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CN113106071A - Hq06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株及其应用 - Google Patents

Hq06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株及其应用 Download PDF

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CN113106071A CN202010033003.0A CN202010033003A CN113106071A CN 113106071 A CN113106071 A CN 113106071A CN 202010033003 A CN202010033003 A CN 202010033003A CN 113106071 A CN113106071 A CN 113106071A
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韩玉莹
孙元
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Abstract

本发明公开了HQ06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株及其应用。本发明以C株为骨架，单个点突变E2蛋白HQ06抗原表位的3个关键氨基酸117F、119G和122P，构建了3株突变体病毒。本发明所构建的3株突变体病毒均失去了与单克隆抗体(mAb)HQ06的反应性，保留了与CSFV E2蛋白其他抗原位点的反应性，生物学特性与C株保持一致；其中，rHCLV‑E2P122A在体外可达到亲本病毒的生长滴度，在家兔和家猪体内均能够诱导机体产生针对CSFV E2的抗体和针对CSFV的中和抗体，但失去了诱导机体产生针对HQ06抗原表位的特异性抗体，本发明的rHCLV‑E2P122A毒株能够开发成猪瘟标记疫苗。

Description

HQ06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株及其应用
技术领域
本发明涉及猪瘟标记疫苗株，尤其涉及HQ06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株及其应用，属于猪瘟标记疫苗株领域。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever,CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛性出血为主要特征的高度传染性疾病，给世界上许多国家的养猪业造成了巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列入须申报(Notifiable)的OIE动物疫病名录。中国《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》将猪瘟列为五种优先防治的“一类动物疫病”之一。
猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)是CSF的病原，它是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员。CSFV为单股正链RNA病毒，其基因组全长约12.3kb，包含5′非编码区(untranslated region,UTR)、一个长的开放阅读框和3′UTR。该阅读框编码由3898个氨基酸组成的多聚蛋白，这一多聚蛋白在细胞和病毒蛋白酶的作用下裂解为12个成熟的病毒蛋白，包括4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)，其中Erns、E1和E2为病毒的囊膜蛋白(Heimann M,Roman-Sosa G,Martoglio B,et al.Core protein of pestiviruses is processed at the Cterminus by signal peptide peptidase[J].J Virol,2006,80(4):1915-1921.Gottipati K,Ruggli N,Gerber M,et al.The structure of classical swinefever virus N(pro):a novel cysteine autoprotease and zinc-binding proteininvolved in subversion of type I interferon induction[J].PLoS Pathog,2013,9(10):e1003704.)。
