa。
实施例5:双抗体夹心法中磁珠包被单抗和吖啶酯标记单抗的筛选
本实施例使用常规双抗体夹心法实验条件、通过实验筛选磁珠包被单 抗和吖啶酯标记单抗的最佳配对。
5.1HBcAg磁珠包被单抗制备
磁性微粒子溶液制备,磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的 磁珠,粒径为1.5~3um;其制备方法为:将磁性微粒子、EDC与NHS的 质量比为1:1:1,并加入pH为5.0的50mM MES溶液,使磁性微粒子浓 度为4mg/mL,放置在垂直旋转仪上活化,活化环境温度25℃,时间20min; 将活化后的磁性微粒子与抗HBcAg单克隆抗体比例为每毫克磁性微粒子标记15ug的抗HBcAg单克隆抗体,放置在垂直旋转仪上标记,反应环境 温度25℃,时间3h;将反应后的磁性微粒子用洗液洗涤3次,加入含有甘 氨酸、0.5%牛血清白蛋白、0.05%Triton X-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲 液,使磁性微粒子浓度为4mg/mL,放置在垂直旋转仪上终止,反应环境 温度25℃,时间2h;将终止后的磁性微粒子用洗液洗涤3次,加入含有0.5%(W/V)牛血清白蛋白、0.5%(W/V)酪蛋白、0.05%T(W/V)ritonX- 100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液,使磁性微粒子浓度为4mg/mL, 2-8℃保存备用;
以上述方法对识别aa150-183的单克隆抗体(18B2-2、1F9)进行MS300 磁珠包被,制备磁性微粒子溶液。
5.2HBcAg吖啶酯标记单抗制备
吖啶酯标记抗体溶液制备,其制备方法为:取待标记抗HBcAg单克隆 抗体50ug,加入含NaCl的磷酸盐缓冲液至体积为300μL,再加入5μL吖 啶酯母液,振荡混匀,室温避光反应30min;反应后加入200μL含NaCl和 甘氨酸的磷酸盐缓冲液,手工颠倒20次混匀,室温避光反应30min;反应 后将产物转移至透析袋中,透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液,2- 8℃避光透析,每隔2h换一次PBS缓冲液,共更换3次,以除去未标记的 吖啶酯;将标记物取出,按实际体积加入10%(W/V)牛血清白蛋白至牛 血清白蛋白的终浓度为0.1%(V/V 1:100),加入等体积甘油,手工颠倒混 匀后,-15℃以下避光保存备用。
以上述方法对6株HBcAg单克隆抗体(1B11、2A7、6E1、14C6、14C7、 5H4)进行吖啶酯标记。
5.3实验方法
5.3.1标本:
HBV病毒阳性(PCR检测)临床血清标本,阳性样本利用20%NBS稀 释至1*107、1*106、1*105、1*104、1*103不同的DNA载量,利用不同的 DNA载量样本开展检测,HBV病毒阴性(PCR检测)临床血清标本。
5.3.2加样:
取25ul样本,加入12.5ul 20%LDS,混匀后37℃孵育30min,加入 30ul10%CHAPS中和,混匀后加入50ul磁珠包被单抗,37℃孵育15min, 孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,再加入50ul 吖啶酯标记单抗,震荡混匀后37℃孵育10min,孵育结束后,用含0.05~0.08% 的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,加入预激发液100~200ul,进行预激发。去 除预激发液,加入激发液100~200ul,进行激发和检测。
以上述方法正交检测各磁珠包被单抗与吖啶酯标记单抗配对,求P/N (阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)值。结果见下表。
表4-1:磁珠包被单抗18B2-2与吖啶酯标记单抗配对检测的P/N值。
表4-2:磁珠包被单抗1F9与吖啶酯标记单抗配对检测的P/N值。
表4-1及4-2显示了当以识别HBcAg aa150-183(即,识别HBcAg的 富含精氨酸的结构域(Arginine Rich Domain,ARD))的抗体包被磁珠, 并以识别HBcAg的1-149aa中的不同表位的单抗作为标记抗体时,检测不 同的DNA载量的样本(P/N>3代表阳性)的结果。结果显示,当以识别 HBcAg 141-154aa表位的三株抗体(2A7、14C6、14C7)作为标记抗体时, 对不同HBV DNA载量样本的检测效果均显著优于其他抗体配对。
实施例6:用于检测HBcAg的酶免检测法及检测试剂
单克隆化抗体18B2-2用磷酸盐缓冲液(20mmol/LPB,pH7.4),稀 释后包被于聚氯乙烯板上,单抗2A7标记辣根过氧化物酶(北京万泰生物 药业股份有限公司)。待测样品包括:浓度为1ug/ml的C183抗原稀释液、 浓度为1ug/ml的C149抗原(厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技 术研究中心实验室研发)稀释液、阳性样本1/2、阴性样本1/2、以及20%nbs。
使用与实施例5相同的方法处理样品裂解病毒。随后加入2A7- HRP(1/500稀释)温育40min,清洗板5次,加入显色液A、B各50ul(北京 万泰生物药业股份有限公司)温育15min。最后加入终止液(2MH2SO4), 轻轻震荡混匀,酶标仪波长450-620下读值。结果如图3所示,本发明的 酶免检测法检测试剂可以特异性检测HBcAg,对c149(即,HBeAg)不检 出,表明其具备良好的特异性。
实施例7:用于检测HBcAg的化学发光检测法及检测试剂
7.1检测试剂盒的制备
7.1.1磁珠包被单抗制备
磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的磁珠,粒径为1.5~3um; 其制备方法为:将磁性微粒子、EDC与NHS的质量比为1:1:1,并加入pH 为5.0的50mM MES溶液,使磁性微粒子浓度为4mg/mL,放置在垂直旋 转仪上活化,活化环境温度25℃,时间20min;将活化后的磁性微粒子与 18B2-2单克隆抗体比例为每毫克磁性微粒子标记15ug的HBcAg单克隆抗 体,放置在垂直旋转仪上标记,反应环境温度25℃,时间3h;将反应后的 磁性微粒子用洗液洗涤3次,加入含有甘氨酸、0.5%牛血清白蛋白、 0.05%Triton X-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液,使磁性微粒子浓度为 4mg/mL,放置在垂直旋转仪上终止,反应环境温度25℃,时间2h;将终 止后的磁性微粒子用洗液洗涤3次,加入含有0.5%(W/V)牛血清白蛋白、0.5%(W/V)酪蛋白、0.05%T(W/V)ritonX-100、防腐剂、pH为7.4的 磷酸盐缓冲液,使磁性微粒子浓度为4mg/mL,2-8℃保存备用。
7.1.2吖啶酯标记单抗制备
