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CN113057963B - 一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体及其应用 - Google Patents

一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于清除β‑淀粉样蛋白的特异性捕获载体及其应用，特异性捕获载体具体是一种功能纳米粒子，包括：介孔二氧化硅纳米粒子、Ca‑MOF、Ce‑Mn MOF、抗hAβ1‑42单克隆抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子以及抗hAβ1‑42单克隆抗体与能穿过血脑屏障透明质酸功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子。这些功能纳米粒子可快速清除血液甚至脑中Aβ1–42，并能通过改变抗体的代谢途径重塑肠道内Aβ的分布，缓解神经退行性疾病如阿尔茨海默症的疾病进程，与对照组相比，静脉注射抗体功能化纳米粒子的APP/PS1小鼠的外周血和脑中β‑淀粉样蛋白显著的减少，盲肠和结肠β‑淀粉样蛋白显著增加，在神经退行性疾病如阿尔茨海默症治疗中有潜在的应用价值。

Description

一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体及其应用。
背景技术
β-淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)沉积是脑淀粉样血管病(Cerebral amyloidangiopathy,CAA)和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的关键病理学基础。临床数据显示80％-98％的AD患者伴有脑血管功能损伤和CAA，脑血管壁上的Aβ的沉积量和疾病严重程度和进程呈正相关。AD是最常见的导致痴呆的神经退行性疾病。Aβ在大脑皮层细胞外空间和脑血管壁中的沉积是AD神经病理学的标志。目前研究表明，过量的Aβ产生或Aβ清除的缺陷在AD发病机理中起关键或致病作用。AD包括家族性AD和偶发性AD。家族性AD约占总AD患者的1％，是由APP，PS1或PS2基因突变引起的，导致Aβ的过量产生，而散发性AD影响99％以上的AD患者，其中大脑中Aβ清除受损是导致其发病的主要因素之一。因此，提高大脑和血管中Aβ清除率是预防和治疗CAA和AD的最有希望的策略之一。
目前认为AD主要由于脑内β-淀粉样蛋白过度产生或清除障碍导致β-淀粉样蛋白过度沉积，引起神经毒性，导致神经突触数量减少和神经元死亡而致病。以Aβ抗体-Aducanumab为基础的抗Aβ免疫治疗AD患者的Ⅲ期临床验证成功，证明了淀粉样蛋白假说的意义，指明以抗Aβ免疫疗法清除脑部Aβ沉积，改善AD病理进程是迄今为止临床研究最有效的治疗手段。当前在Aβ清除方面，包括中枢清除和外周清除两条途径，其中，中枢清除因血脑屏障的存在严重阻碍了药物的利用率，相比之下，外周清除途径显得更有前景。在外周清除途径，最近研究指示，生理条件下，外周脏器组织具有清除Aβ的能力，其中肝脏和肾脏是Aβ外周清除的重要部位。有研究表明对PD-APP转基因小鼠进行静脉注射m266(Aβ单克隆抗体)，可显著降低Aβ沉积，增加中枢神经系统和血浆Aβ清除率来减轻脑内Aβ负担；其次，野生型(WT)和AD模型小鼠的异种共生模型发现，可以显著降低Aβ斑在AD小鼠脑内的聚集。最新研究表明Aβ也具有与朊病毒类似的传播活性，尾静脉注射外周来源的Aβ可进入WT小鼠脑内并沉积，诱导Aβ斑块聚集和促炎因子(TNF-ɑ和IL-6)的表达，导致神经元功能缺陷。上述研究表明Aβ外周清除的重要性和可行性，但单纯的Aβ抗体并不能实现纯粹的Aβ外周清除。
发明内容