目前，中国主要采取免疫接种的措施来预防猪瘟，常用的疫苗为猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株或HCLV株)。该疫苗是中国学者在20世纪50年代通过将CSFV强毒株在兔体内连续传480余代后培育而成的，该疫苗株集高度安全性和良好免疫原性于一身，可同时诱导体液免疫和细胞免疫，对各种年龄的家猪和野猪均安全，并且能够保护不同年龄的猪抵抗猪瘟强毒的攻击(仇华吉,童光志,沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾[J].中国农业科学,2005,38(8):1675-1685.)。由于C株性能稳定、安全和免疫效果良好，在国际上被公认为安全有效的弱毒疫苗。早在在20世纪60年代，C株从中国引入东欧和亚洲友邦，被称为“K株”或“LC株”，随后又传到西欧和拉美各国，其为世界猪瘟的防控做出了重大贡献。时至今日，C株仍被世界上许多国家使用，其地位和价值至今无可动摇。
随着全球范围内猪瘟净化工作的不断开展，部分欧洲和美洲国家已经彻底消灭了猪瘟，中国也将猪瘟净化工作提上了日程。根据《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》要求，农业部在2017年组织制定了《国家猪瘟防治指导意见(2017-2020年)》，要求“在不断提高养殖场(户)防疫能力的基础上，到2020年底，全国所有种猪场和部分区域达到猪瘟净化标准，并进一步扩大猪瘟净化区域范围”的目标。就目前来看，净化猪瘟有两种策略可以借鉴，一种是欧美国家实行的严格的扑杀政策，另一种是标记疫苗配合相应的鉴别诊断检测方法。众所周知，中国是世界养猪大国，严格的扑杀政策并不适用中国的猪瘟净化，中国的猪瘟净化工作必须要依赖标记疫苗配合筛查的方式来进行。但是目前阶段，猪瘟弱毒疫苗C株不具备区分野毒感染与疫苗接种(DIVA)的特性，这种技术上的不足在很大程度上限制了中国猪瘟的净化。现阶段，如何将我国自主研发的C株开发为标记疫苗株，使其在防控猪瘟的工作中继续发挥优势是科研工作努力的方向。
标记疫苗的开发主要是利用反向遗传学操作平台，通过在病毒基因水平的插入、缺失或突变原始病毒株的某一位点，对病毒进行标记或区分(Dong Xiao-nan,Chen Ying-hua.Marker vaccine strategies and candidate CSFV marker vaccines[J].Vaccine,2006,25(2):205-230)。CSFV结构蛋白Erns和E2上存在可以刺激机体产生中和抗体的抗原表位(孙永芳,徐璐,张乾义,等.猪瘟病毒抗原表位的研究进展[J].中国兽医杂志,2017,53(7):72-75.)，这使得改造Erns或E2蛋白成为构建标记疫苗候选病毒株的策略之一。我们实验室前期制备了一株针对E2蛋白的单克隆抗体HQ06，该抗原表位为CSFV中保守的线性B细胞抗原表位，识别的最小基序为772LFDGTNP778，其中117F、119G和122P为HQ06抗原表位的3个关键氨基酸(Peng W,Hou Q,Xia Z,et al.Identification of a conserved linear B-cellepitope at the N-terminus of the E2 glycoprotein of Classical swine fevervirus by phage-displayed random peptide library[J].Virus Res,2008,135,267-272.)。HQ06抗原表位的发现为我们此次标记疫苗的研制提供了充分的研究基础与理论依据。
标记疫苗作为净化猪瘟的有效措施之一，在防控和净化猪瘟方面发挥着关键作用，研制基于C株的标记疫苗对于猪瘟的净化和彻底根除非常重要。
发明内容
本发明的主要目的是提供HQ06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明以C株全长感染性克隆pHCLV为骨架，对其E2蛋白的HQ06抗原表位的3个关键氨基酸117F、119G和122P进行单个点突变，分别构建感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A，再通过反向遗传操作方法拯救得到三株HQ06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A。
其中，所述突变体病毒rHCLV-E2F117A的构建方法包括：(1)将猪瘟病毒C株HQ06表位的第117位的F突变为A；将突变后的目的片段克隆到pHCLV中获得感染性克隆；(2)通过反向遗传操作方法，将构建的感染性克隆转染细胞，拯救得到突变体病毒rHCLV-E2F117A。
所述突变体病毒rHCLV-E2G119A的构建方法包括：(1)将猪瘟病毒C株HQ06表位的第119位的G突变为A；将突变后的目的片段克隆到pHCLV中获得感染性克隆；(2)通过反向遗传操作方法，将构建的感染性克隆转染细胞，拯救得到突变体病毒rHCLV-E2G119A。