其制备方法为:取待标记2A7单克隆抗体50ug,加入含NaCl的磷酸 盐缓冲液至体积为300μL,再加入5μL吖啶酯母液,振荡混匀,室温避光 反应30min;反应后加入200μL含NaCl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液,手工 颠倒20次混匀,室温避光反应30min;反应后将产物转移至透析袋中,透 析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液,2-8℃避光透析,每隔2h换一次 PBS缓冲液,共更换3次,以除去未标记的吖啶酯;将标记物取出,按实 际体积加入10%(W/V)牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1% (V/V 1:100),加入等体积甘油,手工颠倒混匀后,-15℃以下避光保存备 用。
7.2检测方法
1、准备:将7.1获得的试剂盒放置室温(18-30℃)下平衡15-30min。
2、配液:将50ml浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。
3、加样:分别在对应孔中加入25ul待测标本。
4、裂解:使用与实施例5相同的方法裂解病毒。
5、反应:向标本孔中加入50ul磁珠包被单抗18B2-2,混匀后用封板膜 封板后置于37±1℃孵育15min;孵育15~20min,孵育结束后,用含 0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗涤,再加入50ul吖啶酯标记抗体2A7, 孵育10~15min,孵育结束后,用含0.05~0.08%的吐温20磷酸盐缓冲液洗 涤,加入预激发液100~200ul,进行预激发。去除预激发液,加入激发液 100~200ul,进行激发和检测。
结果判定
临界值:Cut Off(C.O.)=9000
结果判定:(S=每孔的发光值)
阴性结果:(S/C.O.<1):标本的发光值小于Cut Off值为阴性,代表 该标本中未检测出HBV核心抗原
阳性结果:(S/C.O.≥1):标本的发光值大于等于Cut Off值为阳性, 代表该标本中检测出HBV核心抗原。
实施例8:HBcAg检测试剂盒的特异性和灵敏度分析
8.1核心抗原检测试剂盒的特异性分析
8.1.1试剂盒准备
用于检测HBV核心抗原的发光诊断试剂盒制备(发光检测试剂法) 如实施例7方法。
8.1.2检测标本
收集自2019年4月至今的80份乙肝两对半5项全阴样本,-20℃冷冻 保存。
8.1.3检测项目
对每份血清标本进行乙型肝炎病毒核心抗原化学发光检测,方法如实 施例7所示。
8.1.4检测结果
完成所有样本检测后统计结果,分析试剂盒的特异性。各样本检测结 果如下表所示。
表7:检测结果
8.1.5结果与分析
从表7的结果可以看出,S/C.O.<1表示该标本中未检测出HBV核心 抗原,特异性良好。
8.2核心抗原检测试剂盒的灵敏度分析
8.2.1试剂盒准备
用于检测HBV核心抗原的发光诊断试剂盒制备(发光检测试剂法) 如实施例7方法。
8.2.2检测标本
8.2.2.1.选取1份利用乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测试剂检测DNA 载量为1.60E+08copies/mL的新鲜血清样本利用20%NBS以3倍为梯度 进行线性稀释11个点,并利用20%NBS作为阴性对照,按照实施例8所 述方法进行检测,并做参考曲线。
8.2.2.2.将C183B抗原利用20%NBS释至1ug/ml,并以3倍为梯度进行 稀释11个点,并利用不含C183B抗原的20%NBS作为阴性对照,按照实 施例8所述方法进行检测,并利用上述参考曲线换算出抗原各个点检测相 对应的值。结果如下表所示。
表8:检测结果
8.2.2.3.结果与分析
表8中数据S/C.O大于1代表阳性,小于1代表阴性,说明对c183 的抗原检测灵敏度在0.05ng/ml,对样本检测灵敏度大约在104copeis/ml (DNA载量)左右。
实施例9:HBcAg检测试剂盒与PCR检测法的比较
9.1试剂盒准备
9.1.1用于检测HBV核心抗原的发光诊断试剂盒制备(发光检测试剂 法)如实施例7的方法。
9.1.2乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测试剂,购自深圳匹基生物工程 有限公司。
9.2检测标本
自2019年4月至今收集的82份的乙型肝炎病毒感染血清标本,-20℃ 冷冻保存。
9.3检测项目
对每份血清标本进行乙型肝炎病毒核酸定量PCR检测。
对每份血清标本进行乙型肝炎病毒核心抗原化学发光检测。
9.4检测结果
完成所有项目检测后统计结果,比较HBV核心抗原与HBV病毒核酸 检测的相关性。结果如下表所示。
表9:HBsAg阳性的乙型肝炎病毒感染血清标本检测结果
9.5结果分析
在表9中,S/C.O.>1表示该样本中检测出核心抗原,S/C.O.<1表示该 样本中未检测出核心抗原。将HBcAg的检测结果与PCR方法获得的DNA 载量结果进行相关性分析,具体地,对各样本的病毒含量及发光强度分别 取对数后进行线性相关性分析。结果如图4所示,R2为0.8368,这一结果 表明本发明的HBcAg检测方法检测性能良好,可以评估样本的DNA载量。
实施例10:2A7单抗的其他免疫学检测的应用
10.1 2A7作为HBcAg免疫荧光检测抗体的用途
将HepG2(获自厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中 心实验室)及稳定整合HBV1.1倍体基因组的HepG2-N10细胞(获自厦门 大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心实验室)以每孔60000 个细胞铺24孔板,待12h细胞贴壁后,吸掉培养基,用20mM PBS洗一 次,4%多聚甲醛固定15min后再以0.02%Triton x-100通透细胞10min, 2%BSA封闭1h后将2A7单抗(1mg/ml)以1:1000的稀释比例稀释到 2%BSA中,室温孵育1h后PBS洗4次,荧光二抗为羊抗鼠-Alexa488 (Beyotime,产品编号:A0428),室温孵育40min后PBS洗4次并用 DAPI染料对细胞核进行染色,实验完成后用Opera phenix激光共聚焦高 内涵成像系统63倍水镜拍摄。
结果如图5所示,2A7对整合了HBV基因组的HepG2-N10细胞有明 显的胞质免疫反应,但对未整合HBV基因组的细胞没有结合,具备良好的 特异性。上述结果说明2A7能够作为HBcAg的免疫荧光抗体进行准确检 测。
10.2 2A7作为HBcAg免疫组化检测单抗的用途
目前在HBcAg免疫组化检测中所采用的抗HBcAg抗体为多克隆抗体, 但是多克隆抗体往往具有背景较高而特异性较低,并且应用其进行的免疫 组化结果不易标准化等缺点,但是目前尚无抗HBcAg单克隆抗体用于免 疫组化检测的报道。本实验考察2A7单抗作为免疫组化检测抗体的性能。