针对现有技术的缺陷和改进需求，本发明提供了一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体及其应用，其目的在于灵活、安全、高效地实现人体内β-淀粉样蛋白的快速清除。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体，所述特异性捕获载体为通过物理方式吸附β-淀粉样蛋白或以特异性结合反应对β-淀粉样蛋白进行捕捉富集的功能纳米粒子；其中，所述β-淀粉样蛋白具体为β-淀粉样蛋白单体和β-淀粉样蛋白寡聚体。
本发明的有益效果是：本发明首次利用功能纳米粒子作为β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体，可利用纳米粒子的结构特点对β-淀粉样蛋白进行物理吸附，也可以通过对纳米粒子进行功能化来对β-淀粉样蛋白进行特异性结合反应的捕捉富集，根据实际需要或实际医疗条件选择清除方式，可极大提高清除人β-淀粉样蛋白的灵活性。另外，本发明所提出的特异性捕获载体，可借助纳米给药系统进行静脉注射，通过清除血液中β-淀粉样蛋白单体和β-淀粉样蛋白寡聚体，进而缓解大脑中β-淀粉样蛋白的负担，无侵袭性，具有操作简便、快速和无需特殊设备等特点，适合于基层推广应用。因此，本发明可利用机体自主体液循环代谢的特点，并结合纳米给药系统无侵袭性、药物稳定性和药物利用率高等独特优势，通过快速清除外周血中β-淀粉样蛋白，来减缓大脑中的β-淀粉样蛋白负担，对医学研究领域具有极大推动作用。
作为本发明的进一步优选，所述功能纳米粒子为介孔二氧化硅纳米粒子。
本发明的进一步有益效果是：上述功能纳米粒子不限于介孔二氧化硅，还可以是四氧化三铁包裹介孔二氧化硅、树枝状介孔二氧化硅、生物可溶性介孔二氧化硅、生物材料修饰(如PLGA、血小板、多巴胺、金属框架材料等)的介孔二氧化硅、复合介孔二氧化硅、不同结构的二氧化硅微球以及具有相似生物学功能性质的纳米粒子，而其中由于介孔二氧化硅纳米粒子在生物医学上已经批准，是生物安全的，因此，本发明优选采用介孔二氧化硅纳米粒子。
作为本发明的进一步优选，所述功能纳米粒子为MOF支架。
作为本发明的进一步优选，所述MOF支架为Ca-MOF或Ce-Mn MOF。
本发明的进一步有益效果是：在生物医学领域，MOFs的孔道结构规则、孔隙率高、生物可降解性、结构组成和功能可调等特点使其具有广泛的应用价值。其中，Ca-MOF可利用其苯环间π键作用力吸附和富集病理性蛋白、多肽和有毒小分子物质；而采用基于Ce和Mn的MOF材料，可以同时实现自由基清除和MRI(核磁)功能成像，实现诊疗一体化。因此，本发明优选采用Ca-MOF或Ce-Mn MOF功能纳米粒子。
作为本发明的进一步优选，所述功能纳米粒子为抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子。
本发明的进一步有益效果是：首先如上所述，介孔二氧化硅纳米粒子在林床上批准地且具有生物安全性，另外，本发明对纳米粒子进行抗体功能化修饰，提高特异性。因此，本方案，一方面通过免疫疗法与纳米技术相结合制备抗体功能化的介孔二氧化硅纳米粒子，全面综合了纳米给药系统无侵袭性和免疫疗法高特异性的优势；另一方面基于抗体功能化纳米探针的特异、高效、快速和安全等诸多优势，在一定程度上提高了阿兹海默综合症患者外周血及脑中β-淀粉样蛋白的清除速度，为阿兹海默综合症的临床快速清除β-淀粉样蛋白、降低β-淀粉样蛋白的毒性提供了新技术来源。此方法比普通的免疫疗法清除效果更好。
作为本发明的进一步优选，所述抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子为抗hAβ1-42单克隆抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子。
作为本发明的进一步优选，所述抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子为抗hAβ1-42单克隆抗体与能穿过血脑屏障的配体共同功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子。