所述突变体病毒rHCLV-E2P122A的构建方法包括：(1)将猪瘟病毒C株HQ06表位的第122位的P突变为A；将突变后的目的片段克隆到pHCLV中获得感染性克隆；(2)通过反向遗传操作方法，将构建的感染性克隆转染细胞，拯救得到突变体病毒rHCLV-E2P122A。
本发明通过耳缘静脉接种家兔的方式来评价3株突变体病毒在家兔体内的特性。试验结果表明，3株突变体病毒在接种家兔后均能够诱导家兔产生定型热反应，能够在家兔的脾脏中复制，能够诱导家兔产生抗CSFV E2抗体和抗CSFV中和抗体，并且病毒在家兔体内稳定存在，并未出现回复突变的现象；由此说明，本研究中的3株突变体病毒保留了C株在家兔体内的生物学特性和良好的免疫原性。
为了验证获得的3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A是否失去了与mAb HQ06的反应性，将3株突变体病毒接种SK6细胞，进行免疫荧光试验。结果显示，3株突变体病毒能够与兔抗CSFV E2的多抗和mAb WH303反应的同时，失去了与mAbHQ06的反应性。
本发明在SK6细胞上评估了3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A的体外生长特性；试验结果显示，单个氨基酸位点的突变影响病毒的复制，与rHCLV相比，rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A的复制水平相对滞后，但在60h时，突变体病毒rHCLV-E2P122A的病毒滴度与rHCLV一致。
为了评价突变体病毒的遗传稳定性，将拯救成功的3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A在SK6细胞上连续传代至20代。将第20代突变体病毒的基因通过RT-PCR扩增并进行测序，测序结果显示，3株突变体病毒的突变位点保持稳定。
本发明进一步检验了3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A在家兔体内的生物学特性和免疫原性，检验结果显示，本发明构建的3株突变体病毒在家兔体内与C株具有相似的生物学特性和免疫原性。
间接免疫荧光结果证实，在接种rHCLV-E2P122A的家兔血清中并未检测到针对HQ06抗原表位的抗体，而在接种rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和C株的家兔血清中可检测到针对HQ06抗原表位的抗体。另外，本发明对家兔脾脏中提取的病毒RNA进行PCR扩增CSFVE2区域的相应目的片段，测序结果证实，突变体病毒在家兔体内保持稳定，并未出现回复突变的现象。
根据家兔实验的结果，本发明进一步在3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A中选取rHCLV-E2P122A用其接种断奶仔猪，接种后，每天测定猪只的体温，观察临床症状；结果显示，rHCLV-E2P122A保持了C株的弱毒特性；在接种后每周对猪只进行采血，用CSFV抗体ELISA检测试剂盒(IDEXX)检测猪只血清中抗CSFV E2抗体，检测结果显示，突变体病毒rHCLV-E2P122A在断奶仔猪体内的免疫原性与C株相同，但失去了诱导产生针对HQ06抗原表位抗体的能力。
本发明将rHCLV-E2P122A标记疫苗候选株提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是CGMCC NO.18219，分类命名是：猪瘟兔化弱毒疫苗标记株；保藏时间是：2019年10月28日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
综上，本发明以C株为骨架，单个点突变E2蛋白HQ06抗原表位3个关键氨基酸构建了3株突变体病毒。这3株突变体病毒均失去了与mAb HQ06的反应性，但是保留了与CSFV E2蛋白其他抗原位点的反应性，3株突变体病毒的生物学特性与C株的保持一致，并且能够诱导产生针对CSFV E2的抗体和针对CSFV的中和抗体，但并未诱导家兔和猪只产生针对HQ06抗原表位的抗体。总之，家兔和家猪试验表明，标记疫苗候选株rHCLV-E2P122A在保留C株良好的免疫原性的基础上赋予了C株DIVA特性。
本发明所构建的3株猪瘟标记疫苗候选株，为开发猪瘟标记疫苗提供了良好的尝试和有益的探索，尤其是rHCLV-E2P122A候选株具有与C株近乎一致的生物学特性，能够开发为猪瘟标记疫苗。
附图说明
图1为全长感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的构建策略。
图2为3株突变体病毒CSFV抗原检测结果。
图3为间接免疫荧光试验测定3株突变体病毒与mAb HQ06反应性结果。