取HBV转基因鼠HBV-TG(获自厦门大学国家传染病诊断试剂与疫 苗工程技术研究中心实验室)和正常C57BL/6小鼠(获自上海斯莱克实验 动物有限责任公司)的肝组织石蜡切片,进行脱蜡、复水、抗原修复、清 洗、封闭,而后加入anti-HBc商品化多克隆抗体和2A7单抗,室温反应 1h,而后清洗,加入二抗室温反应10min,再清洗后加入显色液染色反应,最后进行盐酸分化、复染、封片。
结果见图6,与商业化多克隆抗体类似,2A7单抗能够准确检测HBV 转基因鼠的组织石蜡切片,并且对正常小鼠的组织石蜡切片无结合,表明 2A7也能够作为HBcAg的免疫组化抗体进行准确检测。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将 理解:根据已经公布的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这 些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其 任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门万泰凯瑞生物技术有限公司
厦门大学
<120> 用于检测HBcAg的方法及抗体
<130> IDC190266
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 VH
<400> 1
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Pro Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Asp His Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 VL
<400> 2
Asp Ile Val Ile Thr Gln Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu
85 90 95
Val Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 HCDR1
<400> 3
Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr Pro
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 HCDR2
<400> 4
Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 HCDR3
<400> 5
Asp His Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 LCDR1
<400> 6
Lys Ser Leu Leu Tyr Lys Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 LCDR2
<400> 7
Leu Met Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 18B2-2 LCDR3
<400> 8
Gln Gln Leu Val Glu Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 9
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 VH
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Met Gln Arg Pro Gly Gln Asp Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ile Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Arg Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Ile Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Tyr Arg Asn Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 VL
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Lys Gln Lys Thr Asp Gly Thr Phe Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Tyr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 HCDR1
<400> 11
Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Trp
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 HCDR2
<400> 12
Ile Asn Pro Ile Asn Gly Arg Thr
1 5
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 HCDR3
<400> 13
Thr Arg Glu Gly Tyr Arg Asn Asp Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Phe
1 5 10 15
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 LCDR1
<400> 14
Gln Gly Ile Asn Asn Tyr
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 LCDR2
<400> 15
Tyr Thr Ser
1
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 2A7 LCDR3
<400> 16
Gln Gln Tyr Gly Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 17
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C183
<400> 17
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65 70 75 80
Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
165 170 175
Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S1
<400> 18
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu
1 5 10 15
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S2
<400> 19
Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S3
<400> 20
Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S4
<400> 21
Leu Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S5
<400> 22
Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S6
<400> 23
Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S7
<400> 24
Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S8
<400> 25
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S9
<400> 26
Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S10
<400> 27
Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S11
<400> 28
His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S12
<400> 29
Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu Ala Thr
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13
<400> 30
Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S14
<400> 31
Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S15
<400> 32
Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S16
<400> 33
Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S17
<400> 34
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S18
<400> 35
Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S19
<400> 36
Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S20
<400> 37
Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S21
<400> 38
Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S22
<400> 39
Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S23
<400> 40
Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S24
<400> 41
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S25
<400> 42
Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S26
<400> 43
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S27
<400> 44
Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S28
<400> 45
Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg
1 5 10 15
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S29
<400> 46
Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg
1 5 10
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S30
<400> 47
Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S31
<400> 48
Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser
20 25 30
Gln Cys
Claims (26)
1.一种试剂盒,其包含:
(i)第一抗体,其选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第150-183位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段;和,
(ii)第二抗体,其选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-154位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。
2.权利要求1所述的试剂盒,其中,所述第二抗体选自能够特异性结合HBcAg蛋白的第141-152位中所包含的表位的抗体或其抗原结合片段。
3.权利要求1或2所述的试剂盒,其中,所述第一抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段:
(i)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:3的HCDR1、序列为SEQ ID NO:4的HCDR2、以及序列为SEQ ID NO:5的HCDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:6的LCDR1、序列为SEQ ID NO:7的LCDR2、以及序列为SEQ ID NO:8的LCDR3;或者,
(ii)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含SEQ ID NO:1所示的重链可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH);和/或,包含SEQ ID NO:2所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL);优选地,所述重链可变区中含有的3个CDR,和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR,由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义;或者,