本发明的进一步有益效果是：抗hAβ1-42单克隆抗体结合能穿过血脑屏障的配体来共同功能化纳米粒子，使得纳米粒子能够穿过血脑屏障进入脑内，直接在脑内清除脑中β-淀粉样蛋白，极大加快了脑内β-淀粉样蛋白含量的降低速度，为阿兹海默综合症的临床快速清除β-淀粉样蛋白、降低β-淀粉样蛋白的毒性提供了新技术来源。
作为本发明的进一步优选，所述配体为透明质酸、抗体、蛋白或小分子多肽。
作为本发明的进一步优选，所述抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子中，介孔二氧化硅纳米粒子的尺寸为400-500nm，则抗体的代谢途径为肠道代谢。
本发明的进一步有益效果是：通过合理设计介孔二氧化硅纳米粒子的尺寸，并对其功能化修饰以后，该纳米粒子能够变更抗体在体内的代谢途径和代谢时间，具体的，抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子能将抗体的肝脏和肾脏代谢途径变更为主要通过肠道代谢，加快对血液Aβ的清除，具体抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子可以与β-淀粉样蛋白形成复合体，通过肠道代谢来降低血液中β-淀粉样蛋白的含量；此外，抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子通过对肠道β-淀粉样蛋白单体和β-淀粉样蛋白寡聚体的清除，重塑肠道微环境。
本发明还提供了如上所述的一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体在制备缓解神经退行性疾病的疾病进程的药物中的应用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的特异性捕获载体对β-淀粉样蛋白的捕获原理图；
图2为本发明实施例提供的MSNs、Ca-MOF和Ce-Mn MOF对不同形式β-淀粉样蛋白的吸附图；其中，A图为MSNs扫描电镜图和对不同形式β-淀粉样蛋白的吸附检测图；B图为Ce-Mn MOF透射电镜图和Ce-Mn MOF/Ca-MOF对Aβ1–42Ms的吸附检测图；C图为Ca-MOF XRD检测图和Ce-Mn MOF/Ca-MOF对Aβ1–42Os的吸附检测图；
图3为本发明实施例提供的MSNs-1F12功能纳米粒子的表征图；其中，A图为本发明大粒径的MSNs-NHS粒径图及其对应的扫描电镜图；B图为本发明的抗体功能化纳米粒子MSNs-1F12粒径图及其对应的扫描电镜图；C图为本发明制备的抗体功能化纳米粒子MSNs-1F12对不同形式β-淀粉样蛋白的亲和力图；D图为本发明制备的MSNs-1F12特异性检测图；E图为本发明MSNs-NHS偶联1F12抗体的SDS-PAGE图；
图4为本发明实施例提供的静脉注射抗体功能化纳米粒子MSNs-1F12和HA-MSNs-1F12后在小鼠体内的生物学分布图；其中，A图为本发明抗体功能化纳米粒子MSNs-1F12、1F12和MSNs在雄性7月龄APP/PS1小鼠中肝脏和肠道的代谢分布图和定量分析图；B图为本发明抗体功能化纳米粒子MSNs-1F12、1F12和HA-MSNs-1F12静脉注射后在APP/PS1小鼠脑组织的分布图；
图5为本发明实施例提供的静脉注射抗体功能化纳米粒子MSNs-1F12和HA-MSNs-1F12重塑肠道内β-淀粉样蛋白图；其中，A图为本发明抗体功能化纳米粒子MSNs-1F12对APP/PS1小鼠外周血中的人β-淀粉样蛋白清除的ELISA检测结果图；B图为本发明抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠外周血中的人β-淀粉样蛋白清除的ELISA检测结果图；C图为本发明抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12治疗组与对照组APP/PS1小鼠肠道内β-淀粉样蛋白ELISA检测图；D图为本发明抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12治疗组与对照组APP/PS1小鼠肠道内β-淀粉样蛋白相对面积统计结果图；