图4为3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A的生长曲线。
图5为突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A、rHCLV-E2P122A第20代的测序结果。
图6为间接免疫荧光检测家兔血清中抗HQ06抗原表位的抗体。
图7为3株突变体病毒在家兔脾脏中并未回复突变。
图8为猪瘟病毒E2抗体检测试剂盒(IDEXX)检测猪只血清中抗CSFV E2抗体。
图9为间接免疫荧光检测家猪血清中抗HQ06抗原表位的抗体。
图10为对家猪血清中提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增CSFV E2基因的测序结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
试验例1猪瘟病毒C株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A的构建、鉴定及体内外生物学特性分析
1材料和方法
1.1质粒、细胞和病毒
本发明中用到的C株全长感染性克隆pHCLV由本发明人实验构建及保存。试验中使用的猪肾细胞(SK6和PK15)和人胚肾细胞293T细胞株(293T)由本发明人实验室购买并保存。SK6细胞用含4％胎牛血清(不含BVDV和BVDV的抗体)的DMEM培养基置于5％CO2的37℃的温箱中培养,PK15和293T细胞用含10％胎牛血清(不含BVDV和BVDV的抗体)的DMEM培养基置于5％CO2的37℃的温箱中培养。CSFV石门株(Shimen，SM)由本发明人实验室保存,CSFV弱毒疫苗株(rHCLV)由本发明人实验室前期拯救得到(张玲楷,李永锋,谢利豹,孙元,王晓,仇华吉.表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪瘟兔化弱毒疫苗株的构建与鉴定[J].生物工程学报,2018,34(02):216-223.)。猪瘟疫苗(C株)购于哈尔滨维科生物技术有限公司。
1.2感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A的构建
以C株全长感染性克隆pHCLV为骨架，对其E2蛋白的HQ06抗原表位的3个关键氨基酸进行单个点突变，构建感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A(图1)。利用表1中的引物将HQ06表位单个氨基酸位点分别进行突变，获得目的片段，通过标准分子克隆技术将目的片段引入pHCLV，获得3个感染性克隆。之后，利用核酸限制性内切酶和二代测序对获得的3个感染性克隆进行鉴定。
表1构建pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A所用的引物
Figure BDA0002365021750000081
1.3突变体病毒的拯救
用本发明人实验室前期建立的反向遗传操作平台对3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A进行拯救(Li C,Huang J,Li Y,etal.Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from clonedcDNA using an RNA polymerase II system.Arch Virol,2013,158(4):901-907.)。具体操作步骤如下：取6μg pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A分别转染SK6细胞，将细胞连续传代7次后反复冻融3次收获病毒。用CSFV抗原检测试剂盒(IDEXX)检测第5代和第7代突变体病毒的Erns蛋白的表达。同时，对拯救的突变体病毒的病毒基因组进行提取，通过RT-PCR的方法扩增CSFV Erns、E1、E2和NS5B基因，并进行测序鉴定。
1.4间接免疫荧光试验
将拯救的3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A接种于生长至60％-80％单层的SK6细胞中，2h后换液。先用DMEM洗2遍，然后加入新鲜的含2％胎牛血清的DMEM，置于5％CO2、37℃细胞培养箱中继续培养。48h后弃上清，用-20℃预冷的无水乙醇于4℃条件下固定细胞20min。之后，分别加入mAb HQ06(本发明人实验室制备)、mAbWH303(王琴研究员赠送)和兔抗CSFV E2蛋白的多克隆抗体(本发明人实验室制备)，37℃作用2h后用PBS洗涤5次，加入1:300稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG(或山羊抗兔IgG)(Invitrogen公司)，置于湿盒中37℃条件下作用45min，用PBS分别洗涤5次后，置于倒置荧光显微镜下观察。
