CN113069470A - 棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用。棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用，优选在制备治疗高脂肥胖引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用。所述的棕色脂肪细胞来源的外泌体表达标志性蛋白CD63、CD9和TSG101。所提取的棕色脂肪细胞来源的外泌体能够有效减轻高脂诱导的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝的重量，肝脏与体积的比值，减轻肝脏中脂肪酸和胆固醇的含量，减小了肝脏，使肝脏中的脂肪合成减缓同时增加了脂肪酸的消耗。这为治疗高脂引起的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝提供了新的途经。

Description

棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用

技术领域

本发明涉及棕色脂肪细胞来源的外泌体的应用，具体是棕色脂肪细胞产生的外泌体在肥胖引起的非酒精性脂肪肝治疗中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种常见的肝脏疾病，其定义为在未饮酒或者少量饮酒的情况下在肝脏中5％以上的肝细胞发生了脂肪堆积。据不完全统计，全球14％到27％的人患有脂肪肝。目前对于脂肪肝的药物治疗并不能满足临床需求，并且到目前为止，并没有FDA批准的用于治疗较为严重的非酒精性脂肪肝的药物。

棕色脂肪组织是一种产能组织，其能够通过线粒体中的解偶联蛋白UCP1，从而将体内储存的化学能转化为热能来维持体温，即产生非震颤性产热来维持体温。同时伴随着棕色脂肪组织在成人中的重新发现，同时有研究表明在人体中棕色脂肪的存在与肥胖和糖尿病是负相关的，因此将激活棕色脂肪组织作为一种治疗代谢类疾病的方式得到了越来越多的关注。并且近年来的研究表明移植棕色脂肪组织不仅能够改善高脂诱导的肥胖小鼠的胰岛素抵抗，并且也能在不影响进食的情况下降低天生的肥胖小鼠ob/ob(瘦素缺失小鼠)的葡萄糖稳态。然而由于在人体中，棕色脂肪组织与白色脂肪组织呈一个混合的存在状态，其主要存在于肩胛骨、肾周和脊柱附近，而且并不像啮齿类动物一样具有明显的可区分的组织块，同时移植的脂肪组织的存活率较低，所以通过移植棕色脂肪组织来治疗脂肪肝和其他代谢类疾病在人体中具有很大的技术难度。同时利用寒冷等刺激方式激活人体棕色脂肪组织进行产热消耗能量的方式来进行治疗也具有很大程度的局限性，因为一些肥胖人体中并不存在或者只有很少量棕色脂肪，所以其消耗能量的能力有限。近年来的研究表明，棕色脂肪组织除了是一种重要的产热器官外，其还是一种重要的内分泌器官，能过分泌多种的棕色脂肪因子来调节全身的代谢稳态。其中外泌体(exosome)作为一种重要的细胞间交流工具得到了越来越多的关注。外泌体携带了大量的核酸(miRNA，lncRNA，mRNA)、蛋白质和脂质到达目的细胞进行调节，同时其直径大小符合纳米材料的大小，具有较强的递送信息的能力，同时由于外泌体是内源性的，并不会引起身体的免疫反应。但目前尚未见到棕色脂肪细胞来源的外泌体治疗脂肪肝的报道。

发明内容

本发明的目的是提供棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

作为本发明的一种优选，棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗高脂肥胖引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

所述的棕色脂肪细胞来源的外泌体表达标志性蛋白CD63、CD9和TSG101。粒镜和电镜结果表明其平均直径在100nm左右，同时电镜结果表明其具有脂双层结构符合外泌体的特征。

本发明首次通过动物实验证明：棕色脂肪细胞分泌的外泌体能够有效改善高脂引起的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝，包括减少肝的重量，肝与体重的比值，肝脏切片中脂滴含量下降，脂滴大小减小，肝脏中甘油三酯和总胆固醇的含量下降，同时肝脏中脂肪酸合成相关基因的表达量下降，脂肪酸β氧化相关基因的表达量上升。

本发明的有益效果是：

1.所提取的棕色脂肪细胞来源的外泌体能够有效减轻高脂诱导的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝的重量，肝脏与体积的比值，减轻肝脏中脂肪酸和胆固醇的含量，减小了肝脏，使肝脏中的脂肪合成减缓同时增加了脂肪酸的消耗。这为治疗高脂引起的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝提供了新的途经。

2.外泌体作为一种内源性的细胞外囊泡，其直径大小与纳米级载体相似。并且exosome能够携带不同的信号分子(RNA和蛋白)，因此其具有潜在的作为药物递送载体的能力。并且相对于外源性的纳米载体，外泌体具有不引起免疫反应并且不具有生物学毒性等优势。本发明经过一定方法提取的外泌体，可以在-80度冰箱中长期保存。