图6为本发明实施例提供的静脉注射抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠脑内β-淀粉样蛋白实时MRI监测和清除效果图；其中，A图为本发明抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠脑内β-淀粉样蛋白实时MRI监测图；B图为本发明抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12治疗组与对照组APP/PS1小鼠的脑组织中硫磺素反染后脑组织切片荧光图；C图为本发明抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12治疗组与对照组的APP/PS1小鼠脑组织中β-淀粉样蛋白斑块数量统计结果图；D图为本发明抗体功能化纳米粒子HA-MSNs-1F12治疗组与对照组APP/PS1小鼠的脑组织中β-淀粉样蛋白斑块相对面积统计结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
为便于下文指代，现将主要缩写的含义解释如下：
β-淀粉样蛋白单体(Aβ1–42Monomers)：简写为Aβ1–42Ms；
β-淀粉样蛋白寡聚体(Aβ1-42Oligomers)：简写为Aβ1–42Os；
介孔二氧化硅纳米粒子(Mesoporous Silica Nanoparticles)：简写为MSNs；
抗hAβ1-42单克隆抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子：简写为MSNs-1F12；
透明质酸(hyaluronic acid)：简写为HA；
1F12与能穿过血脑屏障的透明质酸功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子：简写为HA-MSNs-1F12。
本发明实施例提供一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体，特异性捕获载体为通过物理方式吸附β-淀粉样蛋白或以特异性结合反应对β-淀粉样蛋白进行捕捉富集的功能纳米粒子；其中，β-淀粉样蛋白具体为β-淀粉样蛋白单体和β-淀粉样蛋白寡聚体。优选地，功能纳米粒子可为介孔二氧化硅纳米粒子、Ca-MOF、Ce-Mn MOF或抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子。其中，抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子为抗hAβ1-42单克隆抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子或抗hAβ1-42单克隆抗体与能穿过血脑屏障的配体共同功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子。
本实施例利用功能纳米粒子作为β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体，可利用纳米粒子的结构特点对β-淀粉样蛋白进行物理吸附，也可以通过对纳米粒子进行功能化来对β-淀粉样蛋白进行特异性结合反应的捕捉富集，根据实际需要或实际医疗条件选择清除方式，可极大提高清除人β-淀粉样蛋白的灵活性。另外，本实施例所提出的特异性捕获载体，可借助纳米给药系统进行静脉注射，通过清除血液中β-淀粉样蛋白单体和β-淀粉样蛋白寡聚体，进而缓解大脑中β-淀粉样蛋白的负担，无侵袭性，具有操作简便、快速和无需特殊设备等特点，适合于基层推广应用。因此，本实施例可利用机体自主体液循环代谢的特点，并结合纳米给药系统无侵袭性、药物稳定性和药物利用率高等独特优势，通过快速清除外周血中β-淀粉样蛋白，来减缓大脑中的β-淀粉样蛋白负担，对医学研究领域具有极大推动作用。