1.5一步生长曲线
将3株突变体病毒(rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A)和C株分别以感染复数(MOI)为0.01的剂量接种于铺有SK6细胞的24孔板中，37℃感染2h后，将培养液更换为含2％胎牛血清的DMEM，并将细胞放在含5％CO2的37℃温箱中继续培养。在12h、24h、36h、48h、60h和72h收获病毒，用Reed-Münch方法利用间接免疫荧光试验测定收获病毒的滴度(Reed LJ,Münch H.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am JHyg,1938,27:493-497.)，并用每毫升TCID50表示。该试验重复3次，计算平均值和标准偏差。
1.6病毒遗传稳定性分析
将拯救成功的突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A在SK6细胞中进行连续传代，传至第20代后，提取第20代突变体病毒的基因，利用RT-PCR将CSFVE2扩增后进行测序。
1.7家兔接种试验
将26只12周龄新西兰白兔随机分为5组进行接种，三个试验组(A组、B组和C组)各6只兔子，两个对照组(D组和E组)各4只兔子。对所有兔子进行为期3d的适应性饲养，同时，连续3d测量试验家兔的体温，取其平均值作为基础体温，随后进行免疫接种试验。
A组(A1、A2、A3、A4、A5和A6)、B组(B1、B2、B3、B4、B5和B6)和C组(C1、C2、C3、C4、C5和C6)分别耳缘静脉注射同等剂量(104TCID50/ml)的rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A，对照组D组(D1、D2、D3和D4)和E组(E1、E2、E3和E4)分别接种C株和DMEM(表2)。
接种毒株24h后，每6h记录家兔的直肠温度来判定家兔定型热反应。接种后第3d，每组随机选取一半数量家兔进行安乐处死，采集家兔脾脏，用定量RT-PCR检测家兔脾脏中病毒的RNA拷贝数。接种2w内，每隔3d采集所有家兔的血清，并用CSFV抗体ELISA检测试剂盒(IDEXX)检测家兔血清中抗CSFV E2抗体。利用间接免疫荧光试验及血清中和试验，检测试验中采集的所有家兔血清中的HQ06抗体和中和抗体水平
1.8定量RT-PCR及测序
取家兔脾脏后，对脾脏组织进行研磨，用TRIzol法提取病毒RNA，之后利用RT-qPCR的方法检测家兔脾脏中病毒RNA水平(Zhang XJ,Han QY,Sun Y,et al.Development of atriplex TaqMan real-time RT-PCR assay for differential detection of wild-typeand HCLV vaccine strains of classical swine fever virus and bovine viraldiarrhea virus 1.Res Vet Sci,2012,92(3):512-518.)。具体操作为：配20μL的RT-PCR反应体系，包含2.5μL cDNA，10μL Premix，86S和166R各1μL，0.5μL HCLV-FAM(10μM)探针。条件为95℃预变性5min，95℃变性30s及60℃退火/延伸45s(40个循环)。每个样本的实验进行3个重复。通过标准曲线计算病毒基因组的RNA拷贝数。同时，对家兔脾脏中提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增CSFV E2基因,分析突变体病毒在家兔体内是否回复突变。
1.9家猪接种试验
将13头8周龄体型相近的断奶仔猪随机分为3组，两个试验组(A组和B组)各5头猪，对照组(C组)3头猪。首先对所有猪进行为期3d的适应性饲养，期间分别用IDEXX CSFV抗原和抗体检测试剂盒检测CSFV的抗原和抗体，确保所有试验猪CSFV阴性，并且利用PCR方法检测所有试验猪无BVDV感染。同时，连续3d测量试验猪体温，取其平均值作为基础体温，随后进行免疫接种试验。
A组(#86、87、88、89和90)和B组(#91、92、93、94和95)分别颈部注射同等剂量(104TCID50/头)的rHCLV-E2P122A和C株，对照组C组(#96、97和98)注射2mL的DMEM，在接种后2w进行二免(表3)，每日仔细观察每头动物的临床症状。同时，在接种后每周对猪只进行采血，用CSFV抗体ELISA检测试剂盒(IDEXX)检测家猪血清中抗CSFV E2抗体，用中和试验检测血清中的中和抗体水平，用间接免疫荧光试验检测家猪血清中的HQ06抗体。同时，用TRIzol法提取猪血清中病毒RNA，利用RT-PCR扩增病毒E2基因，分析突变体病毒在家猪体内是否回复突变。
1.10CSFV抗体的检测