(iii)抗体或其抗原结合片段,所述抗体是杂交瘤细胞株18B2-2所产生的单克隆抗体,其中,杂交瘤细胞株18B2-2保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCCNO.C2019303。
4.权利要求3所述的试剂盒,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:1所示的序列;(ii)与SEQ ID NO:1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或(iii)与SEQ ID NO:1所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和/或,
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:(iv)SEQ ID NO:2所示的序列;(v)与SEQ ID NO:2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或(vi)与SEQ ID NO:2所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
优选地,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段包含:具有如SEQ ID NO:1所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:2所示的序列的VL。
5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒,其中,所述第二抗体选自下列的抗体或其抗原结合片段:
(i)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:11的HCDR1、序列为SEQ ID NO:12的HCDR2、以及序列为SEQ ID NO:13的HCDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL):序列为SEQ ID NO:14的LCDR1、序列为SEQ ID NO:15的LCDR2、以及序列为SEQ ID NO:16的LCDR3;或者,
(ii)抗体或其抗原结合片段,其包含:包含SEQ ID NO:9所示的重链可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH);和/或,包含SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL);优选地,所述重链可变区中含有的3个CDR,和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR,由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义;或者,
(iii)抗体或其抗原结合片段,所述抗体是杂交瘤细胞株2A7所产生的单克隆抗体,其中,杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCCNO.C2019302。
6.权利要求5所述的试剂盒,其中,所述抗体或其抗原结合片段包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:9所示的序列;(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和/或,
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:(iv)SEQ ID NO:10所示的序列;(v)与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或(vi)与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
优选地,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换;
优选地,所述抗体或其抗原结合片段包含:具有如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:10所示的序列的VL。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂盒,其中,所述第一抗体和/或第二抗体包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL);
优选地,所述第一抗体和/或第二抗体包含小鼠重链恒定区和小鼠轻链恒定区;
优选地,所述第一抗体和/或第二抗体是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA抗体。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂盒,其中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb);和/或,所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
9.权利要求1-8任一项所述的试剂盒,其中,所述第二抗体带有可检测标记,或者,所述试剂盒还包括能够特异性结合所述第二抗体的第三抗体,所述第三抗体带有可检测标记;
优选地,所述可检测标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物素。
10.权利要求1-9任一项所述的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包含固相载体;
优选地,所述固相载体选自磁珠或微量滴定板(例如微孔板或酶标板);
优选地,所述第一抗体包被在固相载体的表面。
11.权利要求1-10任一项所述的试剂盒,其中,所述试剂盒还包含一种或多种选自下列的试剂或装置:标准品(例如,含有不同已知量的HBcAg的系列样品);阳性对照样品(例如,含有已知量的HBcAg的样品);阴性对照样品(例如,不含有HBcAg的样品);用于裂解HBV病毒的裂解剂;和,用于收集或贮存待测样品的装置(例如采血装置)。
12.一种试剂盒,其包含:
(i)第一抗体,编码第一抗体的分离的核酸分子,包含所述分离的核酸分子的载体,或者表达所述第一抗体的重组细胞;其中,所述第一抗体如权利要求1-8任一项中定义;和,
(ii)第二抗体,编码第二抗体的分离的核酸分子,包含所述分离的核酸分子的载体,或者表达所述第二抗体的重组细胞;其中,所述第二抗体如权利要求1-8任一项中定义。
13.权利要求12所述的试剂盒,其中,
表达所述第一抗体的重组细胞是包含编码所述第一抗体的分离的核酸分子或包含所述分离的核酸分子的载体的宿主细胞,