为了更好的说明本发明实施例效果，现给出如下示例。
示例1：MSNs和Ca-MOF/Ce-Mn MOF对β-淀粉样蛋白的吸附
1.1、MSNs和Ca-MOF/Ce-Mn MOF的合成
MSNs的合成：
将5mL十六院基-三甲基-氯化胺(Cetyltrimethylammonium chloride,CTAC0.274mmol)和5mL的三乙醇胺(Triethanolamine,TEA 51.1mmol)混合并磁力搅拌升温到95℃，1h后，将0.5mL的正硅酸乙酯(Tetraethylorthosilicate,TEOS 2.23mmol)逐滴加入并保持温度继续磁力搅拌1h。然后，通过离心和乙醇洗涤3次得到MSNs。将得到的MSNs在1％的盐酸乙醇溶液中60℃搅拌3h，重复3次，离心得到去模板剂CTAC-MSNs。其透射电镜图如图2中A图所示。
Ce-Mn MOF的合成：
分别取103.89g MnCl2 4H2O和83.92g CeCl3 7H2O溶于总体积为25mL的无水乙醇中，超声10min混匀后加入189.126g均苯三甲酸(TA)(提前用15mL无水乙醇溶解)，将混合后的溶液于室温下搅拌10min后，160℃下反应10h。反应后的样品冷却至室温后，于50℃真空干燥。其透射电镜图如图2中B图所示。
姜黄素Ca-MOF的合成：
取姜黄素20g，用1000mL乙醇丙酮(体积比4:1)混合溶液溶解，于40～50℃下保温处理2h备用。另取无水氯化钙5g，溶于100mL乙醇中备用；将氯化钙乙醇溶液添加到姜黄素混合溶液中，保温反应2～3h，将氨水调节上述溶液pH至7～8，静置过夜；过滤分离姜黄素Ca-MOF沉淀，用乙醇洗涤3次后，在70～80℃下干燥，即得到姜黄素Ca-MOF。其XRD检测如图2中C图所示。
1.2、MSNs、Ce-Mn MOF和Ca-MOF对β-淀粉样蛋白的吸附
为了检测MSNs对β-淀粉样蛋白的吸附性，我们选择使用人Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os和Aβ1–40Ms为底物与MSNs进行室温摇晃孵育1h，然后5000rpm，离心5min除去未吸附的Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os和Aβ1–40Ms，使用PBS清洗3次，进行ELISA检测。检测结果发现MSNs可吸附结合不同形式的β-淀粉样蛋白。具体检测结果见图2中A图。
为了检测Ce-Mn MOF和Ca-MOF对β-淀粉样蛋白的吸附性，我们选择使用人Aβ1– 42Ms、Aβ1–42Os与Ce-Mn MOF和Ca-MOF进行室温摇晃孵育1h，然后5000rpm，离心5min除去未吸附的Aβ1–42Ms和Aβ1–42Os，使用PBS清洗3次，进行ELISA检测。检测结果发现Ce-Mn MOF和Ca-MOF可吸附Aβ1–42Ms和Aβ1–42Os。具体检测结果分别见图2中B图和C图。
示例2：MSNS-1F12纳米粒子探针对APP/PS1小鼠外周血β-淀粉样蛋白的清除
2.1、MSNS-1F12纳米粒子探针的制备及检测
NHS修饰MSNs：5.4x 10-6mol NHS(NHS，N-羟基琥珀酰亚胺，与氨基发生点击化学反应，用于生物偶联和标记)加入稀释到3mL的CTAB-MSNs样品中反应3h；离心，PBS清洗3次，分散到200μL DI中避光保存。
1F12抗体的偶联：将MSNs-NHS和1F12抗体按照10:3的比例混合，用0.1M Na2CO3调节pH值在8.5～9.0之间，在漩涡的状态下两者充分混合，4℃，孵育3～5h；得到MSNS-1F12纳米粒子探针，将MSNS-1F12溶于PBS中，浓度为1μg/μL，备用；1F12溶于PBS中，浓度为1μg/μL，备用；MSNs-NHS溶于PBS中，浓度为1μg/μL，备用。将MSNs和MSNS-1F12纳米粒子探针稀释为0.5μg/μL，然后取20μL点样铜网，然后透射电镜观察纳米粒子的大小；取100μL进行粒径测量。结果见图3中的A图和B图。