附图说明：

图1Western-blot法检测棕色脂肪细胞来源外泌体的标志蛋白CD63、CD9和TSG101。

图2电镜观察外泌体的形态：标尺为100nm。

图3粒镜检测外泌体的直径分布。

图4外泌体治疗非酒精性脂肪肝的计划示意图。

图5治疗前后小鼠体重变化。

图6治疗组与非治疗组肝脏的重量及肝脏重量与体重的比值。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

图7治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏的病理改变：H&E染色切片图，标尺为100μm。

图8治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中脂滴的含量：油红染色图，标尺为100μm。

图9治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中甘油三酯的含量的变化。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

图10治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中总胆固醇含量的变化。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

图11治疗组和非治疗组高脂小鼠肝脏中胆固醇合成，流出，脂肪酸吸收，合成和β氧化相关基因表达量的变化。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001

具体实施例：

实施例1分离培养棕色脂肪细胞分泌的外泌体。

(1)棕色脂肪细胞外泌体的提取

将鼠断颈处死后，从小鼠肩胛骨部位取出棕色脂肪细胞，去除棕色脂肪上方少量的白色脂肪。用剪刀将棕色脂肪细胞剪碎。剪碎后置于含有10％mv free FBS的DMEM(均购于Gibco公司)培液中，后置于二氧化碳恒温箱中进行培养。培养24小时后，收取培液进行exosome的提取。

(2)外泌体的提取

首先对培液进行预处理，预处理的方法为300xg，离心10分钟，除去沉淀后3000xg，离心30分钟，再除去沉底，最后10000xg，离心60分钟，然后除去沉淀。预处理是为了去除培液中的细胞碎片或者一些较大的囊泡，如凋亡小体，MV等。最后对预处理之后的培液进行120000xg的超速离心，离心时间为3小时。离心结束后，将培液缓慢倾倒掉，之后用60ul的PBS对离在管底的exosome进行重悬，用于后续实验。

实施例2棕色脂肪细胞来源外泌体的鉴定

(1)Western-blot鉴定外泌体标志蛋白CD63、CD9和TSG101

加入适量的细胞裂解液。将细胞裂解液(购于碧云天)置于冰上裂解30分钟，使细胞裂解液充分作用。对细胞裂解液中的细胞进行超声破碎，使细胞中的蛋白释放更完全。4℃，12000xg，离心5分钟。吸取上清，进行蛋白浓度测试。蛋白浓度测试的方法为BCA法(购于赛默飞公司)，将蛋白稀释10倍后进行测量，即在9μlddH2O中加入1μl蛋白液(详细的步骤见相关的说明书)。将蛋白调到同一的浓度，加入5x loading buffer(购于碧云天)，然后在100℃金属浴中煮5分钟，后将煮好的蛋白放于-20℃保存。配置SDS-PAGE胶(相关试剂购于碧云天)，缓慢上蛋白样后，在浓缩胶阶段使用70V恒压进行电泳，等蛋白进入分离胶后，增加电压到110V恒压跑。根据目的蛋白的分子量大小确定跑胶的时间。转膜。先将PVDF膜用甲醇活化一分钟。然后按照“海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵”的顺序转膜。转膜过程中应该尽量避免气泡的产生。转膜时使用的是300mA恒流，转膜时间为90分钟。转膜结束后，进行封闭。封闭使用的是TBST配置的5％的脱脂奶粉。室温封闭1小时。封闭结束后，对条带敷一抗(CD63、CD9和TSG101，购于Santa Cruz公司)，放置于4℃冰箱中过夜。回收一抗，然后用TBST对一抗进行洗脱，洗脱条件为15分钟换一次液，洗4次。洗膜结束后，对条带用相对应的二抗进行孵育，孵育条件为在室温下孵育1小时。回收二抗，洗膜。用TBST15分钟洗一次，洗4次。曝光。将条带用吸水纸稍微吸除点残留的液体，然后加上发光底物(购于赛默飞公司)，利用曝光机进行曝光，结果如图1所示。

(2)电镜观察外泌体形态

将梯度离心得到的exosome用4％多聚甲醛进行重悬，然后送至南京医科大学进行电镜的拍摄，结果如图2所示，通过梯度离心得到的微粒具有脂双层结构。

(3)粒镜分析外泌体的直径分布

将外泌体充分混匀，进行梯度稀释，稀释的体积最少为1ml，然后缓慢注射进入粒镜分析仪进行检测，至少进行三次的测试，结果如图3所示，其检测到的直径大小为130左右。

该实施例结果说明，用梯度离心法可成功获取棕色脂肪细胞来源的外泌体，这种外泌体表达标志蛋白CD63、CD9和TSG101,平均直径在100左右，电镜观察到的形态符合外泌体特征。实施例3棕色脂肪细胞分泌的外泌体对高脂诱导的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝的治疗作用所用的C57/B6小鼠6周，购于南京大学模式动物研究所。

(1)高脂诱导的肥胖小鼠模型

对6周大的雄性C57BL/6J小鼠喂养60％脂肪含量的高脂饲料。高脂饲料放置的量大概为小鼠2天的食物，对高脂饲料要进行及时的更换或者补充，因为高脂饲料容易氧化变质。并且将小鼠置于25℃室温下，给予小鼠足够的水并且维持12小时光照12小时黑暗的作息。高脂造模时间为3个月。