表达所述第二抗体的重组细胞是包含编码所述第二抗体的分离的核酸分子或包含所述分离的核酸分子的载体的宿主细胞。
14.权利要求12所述的试剂盒,其中,
表达所述第一抗体的重组细胞是杂交瘤细胞株18B2-2,其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCC NO.C2019303;和
表达所述第二抗体的重组细胞是杂交瘤细胞株2A7,其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCC NO.C2019302。
15.检测HBcAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法,其包括以下步骤:
(1)将所述样品与第一抗体接触,以形成抗体-抗原复合物,所述第一抗体如权利要求1-8任一项中所定义;
(2)使所述抗体-抗原复合物与第二抗体接触,以形成抗体-抗原-抗体复合物,所述第二抗体如权利要求1-8任一项中所定义;和
(3)测定所述抗体-抗原-抗体复合物的量。
16.权利要求15所述的方法,其中,所述第二抗体带有可检测标记;或者,步骤(3)中所述的测定包括使用带有可检测标记的第三抗体;
优选地,所述可检测标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物素。
17.权利要求15或16所述的方法,其中,在步骤(3)中,所述测定选自酶免疫测定法或化学发光免疫分析法。
18.权利要求15-17任一项所述的方法,其中,所述第一抗体包被于固相载体的表面;
优选地,所述固相载体选自磁珠或微量滴定板(例如微孔板或酶标板)。
19.权利要求15-18任一项所述的方法,其中,所述样品选自全血、血浆和血清。
20.权利要求15-19任一项所述的方法,其中,
在步骤(1)之前,所述方法还包括处理所述样品的步骤,所述处理包括:将裂解剂与所述样品混合以裂解病毒;和/或
在步骤(2)和/或步骤(3)之前,所述方法还包括洗涤步骤。
21.权利要求1-14任一项所述的试剂盒在制备用于检测HBcAg蛋白在样品中的存在或其水平的检测试剂盒中的用途。
22.能够特异性结合HBcAg的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,
(i)所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:包含下述3个互补决定区(CDR)的重链可变区(VH):序列为SEQ ID NO:11的HCDR1、序列为SEQ ID NO:12的HCDR2、以及序列为SEQ IDNO:13的HCDR3;和/或,包含下述3个互补决定区(CDR)的轻链可变区(VL):序列为SEQ IDNO:14的LCDR1、序列为SEQ ID NO:15的LCDR2、以及序列为SEQ ID NO:16的LCDR3;或者,
(ii)所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:包含SEQ ID NO:9所示的重链可变区中含有的3个CDR的重链可变区(VH);和/或,包含SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中含有的3个CDR的轻链可变区(VL);优选地,所述重链可变区中含有的3个CDR,和/或所述轻链可变区中含有的3个CDR,由Kabat、Chothia或IMGT编号系统定义;或者,
(iii)所述单克隆抗体是杂交瘤细胞株2A7所产生的单克隆抗体,其中,杂交瘤细胞株2A7保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),且具有保藏号CCTCC NO.C2019302。
23.权利要求22所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:
(a)重链可变区(VH),其包含选自下列的氨基酸序列:(i)SEQ ID NO:9所示的序列;(ii)与SEQ ID NO:9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或(iii)与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
和/或,
(b)轻链可变区(VL),其包含选自下列的氨基酸序列:(iv)SEQ ID NO:10所示的序列;(v)与SEQ ID NO:10所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个,2个,3个,4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列;或(vi)与SEQ ID NO:10所示的序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列同一性的序列;
优选地,(ii)或(v)中所述的置换是保守置换;
优选地,所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含:具有如SEQ ID NO:9所示的序列的VH和具有如SEQ ID NO:10所示的序列的VL。
24.权利要求22或23所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述单克隆抗体包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL);
优选地,所述单克隆抗体是IgG、IgM、IgE、IgD或IgA抗体。
25.权利要求22-24任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,其中,所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双抗体(diabody)和单域抗体(sdAb);和/或,所述单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
26.权利要求22-25任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于检测样品中的HBcAg的试剂中的用途;
优选地,所述样品是组织样品(例如组织切片)或细胞样品;
优选地,所述检测是免疫学检测;优选地,所述免疫学检测选自免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、免疫荧光(IF)和Western Blot;
优选地,所述单克隆抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记,或者,所述试剂还包含带有可检测的标记的二级抗体;
优选地,所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、荧光染料或生物素;
优选地,所述二级抗体是抗-免疫球蛋白抗体。
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