MSNS-1F12验证：分别取20μL溶于PBS的MSNS-1F12、1F12 20μL和MSNs-NHS 20μL与3.5μL的6x loading buffer混合。95℃煮10min。在电压110V，电流60mA，电泳80min，然后使用考马斯亮蓝染色30min，脱色12h。结果见图3中的E图。从图中可以看出，1F12抗体已经与MSNs-NHS连接成功。
MSNS-1F12抗体亲和力的检测：为了检测MSNs-1F12纳米粒子探针中1F12的亲和力，选择使用Aβ1–42Os为底物，与不同浓度的1F12进行ELISA检测，具体分组为单纯的1F12抗体和MSNs-1F12。检测结果发现将1F12偶联到MSNs-NHS后，免疫亲和力没有明显的变化。具体检测结果见图3中C图。
MSNs-1F12特异性检测：为了检测MSNs-1F12探针的特异性，本实施例选择使用人Aβ1–42Ms、Aβ1–42Os和Aβ1–40Ms为底物与MSNs和MSNS-1F12进行4℃孵育3h，然后使用磁力架分离上清中未结合1F12，使用PBS清洗探针3次，进行ELISA检测。检测结果发现MSNS-1F12特异的结合Aβ1–42。具体检测结果见图3中D图。
2.2、抗体功能化的纳米粒子MSNs-1F12在APP/PS1小鼠中的代谢分布路径
合成靶向Aβ1-42荧光探针：用0.1M Na2CO3调节1F12 pH值至8.5～9.0之间。在漩涡的状态下加入NHS-Cy3(Cy3属于氨基反应染料，是一种明亮的橙色荧光染料，可以使用532nm的激光谱线)，室温混匀3h。混匀后，将合成好的荧光探针过PD-10柱，除去未结合的NHS-Cy3；再与浓度1μg/μL的MSNs-NHS(pH＝8.5～9.0)室温混匀3h，然后5000rpm，5min离心分离上清中未结合的1F12-Cy3，使用PBS清洗探针3次，即得到靶向Aβ1-42荧光探针MSNs-1F12-Cy3。
MSNs-1F12代谢路径：为了检测MSNs-1F12在AD小鼠中的代谢路径，取100μL已经溶于PBS中，浓度为1μg/μL的MSNs-1F12-Cy3、1F12-Cy3、MSNs-Cy3和PBS对雄性7月龄APP/PS1小鼠静脉给药，在给注射后3h、和6h进行心脏灌流，摘取心、肝、脾、肺、肾、脑和小肠，充分研磨，三氯甲烷萃取各组织中的Cy3，再以MSNs-1F12-Cy3的标准曲线，换算各个组织中的MSNs-1F12-Cy3的量。从结果来看1F12主要经过肝脏后再经过小肠代谢，MSNs-1F12-Cy3直接经肠道代谢，具体检测结果见图4中A图；而HA-MSNs-1F12可以跨血脑屏障进入脑组织，6h后在APP/PS1小鼠中主要通过小肠代谢出去。具体检测结果见图4中B图。
2.3、MSNs-1F12对APP/PS1小鼠外周血β-淀粉样蛋白的清除
为了检测MSNs-1F12对APP/PS1小鼠外周血中β-淀粉样蛋白的清除效果，取100μL已经溶于PBS中，浓度为1μg/μL的MSNs-1F12对雄性7月龄APP/PS1小鼠尾静脉注射，分别在注射前、注射后24h、注射后3d和注射后9d进行尾巴采血，采血量50μL尽行ELISA检测，检测结果发现MSNs-1F12在尾静脉注射24h后急速降低外周血中的β-淀粉样蛋白，后续血液中的β-淀粉样蛋白会再次升高，而1F12和MSNs效果不及MSNs-1F12的清除效果。具体检测结果见图5中A图。
示例3：HA-MSNs-1F12纳米粒子探针对APP/PS1小鼠外周血和脑内β-淀粉样蛋白的清除
3.1、HA-MSNs-1F12功能化纳米粒子的制备
Fe3O4@OA纳米粒子的制备：单分散的Fe3O4@OA纳米粒子是通过化学共沉淀法制备的，在氮气流下，将6.56g FeCl2·4H2O(33.5mmol)和11.30g FeCl3 6H2O(41.8mmol)溶解在80mL去离子(DI)水中。将该溶液加热至80℃并剧烈搅拌0.5h。缓慢地加入45mL的氢氧化铵，并将得到的悬浮液剧烈搅拌5min。加入2mL的OA，并将混合物在80℃下保持25min。将混合物自然冷却至室温。使用磁铁收集黑色产物，并用甲醇和DI水彻底洗涤以除去过量的OA。将得到的油酸稳定的单分散磁铁纳米颗粒(Fe3O4@OA)在50℃下真空干燥24h。