(2)使用棕色脂肪细胞分泌的exosome对于高脂小鼠的酒精性脂肪肝进行治疗

如图4所示，我们将高脂造模3个月之后的小鼠分为两组，治疗组尾静脉注射棕色脂肪细胞分泌的外泌体，对照组进行PBS的注射，每组小鼠的数量为8只。对小鼠进行外泌体尾静脉注射时，注射的外泌体的量为90μg每只小鼠每天，连续注射7天。

(3)小鼠体重和肝脏重量检测

对治疗前和治疗后小鼠的体重进行测量，结果如图5所示，治疗组和对照组小鼠的体重都没有变化，维持在42g左右。等到时间点处死小鼠后，我们也对小鼠肝脏的重量进行了测量，测量结果如图6所示，治疗组小鼠的肝脏重量大概为1.6g,显著低于对照组小鼠的2g。同时肝脏重量与体重的比值结果显示，治疗组小鼠肝脏与体重的比值大概为38mg/g，而对照组小鼠肝脏与体重额比值大概为42mg/g，如图6所示，治疗组与对照组相比具有显著的差异。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

(4)小鼠肝脏组织病理学检测

H&E染色对于肝脏组织的形态学观察：需要先将肝脏放于4％多聚甲醛中固定至少24小时，然后根据常规的石蜡包埋的步骤，将肝脏用石蜡进行包埋。包埋好的石蜡块先进行切片，切片的厚度为5μm。然后将切片常规脱蜡至水，即：二甲苯10分钟(两次，每次10分钟)；无水乙醇3分钟；95％乙醇3分钟；90％乙醇3分钟；80％乙醇3分钟；70％乙醇3分钟；60％乙醇3分钟；50％乙醇3分钟；30％乙醇3分钟；蒸馏水3分钟。苏木精染色1分钟，用于染细胞核。自来水冲洗15分钟。红染色15分钟，用于染细胞质。然后常规乙醇脱水，二甲苯透明，晾干后，用中性树胶封片。结果如图7所示，与对照组相比，治疗组小鼠肝脏中的脂滴含量显著下降，同时脂滴的大小也变小。

油红染色对于肝脏中脂滴的含量进行观察：将肝脏用4％的多聚甲醛固定24小时。用OCT对肝脏进行包埋，然后进行冰冻切片，切片的厚度为10μm。将切片在室温下晾干，放入PBS中浸泡10分钟。将切片放入70％乙醇中放置2分钟。油红染色15分钟。(将4℃中的油红原液与双蒸水以3：2的比例混合，混合均匀之后进行过滤，除去未溶的颗粒状物质。)。将切片放入75％乙醇中清洗5分钟。用PBS清洗5分钟。泡于PBS中，要观察时拿出，观察要迅速。观察结果如图8所示，与对照组相比，治疗组小鼠肝脏中的脂滴含量显著下降。

(5)小鼠肝脏中甘油三酯和总胆固醇的含量

利用碧云天购买的测量甘油三酯和总胆固醇的试剂盒对小鼠肝脏中甘油三酯和总胆固醇的含量进行测定，测定结果如图9和10所示，治疗组小鼠肝脏中甘油三酯的含量大概为53mg/g肝脏，总胆固醇的含量大概为17mg/g肝脏，与对照组比都有显著的下降。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

(6)肝脏中胆固醇合成，流出，脂肪酸吸收，合成和β氧化相关基因表达量的变化

提取肝脏组织的RNA，反转录后做荧光定量PCR(聚合酶链式反应)，检测固醇合成(HMGCR，SREBP-1c)，流出(CYP7A，ABCG1)，脂肪酸吸收(FATP1，FABP1，CD36)，合成(FAS，SCD1，ACCα，PPARy)和β氧化(PDK4，PPARα，CPT-1α，ACOX-1，LCAD，MCAD，UCP2)相关基因表达量的变化。如图11所示，相对于对照组，治疗组小鼠肝脏中胆固醇合成，脂肪酸吸收，脂肪酸合成相关基因的表达量显著下降，同时胆固醇流出，脂肪酸β氧化相关基因的表达量上升。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

以上实验例结果说明：棕色脂肪细胞来源的外泌体能够有效改善由于高脂引起的肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝，因此在制备治疗非酒精性脂肪制剂中具有可观的应用价值。

统计学分析

统计数据以平均值±标准差的形式给出，用GraphPad Prism 5软件(美国圣地亚哥)进行统计分析并作图，两组比较采用t-test，P<0.05(*):有统计学差异；P<0.01(**):有显著差异；P<0.001(***):有极显著差异。

Claims (3)

1.棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于棕色脂肪细胞来源的外泌体在制备治疗高脂肥胖引起的非酒精性脂肪肝的药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的棕色脂肪细胞来源的外泌体表达标志性蛋白CD63、CD9和TSG101。

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