试验过程中采集的所有家兔及家猪的血清样本均利用猪瘟抗体检测试剂盒(IDEXX)进行CSFV E2抗体水平的检测，其具体操作方法见说明书。利用欧盟推荐的中和试验方法检测血清中的中和抗体水平。利用构建的p3xFLAG-CMV-6HQ06e转染293T细胞，48h后，用4％多聚甲醛固定细胞20min，并进行间接免疫荧光试验。具体操作如下：分别加入家兔血清、家猪血清、mAb HQ06和兔抗Flag IgG(Sigma公司)，37℃作用2h后用PBS洗涤1次，加入1:300稀释的FITC标记的山羊抗兔IgG(或山羊抗鼠IgG或兔抗猪IgG)(Invitrogeng公司)，置于湿盒中37℃条件下作用45min，用PBS洗涤2次，置于倒置荧光显微镜下观察。
1.11统计学分析
应用SPSS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中，p≥0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。
2试验结果
2.1突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A的获得
将获得的3个感染性克隆pHCLV-E2F117A、pHCLV-E2G119A和pHCLV-E2P122A分别转染SK6细胞，连续传代拯救3株突变体病毒，用IDEXX猪瘟病毒抗原检测试剂盒对第5代和第7代的SK6细胞上清进行检测，结果显示，所拯救的第7代病毒的Erns蛋白抗原为阳性(图2)。
按照病毒RNA提取说明书提取拯救的病毒基因组RNA，之后通过RT-PCR扩增目的基因并进行测序。结果表明，3株突变体病毒基因组的目的基因与预期的大小一致，测序结果显示突变体病毒的目的基因不存在其他突变。以上结果表明，本发明获得了CSFV E2蛋白的HQ06抗原表位三个关键氨基酸突变的突变体病毒。
2.2突变体病毒失去与MAb HQ06的反应性
为了验证获得的3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A失去了mAb HQ06的反应性，将3株突变体病毒接种SK6细胞，进行间接免疫荧光试验。结果显示，3株突变体病毒能够与兔抗CSFV E2的多克隆抗体和mAb WH303反应，但是失去了与mAbHQ06的反应性(图3)。
2.3突变体病毒的生长动力学和遗传稳定性
本试验在SK6细胞上评估了3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A的体外生长特性。结果显示，单个氨基酸位点的突变影响病毒的复制，与rHCLV相比，rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A的复制水平相对滞后，但在60h时，突变体病毒rHCLV-E2P122A的病毒滴度与rHCLV一致(图4)。
为了评价突变体病毒的遗传稳定性，将拯救成功的3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A在SK6细胞上连续传代至20代。将第20代突变体病毒的基因通过RT-PCR扩增并进行测序，测序结果显示，3株突变体病毒的突变位点保持稳定(图5)。
2.4突变体病毒在家兔体内的生物学特性和免疫原性
为了检验3株突变体病毒rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和rHCLV-E2P122A在家兔体内的生物学特性和免疫原性，按照表2的分组对家兔接种病毒，并测定表中各项指标。结果显示，3株突变体病毒同C株一样均能引起家兔定型热反应；在家兔脾脏中均能检测到病毒的复制，且不同毒株的复制水平无明显差异；在免疫后第7d，所有接种病毒的家兔血清中抗CSFV E2抗体转阳(表2)。中和试验结果表明，在免疫后第7d和14d，接种C株和突变体病毒的家兔血清中均可检测到中和抗体(表3)。以上数据表明，本发明构建的3株突变体病毒在家兔体内与C株具有相似的生物学特性和免疫原性。
间接免疫荧光结果证实，在接种rHCLV-E2P122A的家兔血清中并未检测到HQ06抗体，而在接种rHCLV-E2F117A、rHCLV-E2G119A和C株的家兔血清中均可检测到HQ06抗体(图6)。同时，本试验对家兔脾脏中提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增CSFV E2基因，测序结果证实，突变体病毒在家兔体内保持稳定，并未出现回复突变的现象(图7)。
表2突变体病毒接种后家兔的定型热反应和脾脏中复制情况
Figure BDA0002365021750000141
表3家兔血清中的中和抗体数据
Figure BDA0002365021750000142
2.5突变体病毒rHCLV-E2P122A在断奶仔猪体内的免疫原性