磁性介孔二氧化硅纳米(CTAB-MSNs)的合成：将7.5mg Fe3O4@OA分散在0.5mL氯仿中，添加到5mL含0.1g十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB(0.274mmol))的水溶液中。剧烈搅拌所得溶液后，获得均匀的水包油型微乳液。在60℃加热10min会诱导溶液的氯仿蒸发，从而生成水相分散的纳米颗粒。然后将所得水溶液用100mL DI水稀释。将混合物在40℃下快速搅拌2h。然后将3mL的氢氧化铵(22.7mmol)，0.5mL的TEOS(2.23mmol))和5mL的EtOAc(51.1mmol)相继添加至包含磁铁纳米颗粒的稀释水溶液中。将所得混合物搅拌30s，然后在40℃下在80rpm下再保持3h，使产物老化。通过离心收集沉淀物，并用乙醇和DI洗涤4次。将产物冻干，得到CTAB-MSNs。
HA-MSNs-NHS合成：取10.8*10-6mol HA溶于500μL DMSO中，再加入10.8*10-6mol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydro,EDC)和5.4*10-6mol NHS活化0.5h；将活化后的HA加入稀释到3mL的CTAB-MSNs样品中反应3h；离心，水洗3次，分散到200μL DI中避光保存。
HA-MSNs-1F12的合成：将HA-MSNs-NHS和1F12抗体按照10:3的比例混合，4℃，孵育3～5h；得到HA-MSNs-1F12纳米粒子探针，将HA-MSNs-1F12溶于PBS中，浓度为1μg/μL，备用。1F12溶于PBS中，浓度为1μg/μL，备用。HA-MSNs-NHS溶于PBS中，浓度为1μg/μL，备用。
3.2、HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠外周血β-淀粉样蛋白的清除
为了检测HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠外周血中β-淀粉样蛋白的清除效果，取100μL已经溶于PBS中，浓度为1μg/μL的HA-MSNs-1F12对雄性7月龄APP/PS1小鼠尾静脉注射，分别在注射前和注射后24h、3d和9d进行尾巴采血，采血量50μL进行ELISA检测，检测结果发现HA-MSNs-1F12在尾静脉注射24h后急速降低外周血中的β-淀粉样蛋白，而1F12和MSNs的清除效果不及HA-MSNs-1F12的清除效果好。具体检测结果见图5中B图。
3.3、HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠肠道中β-淀粉样蛋白的重塑
取100μL合成的功能化纳米粒子探针HA-MSNs-1F12探针静脉注射到APP/PS1小鼠中，每周注射一次，连续注射三周。同时设置未功能化的纳米粒子MSNs及PBS作为对照，治疗结束后，分别获取治疗组和对照鼠50mg胃肠道在1mL TBS缓冲液中研磨进行，获取组织匀浆液，分别取100μL进行β-淀粉样蛋白相对面积统计。检测结果发现HA-MSNs-1F12在治疗组12指肠中的β-淀粉样蛋白降低，盲肠和结肠中β-淀粉样蛋白增加。具体检测结果见图5中C图和D图。
3.4、HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠脑内β-淀粉样蛋白实时监测
为了检测HA-MSNs-1F12在AD小鼠中实时监测脑内β-淀粉样蛋白，取100μL已经溶于PBS中，浓度为1μg/μL的HA-MSNs-1F12对雄性7月龄APP/PS1小鼠静脉给药，注射等体积PBS为对照组，在给注射前和给注射后3h和9h进行核磁(Magnetic Resonance Imaging，MRI)成像。从结果来看HA-MSNs-1F12可以进入脑组织实现实时监测脑内β-淀粉样蛋白的变化。具体检测结果见图6中A图。
3.4、HA-MSNs-1F12对APP/PS1小鼠脑内β-淀粉样蛋白的清除
取100μL合成的功能化纳米粒子探针HA-MSNs-1F12探针静脉注射到APP/PS1小鼠中，每周注射一次，连续注射三周。同时设置未功能化的纳米粒子MSNs及PBS作为对照，治疗结束后，获取治疗组和对照组鼠脑冠状切片进行硫磺素反染后β-淀粉样蛋白的统计分析。结果：与对照组相比，APP/PS1小鼠静脉注射功能化的HA-MSNs-1F12探针治疗后，说明HA-MSNs-1F12功能化纳米粒子探针可减缓APP/PS1小鼠脑内β-淀粉样蛋白的负担要比单独的1F12清除效果更好。具体检测结果见图6中B图、C图和D图。
综上所述，本发明提出的抗体功能化的纳米粒子能够应用于快速的减低外周血β-淀粉样蛋白，进一步减缓脑中β-淀粉样蛋白的负担，其效果显著。制备的一种快速清除阿尔茨海默病β-淀粉样蛋白的纳米粒子，对于靶向精准治疗具有重大意义。
实施例1、2和3已经详尽的描述了一种快速清除外周血液中β-淀粉样蛋白的纳米粒子的制备及其应用，但是本发明所述的抗体功能化的纳米粒子不限于本专利实施例所述。本发明所描述了一种快速清除血液中β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体(功能纳米粒子)，其所用的单克隆抗体为1F12，也可以是单克隆抗体6E10和Aducanumab，以及多克隆抗体、单链抗体等具有相似功能的蛋白和小分子多肽，其中上述抗hAβ1-42抗体1F12是由分泌抗hAβ1-42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F12所制备，杂交瘤细胞株1F12的保藏号为：CCTCC NO：C2020131。本发明所描述的穿过血脑屏障的配体不限于透明质酸，也可以是其他能协助穿过血脑屏障的抗体、蛋白或小分子多肽。本发明所描述的纳米粒子不限于介孔二氧化硅和四氧化三铁包裹介孔二氧化硅，还可以是还可以是树枝状介孔二氧化硅、生物可溶性介孔二氧化硅、生物材料修饰(如PLGA、血小板、多巴胺、金属框架材料等)的介孔二氧化硅、复合介孔二氧化硅、不同结构的二氧化硅微球和具有相似生物学功能性质的纳米粒子。本发明所描述的功能纳米粒子不限于对β-淀粉样蛋白的清除，也可以是在抗菌、抗氧化或对体内有害蛋白或小分子多肽的降解及清除等方面应用。以上所述均在本发明保护范围。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体，其特征在于，所述特异性捕获载体为以特异性结合反应对β-淀粉样蛋白进行捕捉富集的功能纳米粒子；其中，所述β-淀粉样蛋白具体为β-淀粉样蛋白单体和β-淀粉样蛋白寡聚体；
所述功能纳米粒子为功能性介孔二氧化硅纳米粒子，该功能性介孔二氧化硅纳米粒子为抗hAβ1-42单克隆抗体与能穿过血脑屏障的透明质酸配体共同功能化表面修饰且核载有四氧化三铁磁性纳米材料的介孔二氧化硅纳米粒子，其尺寸为400-500nm，能够穿过血脑屏障且可作为β-淀粉样蛋白的高特异性清除剂、造影剂；所述抗hAβ1-42抗体1F12是由分泌抗hAβ1-42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F12所制备，杂交瘤细胞株1F12的保藏号为：CCTCCNO：C2020131。
2.根据权利要求1所述的一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体，其特征在于，所述抗体功能化修饰的介孔二氧化硅纳米粒子中，抗体的代谢途径为肠道代谢。
3.如权利要求1或2所述的一种用于清除β-淀粉样蛋白的特异性捕获载体在制备缓解神经退行性疾病的疾病进程的药物中的应用。
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