根据家兔实验的结果，本试验将突变体rHCLV-E2P122A按照材料方法中所述将其接种断奶仔猪。在接种后，每天测定猪只的体温，观察是否出现发热症状。在接种后每周对猪只进行采血，用CSFV抗体ELISA检测试剂盒(IDEXX)检测猪只血清中CSFV E2抗体。结果显示，在接种病毒rHCLV-E2P122A后14d，猪只血清中抗CSFV E2抗体开始转阳；在接种后28d，试验组所有猪只抗CSFV E2抗体全部转阳(图8)。中和试验结果显示，在免疫后3w，试验组猪只血清中可检测到中和抗体，接种后4w试验组猪只血清中的中和抗体滴度可达到1:25(表4)。以上数据表明，突变体病毒rHCLV-E2P122A在断奶仔猪体内的免疫原性与C株相同。
间接免疫荧光结果证实，在接种rHCLV-E2P122A的家猪血清中并未检测到HQ06抗体，而在接种C株的家猪血清中检测到HQ06抗体(图9)。同时，本试验对家猪血清中提取的病毒RNA进行RT-PCR扩增CSFV E2基因，测序结果证实，突变体病毒rHCLV-E2P122A在家猪体内保持稳定，并未出现回复突变的现象(图10)。
表4断奶仔猪血清中的中和抗体数据
Figure BDA0002365021750000151
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120> HQ06表位突变的猪瘟候选标记疫苗株及其应用
<130> HLJ-2001-191138A
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
ccgtgacatt cgagctcctg gcagacggga ccaacccatc aactgaggaa atgggag 57
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
ctcccatttc ctcagttgat gggttggtcc cgtctgccag gagctcgaat gtcacgg 57
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
ccgtgacatt cgagctcctg ttcgacgcaa ccaacccatc aactgaggaa atgggag 57
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
ctcccatttc ctcagttgat gggttggttg cgtcgaacag gagctcgaat gtcacgg 57
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<211> 57
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 5
ccgtgacatt cgagctcctg ttcgacggga ccaacgcgtc aactgaggaa atgggag 57
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 6
ctcccatttc ctcagttgac gcgttggtcc cgtcgaacag gagctcgaat gtcacgg 57

Claims (7)

1.一株猪瘟C株的突变体病毒rHCLV-E2P122A，其特征在于，其构建方法包括：(1)将猪瘟病毒C株HQ06表位的第122位的脯胺酸(P)突变为丙氨酸(A)；将突变后的目的片段克隆到pHCLV中获得感染性克隆；(2)通过反向遗传操作方法，将构建的感染性克隆转染细胞，拯救得到突变体病毒rHCLV-E2P122A。
2.按照权利要求1所述的突变体病毒rHCLV-E2P122A，其特征在于，其微生物保藏编号是CGMCC NO.18219。
3.一株猪瘟C株的突变体病毒rHCLV-E2F117A，其特征在于，其构建方法包括：(1)将猪瘟病毒C株HQ06表位的第117位的苯丙氨酸(F)突变为丙氨酸(A)；将突变后的目的片段克隆到pHCLV中获得感染性克隆；(2)通过反向遗传操作方法，将构建的感染性克隆转染细胞，拯救得到突变体病毒rHCLV-E2F117A。
4.一株猪瘟C株的所述突变体病毒rHCLV-E2G119A，其特征在于，其构建方法包括：(1)将猪瘟病毒C株HQ06表位的第119位的甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A)；将突变后的目的片段克隆到pHCLV中获得感染性克隆；(2)通过反向遗传操作方法，将构建的感染性克隆转染细胞，拯救得到突变体病毒rHCLV-E2G119A。
5.按照权利要求1、3或4所述的突变体病毒，其特征在于，所述的细胞是SK6细胞。
6.权利要求1、3或4所述的突变体病毒制备猪瘟标记疫苗中的用途。
7.权利要求2所述的突变体病毒rHCLV-E2P122A在制备猪瘟标记疫苗中的用途。
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